« 1 » Uusi PCR-määritys klamydian diagnosoimiseen Etvi Juntunen ...
« 1 » Uusi PCR-määritys klamydian diagnosoimiseen Etvi Juntunen ...
« 1 » Uusi PCR-määritys klamydian diagnosoimiseen Etvi Juntunen ...
Transform your PDFs into Flipbooks and boost your revenue!
Leverage SEO-optimized Flipbooks, powerful backlinks, and multimedia content to professionally showcase your products and significantly increase your reach.
<strong>«</strong> 1 <strong>»</strong><br />
<strong>Uusi</strong> <strong>PCR</strong>-<strong>määritys</strong> <strong>klamydian</strong> <strong>diagnosoimiseen</strong><br />
<strong>Etvi</strong> <strong>Juntunen</strong><br />
Ohjaajat: FM Lasse Välimaa, LuK Juuso Huusko<br />
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA in vitro DIAGNOSTIIKKA<br />
Chlamydia trachomatis on yleisintä sukupuolitautia klamydiaa aiheuttava<br />
intrasellulaarinen bakteeri, joka nykyisin tunnistetaan kliinisistä näytteistä<br />
nukleiinihappo– tai ELISA-määrityksillä. Klamydiatartunta voi hoitamattomana<br />
johtaa vakaviin kroonisiin tulehdussairauksiin, kuten sokeuttavaan trakoomaan tai<br />
munajohtimien arpeutumisesta johtuvaan lapsettomuuteen. Erikoistyön<br />
tarkoituksena oli kehittää helppokäyttöinen, herkkä ja spesifinen, aikaerotteista<br />
fluorometriaa hyödyntävä <strong>PCR</strong>-<strong>määritys</strong> Chlamydia trachomatis -bakteerin<br />
tunnistamiseen. Määritys kehitettiin osaksi PanSense-<strong>määritys</strong>konseptia, joka<br />
perustuu useiden erilaisten näytteiden analysoimiseen uudenlaisella mittauslaitteella.<br />
Työssä suunniteltiin uudet <strong>PCR</strong>-alukkeet ja koetin tunnistamaan spesifisesti<br />
Chlamydia trachomatiksen kryptistä plasmidia, jonka koko on 7,5 kb ja kopioluku<br />
solussa 4–6. Monistettava alue on 110 emäsparia pitkä plasmidin ensimmäisen<br />
lukukehyksen (ORF1) sekvenssi. Oligonukleotidit suunniteltiin toimimaan niin<br />
korkeassa lämpötilassa, että alukkeiden kiinnittyminen ja pidentyminen voidaan<br />
tehdä samassa lämpötilassa. Määritys suunniteltiin tehtäväksi kuivatuilla<br />
reagensseilla 30 µl:n reaktiotilavuudessa polypropeenilastuilla, jotka toimivat<br />
uudessa analysaattorilaitteessa. Samassa reaktioseoksessa käytettiin myös sisäistä<br />
standardia, jonka monistumisella kontrolloidaan <strong>PCR</strong>-reaktion toimivuutta.<br />
Määritys on optimoitu puhtaalla DNA:lla käyttäen perinteistä <strong>PCR</strong>-laitetta ja<br />
siirretty uudelle mittausalustalle, jossa optimointia on tarkennettu. Määrityksen<br />
teoreettiseksi herkkyydeksi mitattiin puhtaalla DNA:lla 495 fg, joka vastaa 417<br />
solua. Signaali–taustasuhteiksi 47 minuuttia kestävällä määrityksellä saatiin<br />
positiivisilla näytteillä 4. Uudella määrityksellä analysoitiin potilasnäytteitä, jotka<br />
oli kerätty vanupuikoilla sukupuoliteiden limakalvolta. Määrityksen spesifisyyden<br />
havaittiin olevaan täysin yhtenäinen lipopolysakkaridimäärityksen tulosten kanssa.<br />
Myöskin herkkyys riitti tunnistamaan kaikki positiiviset näytteet ja määrityksen<br />
havaittiin olevan tarpeeksi herkkä toimimaan ilman näytteen rikastamista, jolloin<br />
analyytiksi riitti PBS-puskuriin suspentoidut ja keitetyt limakalvonäytteet. <strong>Uusi</strong><br />
<strong>määritys</strong> mahdollistaa <strong>klamydian</strong> nopean diagnosoimisen <strong>määritys</strong>konseptin<br />
helppokäyttöisyyden ja suorituskyvyn ansiosta.<br />
Asiasanat: <strong>PCR</strong>, klamydia, Chlamydia trachomatis, kliininen mikrobiologia
<strong>«</strong> 2 <strong>»</strong><br />
Fragiili X –oireyhtymän (CGG)n –toistojakson määrittäminen<br />
Mikael Hjort 1<br />
Ohjaaja: dos, FT Alice Ylikoski 2<br />
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA in vitro DIAGNOSTIIKKA<br />
1 Biokemian ja elintarvikekemian laitos, Turun yliopisto<br />
2 PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac Oy, Turku<br />
Fragiili X –oireyhtymä on yleisin yhden geenin mutaatiosta johtuva<br />
kehitysvammaisuutta ja henkistä jälkeenjääneisyyttä aiheuttava sairaus.<br />
Oireyhtymä johtuu X-kromosomin FMR1 -geeniä koodittavan geenialueen<br />
ulkopuolella olevan (CGG)n –toistojakson suurentumisesta, joka aiheuttaa FMR1 -<br />
geenin inaktivoitumisen. Sairaus periytyy X-kromosomin kautta, ja oireyhtymän<br />
yleisyys on 1/2500 miehillä ja 1/5000 naisilla.<br />
Normaalin stabiilin toistojakson koko vaihtelee viidestä 40 toistoon. Epästabiilien<br />
esimutaatioiden toistojaksojen määrä vaihtelee 60 ja 200 välillä, jota suuremmat<br />
toistojaksot määritellään täysmutaatioiksi. Normaalin ja esimutaation alueiden<br />
välille jää nk. harmaa alue. Esimutaatiot saattavat suurentua täysmutaatioiksi<br />
periytyessään äidiltä jälkeläiselle. Suurin osa (99 %) esimutaatioista on kooltaan<br />
alle 95 toistojaksoa. Esimutaatio voi aiheuttaa naisilla sekundaariamenorreaa<br />
(engl. premature ovarian failure, POF) ja molemmilla sukupuolilla FXTASsyndroomaa<br />
(Fragile-X-associated tremor/ataxia syndrome). Pojilla täysmutaatio<br />
johtaa aina fragiili X –oireyhtymään, kun taas tytöistä vain noin puolet sairastuvat.<br />
Toistojaksoja määritetään tyypillisesti esimutaation kantajien seulonnassa ja<br />
täysmutaatiotapauksien diagnosoinnissa. Määrityksiä tehdään Southernhybridisaation,<br />
<strong>PCR</strong>:n ja geelielektroforeesin kombinaatioiden avulla. Tämän<br />
erikoistyön tavoitteena oli kehittää menetelmä (CGG)n –toistojakson luotettavaan<br />
monistukseen sekä monistustuotteen tarkkaan koonmääritykseen.<br />
Kehitetyllä monistusmenetelmällä kyettiin monistamaan DNA-näytteestä 118<br />
toistojaksoa. Monistustuotteet havainnoitiin PAGE:a ja kapillaarigeelielektroforeesia<br />
käyttäen. Menetelmällä voidaan havainnoida DNA-näytteestä<br />
normaalin ja harmaan alueen toistojaksot sekä vähintään 99 % esimutaatioista.<br />
Kehitettyä menetelmää voidaan seuraavaksi käyttää kliinisten näytteiden<br />
sisältämien toistojaksojen tutkimiseen. Määritys soveltuu tulevaisuudessa<br />
käytettäväksi esimutaatiotapauksien seulontaan.<br />
Asiasanat: Fragiili X, <strong>PCR</strong>, toistojakso, PAGE, kapillaarigeelielektroforeesi
<strong>«</strong> 3 <strong>»</strong><br />
Vasta-aine<strong>määritys</strong> hepatiitti C virukselle<br />
Teppo Salminen<br />
Ohjaajat: FM Ville Väisänen, FT Tero Soukka ja FT Kim Pettersson<br />
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA in vitro DIAGNOSTIIKKA<br />
RNA-viruksille tyypillisesti hepatiitti-C viruksen (HCV) genomi on hyvin<br />
heterogeeninen. Maailmanlaajuisesti tunnetaan ainakin kuusi erilaista<br />
genotyyppiä. Tämän vuoksi anti-HCV vasta-aineita tunnistavat immunomääritykset<br />
käyttävät antigeeneinä useita peptidejä HCV:n eri proteiineista.<br />
Lisäksi genotyyppien maantieteellisestä jakaantumisesta johtuen immunomääritykset<br />
saattavat toimia heikommin eri alueilla. Nämä ongelmat huomioon<br />
ottaen on suunniteltu rekombinanttinen multiepitooppiproteiini (MEP), joka<br />
koostuu useista immunodominanteista, lineaarisista ja konservoituneista HCVspesifisistä<br />
epitoopeista.<br />
Tutkimuksen tavoitteena oli kehittää MEP:iin perustuva vasta-aine<strong>määritys</strong>, joka<br />
tunnistaa veressä olevia anti-HCV vasta-aineita. MEP:a käytettiin immunomäärityksessä<br />
sekä solid-faasissa, että tracerina, jolloin vasta-aine muodostaa<br />
sillan solid-faasin ja tracerin välille. Lisäksi toisessa määrityksessä MEP:a<br />
käytettiin solid-faasissa ja tracerina toimi Eu-leimattu antihumaani –vasta-aine.<br />
Näytteinä käytettiin sekä monoklonaalisia anti-HCV vasta-aineita että 10 näytteen<br />
kaupallisilla määrityksillä varmistettua HCV-paneelia.<br />
Vaikka monoklonaalisella IgG –anti-HCV vasta-aineella oli hyvä affiniteetti<br />
MEP:iin, tämä vasta-aine ei kuitenkaan pystynyt muodostamaan siltaa MEP-MEP<br />
immunomäärityksessä. Sen sijaan positiiviset potilasnäytteet muodostivat sillan ja<br />
aiheuttivat positiivisen signaalin MEP-MEP määrityksessä. Positiivinen signaali<br />
saattoi muodostua polyvalenteista IgM –vasta-aineista, jotka ehkä pystyivät<br />
sitoutumaan tehokkaammin useampaan antigeeniin yhtä aikaa. Toinen vaihtoehto<br />
on seerumissa olevat tekijät, jotka aiheuttavat polyklonaalisen IgG-vasteen<br />
muodostumisen kompleksoimalla IgG-vasta-aineita. MEP-MEP siltamäärityksen<br />
etuna on vasta-aineiden epäspesifisen sitoutumisen aiheuttaman taustan<br />
minimoiminen, mutta signaali/tausta –suhteet olivat kuitenkin parempia MEP –<br />
antihuman-Eu määrityksessä. Tutkimuksessa onnistuttiin kehittämään HCVmultiepitooppiproteiiniin<br />
ja Eu-kelaattileimoihin perustuva alustava vastaaine<strong>määritys</strong><br />
hepatiitti C virukselle.<br />
Asiasanat: Hepatiitti C, vasta-aine<strong>määritys</strong>
<strong>«</strong> 4 <strong>»</strong><br />
Spot-<strong>määritys</strong> PAPP-A:lle<br />
Heidi Hyytiä<br />
Ohjaajat: FM Saara Wittfooth ja DI Johanna Ylikotila<br />
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA in vitro DIAGNOSTIIKKA<br />
Raskauteen liittyvä plasman proteiini A, eli PAPP-A (engl. pregnancy-associated<br />
plasma protein A) on isokokoinen proteiini, jonka on havaittu vapautuvan<br />
verenkiertoon sepelvaltimotautikohtauksen yhteydessä, ja jonka käyttöä<br />
sepelvaltimotautikohtauksen diagnostiikassa tutkitaan parhaillaan. Immunomäärityksissä<br />
käytetään yleisesti <strong>määritys</strong>kaivoja, joiden sisäpinta on päällystetty<br />
streptavidiinillä kauttaaltaan. Spot-päällystyksessä streptavidiini on pienellä<br />
alueella kaivon pohjalla ja menetelmän on havaittu parantavan immuno<strong>määritys</strong>ten<br />
herkkyyttä testatuilla analyyteillä. Työn tarkoituksena oli spotteknologiaa<br />
apuna käyttäen kehittää PAPP-A:lle nopea ja nykyistä <strong>määritys</strong>tä<br />
herkempi <strong>määritys</strong>.<br />
Työssä päällystettiin <strong>määritys</strong>kaivoja spot-teknologialla käyttäen natiivia<br />
streptavidiinia ja aktivoitua streptavidiinia sekä sitomiskapasiteettia parantavaa<br />
lisäainetta. Eri päällystyspintoja tutkittiin tavallisten immuno<strong>määritys</strong>ten ja<br />
immunokompleksi<strong>määritys</strong>ten avulla. Tavallisissa immunomäärityksissä biotinyloitu<br />
vasta-aine sidottiin spotin pintaan ja leimavasta-ainetta sekä PAPP-A:ta<br />
inkuboitiin kaivossa haluttu aika. Immunokompleksimäärityksessä biotinyloidun<br />
ja leimavasta-aineen annettiin sitoutua PAPP-A:han liuoksessa ennen määrityksen<br />
suoritusta.<br />
Määrityksissä spesifiset signaalit olivat kaikilla spot-pinnoilla huomattavasti<br />
vertailuikaivoja korkeammat. Toisaalta etenkin muilla analyyteillä hyväksi<br />
havaitun aktivoitua streptavidiinia ja lisäainetta sisältävän pinnan taustasignaalit<br />
olivat korkeat. Lisäksi havaittiin, että riippumatta käytetystä spot-pinnasta<br />
kinetiikat olivat hitaita - signaalitasot tasoittuivat vasta neljän tunnin inkuboinnin<br />
jälkeen. Immunokompleksin muodostamisen avulla saatiin kinetiikkoja<br />
nopeutettua mutta herkkyyttä ei saatu parannettua.<br />
Spot-teknologialla päästään 15 minuutin PAPP-A-määrityksissä samoihin<br />
herkkyyksiin kuin vertailumäärityksellä käyttämällä huomattavasti vähemmän<br />
reagensseja. Hitaan kinetiikan vuoksi pidemmällä <strong>määritys</strong>ajalla spotmäärityksillä<br />
olisi mahdollista parantaa herkkyyttä merkittävästi.<br />
Asiasanat: PAPP-A, spot, sepelvaltimotautikohtaus
<strong>«</strong> 5 <strong>»</strong><br />
Vasta-aineiden eritys Bcl6-poistogeenisissä B-soluissa<br />
Minna Ylihärsilä<br />
Ohjaajat: FM Jukka Alinikula, prof. Olli Lassila<br />
BIOKEMIA<br />
B-solujen kehitystä hematopoieettisista kantasoluista vasta-aineita erittäviksi<br />
plasmasoluiksi säädellään monien eri transkriptiofaktoreiden avulla. Transkriptiofaktorit<br />
Pax5, IRF-4, XBP1, BLIMP1 ja Bcl6 osallistuvat B-solun kehityksen<br />
viimeisten vaiheiden säätelyyn. Bcl6 (B-cell lymphoma 6)-proteiinia tarvitaan<br />
imusolmukkeiden itukeskuksien muodostumiseen, joissa tapahtuu immunoglobuliinigeenien<br />
somaattinen hypermutaatio sekä vasta-aineiden luokanvaihto.<br />
Bcl6 estää myös plasmasolugeeni Blimp-1:n ilmenemistä. Virheet B-solun<br />
kehityksessä voivat johtaa autoimmuunitautien ja syöpien kehittymiseen. Bsolujen<br />
kehityksen ja toiminnan ymmärtämisen kannalta on tärkeää selvittää Blymfosyyttien<br />
kehitykseen osallistuvien transkriptiofaktoreiden toiminta.<br />
Tutkimusta varten on tehty Bcl6-poistogeeninen DT40 B-solulinja homologista<br />
rekombinaatiota hyväksi käyttäen. Työn tavoitteena oli selvittää Bcl6poistogeenisten<br />
solujen vasta-aineiden sekreetioon liittyvää fenotyyppiä. Bcl6poistogeenisten<br />
solujen geenien ilmentymismuutokset (mikrosiruanalyysi)<br />
osoittivat plasmasoluille tyypillisten geenien aktivoituneen. Geenilastukokeet<br />
paljastivat XBP1:n kohdegeenien lisääntyneen ilmenemisen. Työn tarkoituksena<br />
oli selvittää eksosytoosiin, proteiinien ja vesikkelien solunsisäiseen kuljetukseen<br />
liittyvien geenien ekspression muutos ja määrittää muutoksien suuruus. Bcl6poistogeenisten<br />
solujen RNA käänteiskopioitiin cDNA:ksi ja geenien ekspressio<br />
määritettiin kvantitatiivisella <strong>PCR</strong>:llä. Elektronimikroskopialla selvitetään onko<br />
Bcl6-poistogeenisissä soluissa havaittavissa rakenteellisia muutoksia verrattuna<br />
villintyypin soluihin. Työssä kloonattiin kanan XBP1, jotta sen osuutta Bcl6poistogeeniseen<br />
fenotyyppiin voidaan tutkia.<br />
Reaaliaikainen kvantitatiivinen <strong>PCR</strong> osoitti XBP1-, rab40B-, rab27A-, syntaxin6-<br />
sekä sec24D-geenien ilmenemisen lisääntyneen villintyyppiin ja Bcl6 takaisin<br />
transfektoituihin soluihin verrattuna. Nämä löydökset viittaavat vahvasti siihen,<br />
että Bcl6-geenin poisto lisää proteiinisekreetiota soluissa. Tulosten perusteella<br />
Bcl6 näyttää säätelevän sekreetiokoneistoa säätelevän transkriptiofaktori XBP1<br />
tuottoa. Bcl6-geeni näyttäisi estävän B-solun kehitystä vasta-aineita erittäväksi<br />
plasmasoluksi.<br />
Asiasanat: Bcl6, kvantitatiivinen <strong>PCR</strong>, DT40-solulinja
<strong>«</strong> 6 <strong>»</strong><br />
ErbB4-reseptorin isomuotojen onkogeenisyys<br />
Kari Kurppa<br />
Ohjaajat: LL Maria Sundvall ja prof. Klaus Elenius<br />
BIOKEMIA<br />
ErbB4-kasvutekijäreseptori kuuluu EGFR (ErbB1) –reseptoriperheeseen. Perheen<br />
jäsenistä ErbB1 ja ErbB2 ovat tunnettuja onkogeenejä ja niitä vastaan<br />
kohdistettuja syöpälääkkeitä on jo kliinisessä käytössä. ErbB4-reseptorin on<br />
havaittu olevan yli-ilmentynyt ja mutatoitunut useissa syövissä, mutta tähänastiset<br />
tutkimustulokset ErbB4:n roolista syövän kehityksessä ovat ristiriitaisia. ErbB4<br />
eroaa muista ErbB-perheen jäsenistä siinä, että se esiintyy luonnollisesti neljänä<br />
eri isomuotona. Isomuotojen on havaittu eroavan signaalinvälityskyvyiltään ja ne<br />
voivat siten aiheuttaa erilaisia vasteita solutasolla.<br />
Työni tarkoituksena oli luoda retrovirusvälitteisellä geeninsiirrolla pysyvästi eri<br />
ErbB4 isomuotoja yli-ilmentävät solulinjat ja tarkastella miten eri isomuodot<br />
vaikuttavat solujen muuntumiseen pahanlaatuisiksi (transformaatioon).<br />
Käytin työssäni hiiren rintasyövän solulinjaa Shionogi 115 (S115), jonka solut<br />
voidaan halutessa transformoida altistamalla solut testosteronille. S115-solut<br />
tarjosivat tutkimukselle solumallin, jossa samalla geneettisellä solutaustalla<br />
voidaan tutkia eri ErbB4 isomuotojen yli-ilmentymisen vaikutuksia normaaleihin<br />
ja transformoituneisiin soluihin sekä solujen muuntumiseen normaaleista<br />
transformoituneeseen fenotyyppiin. Tarkastelin työssäni ErbB4 isomuotojen yliilmentymisen<br />
vaikutuksia solujen proliferaatioon, morfologiaan, syndekaani-1:n<br />
ilmentymiseen, aktiinifilamenttirakenteeseen ja kasvamiseen pehmeäagarissa,<br />
jotka kaikki ovat hyvin karakterisoituja transformaatioon liittyviä solutason<br />
muutoksia tässä solumallissa.<br />
Erikoistyöni aikana sain optimoitua retrovirustransfektio menetelmän ja luotua<br />
kahta ErbB4 isomuotoa pysyvästi yli-ilmentävät solulinjat. Karaterisoin<br />
isomuotojen vaikutuksia luoduissa solulinjoissa käyttäen kaikkia yllämainittuja<br />
menetelmiä. Tulosten perusteella toinen isomuodoista vaikuttaisi kiihdyttävän<br />
transformaatiota, mutta toinen ei. Jatkossa tarkoituksena on luoda kahta jäljelle<br />
jäänyttä isomuotoa pysyvästi yli-ilmentävät solulinjat ja karakterisoida niiden<br />
vaikutukset solujen transformaatioon.<br />
Asiasanat: kasvutekijäreseptori, EGFR-reseptoriperhe, syöpä
<strong>«</strong> 7 <strong>»</strong><br />
CLEVER-1 tarttumismolekyylin toimintamekanismin selvittäminen<br />
Sari Hernesniemi<br />
Ohjaajat: dos. Kati Elima ja immunologian prof. Sirpa Jalkanen<br />
BIOKEMIA<br />
Valkosolut ovat välttämättömiä elimistön puolustuskyvylle. Ne ovat jatkuvassa<br />
liikenteessä veren ja imukudosten välillä etsien taudinaiheuttajia. Valkosolujen ja<br />
verisuonen endoteelin pinnalla tähän tapahtumasarjaan osallistuvat useat eri<br />
molekyylit, joiden toiminta on jo melko hyvin tunnettua, kun taas valkosolujen<br />
liikenne imukudoksissa tunnetaan huonommin. Muutamia tähän tapahtumasarjaan<br />
vaikuttavia molekyylejä on kuitenkin löydetty, joista esimerkiksi CLEVER-1<br />
(common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1) välittää<br />
lymfosyyttien liikennettä imusuonissa. CLEVER-1:n tutkimisessa on ongelmana<br />
proteiinin suuri, noin 250 kDa koko ja siten huono transfektiotehokkuus nisäkässoluissa.<br />
Tätä varten CLEVER-1 on päätetty pilkkoa pienempiin paloihin.<br />
Tehtävänäni erikoistyössä on näitä proteiinipaloja koodaavien cDNA-palojen<br />
kloonaus, kloonien transfektiot nisäkässoluihin sekä tuotetun proteiinin eristys,<br />
puhdistus ja analysointi. Yritän myös kartoittaa inhibitorisien anti-CLEVER-1<br />
vasta-aineiden 372:n ja 266:n tunnistamia epitooppeja ja testata eri integriinien<br />
sitoutumista CLEVER-1:n fasciclin-domeeneihin immunosaostuksella. Olen<br />
kloonannut viisi eri palaa CLEVER-1:stä pcDNA3.1 Myc/his vektoriin kolmen jo<br />
valmiina olleen kloonin lisäksi ja transfektoinut konstrukteja Hek 293-soluihin<br />
sekä puhdistanut näin tuotettuja proteiineja affiniteettikromatografialla. Solujen<br />
transfektiotehokkuudet olen tarkistanut FACS-värjäyksen jälkeen virtaussytometrillä.<br />
Proteiineja olen analysoinut Western-blottauksella, hopeavärjätyllä<br />
SDS-PAGE-geelillä sekä massapektrometrisesti.<br />
Vaikkakin CLEVER-1 –cDNA on pilkottu pienempiin palasiin, eivät<br />
transfektiotehokkuudet ole olleet haluttua tasoa ja siten proteiinipuhdistusten<br />
saannot ovat jääneet vähäisiksi. Inhibitorisen 372-vasta-aineen epitoopin olen<br />
pystynyt kartoittamaan ensimmäisten 3000 emäsparin alueelle. Toivon uusilla,<br />
vielä testaamattomilla klooneilla saavani 372-epitoopin kartoitettua vielä<br />
pienemmälle alueelle ja löytäväni 266-epitoopin geenin loppupäästä. Seuraavana<br />
vuorossa on kloonaamieni fasciclin-domeenikloonien sitoutumisen testaaminen eri<br />
integriineihin immunosaostuksella sekä palasten tuottokokeilut E.colissa.<br />
Asiasanat: Valkosolu, lymfosyytti, CLEVER-1, vasta-aine
<strong>«</strong> 8 <strong>»</strong><br />
Dioksygenaasien rooli Smad3:n defosforylaation säätelyssä<br />
Marika Nummela<br />
Ohjaaja: FM Pekka Heikkinen<br />
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA in vitro DIAGNOSTIIKKA<br />
Transformoiva kasvutekijä β (TGF-β) säätelee useita solun toimintoja, kuten<br />
kasvua, erilaistumista, vaeltamista ja kuolemaa. TGF-β ylläpitää solunsisäistä<br />
tasapainoa, kun taas häiriöitä signaalinvälitystiessä esiintyy tautitiloissa, kuten<br />
syövässä, fibroosissa ja autoimmuunisairauksissa. Signaalin kuljettajina<br />
solukalvon reseptorilta tumaan toimivat fosforyloidut Smad-proteiinit, jotka<br />
tumassa toimivat transkriptiofaktoreina. Hapen puutteen (hypoksian) on osoitettu<br />
aiheuttavan Smad3:n defosforylaation eli inaktivaation. Hapesta riippuvaiset<br />
entsyymit, dioksygenaasit, saattaisivat siis olla osallisena tapahtumassa. Tämän<br />
erikoistyön tarkoituksena oli selvittää dioksygenaasien vaikutusta TGF-β<br />
signalointiin ja erityisesti Smad3:n defosforylaatioon.<br />
Työ tehtiin humaanisoluviljelymalleissa. Immortalisoituja, mutta ei<br />
pahanlaatuisia, ihmisen ihon keratinosyyttejä (HaCaT) käsiteltiin dioksygenaasien<br />
kemiallisilla inhibiittoreilla, dimetyylioksalyyliglysiinillä (DMOG) ja kobolttikloridilla<br />
(CoCl2), yhdessä TGF-β:n kanssa. Käsittelyjen vaikutusta Smad3:n<br />
defosforylaatioon seurattiin western-blot-analyysillä. Inhibiittorien vaikutusta<br />
solujen fenotyyppiin tutkittiin tekemällä umpinaiseen solukasvustoon haava ja<br />
seuraamalla etenevien solujen morfologiaa ja solu-solukontakteja faasikontrastimikroskopian<br />
ja immunofluorometrian avulla. Solujen pahanlaatuisuutta ja<br />
invasiivisyyttä tutkittiin seuraamalla niiden kulkeutumista solujen ympäristöä<br />
jäljittelevän matrigeelin läpi. Defosforylaatiota säätelevän dioksygenaasin<br />
etsimiseksi valmiina olemassa olevia mikrosirudatoja analysoitiin, ja tulokseksi<br />
saatujen dioksygenaasien tehtävistä ja vuorovaikutuksista haettiin tietoa<br />
proteiinitietokannoista.<br />
Smad3:n defosforylaation ja DMOG-pitoisuuden välillä todettiin selvä<br />
konsentraatioriippuvainen yhteys, mistä voidaan päätellä, että dioksygenaaseilla<br />
olisi rooli Smad3:n defosforylaatiossa. Yhdessä TGF-β:n kanssa dioksygenaasiinhibiittorit<br />
aiheuttivat soluille morfologiamuutoksia ja solu-solukontaktien<br />
havaittiin vähentyneen, mikä saattaisi antaa viitteitä solujen muuttumisesta<br />
pahanlaatuisiksi. Mikrosirudatan analysoinnin tuloksena yksi entsyymi, JHD1A,<br />
tuli esiin todennäköisenä kandidaattina Smad3:n defosforylaation säätelijäksi.<br />
Asiasanat: dioksygenaasientsyymi, TGF-β signaalitie, defosforylaatio,<br />
syöpäbiologia
<strong>«</strong> 9 <strong>»</strong><br />
Angusykliinibiosynteesiin osallistuvien entsyymien PgaE ja PgaM muokkaus<br />
ja karakterisointi<br />
Hanna Korhonen<br />
Ohjaajat: FM Pauli Kallio, FT Jarmo Niemi ja prof. emeritus Pekka Mäntsälä<br />
BIOKEMIA<br />
Monet mikro-organismit tuottavat ja erittävät ympäristöönsä bioaktiivisia aineita<br />
suojatakseen elinympäristöään muilta mikrobeilta. Tällaisia ovat muun muassa<br />
erilaiset aromaattiset polyketidiyhdisteet, joista monet ovat maaperässä elävien<br />
gram-positiivisten Streptomyces-bakteerien tuottamia metaboliitteja. Muutamia<br />
tämän ryhmän yhdisteistä on käytety laajalti syöpälääkkeinä (mm. antrasykliinit<br />
daunorubisiini ja doksorubisiini), sekä bakteeri-infektioiden hoitoon (mm.<br />
tetrasykliini). Erikoistyötutkimukseni liittyy aromaattisten polyketidien ryhmään<br />
kuuluviin angusykliiniyhdisteisiin ja erityisesti niiden biosynteesissä toimiviin<br />
entsyymeihin. Biosynteettisten entsyymien ja niiden katalysoimien reaktioiden<br />
tarkka tuntemus antaa uusia mahdollisuuksia ja työkaluja uusien yhdisteiden<br />
muokkaamiseen ja suunnitteluun.<br />
Pga on angusykliini-tyypin geeniklusteri, joka on peräisin Streptomyces-kannasta<br />
PGA64. PgaE ja PgaM ovat Pga-biosynteesitien geenituotteita, jotka osallistuvat<br />
angusykliinin aromaattisen hiilirungon muokkaukseen. Erikoistyössäni tutkin,<br />
spesifisten pistemutaatioiden ja deleetioiden vaikutusta PgaM ja PgaE entsyymien<br />
ilmenemiseen, aktiivisuuteen ja pysyvyyteen. Muokatut entsyymit tuotettiin<br />
E.coli:ssa, puhdistettiin ja karakterisoitiin vertaamalla niiden ominaisuuksia<br />
natiiveihin entsyymeihin. Tulokset antavat tietoa aktiivisen keskuksen<br />
ominaisuuksista, substraatin sitoutumisesta, sekä entsyymin rakenteeseen ja<br />
pysyvyyteen vaikuttavista tekijöistä.<br />
Muokattujen proteiinien suunnittelussa käytettyjä menetelmiä olivat <strong>PCR</strong> ja muut<br />
molekyylibiologian tekniikat. Proteiiniekspressiossa ja puhdistuksessa sovellettiin<br />
erilaisia kasvatustekniikoita, kromatografisia menetelmiä (FPLC –affiniteettikromatografia<br />
ja -geelisuodatus) ja analyyttista PAGE-elektroforeesia.<br />
Entsyymien aktiivisuusmittaukset tehtiin spektrofotometrisesti ja HPLCmenetelmien<br />
avulla.<br />
Asiasanat: polyketidiantibiootti, angusykliini, PgaE, PgaM, proteiinin muokkaus
<strong>«</strong> 10 <strong>»</strong><br />
Ihmisen neutraalin α-mannosidaasin kolmen eri rekombinanttiproteiinin<br />
kloonaus, niiden tuotto Pichia pastoriksessa ja puhdistus<br />
Iida Salminen<br />
Ohjaajat: FM Elina Kuokkanen ja FT Pirkko Heikinheimo<br />
BIOKEMIA<br />
Glykosidihydrolaasit jaetaan aminohapposekvenssien perusteella 108 perheeseen.<br />
Nisäkkäiden GH38 perheen entsyymit ovat noin 1000 aminohapon suuruisia,<br />
usein oligomeerisia α-mannosidaaseja. Yksi näistä on solulimassa yleisesti<br />
esiintyvä neutraali α-mannosidaasi (NAM), joka toimii sokeriketjujen<br />
hajotuksessa pilkkoen mannoosien välisiä sidoksia. Tutkimusryhmän tarkoitus on<br />
selvittää NAM:n rakenne ja sen toimintaa, joista vielä tiedetään melko vähän.<br />
Työssäni monistin pCR R 2.1-TOPO-kloonausvektorista NAM:in N-terminaalisesta<br />
päästä lyhennettyinä kolmena eripituisena versiona. Natiivikonstruktista poistettiin<br />
vain edellisistä kloonausvaiheista mukaan tulleet kuusi ylimääräistä aminohappoa,<br />
kun taas toisen konstruktin N-terminaalisesta päästä poistettiin noin 200 ja<br />
viimeisestä noin 250 aminohappoa. Tarkoitus oli säilyttää NAM:n konservoitunut<br />
A-domeeni, jonka tiedetään vaikuttavan proteiinin laskostumiseen. Tuotteet<br />
liitettiin pPIC3.5/HKNam-vektoriin ja transformoitiin P. pastoris-hiivaan.<br />
Aktiivisuutta mitattiin tuottokasvatuksissa ja aktiivisimmat kannat fermentoitiin.<br />
Tuotettuja proteiineja puhdistettiin ammoniumsulfaattisaostuksella ja Co2+affiniteettikromatografialla.<br />
Natiiville konstruktille tehtiin tobacco etching virus<br />
(rTEV)-proteaasilla digestio, jossa N-terminaalinen histidiinihäntä leikattiin pois,<br />
jonka jälkeen ajettiin uusi Co2+-affiniteettikromatografia.<br />
Natiivin konstruktin tuottama α-mannosidaasiaktiivisuus oli tuottokasvatuksissa ja<br />
fermentoinnissa odotetusti korkea. Ammoniumsulfaattisaostuksessa ja Co2+pylväsajossa<br />
päästiin eroon suuresta osasta epäpuhtauksia mutta samalla<br />
menetettiin kaksi kolmasosaa aktiivisuudesta ja loput aktiivisuudesta katosi rTEVdigestiossa<br />
ja toisessa Co2+-pylväsajossa. Puhdasta proteiinia ei saatu talteen.<br />
Kaksi muuta konstruktia tuottivat myös α-mannosidaasiaktiivisuutta, mutta<br />
puhdistuksissa aktiivisuus oli niin alhainen, ettei Co2+-affiniteettikromatografian<br />
tuloksista voitu varmuudella sanoa, olivatko ne sitoutuneet pylvääseen.<br />
Puhdistukseen jäi siis paljon parannettavaa, erityisesti lyhimmän konstruktin<br />
ammoniumsulfaattisaostuksessa menetettiin tavallista enemmän aktiivisuutta.<br />
Asiasanat: glykosidihydrolaasi, neutraali α-mannosidaasi, Pichia pastoris
<strong>«</strong> 11 <strong>»</strong><br />
Rapamysiinin tuottotason parantaminen Streptomyces hygroscopicus -<br />
kannalla<br />
Miina Lehestö<br />
Ohjaaja: FM (väit.) Jaana Kantola<br />
BIOKEMIA<br />
Rapamysiini eli sirolimus on erityisesti munuaissiirtojen ja pallolaajennusten yhteydessä<br />
kudosten hylkimisreaktioiden estämiseen käytetty immunosuppressantti (kauppanimi<br />
Rapamune®). Yhdiste on tunnettu jo 1970-luvulta, ja rakenteeltaan se on makrosyklinen<br />
laktoni. Rapamysiiniä tuottavan bakteerikannan (S. hygroscopicus) kehitystä kaupallisesti<br />
kannattavaksi (tuottotasotavoite 500 mg/l) on aloitettu Galilaeus Oy:ssä. Ennen erikoistyöni<br />
aloittamista kanta oli kertaalleen mutatoitu, mutta kannan geenitekninen muokkaaminen ei<br />
ollut onnistunut perinteisen protoplastitransformaation avulla. Tuottokasvatuksiin käytetty<br />
kasvuliuos sisälsi myös bioproteiinia, jonka valmistaminen on lopetettu. Erikoistyöni<br />
tarkoituksena oli jatkaa kannan kehitystä edelleen mutatoimalla tähän mennessä löydetty<br />
paras mutantti (B265), sekä yrittää geeniteknistä muokkaamista konjugaation avulla. Myös<br />
kasvuliuoksen sisältämän bioproteiinin korvaaminen jollain saatavissa olevalla yhdisteellä<br />
oli yksi erikoistyöni tavoitteista.<br />
S. hygroscopicus B265 mutatoitiin kemiallisesti N-metyyli-N-nitro-N-nitroso-guanidiinin<br />
(NTG) ja gentamisiinin avulla. Saatuja mutantteja kasvatettiin ensin 3 ml:n<br />
liuoskasvatuksissa, joista rapamysiinin tuottotasoa arvioitiin TLC:n avulla. Rapamysiiniä<br />
parhaiten tuottaneet mutantit kasvatettiin uudelleen 50 ml:n pullokasvatuksissa, joista<br />
uutetun rapamysiinin määrä analysoitiin HPLC:n avulla. Konjugaatiossa B265<br />
itiösuspensioon yhdistettiin E. coli ET12567/pUZ8002 kannan soluja, joihin oli siirretty<br />
rapamysiinin tuottoon osallistuvia säätely-, resistenttiys- ja transportterigeenejä<br />
kloonattuina pSET152 -vektoriin. Konjugaatiotehokkuutta pyrittiin parantamaan itiöille<br />
annettujen lämpö- tai ultraäänishokkien avulla. Konjugantit seulottiin mutanttien tavoin.<br />
Bioproteiinin korvaamiseksi testattiin kasvuliuoksia, jotka sisälsivät eri määriä mm.<br />
hiivauutteen, soijajauhon, farmamedian ja ammoniumsulfaatin eri yhdistelmiä.<br />
Suunnittelussa ja tulosten analysoinnissa käytettiin Minitab-koesuunnitteluohjelmaa.<br />
Mutantteja seulottiin kaiken kaikkiaan 500. <strong>Uusi</strong>ntakasvatuksiin valittiin yhteensä 28<br />
mutanttia, joista parhaan (C155) tuottotaso oli 1,4-kertainen kontrolliin verrattuna.<br />
Konjugaatiomenetelmä saatiin toimimaan hyvin, mutta konjugoiduista geeneistä ainoastaan<br />
orfG (helix-turn-helix DNA-binding protein) paransi rapamysiinin tuottoa. Myös<br />
bioproteiinin korvaamisessa onnistuttiin soijajauhoa, hiivauutetta ja tärkkelystä sisältämällä<br />
kasvuliuoksella. Kuitenkin saavutetut tuottotasot (~60 mg/l) ovat vielä kaukana<br />
kokonaistavoitteesta, joten kannan kehitystä ja tuotto-olosuhteiden optimointia pitää vielä<br />
jatkaa.<br />
Asiasanat: rapamysiini, S. hygroscopicus, kemiallinen mutatointi, konjugaatio, TLC, HPLC
<strong>«</strong> 12 <strong>»</strong><br />
Halvaannuttavia simpukkatoksiineja tunnistavan monovalentisen Fabfragmentin<br />
ristireaktiivisuuden parantaminen<br />
Merja Mustonen<br />
Ohjaaja: FM Markus Vehniäinen<br />
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA in vitro DIAGNOSTIIKKA<br />
Vasta-aineiden ja vasta-ainefragmenttien muokkaaminen affiniteetin ja<br />
spesifisyyden osalta on yksi keskeisistä biotekniikan sovelluksista. Muokkaamista<br />
varten on lukuisia eri menetelmiä, jotka voidaan karkeasti jaotella satunnaisia tai<br />
kohdennettuja mutaatioita tuottaviksi. Mutageneesilla pyritään tuottamaan<br />
antigeenin tunnistukselle keskeiseltä alueelta toisistaan eroavia vasta-aineita, jotka<br />
ovat uniikkeja ja yhteismäärältään jopa miljardeja. Tästä joukosta vain muutaman<br />
affiniteetti ja spesifisyys kohdeantigeeniin on parantunut merkittävästi, joten<br />
mutantteja ei voida karakterisoida yksitellen. Tehokas kollektiivinen seulontatapa<br />
on faaginäyttö-tekniikka, jossa mutanttien geno- ja fenotyyppi ovat yhdessä, sillä<br />
faagi sisältää mutantin geneettisen koodin sekä ilmentää pinnallaan mutantin<br />
proteiinina. Tämä mahdollistaa seulonnan lopussa yksittäismutanttien tarkastelun<br />
geneettiselläkin tasolla.<br />
Halvaannuttavia simpukkatoksiineja tuottavat tietyt levälajit, joita simpukat<br />
käyttävät ravintonaan ja siten kontaminoituvat. Toksiineilla on sama<br />
perusrakenne, mutta neljä erilaista sivuryhmää, jotka aiheuttavat toksiinin<br />
ominaisuudet. Yhteensä rakenteita on ainakin 21 erilaista. Myrkyllisimpänä<br />
pidetään saksitoksiinia, joka on luokiteltu voimakkaana hermomyrkkynä<br />
bioterroriaseeksi. Nykyisin toksiinipitoisuus analysoidaan standardoitulla<br />
hiirimäärityksellä, jonka käyttöön liittyy mm. eettisiä ongelmia. Immunomäärityksellä<br />
analyysia voisi parantaa, mutta sen ongelmana ovat mm. vastaaineet,<br />
jotka eivät tunnista kaikkia eri toksiineja samalla affiniteetilla. Tämän<br />
vuoksi erikoistyön tarkoituksena olikin muokata Kunkelin kohdennetulla<br />
mutageneesimenetelmällä villityypin Fab-fragmenttia ristireaktiivisemmaksi eli<br />
useampaa kuin yhtä antigeenia hyvin tunnistavaksi. Mutanttien seulomiseen oli<br />
tarkoitus käyttää faaginäyttötekniikkaa.<br />
Työn tuloksena Fab-fragmentin hypoteettinen kolmiulotteinen rakenne selvitettiin<br />
homologiamallituksella ja toksiinin sitomiskohta paikallistettiin. Mallin avulla<br />
suunniteltiin mutaatiot, jotka on tarkoitus tehdä Kunkelin menetelmällä, mutta<br />
mutageneesia ei erikoistyön aikana ehditty toteuttaa. Faaginäytössä käytettävät<br />
kohdeantigeenjohdannaiset saatiin kuitenkin valmistettua ja karakterisoitua.<br />
Asiasanat: halvaannuttavat simpukkatoksiinit, Kunkel-mutageneesi, faaginäyttö
<strong>«</strong> 13 <strong>»</strong><br />
Kunkel-mutageneesin optimointi ja menetelmän hyödyntäminen vastaaineiden<br />
affiniteettimaturaatiossa<br />
Tanja Savukoski<br />
Ohjaajat: FM Eeva-Christine Brockmann ja FT Urpo Lamminmäki<br />
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA in vitro DIAGNOSTIIKKA<br />
Faaginäyttötekniikkaa on sovellettu paljon spesifisten sitojaproteiinien<br />
seulomiseen erilaisista rekombinanttivasta-ainekirjastoista. Tekniikalla voidaan<br />
kytkeä vasta-aineen genotyyppi ja fenotyyppi toisiinsa, mikä mahdollistaa halutun<br />
sitomisominaisuuden omaavan vasta-aineen geenien eristämisen seulonnan<br />
yhteydessä. Faaginäyttötekniikalla voidaan tehokkaasti seuloa 10 9 – 10 11 sitojaa<br />
sisältävä kirjasto, josta ei kuitenkaan aina saada tiettyihin sovelluksiin<br />
sitomisominaisuuksiltaan riittävän hyviä vasta-aineita. Primaarikirjastosta saatujen<br />
sitojien ominaisuuksia voidaankin selektion jälkeen muokata erilaisilla<br />
affiniteettimaturaatiomenetelmillä, joissa tyypillisesti vasta-aineisiin tehdään<br />
satunnaismutaatioita ja seulonta suoritetaan uudestaan olosuhteissa, jotka suosivat<br />
entistä korkea-affiniteettisempia sitojia.<br />
Kunkel-mutageneesi on yksi tapa tehdä satunnaismutaatioita kirjastoista<br />
eristettyihin sitojiin. Sen etuna on suuri transformaatiotehokkuus, mutta<br />
ongelmana on usein korkea mutatoimattomien kloonien aiheuttama tausta.<br />
Menetelmässä mutaation sisältävä fosforyloitu aluke hybridisoidaan templaattina<br />
käytettävään yksinauhaiseen uridinyloituun DNA:han. Templaatti monistetaan ja<br />
syntyvän juosteen päät liitetään yhteen ligaasilla. Tämän jälkeen tuote<br />
transformoidaan E.coli ung+ -kantaan, jolloin in vitro -syntetisoitu juoste<br />
valikoituu solussa. Tässä työssä on tarkoitus vähentää taustaa optimoimalla<br />
menetelmää mm. pidentämällä aluketta DNA-polymeraasilla sekä käsittelemällä<br />
tuote erilaisilla entsyymeillä ennen transformaatiota.<br />
DNA-polymeraasireaktio on optimoitu tuottamaan riittävästi pidennettyä aluketta<br />
Kunkel-reaktioon. Pidennetty aluke näyttää vähentävän Kunkel-reaktiossa toisen<br />
juosteen syrjäytymisestä syntyvän epäspesifisen tuotteen määrää (engl. strand<br />
displaced). Alukkeen vaikutusta taustan määrään pitää vielä tutkia vertaamalla sitä<br />
vastaavaan lyhyellä alukkeella tehtyyn reaktioon. Lisäksi urasiili-DNA:n<br />
glykosylaasi (UDG)- ja metylaasikäsittelyt transformaatiota ennen vähentävät<br />
taustan määrää oleellisesti. Erikoistyöni aikana on tarkoitus vielä soveltaa<br />
optimoitua Kunkel-reaktiota vasta-ainekirjaston affiniteettimaturaatioon.<br />
Asiasanat: Faaginäyttötekniikka, Kunkel-mutageneesi, affiniteettimaturaatio
<strong>«</strong> 14 <strong>»</strong><br />
Pilkkoutuneen PSA:n immunomäärityksen parantaminen<br />
Kristiina Raunio<br />
Ohjaaja: FM Mari Peltola<br />
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA in vitro DIAGNOSTIIKKA<br />
Eturauhassyöpä on teollistuneissa maissa miesten yleisin syöpäsairaus.<br />
Eturauhasen epiteelisolujen erittämä seriiniproteaasi, prostata-spesifinen antigeeni<br />
(PSA), on tällä hetkellä paras ja eniten käytetty merkkiaine eturauhassyövän<br />
toteamiseksi. PSA:ta esiintyy kuitenkin verenkierrossa myös muissa eturauhasen<br />
sairauksissa kuten eturauhasen hyvänlaatuisessa liikakasvussa, ja tästä syystä<br />
pelkästään kohonnutta PSA-pitoisuutta ei voida yksinään pitää luotettavana<br />
merkkinä eturauhassyövästä.<br />
PSA:n tiedetään esiintyvän verenkierrossa sekä vapaana muotona että<br />
kompleksoituneena muiden proteiinien kanssa. Vapaa PSA voidaan jakaa kahteen<br />
ryhmään: sisäisesti pilkkoutuneeseen muotoon sekä sisäisesti pilkkoutumattomaan,<br />
intaktiin muotoon. Viimeaikaisissa tutkimuksissa onkin keskitytty<br />
juuri näiden eri PSA-muotojen mahdolliseen käyttöön eturauhassyövän<br />
tarkemassa diagnosoinnissa.<br />
Erikoistyön tavoitteena oli parantaa intaktin PSA:n tunnistavan rekombinanttisen<br />
4D4-vasta-ainefragmentin affiniteettia hyödyntämällä ohjattua evoluutiota. Tätä<br />
tarkoitusta varten 4D4-Fab-fragmentin raskaan ketjun vaihtelevalle (VH) alueelle<br />
tuotettiin sattumanvaraisia mutaatioita virhealttiilla <strong>PCR</strong>-reaktiolla. Valmis vastaainekirjasto<br />
oli tarkoitus seuloa faaginäyttötekniikalla.<br />
Työssä tuotettiin mutantti-4D4-Fab-fragmenttikirjasto pAK100- ja pIXpAK100fagemidivektoreissa,<br />
joissa rekombinanttiproteiini fuusioituu joko vaihtoehtoisesti<br />
filamenttifaagin p3- (pAK100) tai p9-kuoriproteiiniin (pIXpAK100). Sitojakirjaston<br />
mutaatiofrekvenssin keskiarvoksi saatiin 4 nukleotidimuutosta/VH-alue.<br />
pAK100-fagemidivektorissa tuotetun vasta-ainekirjaston laajuudeksi määritettiin<br />
2,9 x 10 7 kloonia ja vastaavasti pIXpAK100-fagemidivektorissa 2,5 x 10 7 kloonia.<br />
Kirjaston diversiteettiä voidaan pitää varsin riittävänä potentiaalisten sitojien<br />
kartoittamiseen. Vasta-ainekirjaston seulontaa ei ole vielä ehditty aloittaa. Tämän<br />
vuoksi onkin vielä epäselvää, pystytäänkö parhaita sitojia rikastamalla löytämään<br />
affiniteetiltaan villityyppiä parempi mutantti-4D4-Fab-fragmentti, jolla olisi yhä<br />
kyky tunnistaa spesifisesti intakti-PSA.<br />
Asiasanat: PSA, Eturauhassyöpä, virhealtis <strong>PCR</strong>, faaginäyttötekniikka
<strong>«</strong> 15 <strong>»</strong><br />
Rekombinantti-kystatiini C:n katepsiinikompleksit<br />
Päivikki Alatalo<br />
Ohjaajat: FT Jukka Hellman, FM Noora Ristiniemi ja Prof. Kim Pettersson<br />
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA in vitro DIAGNOSTIIKKA<br />
Kystatiini C on pienimolekyylinen (13,4 kDa) kysteiiniproteaasien inhibiittori,<br />
jota on kaikissa kehon nesteissä. Sen pääasiallisena tehtävänä on säädellä<br />
kuolleista soluista vapautuvien ja sairaiden solujen erittämien lysosomaalisten<br />
kysteiiniproteaasien aktiivisuutta. Aktiivisuuden kasvun ja proteaasi–inhibiittoritasapainon<br />
häiriöiden on osoitettu liittyvän moniin sairauksiin, mahdollisesti myös<br />
MS-tautiin, jonka toteamiseksi ei vielä ole yksinkertaista ja luotettavaa testiä.<br />
Lisäksi kystatiini C:n lyhentynyttä muotoa (12,5 kDa) on tutkittu MS-taudin<br />
merkkiaineena, mutta myös aivoselkäydinnestenäytteiden säilytyksen sivutuotteena.<br />
Työn tavoitteena oli tuottaa ja puhdistaa kystatiini C:tä ja vertailla<br />
vasta-aineiden kykyä tunnistaa proteiinin eri muotoja sekä kehittää immuno<strong>määritys</strong><br />
kystatiini C:n ja kysteiiniproteaaseihin kuuluvien katepsiinien B ja L<br />
komplekseille.<br />
Kystatiini C:tä tuotettiin Escherichia coli -bakteerissa sen kodonin käytön suhteen<br />
optimoidusta geenistä. Puhdistus suoritettiin affiniteettikromatografian avulla<br />
hyödyntäen vektorista proteiiniin tuottunutta kuuden histidiinin häntää. Jatkopuhdistus<br />
ja muotojen erottelu toteutettiin anioninvaihtokromatografialla pH:ssa<br />
9,8. Yhdeksän monoklonaalisen kystatiini C -vasta-aineen muotospesifisyyttä<br />
tarkasteltiin heterogeenisillä immunomäärityksillä, joissa kystatiini C kiinnitettiin<br />
biotinyloidulla ja havainnoitiin europium-leimatulla vasta-aineella. Lopuksi<br />
selvitettiin kystatiini C -vasta-aineiden sekä yhden katepsiini B ja yhden katepsiini<br />
L -vasta-aineen kyky tunnistaa katepsiineista ja europium-leimatusta kystatiini<br />
C:stä muodostettuja komplekseja.<br />
Osa työn tavoitteista täyttyi, sillä kystatiini C tuottui hyvin ja 13,4 ja 12,5 kDa:n<br />
lopputuotteet olivat puhtaita. Muotojen erottuminen mahdollisti lisäksi vastaaineiden<br />
vertailun: tunnistusvoimakkuudessa havaittiin vaihtelua, mutta yksikään<br />
vasta-aineista ei tunnistanut vain toista muotoa. Sen sijaan kystatiini C – katepsiini<br />
B ja L -kompleksien immunomäärityksiä ei saatu toimimaan. Osoittautui, että<br />
kompleksien muodostuessa ainakin kystatiini C -vasta-aineiden tunnistamat<br />
epitoopit peittyivät tai muuntuivat, niin että sitoutuminen estyi. Työssä käytetyillä<br />
katepsiini B ja L -vasta-aineilla syynä saattoi olla myös heikko affiniteetti.<br />
Asiasanat: kystatiini C, katepsiini B, katepsiini L, kompleksi, vasta-aine
<strong>«</strong> 16 <strong>»</strong><br />
Fluoresenssienergiansiirtoon perustuva<br />
kolmileima<strong>määritys</strong> proteaasi-inhibiittorien tehoseulontaan<br />
Päivi Malmi<br />
Ohjaaja: FM Antti Valanne<br />
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA in vitro DIAGNOSTIIKKA<br />
Ohjelmoitu solukuolema eli apoptoosi on monisoluisten organismien tapa muun<br />
muassa poistaa elimistöstä vaurioituneita soluja ilman tulehdusvastetta.<br />
Apoptoottista reaktiotietä ohjaavat kysteiiniproteaasiperheeseen kuuluvat<br />
kaspaasit, joista keskeisin on kaspaasi 3. Suuri apoptoottinen aktiivisuus joissain<br />
sairauksissa ja aivovammoissa on haitallista, ja siksi kaspaasi-inhibiittorit ovat<br />
kiinnostavia kohteita lääketeollisuudelle.<br />
Erikoistyön tavoitteena oli kehittää fluoresenssiresonanssienergiansiirtoon<br />
perustuva homogeeninen <strong>määritys</strong> kaspaasi 3 -entsyymin inhibiittorien<br />
tehoseulontaan. Fluoresenssienergiansiirrossa donorina käytettiin pitkän<br />
fluoresenssieliniän omaavia europium(III)-nanopartikkeleja, jotka oli päällystetty<br />
streptavidiinilla. Akseptorina työssä oli biotinyloitu kaspaasi 3 -entsyymin<br />
substraattipeptidi, joka oli paikkaspesifisesti muokattu fluoresoivalla Alexa Fluor<br />
680 -värillä sekä BBQ-650-vaimentajaleimalla (bio-C[Alexa680]DEVDK-[BBQ-<br />
650]). Nanopartikkelit ja substraattipeptidi sitoutuvat toisiinsa biotiinin ja<br />
streptavidiinin vuorovaikutuksesta. Kun inhibiittoria ei ole määrityksessä läsnä,<br />
kaspaasientsyymi pilkkoo substraatti-peptidin ja vapauttaa BBQ-650-leiman<br />
liuokseen. Europiumia viritettäessä (340 nm) energia siirtyy virittäen lähellä<br />
olevan Alexa Fluor 680 -värin, jonka emissio voidaan mitata aikaerotteisesti 730<br />
nm:ssä. Mikäli määrityksessä on läsnä entsyymiä inhiboiva yhdiste,<br />
substraattipeptidi ei pilkkoudu ja Alexa Fluor 680- ja BBQ-650-leimat pysyvät<br />
lähellä toisiaan. Europiumia viritettäessä energia siirtyy Alexa Fluor 680 -värille,<br />
jonka emissiota 730 nm:ssä ei havaita BBQ-650-vaimentajan vaikutuksesta.<br />
Erikoistyössä onnistuttiin kehittämään fluoresenssiresonanssienergiansiirtoon<br />
perustuva kolmileima<strong>määritys</strong>, jossa inhibiittorin (Z-DEVD-FMK) määrän<br />
kasvaessa mitattavan fluoresenssin määrä pieneni. Määrityksen avulla pystyttiin<br />
havaitsemaan parhaimmillaan alle pikomoolin määriä inhibiittoria IC50-arvon<br />
ollessa 12 nM. Määrityksen suorituskykyä ja soveltuvuutta tehoseulontaan<br />
voidaan edelleen parantaa muuttamalla substraatin leimakombinaatioita.<br />
Asiasanat: fluoresenssiresonanssienergiansiirto, homogeeninen <strong>määritys</strong>, Eunanopartikkelit,<br />
kaspaasi 3, tehoseulonta
<strong>«</strong> 17 <strong>»</strong><br />
Up-konvertoivat fosforit ja vasta-ainefragmentit homogeenisessa<br />
immunomäärityksessä<br />
Johanna Vuojola<br />
Ohjaajat: FT Tero Soukka ja FM Terhi Rantanen<br />
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA in vitro DIAGNOSTIIKKA<br />
Vasta-aineiden kykyä tunnistaa kohteensa spesifisesti hyödynnetään yleisesti<br />
diagnostisissa määrityksissä. Kokonaisia vasta-aineita voidaan edelleen parantaa<br />
geneettisen muokkauksen avulla tuottamalla rekombinanttisia vastaainefragmentteja,<br />
joista varteenotettavimpia ovat Fab- ja scFv-fragmentit. Näiden<br />
pieni koko saattaa olla hyödyksi esimerkiksi fluoresenssin resonanssienergiansiirtoa<br />
(FRET) hyödyntävissä määrityksissä, joissa luovuttaja- ja<br />
vastaanottajaleiman välisen etäisyyden on oltava lyhyt. Erikoistyön tavoitteena oli<br />
pystyttää FRETiin perustuva homogeeninen eli erotusvapaa immuno<strong>määritys</strong><br />
mallianalyyttinä toimineelle TSH-hormonille. Erikoistyössä tutkittiin lisäksi, onko<br />
pienemmistä sitojamolekyyleistä, kuten vasta-ainefragmenteista, todellista etua<br />
määrityksissä.<br />
Tässä työssä TSH:n tunnistavia kokonaisia vasta-aineita sekä näistä muokattuja<br />
Fab- ja scFv-fragmentteja konjugoitiin up-konvertoiviin fosforipartikkeleihin. Upkonvertoivat<br />
fosforit ovat uudenlaisia epäorgaanisia merkkiaineita, joilla on<br />
ainutlaatuinen kyky virittyä matalaenergisillä infrapuna-aallonpituuksilla, mutta<br />
joiden viritystila purkautuu korkeampienergisillä näkyvän valon aallonpituuksilla.<br />
Valmistettuja konjugaatteja käytettiin sekä ei-kilpailevassa että kilpailevassa<br />
FRETiin perustuvassa homogeenisessa määrityksessä, jossa luovuttajana toimi upkonvertoiva<br />
fosforipartikkeli. Vastaanottajana ei-kilpailevassa konseptissa toimi<br />
Alexa Fluor 680 -pienmolekyylivärillä leimattu TSH-vasta-aine ja kilpailevassa<br />
konseptissa samalla värillä leimattu TSH.<br />
Työssä havaittiin, että luovuttajan ja vastaanottajan välinen etäisyys sekä<br />
fosforipartikkelien pinnoituskemia olivat <strong>määritys</strong>ten kannalta kriittisiä tekijöitä.<br />
Jotta ei-kilpailevan määrityksen suorituskyky oltaisiin saatu käyttökelpoiseksi,<br />
olisi partikkelien täytynyt olla pienempiä tai niiden sitomiskapasiteetin suurempi.<br />
Käytetyillä komponenteilla vasta-ainefragmenttien koosta saatava hyöty jäi näin<br />
ollen pieneksi. Kilpailevassa määrityksessä pienimmän taustasignaalin antaneet<br />
scFv-pintaiset fosforit toimivat parhaiten, vaikka niiden sitomiskapasiteetti jäi<br />
odotusten vastaisesti pienimmäksi.<br />
Asiasanat: Up-konvertoivat fosforit, vasta-ainefragmentit, homogeeninen<br />
immuno<strong>määritys</strong>, TSH
<strong>«</strong> 18 <strong>»</strong><br />
Entsyymiaktiivisuus<strong>määritys</strong> kokoverinäytteestä<br />
Marja-Leena Järvenpää<br />
Ohjaaja FT Tero Soukka<br />
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA in vitro DIAGNOSTIIKKA<br />
Kliinisesti tärkeiden kokoverinäytteiden käyttöä homogeenisissa<br />
fotoluminesenssiin perustuvissa määrityksissä rajoittavat veren autofluoresenssi ja<br />
voimakas absorptio UV- ja näkyvän valon aallonpituuksilla. Ongelmat voidaan<br />
ratkaista käyttämällä fluoresenssin resonanssienergiansiirrossa luovuttajaleimana<br />
epäorgaanisia up-konvertoivia fosforipartikkeleita (UPC-fosfori), joilla on<br />
ainutlaatuinen kyky virittyä matalaenergisellä infrapunavalolla ja emittoida<br />
korkeaenergisemmän vihreän (550 nm) tai punaisen (660 nm) valon alueella (anti-<br />
Stokes fotoluminesenssi). Koska biologinen materiaali ei up-konvertoi, voidaan<br />
vastaanottajaleiman signaali mitata ilman häiritsevää taustafluoresenssia eikä<br />
viritysvalon absorptiokaan ole ongelmana.<br />
Erikoistyön tavoitteena oli toteuttaa entsyymiaktiivisuutta kokoverestä mittaava<br />
malli<strong>määritys</strong> hyödyntämällä UPC-fosforeita ja niiden anti-Stokes fotoluminesenssin<br />
resonanssienergiansiirtoa. Endonukleaasientsyymin substraattina<br />
käytettiin 10 emäksen pituista oligonukleotidia, joka oli leimattu kolmella eri<br />
molekyylillä: 5’-päässä oli sekä biotiini että vastaanottajafluorofori ja 3’-päässä<br />
ei-fluoresoiva vaimentaja. Entsyymiaktiivisuus havaittiin sitomalla pilkkoutunut<br />
substraatti streptavidiinilla päällystetyn UPC-fosforin pintaan ja mittaamalla<br />
energiansiirron seurauksena virittyneen vastaanottajafluoroforin vaimentumaton<br />
emissio 730 nm:ssä samalla, kun fosforia viritettiin 980 nm:ssä.<br />
Entsyymiaktiivisuuden vaste nähtiin fluoroforin vaimentumattoman emission<br />
lisääntymisenä. Ehjän ja täysin pilkkoutuneen substraatin (2 nmol/L) signaalien<br />
suhde sekä puskurista että 20 % kokoverestä mitattuna oli noin 25. Signaalitaso oli<br />
kuitenkin korkeampi puskurissa kuin veressä. Tämä voi johtua veren punasolujen<br />
aiheuttamasta valon siroamisesta ja intensiteetin heikkenemisestä tai ympäristön<br />
vaikutuksesta käytetyn vastaanottajan fluoresenssiin. Edellä kuvatun<br />
kolmileimatun substraatin käyttäminen mahdollistaa entsyymiaktiivisuusmäärityksen<br />
toteuttamisen partikkeleilla, joiden emissiosta vain pieni osa voi<br />
osallistua energiansiirtoon. Määritys on aiemmin tehty europium-nanopartikkeleilla<br />
ja tässä työssä sen osoitettiin toimivan myös UPC-fosforeilla.<br />
Asiasanat: up-konvertoiva fosfori, entsyymiaktiivisuus, kokoveri
<strong>«</strong> 19 <strong>»</strong><br />
Arvojen vaikutus koulutetun arvioijaraadin suoriutumiseen<br />
Anne Rantala<br />
Ohjaajat: FM Pohjanheimo Terhi ja FT Sandell Mari<br />
ELINTARVIKEKEMIA<br />
Kuvailevat menetelmät ovat tehokkaita analyyttisia keinoja elintarvikkeiden<br />
aistittavien ominaisuuksien määrittämiseen. Elintarvikkeen aistittava laatu on<br />
tärkeä tuotteiden valintoihin vaikuttava tekijä. Aiempien tutkimusten mukaan<br />
myös ihmisten henkilökohtaiset arvot saattavat vaikuttaa elintarvikkeiden<br />
koettuun miellyttävyyteen tai valintaan. Arvoilla tarkoitetaan yleisesti yksilön<br />
tärkeänä pitämiä päämääriä sekä valintakäyttäytymistä ohjaavia periaatteita.<br />
Työssä tarkasteltiin henkilökohtaisten arvojen vaikutusta arvioijan suoriutumiseen<br />
aistinvaraiseen objektiiviseen arviointiin koulutetussa raadissa. Perinteisen<br />
sokkoarvioinnin lisäksi työssä tutkittiin tuoteryhmästä annetun informaation ja<br />
väittämien vaikutusta arviointituloksiin.<br />
Työssä koulutettiin kaksi esitestattua raatia määrittämään kvantitatiivisesti kahden<br />
eri tuoteryhmän, hyvinvointijuomat ja juotavat jogurtit, tärkeimmät aistittavat<br />
ominaisuudet sekä näytekohtaiset tuoteprofiilit. Hyvinvointijuomaraati (n= 30)<br />
muodosti koulutusjaksolla oman sanaston, jogurttiraati (n= 10) koulutettiin<br />
valmiin sanaston kautta. Jogurttiraadin suoriutumista verrattiin tutkimuksen aikana<br />
myös ammattilaisraadin suorittamiin arviointeihin. Koulutuksen lisäksi arvioijien<br />
arvotaustan vaikutusta tarkasteltiin Schwartzin universaalia, 45 väittämästä<br />
koostuvaa arvoteoriaa noudattaen.<br />
Tuoteprofiilin perusteella näytteiden ominaisuuksien voimakkuuksissa oli<br />
havaittavissa tilastollisesti merkitseviä eroja eli näytteet voitiin erotella toisistaan<br />
tutkittavien ominaisuuksien perusteella. Koulutetun jogurttiraadin arviointitulokset<br />
olivat yhdenmukaisia ammattilaisraadin tulosten kanssa. Tuoteinformaatio tai<br />
tuotteista esitetyt väittämät eivät vaikuttaneet merkittävästi profiiliin ja<br />
voimakkuusarviointeihin. Arvoteorian mukaan arvioijaraadin sisälle muodostettiin<br />
kolme arvoluokkaa: itseohjautuvuus, turvallisuus ja hyväntahtoisuus. Yhdessä<br />
arvotarkastelun kanssa suoritettu näytteiden profiilinmuodostus paljasti<br />
tilastollisesti merkitseviä eroja arvioinneissa eri arvoluokkien välillä kummassakin<br />
tuoteryhmässä. Näiden tulosten perusteella arvioijan henkilökohtaisilla arvoilla<br />
näyttäisi olevan vaikutusta ominaisuuksien voimakkuusarviointeihin.<br />
Asiasanat: kuvailevat menetelmät, arvot, Schwartzin arvoteoria
<strong>«</strong> 20 <strong>»</strong><br />
Prosessoinnin vaikutus mustaherukan aistittavaan laatuun<br />
Oskar Laaksonen<br />
Ohjaajat: FM Terhi Pohjanheimo, FT Katja Tiitinen ja Prof. Heikki Kallio<br />
ELINTARVIKEKEMIA<br />
Mustaherukka (Ribes nigrum) on terveellinen pensasmarja, jota käytetään<br />
esimerkiksi mehujen ja viinien raaka-aineena. Herukassa on paljon C-vitamiinia<br />
ja sen siementen rasvahappokoostumus on edullinen ihmiselle. Mustaherukka<br />
sisältää myös paljon erilaisia fenolisia yhdisteitä, kuten flavonoideja, joilla on<br />
terveyttä edistäviä vaikutuksia antioksidatiivisten ominaisuuksien ansiosta. Tämän<br />
työn tarkoituksena oli selvittää, miten mustaherukan prosessointi vaikuttaa sen<br />
aistittavaan makuun. Teollisuudessa mustaherukasta hyödynnetään pääasiassa<br />
vain mehua. Prosessoinnilla voitaisiin hyödyntää myös puristejäännöstä ja muita<br />
prosessoinnin tuotteita.<br />
Mustaherukasta puristettiin mehua ja puristejäännöstä uutettiin<br />
elintarvikekelpoisella etanolilla neljä kertaa. Uuttojen jälkeen etanoli haihdutettiin<br />
pois ja uutteet liuotettiin veteen. Eristettyjä näytteitä oli yhdeksän, joista jokaiselle<br />
muodostettiin makuprofiili kuvailevien menetelmien avulla. Arvioijia oli yhteensä<br />
15 ja heidät koulutettiin ennen varsinaisia arviointeja. Koulutuksen perusteella<br />
arvioitavat ominaisuudet olivat näytteiden kokonaisvoimakkuus, täyteläisyys,<br />
makeus, marjaisuus, happamuus, karvaus, kirpeys ja astringoivuus. Työ tehtiin<br />
aistittavan laadun laboratoriossa. Kuvailtuja ominaisuuksia arvioitiin janaasteikolla<br />
käyttämällä apuna vertailunäytteitä.<br />
Mehu erosi muista näytteistä tilastollisesti merkitsevästi (p < 0,05) karvautta ja<br />
astringoivuutta lukuun ottamatta kaikissa ominaisuuksissa ollen näissä<br />
voimakkain. Uutejäännös erosi muista tilastollisesti merkitsevästi (p < 0,05) ollen<br />
puolestaan heikoin vastaavissa ominaisuuksissa. Uuttokertoja lisäämällä<br />
arvioitujen makuominaisuuksien voimakkuus heikkenee. Puristejäännös ei eroa<br />
etanolilla käsitellystä puristejäännöksestä. Arviointien perusteella suurin osa<br />
mustaherukan mausta jää mehuun.<br />
Asiasanat: mustaherukka, aistinvarainen arviointi, etanoliuutto, fenoliset yhdisteet
<strong>«</strong> 21 <strong>»</strong><br />
Marjojen flavonoidien analysointi plasmasta HPLC-ESI-MS/MSmenetelmällä<br />
Henna-Maria Lehtonen<br />
Ohjaajat: FT Jukka-Pekka Suomela ja Prof. Heikki Kallio<br />
ELINTARVIKEKEMIA<br />
Marjat ovat pieniä pyöreitä pohjoisilla leveysasteilla menestyviä hedelmiä, joita<br />
pidetään yleisesti terveellisinä. Kiinnostus marjojen bioaktiivisten yhdisteiden<br />
sekä monien sairauksien välisiin vuorovaikutuksiin on kuitenkin noussut nykyisiin<br />
mittoihinsa vasta viime vuosina. Eräs bioaktiivisten yhdisteiden ryhmä on<br />
flavonoidit, joita marjoissa esiintyy huomattavia määriä. Marjojen flavonoidit<br />
toimivat sekä antioksidantteina että erilaisissa säätelytehtävissä. Flavonoidien<br />
terveysvaikutuksia on tutkittu runsaasti mm. in vitro-menetelmin. Kattavan<br />
käsityksen saamiseksi flavonoidien metaboliasta on kuitenkin siirryttävä yhä<br />
enenevissä määrin flavonoidien in vivo imeytymiseen ja reaktioihin keskittyvään<br />
tutkimukseen. Tämän erikoistyön tavoitteena oli kehittää herkkä ja selektiivinen<br />
nestekromatografiaan (HPLC) sekä tandemmassaspektrometriaan (MS/MS)<br />
perustuva menetelmä marjojen kuuden flavonoidien analysoimiseksi plasmasta.<br />
Erikoistyössä optimoitiin esikäsittely-, HPLC- sekä MS/MS-menetelmät neljän<br />
flavonolin (isoramnetiini, kversetiini, myrisetiini ja kemferoli) sekä kahden<br />
katekiinin ((+)-katekiini ja (-)-epikatekiini) yhtäaikaiseksi analysoimiseksi<br />
plasmasta. Lisäksi mainittujen flavonoidien pitoisuudet analysoitiin plasmasta<br />
neljästä pohjoisesta marjasta koostuvan marja-annoksen nauttimisen jälkeen.<br />
Isoramnetiinin, kversetiinin ja kemferolin kohdalla menetelmän herkkyys saatiin<br />
tasolle, joka luultavimmin mahdollistaa kvantitatiivisen analysoinnin myös<br />
pienemmillä plasman flavonoidipitoisuuksilla kuin mitä optimoinnissa käytettyjen<br />
postprandiaalisten näytteiden pitoisuudet olivat. Myrisetiini ja molempien<br />
katekiinien kvantitointirajat jäivät kuitenkin liian korkealle johtuen lähinnä<br />
intensiivisen tytärionin puuttumisesta käytetyissä ionisointiolosuhteissa, mikä<br />
vaikeutti MSMS-menetelmän optimointia. Plasman isoramnetiini- ja kversetiinipitoisuudet<br />
kasvoivat marjojen syönnin seurauksena, mutta muiden flavonoidien<br />
kohdalla selvää eroa ei ollut havaittavissa. Kemferolin kohdalla tämä johtunee sen<br />
rajallisesta esiintymisestä tutkittavissa marjoissa, muilla flavonoideilla liian<br />
korkeista kvantitointirajoista.<br />
Asiasanat: marjat, flavonoidit, massaspektrometria
<strong>«</strong> 22 <strong>»</strong><br />
Maitohappopitoisuuden määrittäminen ananas- ja omenatäysmehutiivisteistä<br />
Eija Isokangas<br />
Ohjaajat: Anal. H. Nurminen, FT E. Järvenpää ja Prof. R. Huopalahti<br />
ELINTARVIKEKEMIA<br />
Elintarvikkeita valmistavassa yrityksessä laadunvarmistuksen tärkeimpiin<br />
alueisiin kuuluu raaka-aineiden vastaanottotarkastus. Tarkastuksessa tutkitaan<br />
prosessointiin tulevien ainesten kemiallinen, fysikaalinen, mikrobiologinen ja<br />
aistinvarainen laatu. Marjat ja hedelmät pilaantuvat helposti happotoleranttien<br />
bakteerien, hiivojen ja homeiden vaikutuksesta. Mikrobien kasvu näkyy mm.<br />
maitohappopitoisuuden nousuna. Tämän työn tarkoituksena on valita Oy Marli<br />
Ab:n laboratorioon sopiva kvantitatiivinen maitohappopitoisuuden <strong>määritys</strong>menetelmä.<br />
Tässä työssä verrattiin kirjallisuudesta valitun menetelmän pohjalta muokattua<br />
HPLC-menetelmää ja entsymaattista A.I.J.N:n suosittelemaa D-/L-maitohappojen<br />
analyysimenetelmää. Aistittavaa laatua tutkittiin erotustestillä ja kuvailevalla<br />
menetelmällä. Ananastäysmehuun lisättiin kemiallisesti valmistettua maitohappoa<br />
tunnetut pitoisuudet ja analysoitiin molemmilla menetelmillä. Täysmehun<br />
sisältämä maitohappopitoisuus mitattiin nollanäytteenä. Pitoisuusaluella 0,1 – 0,5<br />
g/l HPLC:llä saatiin pienempi ero teoreettiseen määrään nähden kuin<br />
entsymaattisesti. Pitoisuusalueella 0,7 – 0,9 g/l tilanne oli päinvastoin.<br />
Aistinvaraisten testien perusteella luotiin sanasto vastaanottotarkastuskäyttöön.<br />
Nestekromatografinen menetelmä on käytössä miellyttävämpi, edullisempi<br />
käyttökustannuksiltaan ja aikaa säästävämpi kuin entsymaattinen menetelmä.<br />
Analysoijan muodostama epävarmuustekijä on suurempi entsymaattisessa kuin<br />
HPLC- menetelmässä. HPLC-analytiikka osoittautui toistettavaksi ja nopeaksi.<br />
Matriisin vaikutus menetelmän saantoon on merkittävä. Jatkossa on tarpeen<br />
kehittää näytteiden esikäsittelyä, ja siten eliminoida häiritseviä komponentteja.<br />
Aistinvaraisesti todettiin, että varsinainen kemiallisesti valmistetun maitohapon<br />
vaikutus aistittavaan laatuun oli olematon verrattuna mikrobien fermentoiman<br />
maitohappopitoisuuden nousun vaikutukseen aistittavassa laadussa. Ilmeisesti<br />
mikrobit tuottavat muita haihtuvia yhdisteitä, jotka tosiasiassa aiheuttavat<br />
aistittavien ominaisuuksien laadun heikkenemisen. Tätä olisi mielenkiintoista<br />
tutkia esim. HS-SPME-GC-menetelmällä. Laadunvarmistuksessa HPLCmenetelmän<br />
voi ottaa käyttöön, mutta eri raaka-aineille tulee määrittää matriisista<br />
johtuva epävarmuustekijä. Riitatapauksissa kannattaa näytteet analysoida<br />
molemmilla menetelmillä.<br />
Asiasanat: maitohappo, ananastäysmehutiiviste, analyysimenetelmävertailu
<strong>«</strong> 23 <strong>»</strong><br />
Sipulikasvien haihtuvien aromiyhdisteiden eristäminen ja tunnistaminen<br />
headspace/GC-MS-menetelmällä<br />
Lea Karppi<br />
Ohjaaja: Professori Heikki Kallio<br />
ELINTARVIKEKEMIA<br />
Työn kohteena on erikoistyön "Kepa- eli ruokasipulin (Allium cepa L.)<br />
rikkyhdisteet" analyysitulosten ja kirjallisuuden perusteella tutkia headspacetekniikkojen<br />
soveltuvuutta sipulikasvien aromikomponenttien analysoimiseen.<br />
Headspace-tekniikassa käytetään hyväksi elintarvikkeista vapautuvien aromiaineiden<br />
haihtuvuutta. Sipuleille on luonteenomaista "sipulimainen" ja jonkin<br />
verran "kaalimainen" aromi. Aromi muodostuu entsymaattisesti kun kasvin<br />
solukkoa rikotaan. Kaasufaasin aromiyhdisteiden pitoisuus on suhteessa<br />
näytteessä olleisiin prekursoreihin sekä entsyymireaktioon kuluneeseen aikaan.<br />
Erikoistyössä seurattiin staattisella headspace/GC-MS-menetelmällä viiden kepasipulilajikkeen<br />
aromin kehittymistä sadonkorjuusta yli 6 kuukauden varastoinnin<br />
loppuun. Tuoreen kepasipulin headspace-aromifaasin muodostumisen<br />
kokonaisajaksi valittiin 54 minuutia (37°C). Sipulihakkeen yläpuolelta kaasufaasista<br />
ruiskulla otettu näyte syötettiin on-column-injektiolaitteen kautta suoraan<br />
kapillaaripylvääseen, jonka alkupäässä oli kylmäloukku, johon analyytit<br />
kerääntyivät ennen kromatograafista ajoa. Analyysituloksia verrattiin muihin<br />
sipulitutkimuksiin.<br />
Headspace-tilasta tunnistettiin tioleja, aldehydejä, tioetikkahapon metyyli- ja<br />
propyyliestereitä, mono-, di- ja trisulfideja, joissa metyyli- ja pro(en)yyliryhmät ja<br />
rikkiä sisältäviä heterosyklisiä yhdisteitä. Sipulin lakrymaattoria (tiopropanaali-Soksidi)<br />
ei 54 minuutin aromin muodostuksen jälkeen löytynyt. Sipulilajikkeet<br />
erosivat toisistaan metyyliryhmän sisältävien disulfidien kokonaismäärien<br />
suhteen. Pro(en)yyliä sisältävistä disulfideista dipropyylidisulfidi oli runsain<br />
rikkiyhdiste kaikilla lajikkeilla. Kuuden kuukauden varastointiajan päätyttyä<br />
kaikkien tunnistettujen yhdisteiden kokonaissisältö, muilla lajikkeilla paitsi<br />
Jumbo-lajikkeella, oli suurempi kuin sadonkorjuun aikana. Tuoreella<br />
kepasipulilla, ruohosipulilla ja purjolla yhteisiä yhdisteitä olivat tioetikkahapon<br />
metyyli- ja propyyliesterit, 2-metyyli-2-pentenaali, dimetyylidisulfidi, metyyli-2propenyyli-disulfidi<br />
sekä metyyli-propyylidi- ja trisulfidit. Prop(en)yyliä<br />
sisältävistä disulfideista 1- ja 2- propenyyli-propyylidisulfidit ja 1propenyylipropyylitrisulfidi<br />
oli tuoreella, kuivatulla ja pakastetulla ruohosipulilla<br />
mutta ei purjolla.<br />
Asiasanat: Kapillaarikaasukromatografia, massaspektrometria, headspace-keräys,<br />
haihtuvat orgaaniset yhdisteet, sipulikasvit Amaryllidaceae (Liliaceae, Alliaceae)
Change language