Rapport de synthèse du Delvotest® BLF (DSM ... - NF VALIDATION

Anses
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Rapport de synthèse du Delvotest BLF (DSM,
Pays-Bas) dans le cadre de la marque NF Validation
Janvier 2013

RESUME
Etude préliminaire
Cette étude préliminaire a permis de comparer les performances de la méthode de référence
(méthode 2 boites) à la méthode alternative avec lecture visuelle.
La méthode alternative a donné des résultats très satisfaisants au regard des Limites Maximales de
Résidus (réglementation européenne) et en terme de spécificité.
L’étude a montré que la MA et la MR sont différentes. Toutefois, cela ne remet pas en cause les
performances de la MA, qui le plus souvent est plus sensible pour les béta-lactamines que la méthode
de référence. Le taux de faux-positifs de la MR et de la MA étaient de 0 et 2.1 % respectivement. Les
taux de faux-négatifs de la MA sont inférieurs à ceux de la MR (taux de 0 % et 11.4 % respectivement
à la concentration C3).
Les conclusions de cette étude préliminaire sont favorables à la poursuite du projet. La prochaine
étape proposée est donc l’organisation d’une étude collaborative.
Etude collaborative
MATERIAUX:
Le choix des concentrations a été fait à partir des Limites Maximales de Résidus et des résultats de la
phase 1 de l‘étude préliminaire (sensibilités de la méthode de référence et de la méthode alternative).
Antibiotique Amoxicilline Cloxacilline Cefalonium TTC Néomycine Spiramycine
‘Blanc’ ‘Blanc’ ‘Blanc’ 50000 50000 50000
1 10 0.5
4 30 2
6 120 20
Conce
ntratio
ns
(µg/l)
Chaque matériau a été préparé, codifié et envoyé en double aveugle, soit 30 échantillons à
analyser par laboratoire. En plus des échantillons, un témoin négatif lait de vache a été fourni aux
laboratoires participants pour faciliter la lecture.
RESULTATS :
D’une façon générale on retrouve les mêmes types de résultats que lors de l’étude préliminaire en
termes de niveau de détection. Les résultats de l’étude collaborative sont très satisfaisants. Les
résultats bruts des laboratoires ont été analysés, en plus de ceux du laboratoire expert.
Les résultats du laboratoire expert avec la méthode alternative sont très satisfaisants :
a. 6 échantillons blancs sur 6 sont bien négatifs (12 résultats sur 12),
b. 6 échantillons supplémentés avec d’autres familles d’antibiotiques sur 6 sont bien négatifs,
c. En dessous du seuil de détection supposé (L1), 12 résultats sur 12 sont négatifs,
d. Au seuil de détection supposé (L2), tous les échantillons d’amoxicilline et cloxacilline sont
positifs et les 4 échantillons de cefalonium sont négatifs (1/10 LMR),
e. En dessus du seuil de détection supposé, tous les échantillons sont positifs (12 sur 12).
Les résultats des laboratoires participants avec la méthode alternative sont aussi très satisfaisants :

La spécificité est très satisfaisante (100 %) que ce soit le pour les échantillons blancs (exempts de
résidus de béta-lactamines) et pour les échantillons supplémentés avec des antibiotiques d’autres
familles.
Lors de l’étude préliminaire, 3 résultats faux-positifs avaient été reportés. Deux hypothèses avaient
été faites pour expliquer ces faux-positifs :
− soit une contamination croisée des ampoules,
− soit une agitation insuffisante à l’étape 5 du protocole fournisseur.
Lors de l’étude collaborative, aucun résultat faux-positif n’a été reporté pour les blancs et pour les
échantillons supplémentés avec d’autres familles d’antibiotiques, ni pour le laboratoire expert, ni pour
les laboratoires participants. Il n’y a donc pas de problème de contamination croisée. De plus, comme
la notice va être modifiée pour mettre en évidence cette étape critique, la question des résultats faux-
positifs ne se pose plus.
La sensibilité au niveau L3 est très satisfaisante (100 %). Au niveau L2 qui se situe autour de la limite
de sensibilité du test, on a plus de variabilité ce qui est logique. La sensibilité est de 47.7 % en
moyenne pour les 3 béta-lactamines, avec une sensibilité de 100 % pour l’amoxicilline à la LMR = 4
ppb, 43.2 % pour la cloxacilline à la LMR = 30 ppb et 0 % pour le cefalonium à 2 ppb (LMR = 20 ppb).
Les résultats en termes de répétabilité et de reproductibilité sont très satisfaisants, avec des
pourcentages moyens de 96.7 % à 100 % % pour la répétabilité et de 56.8 % à 100 % pour la
reproductibilité.
En conclusion, le laboratoire expert recommande d’accorder la certification
AFNOR au kit Delvotest® BLF, pour le lait de vache.

SOMMAIRE
1. Objectifs ......................................................................................................................... 5
2. Description des méthodes ............................................................................................ 5
2.1. Description de la méthode alternative (MA) .......................................................... 5
2.2. Description de la méthode de référence ................................................................. 9
3. Synthèse bibliographique ........................................................................................... 11
4. Protocole de l’étude préliminaire ............................................................................... 11
4.1. Praticabilité du kit .................................................................................................. 11
4.2. Protocole de l’étude comparative de la méthode alternative et de la méthode de
référence .............................................................................................................................. 12
4.2.1. Limite de détection / taux de faux négatifs ...................................................... 13
4.2.2. Spécificité / taux de faux positifs ..................................................................... 14
5. Résultats de l’étude préliminaire ................................................................................ 15
5.1. Praticabilité du kit Delvotest® BLF ..................................................................... 15
5.2. Etude comparative de la méthode alternative et de la méthode de référence .. 15
5.2.1. Limites de détection ......................................................................................... 15
5.2.2. Taux de faux négatifs / Spécificité / Taux de faux positifs .............................. 16
5.2.3. Exactitude relative ............................................................................................ 18
6. Protocole de l’étude collaborative .............................................................................. 20
6.1. Planning de l’étude ................................................................................................. 20
- La partie préparation des matériaux a été réalisée semaine 20 (14/05/2012). ......... 20
- Etude d’homogénéité avec la méthode de référence et contrôle des 30
échantillons avec la méthode alternative et la méthode référence en parallèle (15 et
16/05/2012). .......................................................................................................................... 20
6.2. Préparation et envoi des matériaux ...................................................................... 21
6.2.1. 4.1. Préparation des matériaux ......................................................................... 21
6.2.2. Stabilité et homogénéité des matériaux ............................................................ 21
6.2.3. Codification des échantillons ........................................................................... 22
6.2.4. Laboratoires collaborateurs .............................................................................. 22
7. Résultats de l’étude collaborative .............................................................................. 23
7.1. Résultats du laboratoire expert ............................................................................. 23
7.2. Résultats des laboratoires participants ................................................................ 26
7.3. Analyse des résultats .............................................................................................. 26
7.3.1. Pourcentage de résultats positifs ...................................................................... 26
7.3.2. Répétabilité des résultats .................................................................................. 30
7.3.3. Reproductibilité ................................................................................................ 33
8. Conclusions ................................................................................................................. 35
9. Références bibliographiques ...................................................................................... 36

1. Objectifs
Il s’agit d’une demande de validation dans le cadre de la marque NF Validation du kit Delvotest BLF
qui est commercialisé par la société DSM (Pays-Bas) pour la détection des résidus de béta-
lacatmines dans le lait.
Le champ de cette validation sera le lait de vache.
Le Delvotest® BLF se présente sous un format bandelettes et la validation portera sur la lecture
visuelle uniquement.
2. Description des méthodes
2.1. Description de la méthode alternative (MA)
Le Delvotest® BLF est un test rapide pour la détection des résidus de béta-lactamines (pénicillines et
céphalosporines) dans le lait de vache. C’est un test spécifique qui permet de détecter les béta-
lactamines couramment utilisés pour le lait en moins de 6 minutes.
PRINCIPE
Le Delvotest® BLF est basé sur l’utilisation d’un récepteur spécifique des béta-lactamines qui est
contenu dans l’ampoule. Ce lyophilisat va être dissous en présence de l’échantillon de lait. Puis le lait
va migrer sur la bandelette qui comporte deux lignes de capture.
La ligne contrôle (supérieure) sert de référence et doit toujours apparaitre pour que le test soit valide.
La ligne test (inférieure) va apparaitre totalement si l’échantillon ne contient pas de résidus de béta-
lactamines. En présence d’un échantillon de lait contenant un résidu de béta-lactamines, l’antibiotique
va se lier au récepteur contenu dans l’ampoule. Ce complexe antibiotique-récepteur ne pourra se lier
à la bandelette. Donc la ligne test va diminuer d’intensité ou disparaitre totalement en fonction de la
quantité de résidus.
METHODE
Le Delvotest® BLF est composé d’ampoules et de bandelettes qui sont utilisés ensemble, ainsi qu’une
pipette jetable par test. Le Delvotest® BLF est disponible sous le format 100 tests.
Le Delvotest® BLF est d’une utilisation simple. Le lait est déposé dans des ampoules contenant un
récepteur spécifique de la famille des béta-lacatmines. Ensuite, il faut incuber les ampoules pendant 2
minutes à 64°C et insérer une bandelette. Après 3 minutes supplémentaires à 64°C, on peut lire le
résultat. .

Les différentes étapes sont les suivantes :
1. Sortir le flacon du réfrigérateur (4-8°C) et laisser revenir à température ambiante.
2. Détacher une ou plusieurs ampoules. Attention à ne pas endommager la feuille d’aluminium
sur les ampoules restantes. Perforer les ampoules avec précaution.
3. Prendre une pipette neuve pour chaque échantillon de lait. Ne pas réutiliser les pipettes. Ne
pas toucher l’embout qui sera en contact avec le lait.
4. Presser le petit bulbe du haut de la pipette une fois, maintenir la pression. Plonger la pipette
environ 1 cm dans le lait. Relâcher la pression sur le bulbe. La pipette va prélever le volume
approprié (0.15 ml). Note : après le pipettage, le petit surplus de lait est capturé dans le
réservoir de la pipette (petit bulbe en bas). Répéter le pipettage quand n’y a pas de lait dans le
réservoir.

5. Transférer les échantillons de lait en pressant doucement et totalement sur le même bulbe
du haut, en ajoutant le lait directement dans l’ampoule. Note : le petit suprlus de lait dans le
bulbe du bas va rester. Agiter 10 secondes.
6. Vérifier la température de l’incubateur (64°C ± 2°C). Mettre les ampoules dans l’incubateur.
Attendre 2 minutes.
Agiter 5 secondes.
7. Prendre une bandelette par la partie haute (partie verte). Refermer aussitôt le container des
bandelettes. Insérer une bandelette par ampoule.
8. Enlever la bandelette après 3 minutes et lire le résultat.

INTERPRETATION DES RESULTATS
Ligne Contrôle < ligne Test Négatif ;
Ligne Contrôle ≥ ligne Test Positif ;
Précautions d’emploi :
- Comme ce test est très sensible aux résidus de béta-lactamines, toute contamination avec
ces substances doit être évitée. Il est conseillé de se laver les mains et de les sécher
correctement avant de démarrer un essai. Utiliser une paillasse propre.
- Manipuler le test avec précaution pour ne pas endommager les bandelettes. Cela peut aussi
altérer la qualité du test pendant la lecture des résultats.
- Après avoir prélevé des bandelettes dans le container, il faut le refermer aussitôt et le stocker
à nouveau au réfrigérateur. En effet, l’humidité sur les bandelettes raccourcit leur date de
validité.
ORIGINALITE ET INTERET DE LA METHODE ALTERNATIVE
- Pas de manipulation de souches bactériennes.
- Simplicité d’utilisation et nombre d’échantillons analysés par jour supérieur.
- Meilleure standardisation avec un test du commerce et en limitant les étapes sur lesquelles
les variations inter-laboratoires peuvent jouer (épaisseur de la gélose…).
- Délai avant les résultats* : moins de 6 minutes au lieu de 3 heures environ.
*Depuis le traitement de l’échantillon jusqu’au rendu des résultats.
La sensibilité correspond à la concentration pour laquelle 95 % des échantillons analysés donnent n
résultats positifs.

Les limites de détection du Delvotest® BLF annoncées par le fournisseur DSM sont présentées dans
le tableau suivant par comparaison avec les Limites Maximales de Résidus (LMR) et en annexe 1 par
comparaison avec les LMRs et les sensibilités de la boite Bacillus stearothermophilus.
NB : ce tableau présentait une limite de détection erronée pour la cloxacilline. La limite de
détection de la cloxacilline est en fait de 50 ppb.
Pour déterminer ces limites de détection, le fournisseur a analysé 5 échantillons pour chaque
concentration et 6 concentrations par antibiotique (incluant 0 ppb).
2.2. Description de la méthode de référence
La méthode des 2 boites a pour objet la détection des résidus d’antibiotiques dans le lait. Elle était
utilisée par tous les laboratoires interprofessionnels laitiers jusqu’au 1 er juillet 2011 pour la
« confirmation » des échantillons de lait, dans le cadre du paiement à la qualité du lait. La méthode
des 2 boites a pour objet, à l'aide de 2 microorganismes sensibles (Bacillus stearothermophilus et
Bacillus subtilis), la mise en évidence de résidus de substances à activité antibiotique sans en

déterminer leur identité. Elle est applicable aux laits de vache, de brebis et de chèvre (lait cru ou traité
thermiquement).
Dans le cadre de cette certification, seule la boite Bacillus stearothermophilus présente un intérêt pour
la comparaison avec la méthode alternative (même si à présent elle a été remplacée par un test
commercial dans le cadre du paiement à la qualité du lait) car c’est la boite spécifique pour la
détection des béta-lactamines (même spécificité que la méthode alternative).
Note : pour une précédente certification, une autre méthode alternative spécifique des béta-
lactamines a été comparée à la méthode dite d’acidification et à la boite Bacillus stearothermophilus.
La méthode dite d’acidification est obsolète et n’est plus du tout utilisée à ce jour. Elle ne peut donc
être choisie pour la comparaison. Par contre, la comparaison avec la boite Bacillus
stearothermophilus reste d’actualité.
PRINCIPE
La détection des résidus de substances à activité antibiotique nécessite l'application d'une technique
de diffusion en gélose qui comporte :
- La préparation des boîtes de milieu nutritif ;
- La préparation des souches de microorganismes utilisées pour les tests ;
- L'ensemencement, par un microorganisme sensible aux substances à activité antibiotique, d'un
milieu nutritif solide coulé en boîte de Pétri.
Le dépôt d'un disque de papier filtre, imprégné de lait, à la surface du milieu ensemencé, suivi
d'une incubation à la température optimale de développement du microorganisme-test.
Les substances à activité antibiotique éventuellement présentes inhibent la croissance du
microorganisme-test : il en résulte la formation d'une zone d'inhibition autour du disque.
METHODE
Cette méthode requiert l'utilisation de Bacillus stearothermophilus.
Principales étapes :
- Agiter l’échantillon de lait de façon à bien mélanger la crème avec le lait.
- Introduire 2 ml de lait dans un tube à essai.
- Placer dans un bain d’eau réglé à 80°C pendant 10 minutes, le niveau du lait étant au moins 2
cm en dessous de celui de l’eau.
- Refroidir à température ambiante.
- Le témoin positif n’est pas soumis au chauffage à 80°C.
- A l’aide d’une pince, placer un disque de papier filtre à la surface d’une des boites.
- Immédiatement après, déposer 50 µl de lait à l’aide d’une pipette automatique sur le disque.
Placer un 2 e disque à un emplacement opposé sur la boite et déposer 50 µl du même lait.
Il est ainsi possible de déposer dans chacune des boîtes jusqu'à six disques, correspondant à 2
échantillons à examiner, à un disque imprégné de lait témoin négatif et un disque imprégné de lait
témoin positif, tous ces disques devant se situer à environ 1 cm de la périphérie de la boîte.

INTERPRETATION DES RESULTATS
A l’issue de l’incubation, les disques imprégnés de lait témoin positif doivent présenter des zones
d’inhibition 12 ± 1 mm de diamètre.
Pour les laits de vache, sont considérés comme positifs les échantillons de lait donnant des zones
d'inhibition dont le diamètre est au moins égal à 11 mm.
Il faut recommencer l'essai chaque fois que le résultat semble douteux (pour un même échantillon un
disque étant positif et l'autre négatif, colonies éparses dans la zone d'inhibition, contaminations, etc...).
Si le second résultat n'est pas considéré comme positif, le résultat douteux doit être considéré comme
négatif.
Conclusion
Sont considérés comme contenant des résidus de substances à activité antibiotique, les échantillons
trouvés positifs. La boite Bacillus stearothermophilus présente une sensibilité particulière pour les
béta-lactamines et les tétracyclines.
La méthode de référence (MR) a été validée suivant la réglementation européenne (décision
CE/2002/657) (Anonymous, 2002). Le taux de faux-positifs obtenu après analyse de 100 échantillons
de lait de vache a été de 0 % sur la boite Bacillus stearothermophilus sur le lait de vache.
Les capacités de détection (CCβ) déterminées lors de cette validation sont présentés en annexe 1
pour la boite Bacillus stearothermophilus, par comparaison avec les Limites Maximales de Résidus
(LMR) et le Delvotest® BLF.
3. Synthèse bibliographique
Le Delvotest BLF est commercialisé depuis 2012 seulement. Donc aucune référence bibliographique
n’a pu être trouvée sur ce test.
4. Protocole de l’étude préliminaire
4.1. Praticabilité du kit
Les données résultant de cette étude de praticabilité seront intégrées dans le rapport d'étude
préliminaire pour les critères 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 13. Il est à noter que le Laboratoire expert
utilisera le test pour des essais préliminaires, donc le rapport d’étude bénéficiera d’une expérience
importante concernant la praticabilité.
Les données résultant de cette étude de praticabilité seront intégrées :
dans le rapport d'étude préliminaire pour les critères 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 13,
dans le rapport d'étude collaborative pour les critères 7 et 10.

Critères de praticabilité du kit :
Critères à contrôler
1 Emballage
2 Volume des réactifs
3
4
5
6
7
8
Conditions de stockage (+
date de péremption)
Mode d’utilisation après la 1ère
utilisation
Equipement ou locaux
spécifiques
Réactifs prêts à l’emploi ou
réactifs à préparer (protocole)
Temps de formation d’un
technicien inexpérimenté
Temps réel de
manipulation/Flexibilité de la
technique en fonction du
nombre d’échantillons à
analyser,...
9 Délai avant les résultats
10
11
Type de qualification d’un
technicien
Etapes communes avec la
méthode de référence
Communication
sur le critère
Emballage ou
notice
Emballage ou
notice
Emballage ou
notice
Emballage ou
notice
Méthode de contrôle du critère
Vérification par le laboratoire expert
Vérification par le laboratoire expert
Vérification par le laboratoire expert
Vérification par le laboratoire expert
Notice Vérification par le laboratoire expert
Emballage ou
notice
Rapport
Rapport
Rapport et
attestation
Rapport
Vérification par le laboratoire expert
Mesurée par le laboratoire expert (moins d’un jour,
entre 1 jour et 1 semaine ou plus d’1 semaine)
(possibilité de se servir des durées mises en œuvre
par les laboratoires collaborateurs)
Temps de manipulation comparé à la méthode de
référence (inférieur, égal ou supérieur)
Vérification par le laboratoire expert
Précisé par le laboratoire expert par rapport au niveau
requis pour la méthode de référence (même niveau ou
niveau différent) (le laboratoire expert peut se servir
des données des laboratoires collaborateurs)
Attestation Vérification par le laboratoire expert
12 Si oui, traçabilité des résultats Notice Vérification par le laboratoire expert
13
Maintenance par le
laboratoire
Rapport Durée et fréquence
4.2. Protocole de l’étude comparative de la méthode alternative et
de la méthode de référence
Différents paramètres de performance pourront être déterminés grâce aux résultats de l’étude
préliminaire.
Le champ de cette validation sera le lait de vache.
Le lait de vache « blanc » (exempt de résidus d’antibiotiques) pourra être acheté à notre fournisseur
habituel (ferme Charrier, Javené) ou provenir de notre stock de matériaux blancs congelés.

4.2.1. Limite de détection / taux de faux négatifs
La limite de détection doit être définie par l’analyse de matériaux contaminés (artificiellement ou non)
avec des molécules à activité antibiotique à plusieurs niveaux de concentration.
Les échantillons à analyser avec la MA et la MR seront les mêmes (préparation unique, mais
analyses en double). Ensuite, tous les échantillons, préparées seront conservés à -20°C
pendant 4 semaines maximum.
Choix des antibiotiques:
Recommandations du référentiel :
Quand « le spectre d’action du kit est limité à une famille d’antibiotiques : la sensibilité
du kit sera déterminée pour 6 antibiotiques au minimum de cette famille, si elle en comporte au
moins 6. De plus une étude de spécificité basée sur d’autres familles d’antibiotiques complètera
cette étude. Pour cela, des matrices ‘blanches’ contenant des substances à activité antibiotique
issue d’autres familles seront analysées. »
« On peut aussi tenir compte pour le choix des antibiotiques de leur fréquence
d’utilisation en médecine vétérinaire ou de survenue sous la forme de résidus dans la matrice
concernée, si ces données sont connues. »
Usages en milieu vétérinaire
Le choix des antibiotiques pour cette validation est essentiellement basé sur les usages
vétérinaires pour les vaches laitières (voies intra-mammaire, intra-utérine, parentérale). Les
antibiotiques les plus utilisés et présentant le plus grand risque de contamination du lait sont la
pénicilline G, l’amoxicilline, l’oxacilline, la cloxacilline, les céphalosporines (cefalonium,
cefalexine, cefquinome), puis les tétracyclines, ainsi que les aminosides. C’est pourquoi nous
avons choisi de cibler la validation sur 7 béta-lactamines (minimum demandé = 6) et de
déterminer la spécificité pour une tétracycline (la tétracycline), un aminoglycoside (néomycine) et
un macrolide (spiramycine).
Propositions pour l’essai de validation :
Pour le lait de vache uniquement :
- 10 antibiotiques dont 7 beta-lactamines (4 pénicillines : (pénicilline G, amoxicilline,
oxacilline, cloxacilline) et 3 céphalosporines : cefquinome, cefalonium, cefalexine)
Chaque antibiotique choisi sera testé à 3 concentrations différentes (sauf les antibiotiques
non spécifiques).
− Antibiotiques non spécifiques : 1 par famille (tétracyclines (la TTC), macrolides
(spiramycine), aminoglycosides (néomycine).
A titre d’exemple, le premier niveau pourrait être le niveau théorique de détection. Le deuxième niveau
serait légèrement supérieur au niveau théorique de détection. Le troisième niveau serait une

concentration qui à priori devrait donner un résultat positif. Ce 3 e niveau pourrait correspondre à la
LMR si elle a été définie.
Le choix des concentrations a été basé sur les Limites Maximales de Résidus (LMR) des divers
antibiotiques dans la matrice d’intérêt et sur la sensibilité de la méthode de référence et celle
annoncée par le fournisseur de kits pour la méthode alternative.
Famille Antibiotique LMR lait (µg/l) Concentrations
Pénicillines
Céphalosporines
(µg/l)
Pénicilline G 4 1-4-6
Amoxicilline 4 1-4-6
Oxacilline 30 20-30-60
Cloxacilline 30 10-30-60
Cefquinome 20 7.5-20-300
Cefalonium 20 2-20-30
Cefalexine 100 20-100-200
Tétracyclines TTC 100 50000
Macrolides Spiramycine 200 50000
Aminosides Néomycine 1500 50000
Chaque concentration d’antibiotique sera préparée en 5 exemplaires.
Tous les échantillons seront codifiés afin de réaliser ultérieurement les analyses en aveugle.
Chaque échantillon (5 échantillons/antibiotique/concentration) sera analysé 1 fois par la
méthode alternative et 1 fois par la méthode de référence (MR), soit 7 antibiotiques * 3
concentrations * 5 réplicats + 3 antibiotiques * 5 = 120 échantillons avec MA et MR =240 analyses.
Au final 5 résultats seront obtenus par concentration d’antibiotique.
4.2.2. Spécificité / taux de faux positifs
- 20 échantillons de matrice blanche (lait de vache dépourvu de résidus d’antibiotiques ou
autres substances à activité antibactérienne) seront codifiés afin de réaliser ultérieurement les
analyses en double et en aveugle 1 fois par la méthode alternative et 1 fois par la méthode
de référence.
NB : L’absence de substances antibactériennes dans ces échantillons dits « blancs » sera démontrée
par le résultat négatif de la méthode de référence sur ces échantillons.
Un total de 160 échantillons devra être préparé.

5. Résultats de l’étude préliminaire
5.1. Praticabilité du kit Delvotest® BLF
Critères de praticabilité du kit : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13.
Critères à contrôler
1 Emballage
2 Volume des réactifs
3
4
5
6
7
8
Conditions de stockage (+
date de péremption)
Mode d’utilisation après la
1 ère utilisation
Equipement ou locaux
spécifiques
Réactifs prêts à l’emploi ou
réactifs à préparer (protocole)
Temps de formation d’un
technicien inexpérimenté
Temps réel de
manipulation/Flexibilité de la
technique en fonction du
nombre d’échantillons à
analyser,...
9 Délai avant les résultats
10
11
12
13
Type de qualification d’un
technicien
Etapes communes avec la
méthode de référence
Si oui, traçabilité des
résultats
Maintenance par le
laboratoire
Communication
sur le critère
Emballage ou
notice
Emballage ou
notice
Emballage ou
notice
Emballage ou
notice
Méthode de contrôle du critère
Boîte carton, notice d’utilisation en anglais, des exemples
de tests négatifs et positifs pour aide à la lecture des
résultats.
100 ampoules, 100 pipettes et 100 bandelettes.
Notice : stockage, à l’endroit, compris entre 4 et 8°C, à
l’abri de la lumière, protégé du gel. Date de péremption et
numéro de lot indiqués sur la boîte.
Notice : A stocker au frais (4 - 8°C). Protéger du gel.
Notice Incubateur DSM ou bain marie 64°C ± 2°C
Emballage ou
notice
Kit prêt à l’emploi.
Rapport 10 minutes.
Rapport
Rapport et
attestation
Rapport
Fonction du nombre d’échantillons :
Dépôt des échantillons dans les ampoules et des
bandelettes dans les ampoules.
Indépendant du nombre d’échantillons :
Temps de décongélation des échantillons.
Incubation à 64°C±2°C
Entre 10 et 20 minutes entre le début de la préparation et
les résultats suivant le nombre d’échantillons.
Qualification requise inférieure à la méthode de référence
(réactifs prêt à l’emploi)
Attestation Aucune
Notice
Saisie des résultats sous Excel. Dossier technique 12.ES
reprenant la date, le numéro de lot, la validité, témoins –.
Rapport Contrôle du bain marie ou de l’incubateur.
5.2. Etude comparative de la méthode alternative et de la méthode
de référence
5.2.1. Limites de détection
La limite de détection correspond à la concentration la plus basse qui donne un résultat positif
ou douteux pour chacun des 5 réplicats des essais.

Limites de détection
Famille Antibiotique MR MA LMR lait (µg/l)
Pénicillines Pénicilline G ≤ 6 ≤ 4 4
Amoxicilline > 6 ≤ 4 4
Oxacilline ≤ 30 ≤ 60 30
Cloxacilline ≤ 120 ≤ 30 30
Céphalosporines Cefquinome ≤ 7,5 ≤ 7,5 20
Cefalonium ≤ 30 ≤ 2 20
Cefalexine ≤ 100 ≤ 100 100
Pour 2 antibiotiques (cefquinome et cephalexine), les limites de détection de la MR sont équivalentes
à celle de la MA. Pour les 5 autres antibiotiques, les limites de détection de la MR sont supérieures à
celle de la MA, la MA est donc plus sensible. Les limites de détection de la MA sont inférieures ou
égales aux Limites Maximales de Résidus (LMR). Un seul antibiotique (oxacilline) a une limite de
détection de la MA supérieure à la LMR mais inférieure ou égale à 2*LMR. Pour la MR seulement 3
béta-lactamines (oxacilline, cefquinome et cephalexine) ont une LOD inférieure à la LMR.
5.2.2. Taux de faux négatifs / Spécificité / Taux de faux positifs
Le taux de faux négatifs correspond au nombre de résultats négatifs obtenus pour des
échantillons contaminés (artificiellement ou naturellement) divisé par le nombre total
d’échantillons négatifs (ce même nombre plus le nombre d’échantillons blancs donnant un
résultat négatif) et multiplié par 100.
La spécificité correspond à la probabilité que la méthode donnera un résultat négatif pour un
échantillon « réputé » négatif (échantillon reconnu exempt de substances à activité antibiotique ou
contaminé avec des substances qui ne sont pas détectées par cette méthode, si elle est spécifique
d’un antibiotique ou d’une famille).
Le taux de faux positifs correspond au nombre de résultats positifs obtenus pour des
échantillons blancs (exempts de substances à activité antibiotique) divisé par le nombre total
d’échantillons positifs (ce même nombre plus le nombre d’échantillons contaminés donnant un résultat
positif) et multiplié par 100.
Interprétation :
S’agissant d’une méthode alternative de dépistage, le taux qui doit être minimal est le taux de faux
négatifs, étant donné que les échantillons déclarés positifs (dont les faux positifs) doivent être
confirmés par une méthode physico-chimique pour identification et quantification.
Le tableau suivant résume l’ensemble des résultats en termes de taux de faux-négatifs, de taux de
faux-positifs et de spécificité.

MR MA
Taux de faux
négatifs 59,8 38,1
Spécificité 100% 98%
Taux de faux
positifs
0,0 2,1
Les taux de faux-positifs et la spécificité sont très satisfaisants, que ce soit pour la MR ou pour la MA.
Les 3 résultats faux-positifs en MA sont :
− soit dus à une contamination croisée d’une ampoule voisine par une béta-lactamine. On a eu
un résultat positif pour un échantillon supplémenté en tétracycline, un pour un échantillon
supplémenté en spiramycine et un blanc (le même blanc analysé en double a donné un
résultat négatif). Etant donné la forte sensibilité de la MA, il faut porter une grande attention
aux risques de contaminations croisées. Lors de l’étude collaborative, l’envoi d’échantillons
contenant ces antibiotiques et d’autres échantillons fortement concentrés sera réalisé afin de
vérifier la spécificité du test et de confirmer ou non ce risque potentiel de réactions croisées.
− soit dus à une agitation insuffisante de l’ampoule une fois le lait déposé (point 5 page 6 du
rapport). La notice d’utilisation va être modifiée par le fournisseur pour indiquer que cette étape
est un point critique auquel il faut porter une attention particulière. L’ampoule contenant le lait
doit être agitée jusqu’à ce que le lait de vienne rose. Sinon le récepteur n’est pas bien mélangé
et on a un risque de faux-positifs. Ceci ne remet pas en cause la performance du test mais doit
être mis en avant dans la notice d’utilisation.
Le taux de faux-négatifs de la MA est inférieur à celui de la MR. Toutefois, les taux de faux-négatifs calculés
ici sont élevés car ce calcul prend en compte la totalité des résultats faux-négatifs, y compris sur des
échantillons supplémentés à des concentrations choisies pour donner un résultat négatif (C1 au minimum).
Si on refait le même calcul à la concentration d’intérêt (la Limite Maximale de résidus) (C2), le taux de faux-
négatifs est beaucoup plus faible, surtout pour la MA.
Le tableau suivant présente les calculs des taux de faux-négatifs aux concentrations C2 et C3 et C2+C3.
MR MA
taux faux - à C3 11,4 0,0
taux faux - à C2 38,1 7,1
taux faux - à C2+C3 42,6 7,1
taux faux - à
C1+C2+C3 59,8 38,1
Pour la MR, le taux de faux-négatifs est de 11.4 % à la concentration 3 (la plus élevée). Pour la MA, le
taux de faux-négatifs à cette même concentration est de 0 %. A la concentration 2 (LMR), le taux de
faux-négatifs de la MA restent faible par rapport à la MR (7.1 % contre 38.1 %).

5.2.3. Exactitude relative
L’exactitude relative est déterminée à partir des résultats des essais uniquement sur les 7 matériaux
contaminés avec des béta-lactamines. Elle représente le niveau de correspondance entre la réponse
obtenue avec la MR et la réponse obtenue avec la MA sur les mêmes échantillons.
Rappel des définitions
Déviation positive : La méthode alternative présente une déviation positive si elle donne un résultat
positif tandis que la méthode de référence donne un résultat négatif.
Une déviation positive devient un résultat faux positif quand on prouve que le vrai résultat est négatif.
Une déviation positive devient un vrai résultat positif quand on prouve que le vrai résultat est positif.
Déviation négative : La méthode alternative présente une déviation négative si elle donne un résultat
négatif tandis que la méthode de référence donne un résultat positif. Une déviation négative devient
un résultat faux négatif quand on prouve que le vrai résultat est positif.
Sensibilité relative : Capacité de la méthode alternative à détecter l'analyte quand la méthode de
référence le détecte.
Spécificité relative : Capacité de la méthode alternative à ne pas détecter l'analyte quand la méthode
de référence ne le détecte pas.
Le tableau suivant présente les résultats obtenus :
Réponse Méthode de référence
Méthode alternative
positive (A+)
Méthode alternative
négative (A-)
positive (R+)
Accord positif +/+ (PA)
44
Déviation négative +/-
(ND) (A-/R+)
3
Méthode de référence
négative (R-)
Déviation positive -/+
(PD) (R-/A+)
37
Accord négatif -/- (NA)
Total
Total N+ = 47 N- = 58 N = 105
A partir de ce type de tableau, les paramètres suivants ont été calculés pour chaque format de la MA.
Exactitude relative: AC = (PA + NA)/N*100%
Spécificité relative: SP = (NA/N-)*100%
Sensibilité relative: SE = (PA/N+)*100%
Où : N = NA + PA + PD + ND : nombre total d’échantillons
PD)
N- est le nombre total d’échantillons négatifs obtenus avec la méthode de référence (NA +
N+ est le nombre total d’échantillons positifs échantillons obtenus avec la méthode de
référence (PA + ND)
Nombre de résultats discordants: Y = PD + ND
21
81
24

Les tableau suivant présente le résumé des résultats.
AC (%) N+ SE (%) N- SP (%) Y
MA 61,9 47 93,6 58 36,2 40
Calcul des intervalles de confiance (IC) (par rapport au nombre d'échantillons analysés) :
Les intervalles de confiance sont calculés pour chaque pourcentage p de AC, de SE et de SP et
associés au nombre d’échantillons soumis à l’essai.
- Si 10% < p < 90%, calculer l’intervalle de confiance bilatéral à 95% approximatif :
IC 95%) p 2 * racine [p(1-p)/n] avec n=N, N+, N- respectivement pour p (%) = AC, SE, SP.
- Si p 90%, calculer la Limite de confiance inférieure (Low Confidence Limit LCL) à 95%
(unilatéral) avec n N, N+, N- respectivement pour p (%) = AC, SE, SP. Dans ce cas utiliser
la table de la loi binomiale pour n= 20, 30, 40, 50, 60 (Annexe A du référentiel (2005)).
AC (%) IC 95% SE (%) LCL % SP (%) IC 95%
MA 61,9 9,5 93,6 89 36,2 12,6
La sensibilité relative (capacité de la méthode alternative à détecter l'analyte quand la méthode de
référence le détecte) est satisfaisante (94 %). Ce résultat est logique car la déviation négative (MA-
/MR+) est faible (ND= 3).
La spécificité relative (capacité de la méthode alternative à ne pas détecter l'analyte quand la méthode
de référence ne le détecte pas) est assez faible (36 %). En effet, ce calcul prend en compte la
déviation positive. Plus celle-ci augmente, plus la spécificité diminue. Or dans notre cas, la déviation
positive (PD=37) est forte car la MA est le plus souvent plus sensible que la MR. Il ne s’agit pas de
faux-positifs de la MA car ce sont bien des échantillons supplémentés.
L’exactitude relative (62%) Dans tous les cas, l’accord négatif était globalement satisfaisant. La
diminution de l’exactitude vient principalement de l’accord positif qui est parfois faible, en raison du
défaut de sensibilité de la MR par rapport à la MA pour certaines béta-lactamines (amoxicilline
principalement, mais aussi pénicilline, cloxacilline, cefquinome et cefalonium). Cela ne remet pas en
cause les performances de la MA, qui est conforme aux Limites Maximales de Résidus (LMR).
Examen des résultats discordants:
On va vérifier si les 2 méthodes pourraient être différentes pour le rapport sensibilité spécificité :
Quand Y > 22 (plus de 22 résultats discordants), on utilise le test de McNemar avec la
distribution de Chi deux pour 1 degré de liberté :
² = d²/Y, avec d= PD-ND et Y = PD + ND
Les 2 méthodes sont différentes pour < 0.05 (bilatéral) si ² > 3.841.
ND PD Y ² = d²/Y Différence
MA 3 37 40 28,9 Oui

Les 2 méthodes (MR et MA) sont différentes pour < 0.05 (bilatéral) car ² > 3.841.
Les 2 méthodes sont statistiquement différentes, mais cela ne remet pas en cause les performances
de la MA.
Pour conclure à l’équivalence des méthodes, il faut des déviations négatives et positives faibles. Dans
cette étude, le taux de déviation négative (la MA donne un résultat négatif tandis que la MR donne un
résultat positif) est en effet faible mais le taux de déviation positive (la MA donne un résultat positif
tandis que la MR donne un résultat négatif) sont élevés.
Or, une déviation positive élevée devient un vrai résultat positif dans le cas où l’on prouve que le vrai
résultat est positif. C’est le cas ici puisque l’on parle d’échantillons de lait contenant des résidus de
béta-lactamines (donc vrais positifs), parfois non détectés par la MR, mais détectés par la MA. Donc,
la différence entre MA et MR ne remet donc pas en question les performances de la MA. Ceci
s’explique logiquement car la MA est plus sensible que la MR pour les béta-lactamines en général.
Si on compare les sensibilités de la MA aux LMRs, la MA a des limites de détection inférieures ou
égales aux LMRs pour 6 béta-lactamines testées (pénicilline G, amoxicilline, cloxacilline, cefalonium,
cefquinome et cephalexine) et inférieure ou égale à 2 fois la LMR pour l’oxacilline. Pour 2
antibiotiques (cefquinome et cephalexine), les limites de détection de la MR sont équivalentes à celle
de la MA. Pour les 5 autres antibiotiques, les limites de détection de la MR sont supérieures à celle de
la MA, la MA est donc plus sensible.
6. Protocole de l’étude collaborative
6.1. Planning de l’étude
- La partie préparation des matériaux a été réalisée semaine 20 (14/05/2012).
- Etude d’homogénéité avec la méthode de référence et contrôle des 30 échantillons avec la
méthode alternative et la méthode référence en parallèle (15 et 16/05/2012).
Les études de stabilité se poursuivront pendant la période d'analyse des échantillons par les différents
laboratoires participants (jusqu’à la date limite de réception des résultats au minimum) (prévoir une
stabilité le 30/05/2012).
- Envoi des colis : 22 mai 2012 (semaine 21).
- Date limite pour les analyses : 25 mai 2012 (semaine 21).
- Date limite pour le retour des résultats : 29 mai 2012 (semaine 22).
- Analyse des résultats et réalisation du rapport : début juin 2012 (semaine 23).

6.2. Préparation et envoi des matériaux
6.2.1. 4.1. Préparation des matériaux
Des laits de vache blancs (exempts de résidus d’antibiotiques), ainsi que des laits supplémentés par
le laboratoire expert vont être utilisés pour préparer les matériaux envoyés aux participants.
Du lait de vache cru exempt de résidus d’antibiotiques provenant de la ferme Charrier a été utilisé
pour préparer les matériaux.
Avant toute supplémentation et après homogénéisation l’absence de résidus beta-lactamines a été
vérifiée dans le lait de vache par un test de dépistage rapide appelé beta-star®.
La préparation des échantillons s’est faite dans les meilleures conditions afin d’éviter la pollution des
échantillons ‘blancs’.
Ensuite des fractions de lait vont être supplémentées avec les différents antibiotiques aux différentes
concentrations.
Le choix des concentrations a été fait à partir des Limites Maximales de Résidus et des résultats de la
phase 1 de l‘étude préliminaire (sensibilités de la méthode de référence et de la méthode alternative).
Tableau 1. Choix des concentrations :
Antibiotique Amoxicilline Cloxacilline Cefalonium TTC Néomycine Spiramycine
‘Blanc’ ‘Blanc’ ‘Blanc’ 50000 50000 50000
1 10 0.5
4 30 2
6 120 20
Conce
ntratio
ns
(µg/l)
Chaque matériau a été préparé, codifié et envoyé en double aveugle, soit 30 échantillons à
analyser par laboratoire. En plus des échantillons, un témoin négatif lait de vache a été fourni aux
laboratoires participants pour faciliter la lecture.
Le transport et le stockage (à l’Anses et dans les laboratoires participants) a été réalisé dans les
meilleures conditions (échantillons congelés, transport dans la carboglace en 24 heures, stockage à –
20°C ± 3°C minimum avant et après l’envoi). L’accusé de réception des échantillons a permis de
connaître l’état des échantillons à l’arrivée. Tous les échantillons sont arrivés congelés dans les
laboratoires.
6.2.2. Stabilité et homogénéité des matériaux
Une étude de stabilité des matériaux a été réalisée préalablement à l’envoi des échantillons ainsi que
pendant la période d’analyses par les laboratoires collaborateurs et en fin de période afin de garantir
la stabilité des matériaux. Cette étude a été réalisée à l’Anses par le biais d’analyses avec la méthode
de référence (Bacillus stearothermophilus).
Ces études ont montré que les matériaux étaient suffisamment stables sur la période dévolue à
l’analyse (16 jours maximum).

De plus, une étude d'homogénéité a été entreprise pour chaque matériau supplémenté à la
concentration L3 pour les 3 béta-lactamines et pour les 3 autres antibiotiques (tétracycline, néomycine
et spiramycine), dans leur conditionnement final (6 matériaux). Pour chaque matériau, 10 flacons ont
été prélevés de façon aléatoire parmi l'ensemble des échantillons conservés à -20°C ± 3°C. Deux
prises d'essai ont été effectuées par flacon. Les 20 analyses ont été réalisées le même jour, par la
méthode de référence (Bacillus stearothermophilus). L'analyse statistique des données d'homogénéité
(mesures des diamètres des zones d'inhibition) a montré que tous les matériaux étaient homogènes.
6.2.3. Codification des échantillons
Les matériaux soumis à l'essai seront au nombre de 15 à raison de 2 échantillons par matériau, soit
30 échantillons par participant.
Afin de garantir des analyses en aveugle, les échantillons de lait de vache, les échantillons de lait de
vache étaient codifiés de 1 à 30.
Les échantillons devaient être comparés avec le témoin négatif vache. Pour cela, le témoin était
identifié.
Les participants n’ont pas été informés du contenu (antibiotiques choisis et concentrations) des
échantillons.
6.2.4. Laboratoires collaborateurs
12 laboratoires ont été choisis et sollicités pour participer à cette étude. Le laboratoire expert n’est pas
compté parmi ces laboratoires. Chaque laboratoire était identifié par un code (de 12.ES-AA à 12.ES-
AM).
Les laboratoires ont reçu avec le colis un courrier d’instructions), un accusé de réception, un
formulaire de résultats.
De plus, 2 instructions supplémentaires avaient été insérées dans le colis :
− Analyser les échantillons dans l’ordre croissant de 1 à 30,
− Prêter une attention particulière à l’étape 5 du protocole (agitation environ 10 secondes
jusqu’à ce que le lait soit rose.) qui peut représenter un point critique de la méthode
(risque de résultats faux-positifs). Cette recommandation sera ajoutée à la notice du
fournisseur.
Les mêmes instructions ont été respectées par le laboratoire expert.
Toutes les analyses devaient être effectuées en double (2 séries d’analyse distinctes) et en aveugle,
avec le Delvotest BLF uniquement, dans chacun des laboratoires collaborateurs.
Ils devaient impérativement analyser en plus des échantillons inconnus un témoin négatif (‘blanc’).

7. Résultats de l’étude collaborative
7.1. Résultats du laboratoire expert
Tableau 2. Résultats du laboratoire expert avec la méthode alternative.
Sample Code Delvotest® BLF
1st analysis 2 nd analysis
Negative control - -
2 - - Amoxicilline 1
8 + + Amoxicilline 4
12 + + Amoxicilline 6
19 - - Cloxacilline 10
26 + + Cloxacilline 30
27 + + Cloxacilline 120
15 - - Cefalonium 0.5
4 - - Cefalonium 2
9 + + Cefalonium 20
6 - - TTC 50000
14 - - Néomycine 50000
11 - - Spiramycine 50000
17 - - Amoxicilline 1
13 + + Amoxicilline 4
18 + + Amoxicilline 6
21 - - Cloxacilline 10
24 + + Cloxacilline 30
10 + + Cloxacilline 120
16 - - Cefalonium 0.5
20 - - Cefalonium 2
23 + + Cefalonium 20
1 - - TTC 50000
28 - - Néomycine 50000
29 - - Spiramycine 50000
3 - - Blanc
5 - - Blanc
25 - - Blanc
30 - - Blanc
7 - - Blanc
22 - - Blanc

Le laboratoire expert n’a obtenu aucun résultat faux positif pour les 2 séries d’analyses pour les 6
échantillons blancs, ainsi que pour les échantillons supplémentés avec d’autres familles
d’antibiotiques. La concentration L1 a été choisie pour donner des résultats négatifs ce qui a été
confirmé par le laboratoire expert (aucun positif). A la concentration L2 qui est autour de la limite de
sensibilité du test, le laboratoire expert a obtenu 2 résultats positifs (2 séries) pour l’amoxicilline et la
cloxacilline. Pour le cefalonium, la concentration L2 a donné 2 résultats négatifs. Comme c’est proche
de la limite de sensibilité, il ne s’agit pas de faux-négatifs. Le laboratoire expert n’a obtenu aucun
résultat faux négatif à la concentration L3 sachant que cette concentration était celle prévue pour
donner des résultats positifs.
Le tableau ci-dessous présente les résultats du laboratoire expert de manière synthétique (Nombre de
résultats positifs ou douteux sur 4 échantillons testés par antibiotique et par concentration) :
Tableau 2. Résumé du nombre de positifs du laboratoire expert avec la méthode alternative.
Antibiotique Amoxicilline Cloxacilline Cefalonium TTC Néomycine Spiramycine
L0 0 0 0
L1 0 0 0
L2 4 4 0
L3 4 4 4 0 0 0
Les résultats du laboratoire expert sont très satisfaisants :
a. 6 échantillons blancs sur 6 sont bien négatifs (12 résultats sur 12),
b. 6 échantillons supplémentés avec d’autres familles d’antibiotiques sur 6 sont bien
négatifs,
c. En dessous du seuil de détection supposé (L1), 12 résultats sur 12 sont négatifs,
d. Au seuil de détection supposé (L2), tous les échantillons d’amoxicilline et
cloxacilline sont positifs et les 4 échantillons de cefalonium sont négatifs,
e. En dessus du seuil de détection supposé, tous les échantillons sont positifs (12
sur 12).
Aucun résultat faux-positif n’a été reporté lors de cette étude collaborative. Donc il ne s’agissait pas
d’un problème de contamination croisée lors de l’étude préliminaire.
De plus, l’attention particulière portée à l’étape 5 a permis de lever le problème des résultats faux-
positifs. Comme la notice du fournisseur va être changée en ce sens, le problème des faux-positifs ne
se pose plus.

Tableau 4. Résultats du laboratoire expert avec la méthode de référence :
Bst
CODE
ECHANTILLONS Analyse 1 Analyse 2
T+ T- T+ T-
12/11,5 0/0 12,5/12 0/0
Amoxicilline 1 2 0 0 -
Amoxicilline 4 8 0 0 -
Amoxicilline 6 12 11 12 +
Cloxacilline 10 19 0 0 -
Cloxacilline 30 26 0 0 -
Cloxacilline 120 27 13,5 14 +
Cefalonium 0.5 15 0 0 -
Cefalonium 2 4 0 0 -
Cefalonium 20 9 0 0 -
TTC 50000 6 24 24 +
Néomycine 50000 14 15 15 +
Spiramycine 50000 11 16 16 +
Amoxicilline 1 17 0 0 -
Amoxicilline 4 13 0 0 -
Amoxicilline 6 18 11 11 +
Cloxacilline 10 21 0 0 -
Cloxacilline 30 24 0 0 -
Cloxacilline 120 10 13,5 14 +
Cefalonium 0.5 16 0 0 -
Cefalonium 2 20 0 0 -
Cefalonium 20 23 0 0 -
TTC 50000 1 23,5 24 +
Néomycine 50000 28 15 15 +
Spiramycine 50000 29 15 15,5 +
Blanc 3 0 0 -
Blanc 5 0 0 -
Blanc 25 0 0 -
Blanc 30 0 0 -
Blanc 7 0 0 -
Blanc 22 0 9,5 -
Les résultats chiffrés correspondent à des zones d’inhibition (en mm).
T+ : témoin positif ; T- : témoin négatif.
La colonne Conclusion représente la conclusion apportée sur l’échantillon (+ ou -) en fonction des
zones d’inhibition et des seuils de positivité de la méthode de référence.

Les résultats du laboratoire expert sont très satisfaisants :
a. 6 échantillons blancs sur 6 sont bien négatifs (12 résultats sur 12),
b. 6 échantillons supplémentés avec d’autres familles d’antibiotiques sur 6 sont positifs
comme cela avait été montré lors de l’étude préliminaire (la méthode de référence
n’est pas spécifique des béta-lactamines comme la méthode alternative pour des
concentrations aussi élevées d’autres familles d’antibiotiques (50000 ppb)),
c. En dessous du seuil de détection supposé (L1), 12 résultats sur 12 sont négatifs,
d. Au seuil de détection supposé (L2), 12 résultats sur 12 sont négatifs car la MR est
moins sensible pour les béta-lactamines que la MR,
e. En dessus du seuil de détection supposé, tous les échantillons d’amoxicilline et
cloxacilline sont positifs et les 4 échantillons de cefalonium sont négatifs.
NB : lors de l’étude préliminaire, la limite de détection du cefalonium avait été estimée autour de 30
ppb pour la MR. Ceci explique ces résultats négatifs à 20 ppb. Toutefois le laboratoire expert avait
choisi cette concentration en C3 car c’est la Limite Maximale de Résidu et car la MA peut détecter le
cephalonium à 20 ppb.
7.2. Résultats des laboratoires participants
Avant l’étude, des conditions d’élimination des résultats d’un laboratoire avaient été fixées par
l’Anses :
- le témoin négatif est détecté positif,
- mauvais état des échantillons à l’arrivée,
- problème de stockage chez le participant (ex. température trop élevée > -15°C)
Aucune de ces situations ne s’est présentée donc aucun laboratoire n’a été éliminé.
11 laboratoires sur 12 ont renvoyé des résultats. Donc l’analyse a été réalise sur 11 laboratoires.
7.3. Analyse des résultats
7.3.1. Pourcentage de résultats positifs

Tableau 5. Nombre de résultats positifs pour chaque matériau supplémenté et pour la totalité des laboratoires.
Lab
1ere
analyse
2e
analyse
Amoxicilline
0 1 4 6
1ere
analyse
2e
analyse
1ere
analyse
2e
analyse
1ere
analyse
2e
analyse
1ere
analyse
2e
analyse
1ere
analyse
2e
analyse
1ere
analyse
2e
analyse
1ere
analyse
AA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
AC 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
AD 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
AE 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
AF 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
AG 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
AH 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
AI 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
AK 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
AL 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
AN 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
Lab
1ere
analyse
2e
analyse
nb + L0 0 nb + L1 1
Cloxacilline
nb + L2 44 nb + L3 44
0 10 30 120
2e 1ere 2e 1ere 2e 1ere 2e 1ere 2e 1ere 2e 1ere 2e 1ere 2e
analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse
AA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
AC 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1
AD 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
AE 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
AF 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1
AG 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
AH 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1
AI 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1
AK 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
AL 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
AN 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
nb + L0 0 nb + L1 0
nb + L2 19 nb + L3 44

Lab
1ere
analyse
2e
analyse
Cefalonium
0 0,5 2 20
1ere
analyse
2e
analyse
1ere
analyse
2e
analyse
1ere
analyse
2e
analyse
1ere
analyse
2e
analyse
1ere
analyse
2e
analyse
1ere
analyse
2e
analyse
1ere
analyse
AA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
AC 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
AD 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
AE 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
AF 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
AG 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
AH 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
AI 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
AK 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
AL 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
AN 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
Lab
1ere
analyse
2e
analyse
nb + L0 0 nb + L1 0
TTC Néomycine Spiramycine
1ere
analyse
2e
analyse
1ere
analyse
2e
analyse
1ere
analyse
2e
analyse
1ere
analyse
2e
analyse
2e
analyse
nb + L2 0 nb + L3 44
1ere
analyse
AA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AC 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AD 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AE 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AF 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AG 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AH 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AI 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AK 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AL 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AN 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
nb + 0
2e
analyse
nb + 0 nb + 0

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Tableau 6. Pourcentage de spécificité (SP) et de sensibilité (SE) :
Nb de faux +
(L0+L1)
nb total de tous les
essais L0 et L1
FP 1
N- 264
SP (%) 99,6
Nb de faux + (L0) FP 0
nb total de tous les
essais L0
N- 132
SP (%) 100,0
Nb de faux + (L1) FP 1
nb total de tous les
essais L1
N- 132
SP (%) 99,2
nb de vrais positifs
nb total des essais
VP L2 63
L2 ou L3
respectivement
N+ L2 132
SE (%) Au
47,7
niveau L2
VP L3 132
N+ L3 132
SE (%) Au
niveau L3
100,0
Où :
le % de spécificité SP pour les niveaux L0 et L1 :
SP = (1-(FP/N-))*100 %
Où: N-: nombre total de tous les essais L0 et L1
FP : nombre de faux positifs
le % de sensibilité SE pour chaque niveau de contamination positif L2 et L3 à l’aide de
l’équation suivante :
SP = (VP/N+))*100 %
Où: N+: nombre total des essais L2 ou L3 respectivement
VP : nombre de vrais positifs
Conclusion : La spécificité est de 100 % au niveau L0. Au niveau Lo, on n’a aucun résultat faux-
positif. Un seul laboratoire (AI) a obtenu 1 résultat positif pour la 1 ère analyse d’un des 2
matériaux amoxiclline à 1 ppb (spécificité à 99.6 % à L0+L1).
De plus, les 132 échantillons supplémentés avec des antibiotiques autres que béta-lactamines
ont donné des résultats négatifs (132/132) (spécificité 100 %).
La sensibilité au niveau L3 est très satisfaisante (100 %).
Au niveau L2 qui se situe autour de la limite de sensibilité du test, on a plus de variabilité ce qui
est logique. La sensibilité est de 47.7 % en moyenne pour les 3 béta-lactamines, avec une
sensibilité de 100 % pour l’amoxicilline à la LMR = 4 ppb, 43.2 % pour la cloxacilline à la LMR =
30 ppb et 0 % pour le cefalonium à 2 ppb (LMR = 20 ppb).
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Aucun résultat faux-positif n’a été reporté lors de cette étude collaborative. Donc il ne s’agissait pas
d’un problème de contamination croisée lors de l’étude préliminaire.
De plus, l’attention particulière portée à l’étape 5 a permis de lever le problème des résultats faux-
positifs. Comme la notice du fournisseur va être changée en ce sens, le problème des faux-positifs ne
se pose plus.
7.3.2. Répétabilité des résultats
Les tableaux suivants présentent l’ensemble des résultats des laboratoires participants par matrice
(combiné espèce animale/antibiotique) en terme de répétabilité.
Tableau 7. Résultats de l’étude de répétabilité.
Blanc 6 blancs analysés en double (3 paires)
1ere analyse/2e analyse 1ere paire/2e paire
Lab
(Nombre d’analyses
identiques pour un même
échantillon / N)*100
(Nombre d’analyses identiques
pour 2 échantillons
identiques (paire) / N)*100
AA 6/6 6/6
AB 6/6 6/6
AC 6/6 6/6
AD 6/6 6/6
AE 6/6 6/6
AF 6/6 6/6
AG 6/6 6/6
AH 6/6 6/6
AI 6/6 6/6
AK 6/6 6/6
AL 6/6 6/6
AN 6/6 6/6
3 paires analysées en
double
Amoxicilline
Lab
(Nombre d’analyses
identiques pour un même
échantillon / N)*100
(Nombre d’analyses identiques
pour 2 échantillons
identiques (paire) / N)*100
AA 6/6 6/6
AB 6/6 6/6
AC 6/6 6/6
AD 6/6 6/6
AE 6/6 6/6
AF 6/6 6/6
AG 6/6 6/6
AH 6/6 6/6
AI 5/6 5/6
AK 6/6 6/6
AL 6/6 6/6
AN 6/6 6/6
Cloxacilline 3 paires analysées en
Rapport_étude préliminaire_20120510 Valérie Gaudin 30/37

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Lab
(Nombre d’analyses
identiques pour un même
échantillon / N)*100
double
(Nombre d’analyses identiques
pour 2 échantillons
identiques (paire) / N)*100
AA 6/6 6/6
AB 6/6 6/6
AC 6/6 6/6
AD 6/6 6/6
AE 6/6 6/6
AF 6/6 6/6
AG 6/6 6/6
AH 5/6 5/6
AI 6/6 6/6
AK 6/6 6/6
AL 6/6 6/6
AN 6/6 6/6
Cefalonium
TTC
Lab
(Nombre d’analyses
identiques pour un même
échantillon / N)*100
3 paires analysées en
double
(Nombre d’analyses identiques
pour 2 échantillons
identiques (paire) / N)*100
AA 6/6 6/6
AB 6/6 6/6
AC 6/6 6/6
AD 6/6 6/6
AE 6/6 6/6
AF 6/6 6/6
AG 6/6 6/6
AH 6/6 6/6
AI 6/6 6/6
AK 6/6 6/6
AL 6/6 6/6
AN 6/6 6/6
Lab
(Nombre d’analyses
identiques pour un même
échantillon / N)*100
1 paire analysée en double
(Nombre d’analyses identiques
pour 2 échantillons
identiques (paire) / N)*100
AA 2/2 2/2
AB 2/2 2/2
AC 2/2 2/2
AD 2/2 2/2
AE 2/2 2/2
AF 2/2 2/2
AG 2/2 2/2
AH 2/2 2/2
AI 2/2 2/2
AK 2/2 2/2
AL 2/2 2/2
AN 2/2 2/2
Néomycine 1 paire analysée en double
Rapport_étude préliminaire_20120510 Valérie Gaudin 31/37

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Lab
(Nombre d’analyses
identiques pour un même
échantillon / N)*100
(Nombre d’analyses identiques
pour 2 échantillons
identiques (paire) / N)*100
AA 2/2 2/2
AB 2/2 2/2
AC 2/2 2/2
AD 2/2 2/2
AE 2/2 2/2
AF 2/2 2/2
AG 2/2 2/2
AH 2/2 2/2
AI 2/2 2/2
AK 2/2 2/2
AL 2/2 2/2
AN 2/2 2/2
Spiramycine 1 paire analysée en double
Lab
(Nombre d’analyses
identiques pour un même
échantillon / N)*100
(Nombre d’analyses identiques
pour 2 échantillons
identiques (paire) / N)*100
AA 2/2 2/2
AB 2/2 2/2
AC 2/2 2/2
AD 2/2 2/2
AE 2/2 2/2
AF 2/2 2/2
AG 2/2 2/2
AH 2/2 2/2
AI 2/2 2/2
AK 2/2 2/2
AL 2/2 2/2
AN 2/2 2/2
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Le tableau suivant présente l’analyse globale des résultats de tous les participants en termes de
répétabilité et de façon globale.
Tableau 15. Analyse globale.
(Nombre d’analyses (Nombre d’analyses
identiques pour un identiques pour 2
même échantillon / échantillons identiques
Lab
N)*100
(paire) / N)*100
AA 100,0 100,0
AB 100,0 100,0
AC 100,0 100,0
AD 100,0 100,0
AE 100,0 100,0
AF 100,0 100,0
AG 100,0 100,0
AH 96,7 96,7
AI 96,7 96,7
AK 100,0 100,0
AL 100,0 100,0
AN 100,0 100,0
% moyen 99,4 99,4
Les résultats des laboratoires participants en termes de répétabilité sont très satisfaisants avec un
pourcentage moyen de 99.4 % pour un même échantillon et de 99.4 % pour 2 échantillons identiques
(paire).
Seules les laboratoires AH et AI ont eu une fois un résultat différent pour les 2 séries d’analyses pour
un même matériau (amoxicilline à 1 ppb et cloxacilline à 30 ppb), concentrations qui sont bien en
dessous ou autour de la sensibilité de la MA pour ces 2 béta-lactamines). Pour le 2 e matériau de la
paire, les 2 résultats ont été identiques.
7.3.3. Reproductibilité
Le tableau suivant présente l’analyse des résultats de tous les laboratoires participants en terme de
reproductibilité, par matériau (combinaison espèce animale/antibiotique) et de façon globale.
Rapport_étude préliminaire_20120510 Valérie Gaudin 33/37

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Tableau 18. Résultats de l’étude de reproductibilité.
N° de série (n° de
la paire)
Antibiotique (ou
témoin négatif)
Niveau de
contamination
Niveau de
contamination
Reproductibilité
(%)
1 Amoxicilline L1 1 97,7
2 Amoxicilline L2 4 100,0
3 Amoxicilline L3 6 100,0
4 Cloxacilline L1 10 100,0
5 Cloxacilline L2 30 56,8
6 Cloxacilline L3 120 100,0
7 Cefalonium L1 0.5 100,0
8 Cefalonium L2 2 100,0
9 Cefalonium L3 20 100,0
10 Blanc L0 100,0
11 Blanc L0 100,0
12 Blanc L0 100,0
13 TTC 50000 100,0
14 Néomycine 50000 100,0
15 Spiramycine 50000 100,0
Total
97,0
Les résultats des laboratoires participants en termes de reproductibilité sont très satisfaisants avec un
pourcentage moyen de 97.0 %. A la concentration L3 pour les 3 béta-lactamines, la reproductibilité est
toujours de 100 %. La reproductibilité la moins bonne a été observée pour la cloxacilline à 30 ppb (56,8
%) car c’est une concentration limite pour le test.
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8. Conclusions
En conclusion, cette étude préliminaire a permis de comparer les performances de la méthode de
référence à la méthode alternative avec lecture visuelle pour le lait de vache.
La méthode alternative a donné des résultats très satisfaisants au regard des Limites Maximales de
Résidus (réglementation européenne) et en terme de spécificité.
L’étude a montré que la MA et la MR sont différentes. Toutefois, cela ne remet pas en cause les
performances de la MA, qui le plus souvent est plus sensible pour les béta-lactamines que la méthode
de référence. Le taux de faux-positifs de la MR et de la MA étaient de 0 et 2.1 % respectivement. Les
taux de faux-négatifs de la MA sont inférieurs à ceux de la MR (taux de 0 % et 11.4 % respectivement à
la concentration C3).
Les conclusions de cette étude préliminaire sont favorables à la poursuite du projet. La prochaine étape
proposée est donc l’organisation d’une étude collaborative.
D’une façon générale, lors de l’étude collaborative, on retrouve les mêmes types de résultats que lors
de l’étude préliminaire en termes de niveau de détection. Les résultats de l’étude collaborative sont très
satisfaisants. Les résultats bruts des laboratoires ont été analysés, en plus de ceux du laboratoire
expert.
La spécificité est très satisfaisante (100 %) que ce soit le pour les échantillons blancs (exempts de
résidus de béta-lactamines) et pour les échantillons supplémentés avec des antibiotiques d’autres
familles.
Lors de l’étude préliminaire, 3 résultats faux-positifs avaient été reportés. Deux hypothèses avaient été
faites pour expliquer ces faux-positifs :
− soit une contamination croisée des ampoules,
− soit une agitation insuffisante à l’étape 5 du protocole fournisseur.
Lors de l’étude collaborative, aucun résultat faux-positif n’a été reporté pour les blancs et pour les
échantillons supplémentés avec d’autres familles d’antibiotiques, ni pour le laboratoire expert, ni pour
les laboratoires participants. Il n’y a donc pas de problème de contamination croisée. De plus, comme
la notice va être modifiée pour mettre en évidence cette étape critique, la question des résultats faux-
positifs ne se pose plus.
La sensibilité au niveau L3 est très satisfaisante (100 %). Au niveau L2 qui se situe autour de la limite
de sensibilité du test, on a plus de variabilité ce qui est logique. La sensibilité est de 47.7 % en
moyenne pour les 3 béta-lactamines, avec une sensibilité de 100 % pour l’amoxicilline à la LMR = 4
ppb, 43.2 % pour la cloxacilline à la LMR = 30 ppb et 0 % pour le cefalonium à 2 ppb (LMR = 20 ppb).
Les résultats en termes de répétabilité et de reproductibilité sont très satisfaisants, avec des
pourcentages moyens de 96.7 % à 100 % % pour la répétabilité et de 56.8 % à 100 % pour la
reproductibilité.
En conclusion, le laboratoire expert recommande d’accorder la certification
AFNOR au kit Delvotest® BLF, pour le lait de vache.
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9. Références bibliographiques
− Anonymous. 2002. Commission Decision 2002/ 657/EC of 12 August 2002 implementing
Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and
interpretation of results. . Off J Eur Comm. L. 221:8-36.
Rapport_étude préliminaire_20120510 Valérie Gaudin 36/37

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Annexe 1. Les limites de détection des 2 méthodes, comparées aux Limites Maximales de
Résidus (LMR) dans le lait :
PENICILLINES
CEPHALOSPORINES
*par le fournisseur
Antibiotiques
LMR Lait
(µg/l)
LOD annoncées pour
le Delvotest® BLF*
Bacillus
stearothermophilus
Benzylpénicilline 4 3 6
Ampicilline 4 5
Amoxicilline 4 3
Oxacilline 30 36
Cloxacilline 30 17 60
Dicloxacilline 30 24
Nafcilline 30 54
Cefquinome 20 11
Cefalexine 100 34
Ceftiofur* 100 4
Cefalonium 20 3 Entre 20 et 30
Cefacetril 125 **
Cefapirine 60 **