Evaluation de la qualité de la semence fraîche des boucs d ...

1.2. MESURE DE CONCENTRATION, MOTILITE
ET VIABILITE
Les échantillons étaient pesés pour déterminer le volume.
Pour estimer la concentration, 25 µl de semence étaient
dilués dans 5 ml de tri-Sodium citrate dehydrate 28,5 g/l
(C6H5Na3O7.2H2O ; Merck, VWR International BV,
Amsterdam, the Netherlands) et mélangés avec un vortex,
puis 2 ml étaient placés dans un photomètre ACCUELL
(IMV technologies, L’Aigle, France) pour mesurer la
concentration. La concentration obtenue multipliée par le
volume initial nous donnait le nombre total de cellules dans
l’éjaculat. La mobilité était évaluée après dilution de 10 µl
de semence dans 1 ml de tris-buffer et 10 µl de ce milieu
étaient déposés sur une lame chauffée (37°C) et recouverts
d’une lamelle chauffée, puis observés au microscope à
contraste de phase (100-200x). La note de viabilité était
attribuée par coloration à l’eosine-anilineblue (Aniline ;
Gurr BDH 34003 ; eosine gelblich ; Merck 15935) et
observation au microscope standard.
1.3. ANALYSE EN CYTOMETRIE DE FLUX DU %
DE SPERMATOZOÏDES VIVANT/MORT AVEC
COLORATION SYBR-14/PI
Le Kit LIVE/DEAD, combinant Sybergreen (Sybr-14), un
colorant permanent d’acide nucléique de membrane, avec du
Propidium Iodide (PI) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR,
USA), a été utilisé pour évaluer la viabilité de la semence
comme décrit par le fabricant. Les échantillons de semence
ont été dilués (1:10) dans du PBS-0 (Phosphate Buffered
Saline, pH 7,2, sans Calcium Chloride et Magnesium
Chloride ; Gibco, UK) avec 0,1% de PVE (Polyvinyl
Alcohol, Sigma, ST Lois, USA) ajouté au travers d’un filtre
en conditions stériles. Les cellules ont ensuite été analysées
en fluorescence verte et rouge par cytométrie de flux en
utlisant un FACScan équipé d’un laser à l’argon (Becton
Dickinson, San Jose, CA). Les capteurs de fluorescence
(FL 1= 580-605 nM and FL 3= 480-580 nM) ont été réglés
pour distinguer les cellules colorées en vert des cellules
colorées en rouge. Au total, 10 000 spermatozoïdes par
échantillon ont été analysés.
1.4. ANALYSE PAR CYTOMETRIE DE FLUX
DE L’INTEGRITE DES MEMBRANES
ET DES ACROSOMES DES SPERMATOZOÏDES
PAR COLORATION FITC-PNA/PI
Le Propidium Iodide (PI) (Molecular Probes, Inc., Eugene,
OR, USA) a été dilué (1:100) dans du PBS-0 (Phosphate
Buffered Saline, pH 7,2, sans Calcium Chloride et
Magnesium Chloride ; Gibco, UK) à une concentration
finale de 50 µg/ml. Cette solution-PI a ensuite été ajoutée
(4:1) à un Fluorescein Isothiocyanate conjugué à une
solution de peanut agglutinin (FITC-PNA) (EY
Laboratories, Inc., San Mateo, LA, USA) (100 µg/ml).
Après mélange, 25 µl de la solution FITC-PNA/PI a été
ajouté à 1 ml de semence diluée (1100 avec PBS-0 avec
0,1% PVE). Les cellules fluorescentes vertes et rouges ont
ensuite été analysées par cytométrie de flux comme décrit
précédemment.
1.5. FERTILITE
Les résultats de fertilité moyenne après insémination en
élevage ont été collectés pour les éjaculats de chaque bouc.
Ils étaient répartis dans 8 à 16 élevages différents. Le
nombre d’insémination par mâle variait de 70 à 200 I.A.
Toutes les inséminations ont été réalisées en semence
fraîche.
1.6. ANALYSE STATISTIQUE
Les résultats ont été analysés avec Excel (Microsoft) et
SPSS (SPSS Inc., USA ; version 8.0.). Les données de la
cytométrie de flux ont été stockées pour analyse ultérieure
avec Cell Quest software (Becton Dickinson, San Jose, CA)
et WinMDI (Windows Multiple Document Interface
pour cytométrie de flux, version 2.8 ;
http://facs.scripps.edu/software.html).
2. RESULTATS
2.1. CRITERES DE QUALITE ET CONSERVATION
2.1.1. Température de conservation de la semence
fraîche
La mobilité de la semence en fonction de la température de
conservation de la semence fraîche à 4°C ou 18°C ne montre
qu’une légère baisse dans les premières 24 h. Après 24 h la
baisse est significative et la semence conservée à 18°C se
détériore plus vite que la semence conservée à 4°C
(figure 1).
Figure 1
Mobilité de la semence caprine, conservation à 4°C et 18°C ;
analyse microscopique
26 Symposium satellite caprin - 8 décembre 2004 - Paris, France