1. Digestion de l'ADN par les enzymes de - Département de biologie

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TP de Biologie Moléculaire : BIO 36
Marion Benoîst, Keith Dudley, Dominique Charmot
Introduction
Lors de ce TP vous allez cloner des molécules d’ADN. L’objectif est de vous faire
découvrir les principales étapes d’une expérience de clonage puis d’analyser vos
résultats.
Vous devez porter une blouse blanche et aussi mettre des gants de type
chirurgical. Ce que vous allez faire n’est pas dangereux, mais la blouse et les gants
vous assurerons une protection lorsque vous manipulerez les réactifs chimiques et les
bactéries. En outre, vous éviterez de contaminer les réactifs par les molécules présentes
sur vos doigts.
Nous allons vous montrer comment exécuter les différentes étapes de
l'expérience. L’exercice que vous allez trouver sans doute le plus difficile est celui de
pipeter (= prélever un volume déterminé d’un liquide) avec les « pipetman » (dispositif
permettant de faire ces prélèvements avec une grande précision). Il faut regarder, avec
l’aide d’un enseignant, comment utiliser ces pipettes. Vous allez travailler avec de très
petits volumes, mesurés en microlitres (abréviation : µl): 1µl est un millionième de litre.
Les principales étapes de l’expérience que vous allez faire sont les suivantes :
1. Digestion de l’ADN par les enzymes de restriction EcoRI et HindIII. À la fin
de la digestion, vous avez produit plusieurs fragments d’ADN de
tailles différentes.
2. Digestion d’un plasmide (pBluescript) avec EcoRI et HindIII. Vous allez
cloner les fragments de l’étape 1 dans ce plasmide.
3. Inactivation des enzymes de restriction.
4. Ligation des fragments produits dans l’étape 1 dans le plasmide traité dans
l’étape 2, en utilisant une ligase (une « colle moléculaire »)
5. Analyse par électrophorèse sur gel d'agarose des fragments d’ADN
produits pendant les digestions 1 et 2. (logiquement, cette étape devrait être
réalisée avant l’étape de ligation ; vous la faites pendant la ligation pour une
question de temps).
6. Introduction des molécules recombinantes produites pendant l’étape 4 dans
les bactéries par transformation chimique.
7. Étalement des bactéries sur les boîtes de Pétri : la substance qui est au
fond de la boîte de Pétri est une sorte de gel : de l’agar (extrait d’algues) dans
lequel on a inclut de l’ampicilline et un réactif chimique appelé X-gal.

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Étapes 1 et 2 : les digestions par les enzymes de restriction
Sur votre paillasse (= plan de travail), vous allez trouver dans un portoir les tubes
suivants qui contiennent:
· De l’ADN du bactériophage lambda (1µg/µl) [1 µg= 1 millième de gramme]
· De l’ADN du plasmide pBluescript (1µg/µl)
· De l’eau stérile
· Du tampon de digestion (10X [10 fois concentré] ; donc il devra être dilué 10 fois)
· De l’enzyme de restriction EcoRI (5unités/µl)
· De l’enzyme de restriction HindIII (5unités/µl)
Digestion de l’ADN lambda
• Préparer un tube Eppendorf (de contenance 1,5ml) en mettant dans l'ordre
indiqué :
1µl ADN lambda (tube 1 du portoir des réactifs)
2µl tampon
15µl d'eau
1µl Eco R1
1µl Hind III
Soit un volume final de 20 µl
Les enzymes sont dans un tampon avec du glycérol ; donc quand vous les
ajoutez aux réactifs déjà présents dans le tube, le glycérol, plus dense, tombe
au fond sans se mélanger. Il faut homogénéiser avec précaution les réactifs
avec le pipetman ou par tapotage.
• Mettez le tube à 37°C (dans le bain-marie) pendant 30 minutes
Digestion du plasmide
La digestion du plasmide se fait de la même manière.
• Préparer un second tube Eppendorf (de contenance 1,5ml) en mettant dans
l'ordre indiqué :
1µl du tube contenant le plasmide pBluescript (tube 2 du portoir des
réactifs)
2µl tampon
15µl d'eau
1µl Eco R1
1µl Hind III
Soit un volume final de 20 µl
Les enzymes sont dans un tampon avec du glycérol ; donc quand vous les
ajoutez aux réactifs déjà présents dans le tube, le glycérol, plus dense,
tombe au fond sans se mélanger. Il faut homogénéiser avec précaution les
réactifs avec le pipetman ou par tapotage.
• Mettez le tube à 37°C (dans le bain-marie préchauffé à cette température)
pendant 30 minutes

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Commentaire : 1 unité d’enzyme peut digérer 1µg d’ADN en une heure. Vous allez
utiliser 5 unités d’enzyme (contenues dans un microlitre d’enzyme) pendant 30 minutes
ce qui est plus que suffisant pour digérer 1µg de plasmide. On utilise habituellement plus
d’enzyme que nécessaire (= on dit que l’on travaille en excès d’enzyme).
Étape 3 : l’inactivation des enzymes de restriction à la fin des digestions
À la fin de la digestion, il faut chauffer les deux tubes à 70°C (en les transférant
dans un bain-marie chauffé à cette température) pendant 10 minutes, pour inactiver les
enzymes. Les enzymes sont des protéines et à 70°C leurs structures secondaires et
tertiaires sont fortement modifiées, et de ce fait, elles ne sont plus actives.
Étape 4 : la ligation
Il faut d’abord centrifuger brièvement les deux tubes car pendant l’inactivation il
se produit un peu d’évaporation : des gouttelettes se sont formées sur la paroi et le
capuchon des tubes. Donc, vous centrifugez les deux tubes pendant 10 secondes dans la
microfuge (une petite centrifugeuse de paillasse). Les gouttelettes retombent au fond du
tube.
ATTENTION à la manière de disposer les tubes dans la centrifugeuse !!! Ils
doivent être dans des supports diamétralement opposés !
Mettre ensuite les tubes dans de la glace pilée, dans une boîte de polystyrène, pendant
que vous préparez les tubes de l’étape suivante.
Vous allez faire maintenant 3 ligations, chacune dans un tube Eppendorf différent :
1. une fraction du plasmide digéré plus 2µl de l’ADN lambda digéré
2. une fraction du plasmide digéré plus 4µl de l’ADN lambda digéré
3. une fraction du plasmide digéré seul (= sans ajouter de l’ADN de lambda)
Les ligations se font dans un volume final de 10µl.
Vous avez dans le portoir les tubes contenant :
− du tampon de ligation (5X [concentré 5 fois] ; donc il devra être dilué 5 fois)
− de l’enzyme ligase (concentration de l’enzyme dans le tube : 1unité/µl)
• Ligation des molécules : Dans chacun des 3 tubes Eppendorf
(contenance :1,5ml), vous ajoutez dans l'ordre indiqué:
− 2 µl de plasmide digéré
− 2 µl de tampon de ligation 5X
Ligation 1 : on ajoute 2 µl l’ADN lambda digéré plus 3 µl d’eau
Ligation 2 : on ajoute 4 µl l’ADN lambda digéré plus 1 µl d’eau
Ligation 3 : on ajoute 5 µl d’eau
Et enfin1 µl de ligase

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Ne jetez surtout pas les tubes dans lesquels vous avez fait les digestions !!! Laissez-
les dans la boîte à glace. Vous allez en avoir encore besoin !!
Tableau récapitulatif :
Ordre dans
lequel on ajoute
les réactifs
1
2
3
• Laissez les 3 tubes dans le portoir sur la paillasse : 60 minutes à température
ambiante
Étape 5 : analyse par électrophorèse des fragments à l’issue de la digestion des
étapes 1 et 2
Normalement après avoir effectué la digestion de l’ADN, il faut vérifier que les
enzymes ont bien fonctionné, avant de procéder aux étapes suivantes. Nous sommes
obligés ici de faire les ligations avant de savoir si les digestions sont bonnes (=
complètes), car le temps imparti à ce TP d’initiation à la biologie moléculaire est court.
Vous allez faire migrer sur un gel d’agarose 1% (=1g d’agarose pour 100ml de
tampon) les fragments d’ADN que vous avez produits pendant les digestions. Vous allez
faire migrer en parallèle des marqueurs de taille, ce qui va vous permettre de déterminer
la taille des fragments obtenus à l’issue de la digestion, et vous assurer de la conformité
des résultats de la digestion par rapport à vos attentes lorsque vous avez établi le
protocole.
Préparation des échantillons pour le gel :
• Dans des tubes Eppendorf (contenance 1,5ml) mettre dans l’ordre indiqué :
Tube A 4 µl de la digestion de lambda
2 µl de tampon « bleu de charge »
4 µl d’eau stérile
Tube B 2µl de la digestion du plasmide
2 µl de tampon « bleu de charge »
6 µl d’eau
Tube C 2 µl des marqueurs de taille
2 µl de tampon « bleu de charge »
6 µl d’eau
Donc, volume final : 10 µl
• Charger les gels.
Tube 1 Tube 2 Tube 3
2 µl de plasmide
digéré
2 µl de tampon de
ligation 5X
2 µl l’ADN lambda
digéré
2 µl de plasmide
digéré
2 µl de tampon de
ligation 5X
4 µl l’ADN lambda
digéré
2 µl de plasmide
digéré
2 µl de tampon de
ligation 5X
4 3 µl d’eau 1 µl d’eau 5 µl d’eau
5 1 µl de ligase 1 µl de ligase 1 µl de ligase

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Commentaire : Le tampon « bleu de charge » contient du glycérol pour rendre le
mélange plus dense que le tampon de migration (nom du tampon de migration : TAE
1X). Du coup, on peut charger les échantillons dans les puits du gel, et l'ADN tombe au
fond du puits. Le colorant bleu dans le tampon de charge se comporte dans la migration
comme une molécule dont la taille est 50 nucléotides. La position du bleu va donc être
celle du front de migration (= donc les fragments d’ADN, si leur taille est supérieure à 50
nucléotides, seront en arrière de la zone bleue dans le gel)
Nous allons vous montrer comment charger le gel, avec quel volume, comment faire la
migration, pendant combien de temps.
ATTENTION :
- il faut réfléchir au sens de la migration pour placer correctement le gel dans la
cuve d’électrophorèse. L’ADN porte une forte charge négative.
- Il faudra aussi surveiller la migration en regardant régulièrement où se trouve le
colorant bleu (= le front de migration, voir plus haut).
Étape 6 : la transformation des bactéries par les produits de la ligation
Il faut maintenant transformer les bactéries, c'est-à-dire introduire dans les
bactéries les molécules que vous avez produites pendant la ligation. Vous avez des
bactéries "chimio-compétentes" : cela signifie que ces bactéries ont été traitées avec un
tampon spécifique pour les rendre plus perméables aux molécules d’ADN.
• Pour la transformation, dans des tubes mettre stérilement (c’est-à-dire près du
Tube 1
Tube 2
Tube 3
bec Bunsen):
50 µl de bactéries compétentes
5 µl de la ligation du tube 1
50 µl de bactéries compétentes
5 µl de la ligation du tube 2
50 µl de bactéries compétentes
5 µl de la ligation du tube 3
• Mettez les tubes dans la glace pilée, pendant 10 minutes.
• Transférez les tubes très rapidement dans un bain marie préchauffé à 42°C
pendant 2 minutes.
• Transférez les tubes encore une fois dans la glace 5 minutes.
• Ajoutez 300 µl de milieu L-broth. [broth = bouillon] (Le L-broth contient un
mélange de molécules nutritives [les sucres, les acides aminés] pour les
bactéries.)
• Mettre les tubes dans un bain-marie à 37°C pendant 30 minutes.

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Étape 7 : étalement des bactéries transformées sur des boîtes de Pétri
contenant du milieu de culture
• Centrifugez les trois tubes de transformations pendant 1 minute dans le microfuge
à vitesse maximale (centrifugeuse de paillasse). N’oubliez pas d’équilibrer !!!!
• Vous allez obtenir un culot de bactérie. Vous aspirez délicatement le surnagent à
l’aide de la pipette, vous jetez le surnageant, et vous ajoutez 75 µl de L-broth
pour re-suspendre les bactéries (= faire que les bactéries ne soient plus tassées
dans le culot, mais réparties de manière homogène dans le milieu de culture), à
l’aide la pipette, sans faire de bulles : il faut manipuler avec précautions !
• Vous allez maintenant étaler stérilement les bactéries sur les boîtes de Pétri, avec
des billes de verres (qui ont été stérilisées auparavant). Chaque tube de
transformation sera étalé sur une boîte de Pétri. Nous allons vous montrer
comment faire l’étalement avec des billes de verre.
• IMPORTANT :
o N'oubliez pas de marquer vos boites avec vos noms et le n° de la
ligation.
o A votre avis, vous identifiez vos trois boîtes de Pétri en écrivant sur le
fond de la boîte ou sur le couvercle ?
ETAPE ULTIME : vous RANGEZ votre plan de travail avant de partir !!!!!!
• Les boîtes de Pétri sont mises à 37°C toute la nuit dans un incubateur réglé à
cette température. La présence d’un antibiotique (ici l'ampicilline) dans l’agar va
empêcher les bactéries sans plasmide (= non transformées) de pousser. Le
lendemain, on devrait avoir des colonies sur les boîtes : une colonie est un clone
de bactéries (= toutes les bactéries d’un clone descendent d’une seule cellule
bactérienne initiale) qui contiennent toutes le même plasmide. Ces colonies sont
visibles à l’œil nu. Les colonies bleues sont non-recombinantes, les blanches sont
recombinantes. Les enseignants se chargeront de sortir vos boîtes, de les mettre
dans une chambre froide à 4°C pour stopper la croissance bactérienne tout en
préservant leur viabilité.
Mercredi, de 14 à 16h, nous observerons les boîtes, puis nous commenterons et
interpréterons ensemble vos résultats.
BONNES MANIPULATIONS!!!!!