Bioluminescence du plancton marin
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<strong>Bioluminescence</strong> <strong>du</strong> <strong>plancton</strong> <strong>marin</strong><br />
Anne-Sophie Cussatlegras<br />
Patrice Le Gal<br />
IRPHE, UMR 6594 CNRS - Universités d’Aix-Marseille I &II, 49 Rue F. Joliot-Curie, BP 146 13384 Marseille Cedex 13<br />
DIMAR, UMR 6540 CNRS-Université de la Méditerranée, COM, Luminy, Case 901, 13288 Marseille cedex 9
Phénomène physique connu (Aristote, 350<br />
av. J.C.): Oxydation de la luciférine (nom<br />
générique d’une quarantaine de protéines<br />
similaires) catalysée par une enzyme, la<br />
luciférase<br />
La bioluminescence<br />
Quelques organismes terrestres bioluminescents:<br />
-lucioles,<br />
-vers luisants<br />
http://www.lifesci.ucsb.e<strong>du</strong>
Organismes <strong>marin</strong>s luminescents<br />
Bactéries zoo<strong>plancton</strong> phyto<strong>plancton</strong><br />
Mé<strong>du</strong>ses Poissons des profondeurs
Océan<br />
Photographies au microscope électronique<br />
Le Plancton<br />
Plancton<br />
Zoo<strong>plancton</strong><br />
Phyto<strong>plancton</strong><br />
Dinoflagellés: taille ~ 30 µm et 1 mm
Stimulation de la bioluminescence<br />
Émission spontanée<br />
Stimulation mécanique<br />
de la membrane cellulaire<br />
Contrôlée par voie nerveuse<br />
bactérie<br />
dinoflagellé<br />
copépode<br />
Pyrocystis fusiformis
Organes lumineux<br />
Disposition la plus courante des photophores<br />
chez les euphausiacés : 10 photophores:<br />
2 pédoncules oculaires, 3 paires sur le thorax,<br />
4 sur l’abdomen.<br />
Glandes lumineuses caudales sur<br />
un copépode Gaussia princeps.
Mesures in situ de la bioluminescence<br />
des dinoflagellés<br />
Mesures effectuées au large de la Bretagne<br />
(Cussatlegras et al. - juillet 2000)
Phénomène connu des nageurs et des <strong>marin</strong>s<br />
« Dolphins in phosphorescent sea » M.C. Escher, 1922<br />
Bioluminescent bay (Porto-Rico)<br />
Rohr et al. 1998
C<br />
Scintillons et chloroplastes chez les<br />
dinoflagellés<br />
A<br />
D<br />
Pyrocystis lunula<br />
B<br />
E<br />
(A) : Chloroplastes mis en évidence par la<br />
fluorescence de la chlorophylle.<br />
(B) et (C) : Cellule en phase nocturne avec les<br />
chloroplastes au centre.<br />
(D et (E) : Migration des chloroplastes<br />
déclenchée par la lumière, au bout de 3 mn<br />
d’exposition (D) et 15 mn d’exposition (E).<br />
(In Heimann et al., 2000).<br />
Vitesse de migration: 10 µm/min (inhibition)<br />
à 25 µm/min (dés-inhibition) chez Pyrocystis<br />
(Fabros et al. , 2003)
Stimulation de la bioluminescence des<br />
dinoflagellés<br />
Stimulation piézo-électrique d’une seule cellule<br />
jour nuit<br />
Stimulation chimique<br />
par ajout d’acide acétique<br />
(pH=3) mais stimulation<br />
mécanique non inhibée<br />
Signal lumineux<br />
Widder & Case (1981)<br />
Potentiel de membrane<br />
Signal lumineux<br />
Stimulation <strong>du</strong> cristal<br />
Piézo-électrique<br />
Potentiel de membrane<br />
Stimulation mécanique<br />
Widder & Case (1981)
Physico-chimie de la membrane cellulaire<br />
des dinoflagellés<br />
Déformations de la membrane<br />
Ouverture de canaux mécanorécepteurs<br />
Gonyaulax Polyedra<br />
Fritz & Morse (1990)<br />
Propagation d’un potentiel d’action<br />
le long de la membrane de la vacuole<br />
Entrée de cations dans la vacuole<br />
au niveau des scintillons:<br />
libération de la luciférine jusqu’alors liée<br />
à une protéine ligand:<br />
LBP-LH 2 + 4H + H 4 LBP + LH 2<br />
Baisse <strong>du</strong> pH entraîne une activation de la luciférase<br />
(inactive à pH=7.5)<br />
Ghazi (1998)<br />
Hastings & Morin (1991)
Structure moléculaire proche<br />
de celle de la chlorophylle<br />
Oxydation de la luciférine<br />
Wu, 2002<br />
Akimoto, 2003<br />
Quelques étapes de la réaction d’oxydation<br />
pour la luciférine de la luciole
Fritz et al., 1990<br />
Phase nocturne<br />
Phase diurne<br />
Flashs et halo lumineux<br />
Gonyaulax polyedra<br />
Flashs isolés + halo<br />
Pyrocystis lunula, fusiformis<br />
Flashs isolés uniquement<br />
Excitations électriques répétées<br />
Widder & Case, 1981
Caractéristiques physiques de l’émission<br />
lumineuse<br />
Gamme spectrale : spectre d'émission dans le bleu-vert (450 à 520 nm)<br />
Cinétique : flashs très brefs, de l ’ordre de 100 ms chez les dinoflagellés et les copépodes<br />
Intensité : variable selon les organismes mais visible à l’oeil nu (10 8 -10 10 ph/cell)<br />
(In Sweeney et al., 1983)<br />
Spectre d’émission <strong>du</strong><br />
dinoflagellé<br />
Gonyaulax polyedra<br />
Cinétique des flashs chez le<br />
copépode Oncaea conifera<br />
stimulation électrique répétée<br />
In Herring et al., 1993)
Etude de la réponse à une stimulation mécanique<br />
contrôlée<br />
Latz et al. 1994 : Ecoulement de Couette cylindrique<br />
.<br />
le cisaillement de l’écoulement stationnaire stimule la bioluminescence<br />
seuil critique: 0.1 N.m-2 cylindre tournant (verre)<br />
Cavité (cisaillement constant)<br />
cylindre fixe intérieur<br />
(acétale noire)<br />
Longueur 190 mm <br />
épaisseur 3 mm <br />
(Ø 52.3 - 46.3 mm) <br />
0.1 N.m-²<br />
Visualisation quantitative en mécanique des fluides:<br />
Nombre de photons émis Cisaillement<br />
« The use of bioluminescence as a flow diagnostic », Phys. Lett.A, Rohr et al, 1997
• F/2 milieu de culture F/2 (eau de mer + sel)<br />
• Cycle Jour/ nuit 12:12 20°C<br />
(dilution)<br />
Pyrocystis lunula<br />
T 10 = 25 j<br />
Cultures<br />
• Acquisition de différentes souches<br />
• Salle de culture climatisée<br />
Cultures de Dinoflagellés:<br />
Pyrocystis noctiluca<br />
Pyrocystis lunula<br />
(≈ 300 µm)<br />
(≈ 500 µm)
<strong>Bioluminescence</strong> in vitro<br />
Emission spontanée: un flash ~ 100 ms Stimulation par agitation turbulente: fatigue<br />
Mise en évidence <strong>du</strong> cycle circadien<br />
Temps de fatigue ~ 10 mn
Photo-inhibition/ désinhibition de la<br />
bioluminescence<br />
Temps caractéristique ~ 30 mn Temps caractéristique ~ 15 mn
• Camera CCD intensifiée<br />
Munie d’un filtre interférenciel<br />
(475 +/- 10 nm)<br />
• Couette cylindrique<br />
Moteurs asservis (+/- 0.01 Hz)<br />
• Photomultiplicateur<br />
Montage experimental de Couette
Visualisations à l’aide de kalliroscope<br />
Ecoulement laminaire Spirale turbulente<br />
Présence de<br />
cellules d’<br />
Ekman<br />
Transition sous-critique<br />
Contrôlée par ajout d’un adhésif
Resultats<br />
Pyrocystis noctiluca<br />
Emission de lumière:<br />
- extrémités des cylindres<br />
- équateur (cellule d’Ekman)<br />
- transition à la turbulence à 13 Hz<br />
(avec le ruban adhésif)<br />
Emission de lumière:<br />
- extrémités des cylindres<br />
- équateur (cellule d’Ekman)<br />
- transition à la turbulence à 26 Hz<br />
(seuil aléatoire sans le ruban<br />
adhésif)<br />
A<br />
106 Ph cell-1 s-1 B<br />
Seuil mesuré par Latz et al. 94<br />
10 6 Ph cell -1 s -1
Transition à la turbulence
Cisaillement homogène et stationnaire<br />
ne stimule pas la bioluminescence<br />
Premières conclusions<br />
« Contre-manips » :<br />
Les cellules ne semblent être sensibles<br />
qu’à des changements temporels de<br />
cisaillement: effets de bouts, turbulence<br />
Intro<strong>du</strong>ction d’un petit cylindre (φ=1.5mm) Basculement <strong>du</strong> montage de Couette à l’horizontal
Ecoulement cisaillé et accéléré<br />
Démarrages abrupts <strong>du</strong> cylindre extérieur pour 4 accélérations<br />
0.3<br />
0.2<br />
0.1<br />
Light emission (10 6 ph.s -1 .cell -1 )<br />
0.0<br />
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10<br />
Pyrocystis lunula<br />
Pic d’émission<br />
Cisaillement constant:<br />
pas d’émission après 1s<br />
Time (s)<br />
4 accelerations :<br />
O 70 rps²<br />
+ 35 rps²<br />
X 17 rps²<br />
* 9 rps²<br />
s - m<br />
I = max x (1+erf ) σ<br />
σ<br />
m<br />
erf = fonction erreur<br />
max
L’accélération impose l’amplitude de la<br />
bioluminescence<br />
Light emission (10 6 ph s -1 cell -1 )<br />
Acceleration (m s -2 )<br />
max<br />
Shear (N m -2 )<br />
Acceleration (m s -2 )<br />
Accélération impose l’amplitude (max) de la réponse lumineuse chez les dinoflagellés<br />
Seuil de bioluminescence et raideur de la réponse ne dépendent pas de l’accélération<br />
m<br />
σ
Light emission (10 6 ph s -1 cell -1 )<br />
contra<br />
Pyrocystis lunula<br />
simple<br />
Cylindres en contra-rotation<br />
δω=9Hz<br />
Contra-rotation δω= 9Hz<br />
2 expériences de démarrages : δω, accélération fixée<br />
- seul le cylindre extérieur est mis en rotation: ‘simple’: = v ext / e<br />
- les deux cylindres sont mis en contra-rotation: ‘contra’: = 2 v ext / e
Light emission (10 6 ph s -1 cell -1 ))<br />
Deux espèces testées:<br />
Pyrocystis lunula et Pyrocystis noctiluca<br />
δω (Hz)<br />
Light emission (10 6 ph s -1 cell -1 )<br />
Pyrocystis lunula Pyrocystis noctiluca<br />
δω (Hz)
Le cisaillement contrôle le seuil de bioluminescence<br />
Le cisaillement moyen intégré dans l’écoulement détermine le seuil de bioluminescence<br />
Light emission (ph s -1 cell -1 ) Light emission (ph s -1 cell -1 )<br />
(N m -2 )<br />
Pyrocystis lunula Pyrocystis noctiluca<br />
= cisaillement =<br />
µ _ ⎧ dV __ dr<br />
e ⎭ dr<br />
0<br />
e<br />
(N m -2 )
Probabilité de stimulation de la bioluminescence<br />
La réponse en fonction erreur n’est<br />
que la probabilité cumulée<br />
de stimuler la bioluminescence<br />
rms = 0.3 N.m -2<br />
mean = 1 N.m -2<br />
Histogramme expérimental<br />
Derivée de la<br />
fonction erf<br />
Pyrocystis lunula<br />
Diversité dépend de l’espèce<br />
Calcul de la dérivée de la réponse:<br />
Statistique Gaussienne de la<br />
diversité des seuils de déclenchement<br />
Pyrocystis noctiluca<br />
rms = 0.27 N.m -2<br />
mean = 0.7 N.m -2
Conclusions et perspectives<br />
Un cisaillement stationnaire et homogène comme celui de Couette<br />
cylindrique ne stimule pas une bioluminescence massive chez Pyrocystis<br />
noctiluca et Pyrocystis lunula.<br />
Gonyaulax Polyedra?<br />
La turbulence excite une réponse lumineuse intense. (à suivre…)<br />
L’accélération (changement temporel de l’environnement de la cellule)<br />
détermine l’intensité de la réponse lumineuse). En accord avec les récents résultats de<br />
Blaser et al. 2003.<br />
Distribution Gaussienne des seuils de stimulation mécanique qui montre la<br />
variabilité au sein de la population et/ou au sein des organismes.<br />
Stimulation d’une cellule unique:<br />
- Statistique de la réponse<br />
Probabilité d’ouverture d’un canal mécano-récepteur (Morris, 1990)<br />
- Déformation de la membrane
Se défendre<br />
Décharges lumineuses chez<br />
Euaugaptilus magnus,<br />
Prédateur 1<br />
dinoflagellés<br />
Mais pourquoi font ils de la lumière?<br />
Se nourrir<br />
Défendre la communauté<br />
Prédateur 2<br />
Préd. 1 Ré<strong>du</strong>it la pression de<br />
prédation sur la communauté<br />
des dinoflagellés<br />
dinoflagellés<br />
(«burglar alarm »)
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