illustration - laboratoire PROTEE

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illustration - laboratoire PROTEE

Application de la technique de

spectroscopie de fluorescence à la

caractérisation de la matière organique

dissoute (MOD) dans les eaux

naturelles

E. Parlanti

Laboratoire de Physico-ToxicoChimie

Physico ToxicoChimie (LPTC) des systèmes naturels

UMR 5472 CNRS - Université Bordeaux 1


Toulon 9/10 octobre 2003 - E. Parlanti

Laboratoire de Physico-ToxicoChimie

Physico ToxicoChimie (LPTC) des systèmes naturels - UMR 5472 CNRS - Université Bordeaux 1

Rappels sur la fluorescence

vibration

(1 er état excité S2)

4

3

2

1

0

État excité

absorption Absorption

conversion

interne

fluorescence

retour

non radiatif

Fluorescence

4

3

2

1

0

rotation

vibration

(état excité S1)

transfert d’énergie

à une autre molécule

Diagramme de Perrin-Jablonski

vibration

(état fondamental S0)

Absorption de photons

Passage à un état excité

Retour à l’état fondamental

par émission de

FLUORESCENCE


Toulon 9/10 octobre 2003 - E. Parlanti

Laboratoire de Physico-ToxicoChimie

Physico ToxicoChimie (LPTC) des systèmes naturels - UMR 5472 CNRS - Université Bordeaux 1

Fluorescence des eaux naturelles

MOD colorée absorption lumineuse

Propriétés remarquables de la MOD : émission de fluorescence

70% de la MOD

Technique largement appliquée à

l’étude de la MOD


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Laboratoire de Physico-ToxicoChimie

Physico ToxicoChimie (LPTC) des systèmes naturels - UMR 5472 CNRS - Université Bordeaux 1

Fluorescence des eaux naturelles

Larges bandes de fluorescence contribution simultanée des

spectres discrets de plusieurs fluorophores

Fluo.Int.(a.u.)

300000

250000

200000

150000

100000

50000

0

β

α

320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600

Wavelength (nm)

Eau continentale

λ exc = 310 nm

Eau marine

Spectrofluorimétrie 3D : technique de

choix pour l’étude de la MOD


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Laboratoire de Physico-ToxicoChimie

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Fluorescence des eaux naturelles

Avantages:




POURQUOI LA FLUORESCENCE ?

Technique sensible et rapide

Pas de préparation de l’échantillon

Plus spécifique que l’UV

Désavantages




Dépend du pH

Non spécifique comparée à la RMN, IR, etc.

Seuls les composés fluorescents peuvent être mesurés


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Laboratoire de Physico-ToxicoChimie

Physico ToxicoChimie (LPTC) des systèmes naturels - UMR 5472 CNRS - Université Bordeaux 1

Fluorescence des eaux naturelles

Avantages:

POURQUOI LA FLUORESCENCE ?

Technique sensible et rapide

Pas de préparation de l’échantillon

Plus spécifique que l’UV

Signature caractéristique de la MOD

Différenciation des eaux en fonction de leur nature

et de leur origine

Estimation de l’activité biologique

Suivi des variations saisonnières


Variations dans un gradient de salinité


excitati..

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Laboratoire de Physico-ToxicoChimie

Physico ToxicoChimie (LPTC) des systèmes naturels - UMR 5472 CNRS - Université Bordeaux 1

Caractérisation par fluorescence 3D

250

300

350

400

660

610

560

510

460

410

360

émission (nm)

310

260

Intensité de fluorescence (u.a.)

α

250

280

excitation (nm)

310

α’

340

370

400

α’ : matériel humique + matériel plus récent

α : matériel humique

β : matériel d’origine biologique

γ : matériel type protéinique + activité bactérienne

β

γ

660

610

560

510

460

410

360

émission (nm)

310

260


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Laboratoire de Physico-ToxicoChimie

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Caractérisation par fluorescence 3D

250

EAU

DOUCE

290

330

370

410

660

610

560

510

460

410

EXCITATION

250

360

310

260

EAU

MARINE

290

330

370

410

660

610

560

510

460

EAU

COTIERE

250

290

330

410

370

410

360

EMISSION

310

660

260

610

560

510

460

410

360

310

260

INTENSITE


Int.Fluo. (u.a.)

4

3,5

3

2,5

2

1,5

1

0,5

0

rapport d'intensité

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Physico ToxicoChimie (LPTC) des systèmes naturels - UMR 5472 CNRS - Université Bordeaux 1

Variation des intensités de fluorescence en fonction de la salinité salinité

Intensité de fluorescence en fonction de la salinité

0 5 10 15 20 25 30

salinité

1,5

1,45

1,4

1,35

1,3

1,25

1,2

1,15

1,1

1,05

1

0,95

Ib/Ia' (I.320-400/I.max370)

MO biologique/MO mature

0 5 10 15 20 25 30 35

salinité

Ia'

Ig

Ib

Ia

rapport d'intensité

2,85

2,75

2,65

2,55

2,45

2,35

2,25

rapport d'intensité

Ia/Ia' (I.max250/I.max370)

MO juvénile/MO mature

0 5 10 15 20 25 30 35

1,4

1,2

1

0,8

0,6

0,4

0,2

salinité

Ig/Ia' (I.280-330/I.max370)

MO protéinique/MO mature

0 5 10 15 20 25 30 35

salinité

janvier

2001

avril 2001

août PM

2001

septembre

2002


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Variation des rapports d’intensités de fluorescence dans un estuaire estuaire

Ia/Ia' (Exc250nm/Exc370nm)

3

2,5

2

1,5

1

0,5

MO juvénile/MO mature

0

21/03/2002

17/04/2002

15/05/2002

12/06/2002

11/07/2002

24/09/2002

23/10/2002

11/12/2002

Honfleur

Caudebec

Tancarville

Poses

La Bouille

Ib/Ia' (Exc310nm/Exc370nm)

1,6

1,4

1,2

1

0,8

0,6

0,4

0,2

MO biologique/MO mature

0

21/03/2002

17/04/2002

15/05/2002

12/06/2002

11/07/2002

24/09/2002

23/10/2002

11/12/2002

Phases successives de production et de

consommation de matière organique

dissoute.

Forte variabilité de la composition de la

matière organique dans l’espace et dans

le temps.

Honfleur

Caudebec

Tancarville

Poses

La Bouille

Ig/Ia' (Exc280nm/Exc370nm)

MO protéinique/MO mature

2,5

2

1,5

1

0,5

0

21/03/2002

17/04/2002

15/05/2002

12/06/2002

11/07/2002

24/09/2002

23/10/2002

11/12/2002

Honfleur

Caudebec

Tancarville

Poses

La Bouille


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Variation des rapports d’intensités de fluorescence dans un estuaire estuaire

1,39

1,38

1,37

1,36

1,35

1,34

1,33

1,32

1,31

1,3

1,29

SEINE AVRIL 2001

Aval BV Amont

Iβ/Iα (I.310-400/I.max370)

Surface

Mi-fond

Fond

1,05

1

0,95

0,9

0,85

0,8

GIRONDE JUIN 2001

Aval BV Amont


250

270

290

excitation (nm)

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Physico ToxicoChimie (LPTC) des systèmes naturels - UMR 5472 CNRS - Université Bordeaux 1

Modélisation in vitro du fonctionnement du bouchon vaseux

250

270

310

290

excitation (nm)

330

310

350

330

370

350

390

370

410

390

410

260

310

360

410

460

510

560 émission (nm)

610

660

260

310

360

410

460

510

560

610

660 émission (nm)

Culture

d’algues

BV filtré +

culture d’algues

250

270



290

excitation (nm)


310

330

350

370

390

410

BV +

culture

d’algues

260

310

360

410

460

510

560

610

660 émission (nm)

250

270

290

excitation (nm)

310

330

BV + CDV +

culture d’algues

350

370

390

410

260

310

360

410

460

510

560 émission (nm)

610

660

Incubation à 20°C dans l’obscurité pendant 28 jours


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Modélisation in vitro du fonctionnement du bouchon vaseux

Rapport Ig/Ia'

6

5

4

3

2

1

0

MO protéinique/MO mature

0 5 10 15 20 25 30

Temps (jours)

Rapport Ib/Ia'

1,3

1,25

1,2

1,15

1,1

1,05

1

MO biologique/MO mature

0 5 10 15 20 25 30

Temps (jours)

BV filtré + algues BV + algues BV + CDV + algues

Augmentation des particules ⇒ production plus rapide

des composés de types protéiniques (bande γ)

Fluorophores bande β ⇒produits de dégradation des

algues indépendamment de la teneur en particules


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Dégradation d’algues in vitro

Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 8

γ

α’ β

γ

γ

γ

α’

γ

β

2 mois

α

β

α

γ

β

α

γ

β

α

γ

β

α


250

270

290

excitation

(nm)

250

270

290

excitation

(nm)

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Extraction sur résines

310

310

Eluat acétonitrile/eau

XAD8

330

330

350

350

370

370

390

390

410

410

Fraction hydrophobe

660

610

Eluat sodique

XAD8

660

610

560

560

510

460

410

émission (nm)

510

460

410

émission (nm)

360

360

310

310

260

260

Eau filtrée, concentrée par osmose

inverse, acidifiée

α

250

270

290

excitation

(nm)

310

330

350

XAD 8

XAD 4

Fraction hydrophile

Sortie XAD4

370

390

410

660

610

560

510

460

410

émission (nm)

250

270

290

excitation

(nm)

Eluat acétonitrile/eau

XAD4

250

270

310

290

excitation

(nm)

360

310

260

330

310

350

330

370

350

390

370

Fraction transphilique

410

390

410

660

660

610

Eluat sodique

XAD4

610

560

560

510

460

410

émission (nm)

510

460

410

360

émission (nm)

360

310

310

γ

260

β

260


Fractionnement par Ultrafiltration Tangentielle

250

290

excitation

330

370

410

665

YM3

615

565

échantillon

YM1

YC05

515

460

410

360

émission (nm)

310

250

270

260

290

excitation (nm)

310

330

350

370

390

410

Rétentat YM3

10kD>Mw>3kD

Rétentat YM1

3kD>Mw>1kD

Rétentat YC05

1kD>Mw>500D

Filtrat YC05 Mw


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Fractionnement par Ultrafiltration Tangentielle

Intensité de fluorescence normalisée (u.a.)

1,2

1

0,8

0,6

0,4

0,2

0

Mw

λ exc = 320nm

330 380 430 480 530 580 630 680

Longueur d'onde d'émission (nm)

ret YM10

ret YM3

ret YM1

ret YC05

fil YC05


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Conclusion

Spectroscopie de fluorescence: méthode non invasive

Informations globales sur les caractéristiques

moléculaires de la MOD et sur les concentrations

relatives des fluorophores.

Etude des phénomènes de transformation,

dégradation ou interaction dans les eaux naturelles.

Déconvolution de la matrice de fluorescence 3D

modéliser le comportement de la MOD

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