O - laboratoire PROTEE - Université du Sud - Toulon - Var

protee.univ.tln.fr

O - laboratoire PROTEE - Université du Sud - Toulon - Var

Laboratoire MAPIEM – Université du Sud Toulon Var

Encadré par : Dr Annick Ortalo-Magné

Étude comparative de la nature de métabolites secondaires

de bactéries marines pionnières du biofilm

Présenté par William DUDEFOI

MASTER Chimie et Matériaux

Spécialité CHARME

11/06/12

1


BIOFOULING

Contexte

Colonisation de surfaces immergées inertes ou vivantes par des organismes vivants

surface

vierge

sec

bact é ries planctoniques

film conditionnant

min heures - jours jours - mois

Adhésion

bactérienne

Croissance

bactérienne

Micro-organismes

Champignons,

µalgues

Macro algues, balanes, bivalves et

autres invertébrés marins

Macro-organismes

2


Impacts économiques :

Impacts écologiques :

Conséquences du Biofouling

Vecteur d’espèces invasives

(ex Crepidula fornicata, Ficopomatus enigmatus)

- Sur les coques de bateaux:

biomasse

rugosité

forces de friction

vitesse

consommation

- Effets sur le matériel :

propriétés

biocorrosion

3


IMPORTANCE DE TROUVER D’AUTRES STRATEGIES ANTIFOULING

Métabolites secondaires

Lutte contre le Biofouling

Composés organostaniques de type TBT

Autres Biocides ( Cu, Sea Nine , Irgarol…) Restriction

La défense chimique La défense physique

Ex : Posidonie

Ex : Plathelminthes

Interdits depuis 2008

Topographie du revêtement

Revêtement lisse et hydrophobe

Ex : Tégument de

Globicéphale

Ex : Tégument

externe de Requin

4


Objectifs de la thèse dans laquelle s’inscrit mon stage

« Identification et caractérisation des exopolymères de biofilms de bactéries marines »

Travaux

déjà

réalisés

Cadre du

stage

Perspectives

Caractérisation de souches bactériennes

isolées de surfaces immergées

en Méditerranée

Sélection de souches productrices de biofilm

Caractérisation biochimique de la matrice

des biofilms produits par ces souches

Identification des molécules anti-fouling

que produisent certaines de ces bactéries

5


Travaux antérieurs / Caractérisation des souches

- Dans la Méditerranée : Mourillon (Toulon)

Port militaire de Toulon

- Immersion de plaques de polystyrène

silicone

silicone fluoré

- Durée d’immersion: 6 h ou 24 h

13 souches ont été isolées

Etude de ces souches

Morphologie

Courbe de croissance

Phylogénie

Coloration de Gram

MATS

Mobilité

Potentiel zêta

Galeries API (ZYM, 20NE et 50CH)

Biofilm Ring Test (BFRT)

6


Résultats antérieurs / Caractérisation des souches

Souches Date

d’isolement

TC 5 13/02/2008

TC 8 13/02/2008

TC 9 13/02/2008

TC 10 13/02/2008

FRA 1 10/06/2010

FRA 2 10/06/2010

FRA 4 10/06/2010

FRN 1 10/06/2010

Lieux

d’immersion

Mourillon

(Toulon)

Mourillon

(Toulon)

Mourillon

(Toulon)

Mourillon

(Toulon)

Port militaire

de Toulon

Port militaire

de Toulon

Port militaire

de Toulon

Port militaire

de Toulon

Durée

d’immersion

(h)

6

6

6

6

24

24

24

24

Substrat Gram

silicone

ELP08/55554/13

silicone

ELP08/55554/13

silicone

ELP08/55554/13

silicone

ELP08/55554/13

silicone fluoré

ELP08/55554/13

silicone fluoré

ELP08/55554/13

silicone fluoré

ELP08/55554/13

silicone fluoré

ELP08/5555/1

Couleur

des

colonies

Taxonomie

- Jaune Polaribacter sp.

- Beige

Pseudoalteromonas

byunsanensis

- Blanche Shewanella surugensis

- Beige Shewanella donghaensis

-

Beige

saumon

Shewanella

pneumatophori

- Blanche Alteromonas genovensis

- Violette Pseudoalteromonas sp.

- Blanche Pseudoalteromonas sp.

7


Résultats antérieurs: Mesure de la formation de biofilm

BioFilm Ring Test® : Test Basé sur la mobilité de microbilles magnétiques

Δ BFI < 2

2 < Δ BFI < 20

Δ BFI > 20

Evaluation de la formation du biofilm

Culture bactérienne

+

Billes magnétiques

8


Résultat BFRT: Formation de biofilm à différents temps

Δ BFI

30,00

25,00

20,00

15,00

10,00

5,00

0,00

-5,00

TC 8 MB TC 9 MB FRA 1 MB FRN 1 MB FRA 3 MB FRA 4 MB FRA 2 MB TC5 MB

Milieu MB

La production de biofilm est maximale après 72 h de culture en MB

24h

48h

72h

9


Etapes à réaliser à mon arrivée

Production de biofilm sur support en polystyrène

Caractérisation de la matrice des biofilms Extraction des EPS (résine DOWEX)

10


La matrice extrapolymérique : les EPS

(Flemming and Wingender, 2010)

Composition variée

Plusieurs types d’interactions

Cohésion de la matrice

Flemming, H.-C., Wingender, J., 2010, The biofilm matrix. Nat Rev Micro 8, 623-633.

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CT1

Bactéries libres

dans le milieu

Mise au point d’un protocole d’extraction des EPS

Milieu

Centrifugation (4000 g)

Phase

aqueuse

- Filtration 0, 22 µm

-Dialyse (3500 Da) – 3j – 4°C

SN1

EPS-solubles

Partage

Interphase

Phase

organique

Culture en Biofilm

(72 h – Milieu MB avec ajout à 48h)

CT

CT2

Bactéries du

biofilm dans leur

matrice

exopolymérique

Suite pour culture

100 boîtes

Grattage

Biofilm adhéré

Centrifugation (4000 g)

SN

- Filtration 0, 22 µm

-Dialyse (3500 Da) – 3j – 4°C

SN2

EPS faiblement liés

Phase

aqueuse

Partage

Interphase

Phase

organique

12


Protocole d’extraction des EPS (2 ème partie)

CT4

Extraction CER (Dowex)

Centrifugation – 12 000 g – 4°C – 1 min

Résine + qq bactéries SN4

CT5

Bactéries + reste résine

CT6

Bactéries

Bactéries du

biofilm dans leur

matrice

exopolymérique

Centrifugation – 15 000 g – 4°C – 1 h

Centrifugation – 15 000 g – 4°C – 1 h

Filtration (0, 22µm)

Dialyse (3500 Da)- 3j – 4°C

SN6

EPS-liés

SN5

Cadre du stage

2 souches (TC9 et FRN1)


Résultats cultures 10 boîtes / BFRT

Objectif : Comparer les métabolites relargués (SN1) / EPS faiblement liés (SN2)

masse CT1 masse CT2 masse SN1 masse SN2 BFRT MB 72h

Souches (mg) (mg) (mg) (mg) (ΔBFI)

TC 5 230 20 37 6,7 14,3

TC 8 70 70 27 23 20,88

TC 9 140 30 39 18 21,36

TC 10 170 50 22 27 ND

FRA 1 110 70 34 3,6 20,86

FRA 2 130 80 47 1 22,25

FRA 4 70 240 21 55 21,14

FRN 1 180 110 26 9 21,25

Résultats remarquables : TC5 / FRA 4 / FRA 2

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Partage CHCl 3/MeOH/H 2O des échantillons

Partage effectué sur tous les surnageants (SN1 et SN2)

Phase aqueuse

Interphase

Phase organique

3 phases

La quantité d’EPS solubles la plus

importante est dans la phase aqueuse

Exception pour la souche TC5

masse phase organique > phase aqueuse

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Analyse RMN des phases organiques

Profil comparatif de TC9 : SN1 1,2,3 en vert, SN6 en rouge (RMN- 1 H)

2 régions intéressantes :

a

b

a

16


Analyse IR des phases organiques

Spectre IR-TF des phases organiques de FRA 4

SN1 (en rouge) et SN2 (en bleu)

Bandes de vibrations de valence caractéristiques de la présence d’acides gras

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Analyse CLHP de l’extrait organique de FRA 4


FRA 4, Pseudoalteromonas ulvae : production de violacéine ?

Forme un biofilm violet

Violacéine

Masse de 343 g/mol

3 maxima à 258, 372 et 575 nm

(Durán et al., 2007)

(Duran N., Z. Justo G., V. Ferreira C., S. Mel P., Cordi L., and Martins D., 2007, “Violacein: properties and biological

activities” Biotechnol. Appl. Biochem. 48, 127–133)

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Analyse CLHP de l’extrait organique de FRA 4

258

343

575


Spectrométrie de masse des composés à tr = 4min

342

Spectre de

masse (-MS)

Violacéine : Masse de 343 g/mol ( ref)

344

Spectre de

masse (+MS)

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Conclusions

Grâce au travail réalisé sur les cultures importantes de deux souches :

- Mise au point d’un protocole d’extraction des EPS de biofilms

formés par différentes souches de bactéries marines.

Isolement des EPS selon leurs forces d’adhésion

Grâce aux cultures sur 10 boîtes de Pétri de l’ensemble des huit souches :

- Aperçu de la teneur en EPS solubles ou faiblement liés produits par

chacune des souches.

Attention particulière portée sur les profils lipidiques

Concernant le pigment produit par la souche FRA 4, Pseudomonas ulvae

- Présence fortement probable de la violacéine dans l’extrait

organique analysé en CLHP triple détection

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Perspectives

Pigment produit par la souche FRA 4, Pseudomonas ulvae

- Purification et analyse structurale

- Test d’activités antifouling - cytotoxicité

Analyse des échantillons SN1, SN 2 et SN6 (EPS solubles relargués dans le

milieu, faiblement associés et fortement associés au biofilm) :

- Détermination des pourcentages en protéines et en polysaccharides par

des techniques de dosages colorimétriques spécifiques

- Purification et analyse structurale par RMN et CPG-SM des

polysaccharides

- Test de tout composé purifié, de nature lipidique ou polysaccharidique,

pour son activité antifouling sur d’autres souches bactériennes marines

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Merci pour votre attention.

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