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MISE AU POINT D ’UNE

SYSTEMATIQUE DE

CARACTERISATION DE LA

MATIERE ORGANIQUE

NATURELLE (MON)

Par fluorescence MEEF et

chromatographie d’exclusion


Méthode de caractérisation : la fluorescence

MEEF

• Balayage dans la gamme des λ em et des λ exc

⇒ Spectre 3 D représentant l’intensité de

fluorescence en fonction de λ em et de λ exc

• Distinction des groupements fonctionnels

fluorescents (fluorophores) : groupements

carboxyliques, groupements phénoliques et

squelettes aromatiques

• L’intensité de fluorescence est proportionnelle à

la concentration en carbone des fluorophores


La MON :

Les substances Humiques (SH)

Les Acides Humiques (AH)

• 2 000 < PM < 10 000 Da

• Phénol = - COOH

• Fortement aromatiques

• Moins riches en sites

complexants

• Insolubles à pH acide

Les Acides Fulviques (AF)

• 500 < PM < 2 000 Da

• Phénol < - COOH

• Moyennement

aromatiques

• Plus riches en sites

complexants

• Solubles à tous pH


PROBLEMATIQUE

TYPE C

TYPE A

Hypothèses (Mounier et al., 1998)

Fluorophores de type C :

Fluorophores de type «humique»

Fluorophores de type A :

Fluorophores de type «fulvique»


Plan d’étude I

Caractérisation par fluorescence MEEF des

Substances Humiques (SH) naturelles et

commerciales :

•Etude de la position des maxima (A et C)

•Etude du rapport R A,C = I A / I C

Pics A et C caractéristiques d’une catégorie de MO ?


longueur d'onde d'excitation (nm)

360

340

320

300

280

260

240

220

200

TYPE C

Resultats I : position des pics A et C

TYPE A

425 430 435 440 445 450 455 460 465

longueur d'onde d'émission (nm)

AHSR

AFSR

AF Armadale

D2C3

Coble (1993)

porquerolle

•Toutes les catégories de

SH étudiées présentent

les pics A et C

•La position des maxima

varie peu :

A (λem/λexc) = (430-445/230-260)

C (λem/λexc) = (440-460/330-350)

•Pas de lien position des

maxima / type de M.O.


Ra,c

Résultats I : intensité de fluorescence des

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

pics A et C

• Variations importantes

d ’intensité des pics A

et C (de 0,23 pour les AF

Armadale à 0,63 pour les

AF de Porquerolle)

• Pas de systématique de

variation


Plan d’étude II

Séparation par taille de la MO : isolement des

fluorophores ?

•Séparation par taille des substances humiques

entre elles

•Séparation de molécules de tailles distinctes au

sein d’une catégorie de SH

Corrélation taille de la MO / valeur de R A,C ?


La chromatographie d ’exclusion : séparation des

molécules en fonction de leurs tailles

• Une colonne de verre est

remplie d ’un gel de billes

poreuses de taille définie

• Les molécules à séparer sont

déposées en haut de la colonne

• Ces molécules sont entrainées

par un liquide nommé éluant

• Une pompe péristaltique

permet la circulation de

l ’éluant dans la colonne à un

débit fixe


Allure des profils d’élution en

chromatographie

• Les molécules de petite taille pénètrent dans les pores

de la colonne, les grosses molécules en sont exclues

⇒ les petites molécules sont éluées après un temps plus

long que les grosses molécules

•Les molécules de tailles voisines se répartissent suivant

un étalement gaussien dans la colonne ⇒ courbes de

fluorescence et de C.O.T. d’allure gaussienne

• A partir d ’une macromolécule de haut poids

moléculaire : le bleu dextran : détermination du volume

d’exclusion totale (V ex )


Résultats II : Optimisation des paramètres en

int. de fluorescence

int. de fluorescence

800

700

600

500

400

300

200

100

0

140

120

100

80

60

40

20

BD

chromatographie d’exclusion

Elution des AF Suwannee

(colonne G50 - pH 11)

sans NaCl

AF fluo (260 nm)

AF fluo (350 nm)

bleu dextran(BD)

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

Pic 1

Pic 2

Avec NaCl (0,1 M)

0

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

volume d'élution (ml)

Pic 3

Avec un éluant concentré

en NaCl (0,1 M) :

Apparition de 3 pics

correspondant à 3

classes de molécules

(ou agrégats de mol.)

de tailles distinctes pour

les AF Suwannee


Résultats II : Comparaison des profils

d’élution des SH commerciales

E l u t io n d e s a c i d e s h u m i q u e s e t f u l v i q u e s S u w a n n e e e t d e s a c i d e s

40608010120140

0

140

120

100

80

60

40

20

140

120

100

80

60

40

20

Colonne f u l v i q u e s A r mG a d50 a l e ( -c opH l o n n e 8 G-5 0 éluant - é l u a n t : N aNaCl C l 0 , 1 M 0,1 - p H M1

1 )

AH Suwannee

fluo (260 nm)

fluo (3 5 0 nm)

bleu dextran

C.O.T. (mg/l)

40 90 140 190 240 290 340

0

0

40 90 140 190 240 290 340

v o lum e ( m l)

Volume (ml)

AF Suwannee

AF Armadale

90 190 290

• Les AH et les AF ne

peuvent pas être

séparés

physiquement par

10152025303540

16

14 chromatographie

12

10 d’exclusion

8

6

4 • 2 pics correspondant

2

0

40 à 2 classes de taille

35

30 distinctes sont

25

20

15 présents dans les 3

10

5 catégories de MO


R a,c

Résultats II : valeur du rapport RA,C des

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

0.32

0.53

0.43

0.52

0.32

pics 1, 2 et 3

AH Suwannee AF Suwannee AF Armadale

0.45

0.56

0.2

pic 1

pic 2

pic 3

• La valeur de R A,C

évolue de façon

similaire pour les 3

catégories de SH

• Il n’existe pas de

linéarité entre

R A,C et la taille

des fractions


Conclusion

Le rapport R A,C n’est pas exploitable directement

puisqu’il n’est spécifique

⇒ Ni d’un catégorie de MO (AF ou AH)

⇒ Ni directement de la taille des molécules

L’hypothèse de Mounier et al. (1998) n’a pas été

confirmé


Perspectives 1

1 - Etude d ’autres M.O. :

⇒ Présence des pics 1, 2 et 3 ?

⇒ Valeur de R A,C ?

2 - Optimisation des paramètres en

chromatographie :

⇒ Meilleure résolution


int. de fluorescence

int. de fluorescence

120

100

80

60

40

20

0

120

100

80

60

40

20

0

Elution des AH Suwannee

(colonne G50 - éluant NaCl 0,1 M - pH 11)

50 100 150 200 250 300

volume d'élution (ml)

Elution du pic 2 des AH Suwannee

(colonne G50 - éluant NaCl 0,1 M - pH 8)

Perspectives II

AH fluo (260 nm)

AH fluo (350 nm)

simulation

bleu dextran

50 100 150 200 250 300

volume d'élution (ml)

AH fluo (350 nm)

AH fluo (260 nm)

Séparation physique de

molécules, ou amas de

molécules, de tailles

distinctes :

•Analyse fine de la

structure moléculaire de

ces fractions

•Comparaison entre les

fractions de taille similaires

appartenant à des SH

différentes

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