Manuscrit - laboratoire PROTEE - Université du Sud - Toulon - Var

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Manuscrit - laboratoire PROTEE - Université du Sud - Toulon - Var

Caractérisation de la matière organique

dans différents types de sols de la région

des monts Bambouto, Cameroun

Romain Achard, Gaël Durrieu* (tuteur)

*Laboratoire PROTEE, Université du Sud Toulon Var, France

Résumé : L’objectif de ce stage est de caractériser la matière organique présente dans

différents types de sols prélevés dans la région des monts Bambouto et de comprendre les

processus d’humification. Pour cela, on utilise un protocole d’extraction permettant la

séparation des différentes fractions du sol (fraction des acides fulviques, des acides hmiques,

les humines et la fraction non-humifiée), on analyse la teneur en carbone de chaque fraction et

on mène des études spectroscopiques pour connaître leur potentiel discriminatif des fractions.

L’ensemble des analyses de la concentration en carbone montre que les sols sont tous

de type andosol excepté BJ6ea qui est de type feriferalutite.

Les études spectroscopiques ( les index E4/E6 et Milori qui en dérivent) discriminent

les différentes fractions des sols. L’ensemble des résultats suggèrent que le processus

d’humification s’accompagne d’une augmentation du degré de condensation aromatique plus

ou substitué en groupements fonctionnels contenant de l’oxygène ou de l’azote.

Mots clés : extraction ; concentration en carbone ; processus d’humification ; études

spectroscopiques

Stage de Janvier-Février 2008

Laboratoire PROTEE - Bâtiment R

Université du Sud Toulon-Var, BP 20132

83957 LA GARDE Cedex

1


Sommaire

I . INTRODUCTION : ............................................................................................................... 3

II. Matériels et Méthodes ........................................................................................................... 3

II.1 Prélèvements des sols bruts ............................................................................................. 3

II.2 Procédure d’extraction et de séparation des HS .............................................................. 4

II.3 mesure de la concentration en carbone C organique:...................................................... 9

II.3.1 les sols bruts et les humines: .................................................................................... 9

II.3.2 les AH :..................................................................................................................... 9

II.3.3 les AF et FNH :....................................................................................................... 10

II.4 études spectroscopiques :............................................................................................... 11

II.4.1 spectroscopie UV-visible :...................................................................................... 11

II.4.2 spectroscopie infra-rouge : ..................................................................................... 11

II.4.3 spectroscopie de fluorescence 2D et 3D :............................................................... 11

III-Résultats et discussions :..................................................................................................... 12

III.1 mesure de la concentration en carbone organique total : ............................................. 12

III.2 Spectroscopie UV-visible :........................................................................................... 14

III-3 spectroscopie Infra-rouge : .......................................................................................... 16

III.4 spectroscopie de fluorescence 2D et 3D ...................................................................... 18

III.4.1 spectres 3D :.......................................................................................................... 18

III.4.2 Spectres 2D : ......................................................................................................... 19

IV. Conclusion : ....................................................................................................................... 21

Liste des abréviations :

AF : Acide Fulvique

AH : Acide Humique

FNH : Fraction non humique

IR : Infra-Rouge

MO : Matière organique

SH: Substance humique

SISH: Société internationale des Substances Humiques

TF : Transformée de Fourier

? : longueur d’onde

2


I . INTRODUCTION :

La région de Baranka au Cameroun est de type andosol (andique ferralitique)

riche en matière organique MO (10% de carbone dans le sol) de couleur noire (en

opposition aux sols feriferalutiques rouges). Cette région présente différents types de

sols : sols cultivés, écobués, jachères et sols sous couverts naturels. D’où l’importance

de connaissances adéquates sur la MO et sa répartition en carbone organique et

inorganique dans les différentes fractions que sont : les acides fulviques (AF), les

acides humiques (AH), les humines (HU) et la fraction non-humifiée (FNH)

nécessaires pour comprendre les différents processus agissants sur le devenir du

carbone. De nos jours, la détermination des Substances Humiques (SH) d’extraits

solides et liquides est principalement basée sur l’analyse du carbone organique total

correspondant aux AF (soluble à tout pH), AH (solubles à pH basique) et aux HU

(insolubles à tout pH) (Stevenson, 1994). La Société internationale des substances

humiques SISH propose une méthodologie d’extraction des SH et du matériel non

humique.

Différentes techniques analytiques (et les index qui en dérivent) présentent le

potentiel de caractérisation des SH des sols, la spectroscopie UV-visible (index

numérique : ratio entre l’absorbance à 465 et 665 nm (E4/E6)), infra-rouge (IR) et de

fluorescence (index de Milori) (Senesi, 1991).

Le but de ce travail est de caractériser la MO par extraction et séparation des fractions

d’AF, AH, HU et FNH des sols bruts camerounais, de calculer la concentration en

carbone des sols bruts et des différentes fractions les composant. Un autre objectif sera

de connaître la capacité de la spectroscopie UV-vis, d’IR et de fluorescence à

caractériser les différentes fractions des sols et de comprendre les processus liés à

l’humification de la matière organique.

II. Matériels et Méthodes

II.1 Prélèvements des sols bruts

Les différentes caractéristiques des échantillons à analyser sont réparties dans le

Tableau n°1 suivant :

3


Tableau n°1 nature des échantillons :

Echantillons

Nature de la

roche

mode de mise en

valeur de la parcelle

durée de

mise en

valeur

Me>10a basaltique Culture >10 ans

BC>10a Trachyte Culture >10 ans

MJ>10a basaltique friche >10 ans

BJ>10a Trachyte friche >10 ans

MBJ10Ae basaltique Ecobuage 5-10 ans

BJ6ea Trachyte Ecobuage 5-10 ans

MeNA basaltique couvert naturel

BNAa Trachyte couvert naturel

position des

prélèvements

0-10 cm

Ces sols ont été prélevés dans la région des monts Bambouto au Cameroun.

Les sols commençant par la lettre B sont de la région de Baranka.

II.2 Procédure d’extraction et de séparation des HS

L’extraction et la séparation des HS des sols se fait selon le protocole suivant

issu de l’ISSH avec quelques adaptations nécessaires car nous ne travaillons pas

forcément dans les conditions requises pour suivre le protocole tel quel.

4


Protocole d’extraction ISSH :

Etape 1 :

Etape2 :

1 gramme de sol tamisé et séché à l’air +

30 mL de HCL (1M) :solution à pH 1

Puis agitation 1 heure

Puis centrifugation 30 min à

2800 tours/minutes

Résidu (R1) Surnageant(S1)

+ 15 mL de NaOH (0.1M) passage sur résine DAX-8

+ 15 mL de NaOH (1M) (3mL), débit=50mL/h

Solution à pH 13

Puis bullage sous azote 5 min Chargement de l’échantillon

Puis agitation 4 heures sous azote Puis 10mL d’eau Milli-Q.

Puis repos 12 à 16 h (fraction passante= FNH)

Centrifugation 30 min à Elution avec 10 mL de

2800 tours/minutes NaOH(0.1M),

Puis 20mL d’eau Milli-Q

(fraction passante=AF)

Surnageant(S2) Résidu(R2) AF(S1)

Séchage (60°C)

HUMINE

FNH(S1

5


Etape 3 :

Etape 4 :

+ 20 mL de HCl (6M), pH solution=1

Puis repos de 12 à 16 h

Puis centrifugation 30 min à 2800 tours/min

+ 25 mL de NaOH(0.1M) passage sur résine DAX-8

+ 20 mL de NaOH (1M) (6 mL), débit 90 mL/h

Puis bullage sous azote Chargement de tout

pendant 5 min l’échantillon 30 mL d’eau

Milli-Q (FNH passe)

AH (S4)

Surnageant (S2)

Résidu(R3) Surnageant (S3)

FNH (S3) +

FNH (S1)

Elution avec NaOH(0.1M)

Puis 30 mL d’eau Milli-Q

(AF passe)

Plus 10 mL HCl 6M plus 10mL HCl 6 M

complété à 250 mL complété à 200 mL

avec de l’eau MQ avec de l’eau MQ

dans une fiole dans une fiole

Détails sur le protocole d’extraction et de séparation des SH :

A-1-Préparation des solutions nécessaires à l’extraction :

Acide HCl 6 M à partir de HCl 37.5%, d =1.18 ; pureté 99,9%

Acide HCl 1 M par dilution au 1/6 de la solution HCl 6 M

AF (S3) +

AF (S1)

6


NaOH 0,1 M à partir de 4 g de pastilles de soude anhydre (pureté = 99,98%) dans 100

mL d’eau MQ

NaOH à 0,1 M par dilution de la solution de NaOH 1M au 1/10

A-2-Rôle des solutions HCl et NaOH à chaque étape :

Etape 1 :l’acidification solubilise les AF et fait précipiter les AH (après

centrifugation : les AF seront dans S1 et les AH dans R1 avec les humines).

Etape 2 : l’alcalinité solubilise les AH (après centrifugation : les AH seront dans

le S1 et les HU dans le R2).

Etape 3 : l’acidification à le même rôle que dans l’étape 1 (après centrifugation :

les AF restant se retrouvent dans S3 et les AH dans R3).

Etape 4 : la soude resolubilise les AH

B- tableau des masses des sols bruts pesées à l’étape1 :

Tableau n°2 masse des sols bruts :

Masse des sols bruts

tamisés, secs et

nettoyés des racines en

gramme

BJ6ea 1.007

BJ>10a 1.004

BC>10a 1.006

BNAa 1.005

MJ>10a 1.002

MeNA 1.009

ME>10 1.00102

MBJ10Ae 1.009

C- tableau des masses des humines pesées après séchage à

l’étuve (60°C) :

Tableau n°3 masse des humines :

Masse des fractions S1

Humines en g

Echantillons

BJ6ea 0.799

BJ>10a 0.7690

BC>10a 0.801645

BNAa 0.7322

MJ>10a 0.8001

MeNA 0.7548

ME>10a 0.7884

MBJ10Ae 0.8276

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D-Préparation de la résine DAX-8 :

Procédure d’humification de la résine :

On place la résine dans un bécher puis on ajoute du méthanol couvrant de 2,5 à

5 cm la résine.

On agite doucement pendant 1 min suivi d’un repos de 15 min, la résine va se

gonfler progressivement.

On remplace le méthanol par de l’eau MQ sous agitation douce puis repos de 5

à 10 min.

On veille à laver la résine plusieurs fois de sorte que toute trace de méthanol

soit éliminée, on évite ainsi les pollutions carbonées

E-Préparation des colonnes et utilisation :

On verse la résine dans la colonne pré-hydratée, on évacue l’eau MQ par le

robinet (la résine décante) en laissant un volume d’eau au dessus du lit de la résine.

Chargement de la résine :

l’échantillon passe au travers de la colonne où les composés recherchés

s’adsorbent (adsorption est un phénomène d’équilibre, le produit adsorbé ne l’est

jamais totalement).

Elution du composé adsorbé :

Avant l’élution, on fait passer de l’eau MQ de façon à bien éliminer les

composés non recherché (FNH). Puis élution avec la soude où l’on récupère la

fraction d’acide fulvique.

F-Rôle de l’azote :

L’azote permet de maintenir une atmosphère inerte empêchant la pollution de

l’échantillon par le CO2 atmosphérique.

I-Centrifugation :

ON utilise une centrifugeuse Sigma. Il est nécessaire de bien équilibrer les

tubes. Les masses des tubes avant centrifugation sont regroupés dans les tableaux n°*

qui se trouvent en annexe.

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II.3 mesure de la concentration en carbone C organique:

Les mesures de carbone organique sont effectuées avec un analyser de carbone

organique (TOC) SHIMADZU sous débit oxygène pur.

Les échantillons solides sont mesurés à l’aide d’un module d’analyse solide SSM-

5000A.

Les échantillons liquides sont transmis au four par un passeur automatique ASI-V

SHIMADZU (programmation de différentes analyses sur une série d’échantillon).

II.3.1 les sols bruts et les humines:

Avant toutes mesures, il est nécessaire de faire une droite de calibration sur laquelle on

reportera nos mesures.

On utilisera le glucose (1 ; 2 ; 5 ; 10 mg de carbone) pour la gamme étalon car comme

les HU et les sols bruts, sa combustion (ici 900°C) libèrent du CO2 qui sera analysé

par la cellule de détection.

Pour faire une mesure d’échantillon solide :

1- on attend la stabilisation du bruit de fond, que le four soit à 900°C sous un

débit d’oxygène pur à 0,4 L / minutes

2- on brûle les barques où seront placés les échantillons de manière à éliminer

toute trace de carbone sous forme de CO2

3- on place une masse (que l’on note sur l’interface de l’appareil) dans une

barque que l’on place dans le four

4- la combustion du carbone donne du CO2 qui sera détecté par une cellule

courte

5- entre deux mesures on attend 3 minutes avant de lancer la détection de telle

sorte que le CO2 atmosphérique ne pollue pas les mesures (lorsque que l’on

ouvre le module, on se situe dans le système).

II.3.2 les AH :

On utilisera différentes solutions d’hydrogénophtalate HPK (par dilution automatique,

à partir d’une solution mère de 250 ppM ) pour effectuer la droite de calibration qui

permettra de connaître la concentration en carbone total (TC) de la fraction AH . Des

solutions de mélange de carbonates et de bicarbonates sont utiliser afin de réaliser

deux droites de calibration en carbone inorganique (IC) pour connaître la

concentration en carbone inorganique des AH.

Le carbone organique total (TOC) est égal au carbone total retranché du carbone

inorganique (TOC = TC – IC).

9


Pour effectuer la mesure d’un échantillon liquide :

1- on vérifie que le bruit de fond est constant et que le four soit à 680°C, on

travaille sous flux d’oxygène pur (0,1 L/minute) de façon à ne pas être

contaminé par le CO2atmosphérique

2- on vérifie les niveaux d’eau Milli-Q hors de l’appareil et dans l’appareil (

entre HI et LO)

3- on vérifie qu’il n’y ait pas de bulle dans le drainpot et que le niveau de l’eau

se situe sous la surverse

4- on fait passer en premier un échantillon d’eau Milli-Q de manière à bien

nettoyer le système

5- on fait passer notre échantillon en indiquant sur l’interface s’il s’agit de

calibration ou d’une mesure simple

II.3.3 les AF et FNH :

On utilisera des solutions de HPK (obtenues par dilution automatique à partir d’une

solution mère à 50 ppM) pour effectuer une droite de calibration qui permettra de

connaître la concentration en carbone organique total des fractions FNH et AF.

On effectue les mesures de nos échantillons liquides en N-POC c’est-à-dire que l’échantillon

est acidifié automatique de façon à éliminer le carbone inorganique (carbonates) sous forme

de CO2.

L'analyse de l'échantillon se déroule en plusieurs étapes :

L’échantillon circule en continu dans le système. Puis, l'échantillon est acidifié

avec de l'acide sulfurique (pH < 2) et l’oxygène pur permet la purge du carbone

inorganique provenant des carbonates. Maintenant, L’échantillon contient seulement

du carbone organique.

À l'étape suivante, l'échantillon est pompé vers un catalyseur où le carbone est

oxydé et libéré sous forme de CO 2. En quittant le réacteur, le flux de CO2 gazeux

traverse le dispositif liquide de séparation de gaz avant d'entrer dans un détecteur

infrarouge NDIR, qui mesure la concentration en CO2.

Un ordinateur calcule les données du détecteur NDIR en concentration (mg/L ou

ppm). Les possibilités avancées de calibration de gaz et de liquide assurent des

résultats précis.

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II.4 études spectroscopiques :

II.4.1 spectroscopie UV-visible :

Les analyses spectroscopiques ont été réalisées avec un spectrophotomètre

HE?IOS ? à 3 unités d’absorbance utilisant une cuve en quartz de 4 mL. Balayage

entre 200 et 700 nm, vitesse= 600 nm/min, bande passante 0,5 nm.

On s’intéressera au ratio E4/E6 absorbance 465nm/665nm, ce ratio semble être

inversement proportionnel au poids moléculaire, à la taille moléculaire et à la

polymérisation, il indique aussi le degré de condensation aromatique (Chen et al, 1977

Marta Fuentes et al ,2OO6).

Tableau n°4 des solutions à analyser :

Fraction

volume fraction en

µL

Volume de NaHCO3 en

mL

AH 50 2.95

AF 100 2.90

FNH 50 2.95

II.4.2 spectroscopie infra-rouge :

volume total

en mL

On travail avec spectrophotomètre IR-TF JASCO modèle J-410, balayage entre 400 et

4000 cm -1 , résolution 4 cm -1 .

Pour effectuer des mesures d’échantillon solide, il faut créer une pastille.

Création de pastille :

1-pastille KBR : réduction en poudre fine du KBr que l’on dépose en couche mince

entre deux mâchoires polies. Puis, sous l’action d’une pression de 8 bars pendant deux

minutes, on obtient une pastille qui servira à la mesure du bruit de fond de

l’appareillage.

2-pastille à analyser : réduction en poudre fine de 10 mg de sol brut tamisé et propre

(sans racine) ou d’humines que l’on mélange avec 1g de poudre de KBr, déposés en

couche mince entre deux mâchoires polies sous l’action d’une pression de 8 bars

pendant deux minutes, on obtient une pastille qui servira à la mesure du spectre IR de

l’échantillon.

II.4.3 spectroscopie de fluorescence 2D et 3D :

Toutes les mesures sont effectuées avec un spectrophotomètre de fluorescence

Hitachi F-4500 et avec le logiciel FL SOLUTION dans une cuve en quartz de 4 mL.

Avant toutes mesures, on effectue le Raman de l’eau qui sert de mesure de bruit

de fond.

3

11


Pour toutes les mesures de fluorescence, on prépare les différentes solutions

selon le tableau suivant :

Tableau n°5 préparation des solutions à analyser :

Volume volume de

Fraction fraction en µL NaOH en mL

AH 100 2.90

AF 400 2.60

FNH

50 ou 100

2.90 ou

2.95

III-Résultats et discussions :

volume de total

en mL

III.1 mesure de la concentration en carbone organique total :

Les résultats des gammes étalon sont répartis dans les tableaux 6 ; 7 ; 8 qui se trouvent

en annexe.

Dans les tableaux suivants, sont regroupés respectivement l’ensemble des

résultats pour les sols bruts et les humines, pour les AF et les FNH ainsi que pour les

AH.

Tableau n°9 récapitulatif des concentrations pour les sols bruts :

échantillons

bruts

aire SD en % CV en %

3

Concentration

de carbone

en %

somme des

concentrations de

carbone des fractions en

%

BJ6ea 629.2 0.03 1.74 1.511 1.64

BNAa 707.3 0.02 0.24 9.42 7.451

BC>10a 647.9 2.86 8.47 6.789

BJ>10a 681.2 0.04 0.40 9.618 7.667

MeNA 705.9 0.42 3.54 11.81 9.586

ME>10a 864.6 0.19 1.58 11.83 9.941

MJ>10a 809.5 0.19 1.56 12.20 10.171

MBJ10Ae 747.3 0.40 4.47 8.988 7.847

En annexe se trouve les détails des calculs qui permettent d’effectuer la somme des

concentrations de carbone en % des fractions

12


Tableau n°11 récapitulatif des concentrations pour le humines :

HUMINES aire SD en % CV en %

concentration en

% pour la masse

d’humine

concentration en

% pour la masse

totale de sol brut

BJ6ea 289.5 0.03 1.82 1.530 1.21

BNAa 542.3 5.631 4.09

BC>10a 524.40 0.07 1.33 4.978 3.966

BJ>10a 601.3 0.21 3.57 5.895 4.515

MeNA 495.9 0.18 2.55 7.261 5.431

ME>10a 480.1 0.19 2.30 7.788 6.13

MJ>10a 522.4 0.03 0.35 8.647 6.904

MBJ10Ae 64.76 0.5 5.16 7.005 5.745

Le détail des calculs se situe dans les annexes

Tableau n°12 récapitulatif pour les AF et FNH :

AF dilués au ¼ aire SD

CV en

%

concentration en

mg/L

SD CV en %

concentration totale en

%

BJ6ea 11,49 0,16 1,41 2,869 0,4 1,37 0.23

BNAa 55,12 0,66 1,2 13,46 0,16 1,19 1.07

BC>10a 54,2 0,43 0,79 13,23 0,1 0,79 1.05

BJ>10a 54,18 0,64 1,19 13,23 0,16 1,18 1.05

MeNA 82,78 0,81 0,98 20,17 0,2 0,98 1.60

ME>10a 60,9 0,72 1,19 14,86 0,18 1,18 1.18

MJ>10a 53,29 0,59 1,11 13,01 0,14 1,11 1.038

MBJ10Ae 44,55 0,77 1,73 10,89 0,19 1,72 0.863

FNH dilué au ¼

aire SD

CV en

%

concentration en

mg/L

SD CV en %

concentration totale en

%

BJ6ea 6.982 1,16 1,53 1.645 0,28 1,53 0.16335

BNAa 70.58 0,47 1,21 17.21 0,11 1,21 1.712

BC>10a 52.61 0,75 0,97 12.85 0,18 0,96 1.277

BJ>10a 63.9 0,6 0,87 15.59 0,14 0,87 1.552

MeNA 77.3 0,13 1,85 18.84 0,03 1,85 1.867

ME>10a 75.83 0,44 0,63 18.48 0,11 0,63 1.846

MJ>10a 68.21 0,76 1,45 16.63 0,19 1,44 1.659

MBJ10Ae 38.51 0,65 1,02 9.075 0,16 1,01 0.994

Détail des calculs en annexe

13


Tableau n°13 récapitulatif pour les AH :

AH dilué au 1/10

COT en

mg/L concentration en %

BJ 6ea 1,933 0.038

B(Na)a 29,11 0.579

BC>10a 24,8 0.496

BJ>10a 27,66 0.550

MeNA 34,49 0.689

ME>10a 39,33 0.785

MJ>10a 28,58 0.570

MBJ10Ae 27.95 0.540

Dans un souci de vérification des manipulations, on vérifie que :

S [carbone] des fractions extraites d’un sol brut = [carbone] du sol brut

Les sommes des concentrations en carbone des différentes fractions sont un peu

inférieures à la concentration en carbone des sols bruts, exception pour BJ6ea qui a sa

somme légèrement supérieure à la concentration en carbone du sol brut. Ces résultats

suggèrent que les manipulations ont été correctement effectuées.

Les détails nécessaires pour effectuer les calculs ci-dessus sont dans les annexes.

Les sols de nature trachyte sont composés d’approximativement 9% de carbone

et les sols basaltiques de 11,8% seuls les sols écobués présentent des concentrations en

carbone inférieures, 1.5% pour le BJ6ea et 8.9% pour MBJ10Ae. Ces résultats

suggèrent que les sols basaltiques sont les plus concentrés en carbone et que

l’écobuage est à l’origine de la perte de carbone (perte due à la formation de CO2).

D’autre part, les humines représentent la majeure partie de la concentration en

carbone du sol suivi des FNH puis des AF. Les AH ont la concentration en carbone la

plus faible.

Chez l’échantillon BJ6ea, la concentration en carbone des AF est supérieure à celle de

la FNH.

L’ensemble des résultats suggèrent que les sols prélevés sont de nature andosol

(andique ferralitique) vu que leur concentration en carbone organique est proche de

10%. Seul BJ6ea possède une concentration en carbone de 1,5%, c’est donc un sol

plus pauvre en carbone organique qui plus est de couleur rouge, ce sol est de nature

feriferalutite.

III.2 Spectroscopie UV-visible :

Les spectres UV-visible se trouvent dans les annexes.

Les différents résultats sont regroupés dans le tableau suivant :

14


Tableau n°14 des ratios E4/E6 :

FNH Ratio E4/E6

BJ6ea 2.021

BNAa 1.679

BC>10a 2.15

BJ>10a 1.129

MeNA 0.446

ME>10a 0.942

MJ>10a 0.901

MBJ10Ae 1.390

AF

BJ6ea 2.569

BNAa 6.250

BC>10a 1.75

BJ>10a 1.579

MeNA 2.875

ME>10a 3.395

MJ>10a 3.258

MBJ10Ae 1.927

AH

BJ6ea 3.616

BNAa 7.440

BC>10a 4.200

BJ>10a 4.683

MeNA 5.377

ME>10a 4.879

MJ>10a 4.122

MBJ10Ae 5.693

Les valeurs du ratio E4/E6 indiquent sur la taille et le poids moléculaire, le

degré de condensation aromatique et de polymérisation. De larges valeurs sont

caractéristiques de composés de petites tailles et de faibles poids moléculaire, de la

présence de cycle aromatique (la condensation aromatique est un processus

d’humification) et de non polymérisation, ces composés sont facilement transformés

dans le sol(Chen, 1977 et Mafra et al, 2006) .

Les résultats du tableau ci-dessus montrent que pour chaque type de sols, excepté

BC>10 A, les ratios E4/E6 des AH est supérieur à celui des AF qui lui-même est

supérieur au E4/E6 des FNH. Ces résultats signifient que les AH par rapport aux AF

sont de plus faible taille et poids moléculaire, sont moins polymérisés et ont un plus

haut degré de condensation aromatique. De même, les AF en comparaison avec les

FNH sont de plus petite taille et faible poids moléculaire, sont moins polymérisés et

ont un plus haut degré d’aromaticité. Donc la FNH est polymérisée, de taille

importante et de haut poids moléculaire.

15


III-3 spectroscopie Infra-rouge :

Les bandes inférieures à 600 cm -1 et supérieures à 3800 cm -1 ne sont pas prises

en compte pour tous les échantillons car on se situe dans les limites de détection de

l’appareillage, donc l’interprétation des spectres IR commence pour 600 cm -1 et se

termine à 3800 cm -1 .

La large bande autour de 3400 cm -1 est associée à la vibration d’élongation de

la liaison O-H. La bande à 2361 cm -1 correspond à la vibration de valence de la liaison

C=C. La bande intense autour 1600-1700 cm -1 est attribuée à la vibration de valence

de la liaison C=C des cycles aromatiques et l’élongation de la liaison C=O d’amide. La

bande entre 1380-1396 cm -1 correspond à la vibration de déformation la liaison CH3.

La bande à 1510 cm -1 est attribuée à la vibration de déformation de la liaison de la

liaison N-H et à la vibration d’élongation de la double liaison C=N. La bande à 1040

cm -1 est généralement associée à la vibration d’élongation de la liaison C-O de

polysaccharide. La bande à 910-920 cm -1 est attribuée à la vibration de déformation de

la liaison O-H de groupement acide, celle à 790-800 cm -1 à la vibration de

déformation de la liaison C-H de cycle aromatique contenant 3H adjacents.

La détermination des bandes est appuyée sur une publication de Mafra et al

(2006)

Exemple de spectre IR (Fig 1) : (voir aussi les annexes)

Fig1 : spectre IR de sols bruts BC>10a

16


Comparaison entre les spectres IR de même type sol et différents

types de sols :

Les spectres IR des sols cultivés depuis plus de 10 ans, présentent des

composés aromatique plus ou moins substitués en groupement –OH (BC>10a semble

plus substitué que ME>10a car BC>10a possèdent d’autres pics plus fins autour de la

large bande à 3400 cm -1 ). D’autre part, BC>10a présente des bandes caractéristiques

du groupement –COOH tandis que le sol de basalte n’en possède pas.

Les sols provenant du couvert naturel présentent des spectres similaires à

quelques différences près. Les spectres montrent le caractère aromatique plus ou moins

substitués en groupement -OH des composés des sols (BNAa semble plus substitué

que MeNA). Ces deux sols présentent des composés riches en groupement –COOH.

Les spectres IR des zones de friche présentent des bandes caractéristiques de

composés aromatiques plus ou moins substitué en groupement –OH, il semble que le

sol trachyte soit plus substitué que le sol basaltique. Des différences apparaissent, le

sol BJ>10a présentent des bandes caractéristiques de groupement –COOH absentes

chez MJ>10a.

Les spectres des sols écobués présentent des bandes caractéristiques de

groupements phénoliques et de liaison alcyne, le spectre IR de MBJ10Ae présente une

bande caractéristique de groupement –COOH absente chez BJ6ea

Les différents spectres montrent que les sols bruts sont composés de matière

riche en cycles aromatiques plus ou moins substitués, riches en systèmes insaturés

(liaison alcyne), en groupement acide, en groupement contenant de l’oxygène et-ou de

l’azote.

La nature de la roche influence la composition du sol, les résultats indiquent que

les sols de nature trachyte possèdent des composés aromatiques plus substitués en -OH

que les sols basaltiques.

Tous les sols de type trachyte possèdent des composés riches en groupement

carboxylique excepté le sol écobué. L’écobuage sur sol de nature trachyte semble à

l’origine de la perte de la polysubstitution des cycles aromatiques et des groupements

carboxyliques.

Ces groupements carboxyliques se retrouvent dans MBJ10A et MeNA,

respectivement sol écobué et sol de couvert naturel de nature basaltique. Ces résultats

indiquent que la culture et la jachère sur sol basaltique serait à l’origine de la perte des

groupements –COOH.

Dans l’ensemble les spectres IR des sols se ressemblent à quelques différences

près énoncé ci-dessus sauf pour BJ6ea

Les spectres IR des humines sont quasi similaires à ceux des sols bruts, ces

observations laissent suggérer que lors de l’extraction et de la séparation une partie des

différentes fractions composants le sol se retrouve piéger dans les humines. Ces

17


ésultats suggèrent que le protocole d’extraction n’est pas parfait et qu’il faudrait

ajouter des étapes pour extraire des humines les autres fractions.

III.4 spectroscopie de fluorescence 2D et 3D

Le spectre 2D de l’eau présente une IF maximale = 82,8 pour une longueur

d’onde ? = 334,2 nm.

Tableau récapitulatif de la spectroscopie de fluorescence :

( les valeurs en 3D des ? excitation et émission sont caractéristiques des tâches de

fluorescence apparaissant sur le spectre).

III.4.1 spectres 3D :

L’ensemble des spectres de fluorescence 3D suggèrent qu’il existe des régions

spécifiques de fluorescence selon la nature de la fraction étudiée.

On observe les pics de fluorescence des FNH pour une ? d’émission entre 400-420nm

et ? d’excitation entre 320-325nm. (voir dans les annexes tableau I et fig 2).

Fig 2 : spectre 3D de la FNH de BNAa

Les AF présentent deux zones de pics pour une longueur d’onde d’émission (? ém)

entre 430-440nm et deux longueurs d’onde d’excitation (? ex) entre 290-315 nm et

250-260nm. Ces résultats indiquent que deux composés fluorophores entrent dans la

composition de la fraction des AF (Fig 3).

Exception pour le pic de BJ6C qui sort pour une ?em entre 442nm et ?ex 291nm. A

expliquer parce que

18


Fig 3 : spectre 3D de l’AF BNAa

Les AH présentent une zone de pics de fluorescence pour longueur d’onde d’émission

entre 525-535nm et longueur d’onde d’excitation entre 468-475nm. Ces résultats

soulignent que un seul produit se trouve dans la fraction des AH (Fig 4). Seul BJ6C ne

présente pas de taches dans ce domaine, il n’existe pas d’AH dans le sol BJ6C ou au

vue de la très faible concentration en carbone organique totale de la fraction AH BJ6C

(tableau I), cette fraction d’AH n’est sûrement pas composés de groupements

fluorophores.

Fig 4 : spectre 3D de l’AH BNAa

III.4.2 Spectres 2D :

19


Ces spectres sont effectués lorsque sur les spectres 3D, on se situe dans le domaine de

linéarité (Fig 5).

Fig 5 : spectre 2D d’émission de l’AH MeNA

L’index de Milori montre que les fluorophores responsables du spectre d’émission à

longueur d’onde d’excitation fixe (?ex= 465nm) sont des systèmes insaturés

possiblement présent dans les cycles aromatiques et à la substitution dans ces

structures de groupemenst fonctionnels contenants de l’oxygène et de l’azote (Milori

et al, 2002). ( plus l’intensité de fluorescence IF est grande plus la condensation

aromatique augmente). L’index de Milori permet la discrimination entre les différentes

fractions du sol. Effectivement, l’ensemble des résultats (Tableau n°15) montrent que

le maximum d’intensité de fluorescence des FNH sort pour longueur d’onde

d’émission entre 545-550nm, il en est de même pour les AF qui possèdent une IF bien

supérieure à celle des FNH. Seul l’intensité de fluorescence de la fraction Acide

Fulvique BJ6ea est inférieure à l’IF de la FNH BJ6C.

L’intensité de fluorescence maximale de la fraction AH se situe à ?em entre 516-

545nm et est largement supérieure à l’IF des fractions AF. La fraction AH BJ6ea

présente une IF maximale pour ?em=547, ce résultat est identique à la FNH BJ6ea.

Ces résultats corrélés avec ceux de spectroscopie UV-visible et IR suggèrent

que les AH sont des molécules de petite taille et de faible poids moléculaire présentant

un haut degré de condensation aromatique plus ou moins substitué par des

groupements fonctionnels contenant de l’oxygène ou de l’azote. Les AF sont de taille

et de poids moléculaire plus élevé et de degré de condensation aromatique plus faible

que les AH. Les FNH présentent des IF plus basse que les IF des AF, ce sont donc des

molécules de taille et de poids moléculaire élevés qui serait polymérisées.

20


Tableau 15 récapitulatif des résultats des spectres de fluorescence 2D

et 3D :

spectroscopie de fluorescence

échantillons 3 D 3 D

? excitation

FNH ? émission DILUTION IF ? émission (nm) ? excitation (nm) ? émission (nm) (nm)

BJ6ea 547.8 1/19 83.41 400 325

BNAa 549 1/38 151.4 415 325

BC>10a 549.4 1/38 135.5 410 324

BJ>10a 550.4 1/38 122.9 406 325

MeNA 548 1/19 76.74 420 325

ME>10a 548.8 1/19 71.11 415 321

MJ>10a 545.4 1/19 79.8 415 320

MBJ10Ae

AF

549 1/19 95.969 400 325

BJ6ea 548.2 1/19 11.5 442 291

BNAa 549.6 1/120 563.4 435 310 435 260

BC>10a 547.6 1/120 690.3 435 311 435 260

BJ>10a 547.8 1/120 532.9 435 310 435 255

MeNA 546.8 1/152 1311.6 441 315 440 260

ME>10a 551 1/120 732.6 430 310 433 255

MJ>10a 449.2 1/120 435 310 440 260

MBJ10Ae

AH

549.4 1/120 700.92 431 308

BJ6ea 547 1/60 83.64 470 280

BNAa 544.4 1/240 3002.4 533 475

BC>10a 526.4 1/240 5601.6 533 476

BJ>10a 522 1/240 5047.2 534 475

MeNA 526 1/120 4963.2 533 475

ME>10a 525.0 1/240 8762.4 535 477

MJ>10a 526.4 1/240 6756 535 475

MBJ10Ae 516.2 1/120 4970.4 525 468

zone où se situent les pics de fluorescence

IV. Conclusion :

Les différents échantillons de sols sont de nature andosol excepté

BJ6ea qui est feriferalutite. L’écobuage est une technique qui fait

perdre au sol du carbone organique sous forme de CO2 gazeux.

La corrélation des techniques spectroscopiques décrites dans le

rapport et leurs index permettent la discrimination des différentes

fractions composant le sol et nous renseignent sur le processus

d’humification de la MO. Les processus d’humification de la matière

organique s’accompagnent d’une réduction du poids et de la taille

moléculaire ainsi qu’une réduction du degré de polymérisation. De

21


plus, ces processus s’accompagnent d’une augmentation en cycle

aromatique plus ou moins substitué en groupement contenant de

l’oxygène ou de l’azote et d’une facilité de transformation moléculaire

Hypothèse de modèle d’humification de la MO :

FNH

AF augmentation de l’humification

AH

Pour approfondir les connaissances sur la matière organique, la RMN

pourrait être utile pour étudier la structure des molécules qui

composent les différentes fractions du sol (Mafra ,2006).

Remerciemment: Je tiens à remercier l’ensemble de l’équipe du

laboratoire Protée en particulier Gaël Durrieu pour sa disponibilité et son aide dans le

déroulement du stage.

Références :

Chen, Senesi, Schnitzer 1977. Information provided on humic substances by E4/E6

ratios. S653 Science Society of America journal 41, 2615-2622

Mafra, Senesi, Brunetti, Miklos, Melfi, 2006, Humic acids from hydromorphic soils of

the upper Negro river basin, Amazonas: Chemical and spectroscopic characterisation

Marta Fuentes, Gonzalez-Gaitano, Garcia 2006, The usefulness of UV- visible and

fluorescence spectroscopies to study the chemical nature of humic substances from

soils and composts, Organic Geochemistry 37 (2006) 1949-1959

Negro river basin, Amazonas: Chemical and spectroscopic characterisation. Geoderma

138 (2007) 170-176

Senesi et al, 1991. Characterisation, differention and classification of humic

substances by fluorescence spectroscopy, Soil Sci. 152, 259-271

Stevenson, F.J, 1994 Humus Chemistry, 2 nd ed. Wiley, New York

22


Listes des Tableaux et des figures :

Tableau n°1 nature des échantillons

Tableau n°2 masse des sols bruts

Tableau n°3 masse des humines

Tableau n°4 des solutions à analyser

Tableau n°5 préparation des solutions à analyser

Tableau n°6 de la gamme étalon du glucose

Tableaux n°7 des gammes étalon de HPK

Tableaux n°8 des gammes étalon d’IC

Tableau n°9 récapitulatif des concentrations en carbone pour les sols bruts

Tableau n°11 récapitulatif des concentrations en carbone pour les humines

Tableau n°12 récapitulatif des concentrations pour les AF et FNH

Tableau n°13 récapitulatif pour les AH

Tableau n°14 des ratios E4/E6

Tableau 15 récapitulatif des résultats des spectres de fluorescence 2D et 3D

Tableaux n°* récapitulatif des masses des tubes à chaque centrifugation

Fig1 : spectre IR de sols bruts BC>10a

Fig 2 : spectre 3D de la FNH de BNAa

Fig 3 : spectre 3D de l’AF BNAa

Fig 4 : spectre 3D de l’AH BNAa

Fig 5 : spectre 2D d’émission de l’AH MeNA

ANNEXES:

Détails des calculs permettant de faire la somme des concentrations en

carbone des fractions composants le sol brut :

Exemple pour BJ6ea :

1- La fraction AF = 2.86mg de carbone/L ; dilution 1/4 ; volume initiale 200 mL ;

masse de sols bruts initiales=1.001g

Concentration en % de carbone des AF :

23


(2.86*4*0.2)/1.007=2.27 mg de C/ g de sol brut

Donc pour 100g de sol brut on 0.23g de C soit 0.23%

2- La fraction AH= 1.93 mg de C/L ; dilution 1/10 ; volume initiale 20 mL.

Calcul de la concentration de C en % des AH :

(1.93 *10 *0.02)/ 1.007=0.38mg de C/ g de sol Soit 0.038%

3- La fraction FNH = 18.48 mg de C/L ; dilution 1/4; volume initiale 250mL

Calcul de la concentration de C en % des FNH:

(18.48*4*0.25)/1.007= 18.35 mg C/ g de sols soit 1.83% de C

4- Les humines = 1.53% de C pour une masse de 0.799g

Soit 1.21% de C

Détail d’appareillage (pris sur le site du laboratoire PROTEE)

Le principe du COT-mètre

La matière organique est composée notamment de carbone, dissous et particulaire, que l'on peut

doser par l'emploi d'un COT-mètre. On distingue le carbone organique total (COT) et carbone

organique dissous (COD), ainsi que le carbone inorganique qui correspond aux carbonates.

L'analyse de l'échantillon se déroule en plusieurs étapes. L'échantillon circule sans interruption

dans l'analyseur. A la première étape, l'échantillon est acidifié avec de l'acide sulfurique pour

atteindre un pH inférieur à 2 et purgé avec du gaz pour enlever le carbone inorganique. Pendant

cette étape, le carbone purgeable potentiellement existant (POC) est également eliminé. A ce

point, l'échantillon contient seulement du carbone organique.

À l'étape suivante, l'échantillon libéré du carbone inorganique est pompé vers un catalyseur. Le

carbone y est oxydé et libéré sous forme de CO 2. En quittant le réacteur, le flux gazeux de CO 2

traverse le dispositif liquide de séparation de gaz avant d'entrer dans un détecteur infrarouge

NDIR, qui mesure la concentration en CO 2 .

Un ordinateur calcule les données du détecteur NDIR en concentration (mg/L ou ppm). Les

possibilités avancées de calibration de gaz et de liquide assurent des résultats

précis.

24


Le laboratoire

s'intéresse

également à

l'influence de la

matière organique

(résidus organiques

autres que les

organismes vivants

et ceux résultants

de l'activité

humaine) sur le

devenir des

métaux. En effet,

cette partie

organique possède

des sites fortement

attracteurs des

éléments

métalliques,

empêchant ainsi

qu'ils soient

assimilables par les organismes présents dans l'environnement. Pour mieux comprendre cette

fraction organique, le laboratoire possède plusieurs appareils:

- un analyseur de carbone dissous ou particulaire. Cette donnée permet de quantifier la partie

organique.

Le principe l'analyse spectrofluorimétrique

L’analyse spectrofluorimétrique est la technique de caractérisation de la nature des

constituants de la matière organique dissoute (MOD) la mieux adaptée aux faibles teneurs

rencontrées dans les eaux naturelles (en l’absence de pollution, de quelques ppb à quelques ppm).

Dans les eaux de surface et souterraines, la fluorescence provient essentiellement des acides

organiques, principaux constituants de la MOD d’origine naturelle.

L’analyse spectrofluorimétrique ne nécessite aucun traitement préalable (comme la

reconcentration des composés sur résines à partir de volumes d’eau importants…). Elle ne

dénature pas l’échantillon. Cet avantage est important pour l’étude des interactions métauxmatière

organique. Cela représente aussi un gain de temps considérable pour les traçages qui

nécessitent l’analyse de nombreux échantillons et ne dénature pas l’échantillon.

Le principe de cette méthode repose sur le fait que de nombreux composés organiques et

inorganiques, en solution ou solide, émettent de la lumière lorsqu’ils sont excités par des photons

du domaine du visible ou du proche ultraviolet. Ce phénomène appelé fluorescence permet de

caractériser la substance analysée, puisque l’intensité maximale de fluorescence correspond à un

couple particulier de longueurs d’onde d’excitation et d’émission. En fluorimétrie, le seuil de

détection d’un composé fluorescent en solution est souvent 1000 fois plus faible qu’en

absorption UV/visible (colorimétrie). Cette technique est donc très sensible et permet de

travailler à de très faibles concentrations. Par rapport à la fluorimétrie, qui permet de doser une

substance fluorescente pour une longueur d’onde donnée, la spectrofluorimétrie fournit les

25


moyens d’identifier l’ensemble des substances en solution. L’analyse de l’échantillon s’effectue en

balayant simultanément une large plage de longueurs d’onde d’excitation et d’émission, ce qui

permet la quantification de chaque composé.

Exemple de spectres IR:

- un

spectromètre

de

fluorescence

moléculaire .

Cet appareil

permet de

caractériser les

sites de fixation

de la matière

organique, et de

déterminer la

provenance de

cette dernière

(origine marine

ou terrigène).

Spectre IR du sols bruts BC>10a en vert et en bleu sa fraction HU

26


Spectre IR des sols bruts de nature trachyte :

- vert : BNAa

- bleu : BC>10a

- jaune : BJ>10a

- rouge : BJ6ea

Spectre IR des sols bruts de nature basaltique :

- vert : MBJ10Ae

- bleu : ME>10a

- jaune : MJ>10a

- rouge : MeNA

27


Tableaux n°3 récapitulatif des masses des tubes à chaque

centrifugation :

Masse des tubes avant 1 er centrifugation en g

sans ajustement Ajustées avec HCl 1M

Echantillons pH

BJ6ea 133.26

BJ>10a

BC>10a

134.20

133.09

134.20

BNAa 133.59

MJ>10a 136.13

MeNA 136.35

ME>10a 136.36

MBJ10Ae

137.50

Masse des tubes R1 avant 2 nd centrifugation en g

sans ajustement Ajustées avec NaOH 1M

Echantillons pH

BJ6ea 134.61

BJ>10a

BC>10a

134.5

133.26

136.7

BNAa

MJ>10a

136.7

136.129

12.50

MeNA

ME>10a

MBJ10Ae

136.35

136.36

137.50

masse des tubes contenant S2 avant 3ième centrifugation en g

Sans ajustement ajustées avec HCL 6M

Echantillons pH

BJ6ea 145.55

BJ>10a

BC>10a

145.06

147.86

149.4

BNAa

MJ>10a

149.38

149.72

1

MeNA

ME>10a

149.87

149.72

150.0

MBJ10Ae 149.99

Tableau n°6 de la gamme étalon du glucose :

gamme étalon de glucose

mg de carbone aire SD en % CV en %

1 131.3 4.08 2.88

2 303.9 0.84 0.27

5 570.6 1.07 1.83

10 1104 2.98 0.27

Déviation standard (SD) ; Coefficient d’erreur (CV)

1

28


Tableaux n°7 des gammes étalon de HPK :

gamme étalon de HPK

par dilution automatique

à partir d'une solution

mère à 250 ppM

aire SD en% CV en %

25 ppM 99,63 1 1

50 ppM 205,6 1,07 0,52

100 ppM 392,1 17,6 4,49

250 ppM 935,3 0,895 0,96

gamme étalon HPK

par dilution

automatique à

partir d'une solution

mère à 50 ppM

aire SD en % CV en %

2.5 ppM 10,29 0,05 0,45

10 ppM 40,66 0,2 0,5

25 ppM 102,4 0,32 0,31

50 ppM 205,9 0,53 0,26

Tableaux n°8 des gammes étalon d’IC :

gamme étalon IC0 (en mg/L)

par dilution automatique à

partir d'une solution à 20 mg/L

(volume injection=50µL)

Aire SD en % CV en %

1 3.917 0.04 1.01

5 21.13 0.05 0.26

10 42.07 0.34 0.80

20 84.21 0.21 0.25

Gamme étalon IC0 (en mg/L)

par dilution automatique à

partir d'une solution à 100

mg/L (volume injection=50µL)

Aire SD en % CV en %

10 40.12 0.07 0.18

20 83.25 0.46 0.55

50 210.9 1.68 0.80

100 429.2 0.62 0.15

29

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