maenas (intertidal zone) and Segonzacia mesatlantica - Station ...

THESE DE DOCTORAT DE
L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
Spécialité
Physiologie Intégrée des Invertébrés
(Ecole doctorale Inter///Bio)
Présentée par
M. Matthieu BRUNEAUX
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR de l’UNIVERSITÉ PIERRE ET MARIE CURIE
''Réponse adaptative à court terme et
plasticité phénotypique des hémocyanines de
Crustacés Décapodes : l'exemple de Carcinus
maenas et Segonzacia mesatlantica''
soutenue le 18 décembre 2008
devant le jury composé de :
Dr. Franck ZAL, CNRS, Station Biologique de Roscoff
Pr. François LALLIER, UPMC, Station Biologique de Roscoff
Pr. Michel SALZET, Université Lille I
Pr. Jürgen MARKL, Université Johannes Gutenberg, Mayence
Dr. Daniel THOMAS, Université Rennes I
Pr. André TOULMOND, UPMC, Station Biologique de Roscoff
Directeur de thèse
Directeur de thèse
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur

Photos de couverture : Carcinus maenas (David Busti, ENS Lyon) et Segonzacia mesatlantica (Patrick Briand, Ifremer).

i
Résumé / Abstract
Réponse adaptative à court terme et plasticité phénotypique des hémocyanines de Crustacés
Décapodes : l’exemple de Carcinus maenas et Segonzacia mesatlantica
Les hémocyanines (Hcs) des Crustacés Décapodes sont des pigments respiratoires formés de 6 ou 12 sousunités
de 75 kDa. L’existence de différents types de sous-unités et d’effecteurs allostériques permet une grande
plasticité structurale et fonctionnelle des Hcs face aux changements de conditions du milieu. L’objectif de cette
thèse était de caractériser les adaptations respiratoires à court terme au niveau de l’Hc chez deux crabes vivant
dans des milieux hypervariables, Carcinus maenas (en zone intertidale) et Segonzacia mesatlantica (près des
sources hydrothermales profondes).
L’interaction de l’Hc de C. maenas avec certains effecteurs physiologiques (L-lactate, cations divalents) a
été caractérisée par spectrométrie de masse supramoléculaire. Des sous-unités spécifiques interagissent avec le
L-lactate et toutes les sous-unités ne jouent pas le même rôle dans l’assemblage du complexe d’Hc.
Chez C. maenas, la plasticité phénotypique de l’Hc n’est pas impliquée dans les adaptations à un changement
de salinité ou à l’hypoxie à court terme. En revanche, les sous-unités interagissant avec le L-lactate sont
plus abondantes après une hypoxie longue (quelques jours).
Chez S. mesatlantica, l’Hc est intrinsèquement très affine pour l’oxygène et présente un fort effet Bohr,
mais le L-lactate et l’urate ne modulent que faiblement l’affinité de l’Hc. La plasticité phénotypique n’est pas
impliquée dans la réponse à nos conditions d’acclimatation.
Les résultats obtenus suggèrent que les adaptations respiratoires à court terme ne sont pas les mêmes dans
les deux milieux hypervariables étudiés : l’affinité de l’Hc est modulée par des effecteurs hémolymphatiques
chez C. maenas alors qu’elle est constitutivement très forte et peu modulée chez S. mesatlantica.
Mots-clés : Carcinus maenas, hémocyanine, milieu hydrothermal, physiologie respiratoire, pigment respiratoire,
plasticité phénotypique, Segonzacia mesatlantica, zone intertidale
Short-term adaptive response and phenotypic plasticity of decapod crustacean hemocyanins : the
example of Carcinus maenas and Segonzacia mesatlantica
Decapod crustacean hemocyanins (Hcs) are respiratory pigments made of 6 or 12 subunits of 75 kDa
each. Several subunit types and allosteric effectors exist, thus permitting a very high structural and functional
plasticity in order to cope with changes in environmental conditions. Our aim was to characterize short-term
respiratory adaptations at the Hc level in two crab species living in hypervariable environment : Carcinus
maenas (intertidal zone) and Segonzacia mesatlantica (deep-sea hydrothermal vents).
The interaction between C. maenas Hc and some of its physiological effectors (L-lactate and divalents
cations) was studied by supramolecular ESI-MS. Specific subunits interact with L-lactate and subunits have
different roles in the complex association.
For C. maenas, phenotypic plasticity of Hc is not involved in the response to changes in salinity or to shortterm
hypoxia. However, L-lactate sensitive subunits were more abundant after several days under hypoxia.
For S. mesatlantica, Hc affinity for oxygen is very high with a strong Bohr effect but only a low modulation
by L-lactate and urate. Phenotypic plasticity response was not observed under our acclimation conditions.
These results suggest that short-term adaptations are different in the two studied hypervariable environments
: Hc affinity is modulated by hemolymphatic effectors for C. maenas whereas it is constitutively very
high and only slightly modulated for S. mesatlantica.
Keywords : Carcinus maenas, deep-sea hydrothermal vents, hemocyanin, intertidal zone, Segonzacia mesatlantica,
respiratory physiology, respiratory pigment, phenotypic plasticity

Sommaire
Résumé
Sommaire
i
ii
1 Introduction 1
1.1 Milieux et modèles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2 Physiologie respiratoire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.3 Pigments respiratoires - présentation générale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
1.4 L’hémocyanine des Crustacés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
1.5 Questions biologiques et objectifs de la thèse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
2 La spectrométrie de masse et la diffusion de lumière appliquées à l’étude des pigments
respiratoires : article de revue 55
2.1 L’ESI-MS et les pigments respiratoires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.2 Le MALLS et les pigments respiratoires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
2.3 Article de revue ESI-MS et MALLS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
2.4 Conclusion : intérêt de la spectrométrie de masse et de la diffusion de lumière pour
l’étude de l’Hc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
3 Interaction de l’hémocyanine de Carcinus maenas avec le L-lactate et les cations divalents
: étude par spectrométrie de masse 103
3.1 Problématique et objectifs de l’étude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
3.2 Manuscrit : Structural study of Carcinus maenas hemocyanin by supramolecular ESI-
MS : interaction with L-lactate and divalent cations . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
3.3 Bilan et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
4 Etude de la plasticité phénotypique de l’Hc de Carcinus maenas 133
4.1 Introduction : la plasticité phénotypique des Hc de Crustacés . . . . . . . . . . . . . 134
iii

iv
SOMMAIRE
4.2 Objectifs de l’étude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
4.3 Matériels et méthodes communs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
4.4 Etude n°1 : Expérience préliminaire d’acclimatation à différentes salinités . . . . . . 140
4.5 Etude n°2 : Acclimatation à différentes salinités et oxygénation en laboratoire . . . . 145
4.6 Etude n°3 : Plasticité phénotypique d’une population naturelle dans un estuaire (rivière
Penzé) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159
4.7 Bilan général et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
5 Adaptations respiratoires du crabe hydrothermal Segonzacia mesatlantica 171
5.1 Segonzacia mesatlantica et le contexte hydrothermal . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
5.2 Matériels et méthodes utilisés pour l’étude d’une espèce hydrothermale . . . . . . . 176
5.3 Problématique et objectifs de l’étude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179
5.4 Manuscrit : Respiratory adaptations of the deep-sea hydrothermal vent crab Segonzacia
mesatlantica in response to hypoxia and temperature changes . . . . . . . . . 179
5.5 Bilan et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213
6 Conclusion et perspectives 215
6.1 Conclusion générale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
6.2 Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
6.3 Vue intégrée des adaptations respiratoires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222
Annexes 225
A Détermination des masses de deux complexes éluant simultanément par SEC-MALLS 227
B Détermination des distributions de masse des hexamères d’Hc de Carcinus maenas 231
Bibliographie 237
Liste des figures 252
Liste des tableaux 256
Table des matières 258

Chapitre 1
Introduction
1

2 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
Les écosystèmes marins présentent une grande diversité de conditions physico-chimiques. Les
océans et les plaines abyssales présentent généralement des conditions stables et bien tamponnées
localement, alors que la zone côtière est un environnement plus variable à l’échelle de l’année, et
la zone de balancement des marées un environnement hypervariable à l’échelle de la journée. Jusqu’à
une période relativement récente, le milieu côtier peu profond à forte biomasse était opposé aux
plaines abyssales peu densément peuplées mais présentant une plus forte diversité spécifique (Hessler
et Sanders, 1967). Un gradient similaire était observé entre la faune arctique et la faune tropicale, et
l’une des hypothèses explicatives avancées était l’existence d’un lien entre la stabilité d’un milieu et
sa diversité spécifique : un milieu stable favoriserait la mise en place de relations et d’interactions
entre les espèces pouvant déboucher sur de nouveaux événements de spéciation, alors qu’un milieu
fluctuant favoriserait la flexibilité génétique de chaque espèce et limiterait la fréquence de ces événements
(Sanders, 1968).
La découverte des sites hydrothermaux profonds des Galapagos en 1977 et des efforts d’échantillonnage
plus importants en zone côtière ont remis en cause ce paradigme. La faune profonde peut
présenter localement des biomasses très élevées autour des sources hydrothermales ainsi qu’une forte
endémicité des espèces présentes (Lonsdale, 1977) et des études présentant un effort d’échantillonnage
suffisant ont montré que la diversité côtière était au moins aussi importante que celle des grands
fonds (Gray, 2001).
Les milieux hypervariables sont donc susceptibles d’héberger de nombreuses espèces (milieu côtier)
et de fortes biomasses (milieu côtier et milieu hydrothermal profond) malgré leur caractère extrême.
Les organismes vivant dans ces environnements présentent des adaptations spécifiques leur
permettant de supporter ces conditions. Ce sont également d’excellents modèles pour comprendre
les adaptations spécifiques à certains facteurs qui peuvent être exacerbées dans ces conditions. La
compréhension du fonctionnement de ces écosystèmes ainsi que de l’histoire évolutive des groupes
qui y sont présents nécessite de connaître les adaptations physiologiques particulières aux différents
milieux hypervariables.
Dans ce contexte, l’étude de la zone intertidale et des sources hydrothermales profondes permet de
comparer deux milieux hypervariables contrastés. L’étude de deux espèces d’un même groupe mais
vivant dans chacun des milieux permet de mettre en évidence les adaptations partagées dans le groupe
et, par une approche de physiologie comparée des organismes peuplant ces biotopes, d’identifier des
mécanismes adaptatifs spécifiques. De ce point de vue, les Crustacés Décapodes représentent un taxon

3
de choix car ils ont colonisé des biotopes très variés (océans, abysses, boues anoxiques, eau douce,
milieu aérien) et de nombreuses données sont disponibles dans la littérature. Il est ainsi aisé de trouver
des espèces de Décapodes Brachyoures afin de réaliser une approche comparative de l’adaptation
physiologique aux milieux extrêmes à travers des études d’écophysiologie comparée.
L’objectif de cette thèse est d’étudier ces adaptations respiratoires au niveau du pigment respiratoire
lui-même, l’hémocyanine, sous l’aspect structural et fonctionnel. Une première partie des
travaux aborde la question de l’interaction du pigment avec certaines molécules modulatrices pour
son affinité, ainsi que la formation des complexes d’hémocyanines. La deuxième partie aborde la réponse
physiologique aux variations environnementales à court terme, en particulier au niveau de la
plasticité phénotypique du pigment. Quelles sont les modalités de l’interaction d’un pigment respiratoire
de Crustacés (hémocyanine) avec ces effecteurs ? Quelles sont les réponses physiologiques et
phénotypiques (au niveau de leur hémocyanine) de Crustacés vivant dans des milieux hypervariables
contrastés ? Quels sont les points communs et les différences entre les adaptations à la zone intertidale
et au milieu hydrothermal profond ?
Dans un premier temps, l’introduction présente les deux milieux, les modèles biologiques étudiés
et les contraintes propres à chaque milieu. La physiologie respiratoire est ensuite présentée de manière
générale, puis les pigments respiratoires dans leur globalité. Enfin, la structure des hémocyanines de
Crustacés est présentée plus en détail, ainsi que leur fonction.

4 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
1.1 Milieux et modèles
1.1.1 La zone intertidale
La zone intertidale ou zone de balancement des marées correspond à la frange côtière périodiquement
découverte à marée basse. La force à l’origine des marées est la résultante de la force centrifuge
due au mouvement de rotation de la Terre et de la Lune l’une par rapport à l’autre et de la force
d’attraction de la Lune sur la Terre. Ces deux forces se compensent exactement au niveau du centre
de gravité de la Terre, mais leur résultante est non-nulle ailleurs. Toute la matière présente dans le
système "Terre" est donc soumise à des forces de marées, y compris la croûte terrestre. Cependant,
seul l’effet sur les masses d’eau, qui peuvent être mises en mouvement, est facilement perceptible
sous la forme d’une onde de marée qui parcourt les océans. La période quotidienne des marées est
due à la rotation de la Terre qui place un point du globe à la même position par rapport à la Lune
en un peu plus de 24h (temps de rotation de la Terre sur elle-même plus le temps pour "rattraper" la
Lune qui a tourné autour de la Terre pendant la journée). Il existe une autre période de l’ordre de 14
jours correspondant au demi-cycle lunaire : l’attraction du Soleil produit également un effet de marée
qui se conjugue avec celui de la Lune lorsque les 3 astres Terre-Lune-Soleil sont alignés (marées de
vive-eau à la pleine lune et à la nouvelle lune) et s’y oppose au premier quartier et au dernier quartier
(marées de morte-eau) (figure 1.1(a)).
Selon la localisation géographique et la configuration des côtes et des bassins océaniques, le
cycle d’émersion peut être diurne, semi-diurne ou mixte. A Roscoff (Finistère), les marées sont semidiurnes
: l’émersion a lieu deux fois par jour. Des peuplements à forte densité existent dans la zone
de balancement des marées. Les organismes qui les composent sont exposés alternativement à des périodes
d’émersion et d’immersion dont la durée dépend de leur position sur l’estran et peut atteindre
plusieurs jours lors des marées de mortes-eaux pour les espèces colonisant le haut de l’estran (figure
1.1(b)).
Contraintes environnementales liées à la marée
Les conditions environnementales rencontrées durant les périodes d’émersion et d’immersion sont
très contrastées et imposent aux organismes vivant sur l’estran des adaptations particulières. Ces
organismes peuvent être fixés ou mobiles et subir la marée basse à l’air libre, immergés dans des
cuvettes, réfugiés sous les algues ou enfoncés dans le sédiment.

1.1. MILIEUX ET MODÈLES 5
(a)
(b)
FIG. 1.1 – Cycle des marées et émersion des côtes. Pris dans Turquier et Loir (1981). (a) maréegramme
présentant la période courte (environ 12h) due au mouvement de rotation de la Terre sur
elle-même et la période longue (environ 14 jours) due à la rotation de la Lune autour de la Terre. (b)
étagements des zones d’émersion sur le littoral. Selon la hauteur de la zone par rapport à la hauteur
moyenne de l’eau, l’immersion et l’émersion peuvent être quotidiennes ou espacées de plusieurs jours
pour les zones extrêmes de l’étagement.

6 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
Les principales contraintes liées à l’exposition à l’air libre sont la dessication et les changements
de température. Les individus peuvent aussi subir un stress osmotique lorsqu’ils sont en présence
d’eau de pluie. Les animaux s’isolant dans une coquille fermée pour limiter les pertes en eau (bivalves,
patelles) peuvent subir une hypoxie se mettant en place au cours de la marée basse (Truchot,
1987). Les cuvettes intertidales constituent une protection face à la dessication mais leur isolement
et leur volume limité amplifient l’effet des conditions climatiques (température de l’air, vent, ensoleillement,
pluie) et biotiques (hypoxie, hyperoxie, hypercapnie ou alcalose liées à la photosynthèse
et à la respiration) (Truchot et Duhamel-Jouve, 1980, Morris et Taylor, 1983). Le sédiment constitue
un milieu plus stable que les deux précédents car les variations thermiques sont très amorties par une
épaisseur même faible de sédiment et le milieu reste humide. Dans ce cas, la contrainte principale
devient plutôt l’hypoxie due à l’absence de renouvellement d’eau pendant la marée basse.
Les habitats de l’estran
L’estran présente une grande variété d’habitats différents qui sont déterminés par la nature du
substrat, par la hauteur par rapport au niveau moyen de l’eau, par le mode (battu ou abrité) et par
les courants, et par des facteurs biologiques (e.g. couverture d’algues, massifs d’Hermelles). Chaque
type d’habitat présente des peuplements différents.
Le substrat peut être meuble ou rocheux. Alors qu’un substrat rocheux permet l’établissement
d’algues ou d’animaux fixés et celui de brouteurs et de prédateurs associés, les substrats meubles sont
plutôt peuplés d’organismes fouisseurs psammivores ou filtreurs et de leurs prédateurs. Les conditions
hydrodynamiques du site déterminent si un substrat rocheux sera plutôt colonisé par des algues (mode
abrité) ou par des animaux fixés (Balanes et Moules en mode battu). Les courants participent aussi
à l’établissement de l’habitat en rendant possible ou non la sédimentation de petites particules, de
graviers ou de galets (figure 1.2). La présence de végétaux (herbiers de Zostères) peut également
modifier les conditions de courant localement et favoriser la sédimentation de petites particules.
Dans les zones d’estuaire, l’effet de marée peut se faire sentir jusqu’à plusieurs kilomètres à
l’intérieur des terres. L’estuaire présente une eau dont la salinité décroît en remontant le cours d’eau.
Des habitats typiques (pré salé ou schorre et estran vaseux ou slikke) existent dans ces zones. Certaines
espèces marines supportant bien la dessalure colonisent les zones estuariennes. En particulier, des
individus juvéniles d’espèces marines peuvent grandir dans ces zones en étant à l’abri de prédateurs
qui ne peuvent pas supporter l’eau hyposaline.
Chaque type d’habitat présente un ensemble de conditions physiques et chimiques propres, le plus
souvent variables selon différentes périodes (journée, saison, apériodique pour les précipitations et les
tempêtes) et qui déterminent quelles sont les espèces qui peuvent potentiellement coloniser l’habitat.

1.1. MILIEUX ET MODÈLES 7
FIG. 1.2 – Diagramme de Hjulström, pris dans Dercourt et Paquet (1978). Le diagramme présente les
vitesses de courant pour lesquelles les particules sont entraînées (transport), sédimentent, ou peuvent
être remises en suspension depuis le fond (érosion et transport). La présence d’un couvert herbacé
ralentit le courant et permet la sédimentation de particules plus fines.
L’exemple des cuvettes rocheuses émergées à marée basse et dans lesquelles d’importants peuplements
animaux et végétaux peuvent s’établir illustre à quel point ces conditions peuvent présenter des
gammes de variations importantes.
Un exemple détaillé : les cuvettes rocheuses en milieu tempéré
Le tableau 1.1 présente les valeurs extrêmes observées dans des cuvettes intertidales à Roscoff et
sur l’île de Cumbrae (Ecosse, embouchure de la Clyde) comparées à celles de l’eau libre qui recouvre
les cuvettes à marée haute. Deux échelles de temps sont présentées : d’une part les amplitudes observées
pendant des journées d’été et d’autre part l’amplitude des variations saisonnières (pour la cuvette
écossaise) (tableau 1.2). Les amplitudes observées pour la température, la teneur en O 2 , en CO 2 et le
pH sont beaucoup plus importantes dans l’eau des cuvettes que dans l’eau libre.
A l’échelle de la journée (figures 1.3(a) et 1.3(b)), les paramètres évoluent de manière cyclique
avec de brusques changements lors de la remontée du flot. Le sens et l’amplitude des variations
sont différents selon la période d’émersion (journée/nuit, hiver/été) et le peuplement des cuvettes
(présence d’algues, d’animaux). Il existe ainsi deux échelles temporelles de variations : l’échelle
quotidienne avec deux émersions par jour et l’échelle annuelle avec l’alternance des conditions saisonnières.
Quelle que soit l’échelle de temps considérée, l’amplitude des variations est toujours plus
importante dans les cuvettes que dans l’eau libre : le faible volume des cuvettes exacerbe les variations
des paramètres physiques et chimiques. A ces variations régulières et prévisibles (cycle jour-nuit

8 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
TAB. 1.1 – Paramètres physiques et chimiques de cuvettes intertidales et de l’eau de mer libre ; pris
dans Truchot et Duhamel-Jouve (1980), Morris et Taylor (1983). Données extrêmes pour Roscoff
relevées au cours d’un mois d’été (juin) ; données extrêmes pour Cumbrae relevées au mois de juillet.
Roscoff
Firth of Clyde (Ecosse)
cuvettes eau libre cuvettes
Température (°C) 12 25,5 12,5 16 11,4 25,1
Salinité () 34,1 36,7 34,5 35,2 - -
P O2 (Torr) 1,6 577 134,9 194,7 40 435
C O2 (mmol.L −1 ) 0,0027 0,836 0,225 0,31 - -
pH 7,29 10,16 8,1 8,64 8,23 8,97
Alcalinité totale (meq.L −1 ) 2,492 1,722 2,42 2,36 2,06 1,87
P CO2 (Torr) 2,72 9,5.10 −5 3,6.10 −1 7,7.10 −2 0,25 1.10 −2
C CO2 (mmol.L −1 ) 2,58 0,348 2,223 1,842 1,75 1,22
TAB. 1.2 – Paramètres physiques et chimiques de cuvettes intertidales et de l’eau de mer libre à
Cumbrae ; données extrêmes à l’échelle de l’année prises dans Morris et Taylor (1983).
Firth of Clyde (Ecosse)
cuvettes
eau libre
Température (°C) 0,5 25 5 17
Salinité () 23 36,5 28,5 35
P O2 (Torr) 18 482 65 230
C O2 (mmol.L −1 ) - - - -
pH 6,4 9,62 7,6 9,1
Alcalinité totale (meq.L −1 ) 2,65 1,69 2,53 1,87
P CO2 (Torr) 1,42 4,8.10 −3 0,55 2,2.10 −2
C CO2 (mmol.L −1 ) 2,63 0,97 2,32 1,63

(a) Evolution des paramètres de l’eau d’une cuvette rocheuse sur l’estran,
pendant l’été à Roscoff - pris dans Truchot et Duhamel-Jouve
(1980)
(b) Evolution des paramètres de l’eau d’une cuvette (gauche) et de l’eau
libre (droite) sur l’île de Cumbrae (Ecosse) pendant une journée d’été -
pris dans Morris et Taylor (1983)
FIG. 1.3 – Evolution des paramètres physiques et chimiques dans des cuvettes intertidales
1.1. MILIEUX ET MODÈLES 9

10 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
et cycle des marées) s’ajoutent des variations aléatoires mais importantes dues à l’imprévisibilité des
conditions climatiques (e. g. tempête, journée très ensoleillée, hiver froid). Ces variations superposent
un signal irrégulier aux variations périodiques attendues et participent à l’hypervariabilité de l’environnement
intertidal.
Ces variations influencent notamment la disponibilité de l’oxygène pour la fonction respiratoire
des animaux. La pression partielle d’oxygène du milieu (P O2 ) dépend à la fois de la concentration
en oxygène, de la température et de la salinité : une augmentation de la température ou de la salinité
diminue la solubilité de l’oxygène. La teneur en CO 2 et le pH du milieu peuvent induire des modifications
de l’équilibre acido-basique chez les organismes concernés, tout comme d’éventuelles réponses
d’hypo- ou d’hyperventilation à l’oxygénation du milieu. Les organismes doivent maintenir un approvisionnement
en oxygène adéquat à leurs tissus pendant la marée basse, ou réduire leur métabolisme
voire passer en métabolisme anaérobie si l’approvisionnement ne peut être assuré.
Influence des conditions de l’estran sur les peuplements
Face à ces contraintes environnementales, les organismes présentent des réponses physiologiques
et comportementales particulières à la dessication, à la température et à l’hypoxie. Certains utilisent
l’oxygène atmosphérique en communiquant périodiquement avec l’air extérieur, de manière limitée
pour éviter la dessication (Balanes, Bivalves, Gastéropodes) (Truchot, 1987). L’évaporation qui a
lieu pendant ces périodes d’ouverture peut également permettre de diminuer la température et donc
d’améliorer la résistance au stress thermique. Chez les crabes émergés comme Carcinus maenas,
la chambre branchiale se remplit d’air mais des adaptations particulières (canal marginal renforcé)
permettent de limiter l’accolement des lamelles branchiales et de préserver l’extraction d’oxygène.
Les organismes aptes à respirer dans l’air maintiennent ainsi une consommation en oxygène élevée
même à l’émersion. Pour d’autres espèces moins efficaces pour exploiter l’oxygène atmosphérique,
une dette métabolique en oxygène (liée à l’accumulation des produits du métabolisme anaérobie) peut
se constituer au fur et à mesure de l’émersion.
Les cuvettes constituent un refuge face à la dessication, mais les conditions d’hypoxie voire
d’anoxie qui peuvent s’y mettre en place lors de la marée basse peuvent conduire les organismes
mobiles à modifier leur comportement (bullage dans la chambre branchiale de Carcinus maenas) ou
à quitter la cuvette pour passer à un mode de respiration aérien.
La rapidité des changements des paramètres de l’environnement (de l’ordre de quelques heures à
quelques jours pour les stations extrêmes sur l’estran) et leur forte amplitude imposent aux organismes
des réponses physiologiques rapides pour résister à ces contraintes. Ceci est également vrai lors de
la remontée du flot et de l’envahissement d’une cuvette par la première vague d’eau libre (figure

1.1. MILIEUX ET MODÈLES 11
FIG. 1.4 – Influence du mode sur l’étagement en milieu rocheux. Un mode battu tend à déplacer vers
le haut les limites des ceintures de peuplement. Pris dans Turquier et Loir (1981).
1.3(a)). A l’échelle de l’estran, la capacité de chaque espèce à résister à des périodes d’émersion
plus ou moins longues conditionne leur répartition le long de ceintures parallèles, plus ou moins
hautes sur la côte. Le littoral présente une zonation en étages successifs, caractéristiques du régime
d’émersion et du mode battu ou abrité du site (figure 1.4). Localement, des conditions particulières
(crevasses ombragées, couverture d’algues, cuvettes) permettent à des espèces de ceintures inférieures
de remonter sur l’estran (Bournérias et al., 1995).
A ces facteurs physiologiques viennent s’ajouter des facteurs biotiques comme la compétition
entre espèces, qui modifie la répartition d’espèces dont les zones de présence sont chevauchantes. La
physiologie des organismes détermine donc leur aire de répartition potentielle sur l’estran, et leurs
performances par rapport à celles des autres espèces leur répartition effective.
1.1.2 Les sources hydrothermales profondes
La découverte des sources et la remise en cause du paradigme des fonds océaniques
Jusque dans les années 1970, les peuplements des habitats océaniques profonds passaient pour
présenter de faibles densités et une forte diversité spécifique (Sanders, 1968, Hessler et Jumars, 1974,
Hessler et al., 1988), dépendant entièrement pour leur apport en carbone organique de la matière organique
produite en surface par les producteurs primaires planctoniques et sédimentant à travers la
colonne d’eau (Kiørboe, 2001). La dégradation progressive de cette matière organique par les décomposeurs
présents dans la colonne d’eau limite fortement la quantité de matière arrivant sur le fond.

FIG. 1.5 – Localisation des principaux sites hydrothermaux profonds actuellement connus -pris dans Desbruyères et al. (2006)
12 CHAPITRE 1. INTRODUCTION

1.1. MILIEUX ET MODÈLES 13
Le flux de matière arrivant aux organismes benthiques profonds représente donc une faible biomasse
dépendant à la fois de la productivité primaire de surface et des producteurs secondaires la consommant
avant son arrivée au fond, donc de la hauteur de la colonne d’eau (Smith et al., 2008). Les
communautés d’organismes profonds peuvent proliférer ponctuellement lorsqu’un bloom en surface
augmente transitoirement la quantité de matière sédimentant jusqu’à eux ou qu’un cadavre de grand
animal coule au fond (requin, baleine) (Smith et Baco, 2003).
Lors d’une exploration géologique de la ride des Galapagos en 1977, une communauté animale
très dense fut découverte à proximité d’un site hydrothermal profond (Lonsdale, 1977, Corliss et al.,
1979). Par la suite, de nombreux autres sites furent découverts au cours de l’exploration des dorsales
océaniques et des bassins arrière-arc. Actuellement, l’existence de sites hydrothermaux est connue
le long des dorsales Est-Pacifique et Ouest-Pacifique, Atlantique et en certains points des dorsales
de l’Océan Indien et de l’Océan Arctique. Des sites actifs présentant des peuplements denses ont été
observés le long des bassins arrière-arc comme dans le Pacifique ouest et sud-ouest (figure 1.5). Des
zones importantes des dorsales océaniques restent encore à explorer, notamment le sud de la dorsale
Atlantique et la dorsale Antarctique et il est probable que de nouvelles sources seront découvertes dans
ces zones (Desbruyères et al., 2006). D’autres communautés profondes basées sur des écosystèmes
chimiosynthétiques furent également découvertes dans des zones de suintement froid, au niveau de
marges actives présentant des prismes d’accrétion ou de marges passives comme l’embouchure des
grands fleuves au niveau du Golfe du Mexique ou du Golfe de Guinée (Sibuet et Olu, 1998, Cordes
et al., 2007).
Contexte géologique et fonctionnement d’un système hydrothermal
L’hydrothermalisme sous-marin profond est lié à l’existence de zones géologiquement actives :
limites de plaques tectoniques (dorsales océaniques et bassins d’arrière-arc) et points chauds (monts
sous-marins dans l’alignement des archipels volcaniques intra-plaques). Les dorsales océaniques sont
des zones d’expansion océanique liées à l’écartement de deux plaques tectoniques, à la remontée de
matériel chaud à l’aplomb de cette zone et à la formation de croûte océanique. Ces zones du plancher
océanique présentent un réseau de fissures dans lequel l’eau de mer peut pénétrer (figure 1.6). Cette
eau s’infiltre plus ou moins profondément dans la croûte, dans des zones plus ou moins proches du
matériel chaud. Sous l’effet de la dilatation due à son échauffement, l’eau infiltrée remonte alors sous
pression vers la surface pour donner naissance au fluide hydrothermal. Ce mécanisme de dissipation
de la chaleur de la croûte avait été suggéré au début des années 1970, avant la découverte des sources
hydrothermales, en raison d’un déficit du bilan du transfert de chaleur entre la croûte et l’eau de mer
qui suggérait l’existence d’une telle circulation hydrothermale (Lister, 1972).

(a)
FIG. 1.6 – Fonctionnement d’un site hydrothermal, pris sur le site de la Woods Hole Oceanographic Institution. (a) Formation du fluide hydrothermal.
1 - l’eau de mer froide s’infiltre à travers les fissures de la croûte. 2 - O 2 et K + sont éliminés de l’eau de mer. 3 - Ca 2+ , SO 2−
4
et Mg 2+ sont
éliminés du fluide. 4 - Na + , Ca 2+ et K + sont incorporés dans le fluide à partir de la croûte environnante. 5 - le fluide atteint sa température maximale
et Cu, Zn, Fe et H 2 S de la croûte se dissolvent dans le fuilde. 6 - le fluide chaud contenant les métaux dissous remonte à travers la croûte. 7 - le fluide
hydrothermal ses mélange à l’eau de mer froide et oxygénée, les métaux et les sulfures précipitent et forment des minéraux noirs. (b) Différents types
d’émissions existant au niveau d’une source hydrothermale. 1 - l’eau de mer froide s’infiltre à travers les fissures de la croûte. 2 - l’eau de mer subit
des transformations chimiques et est chauffée à haute température. L’importance et la nature des transformations subies dépend de la profondeur
d’infiltration de l’eau de mer et de la nature de la roche. 3 - le fluide hydrothermal chaud et moins dense remonte vers la surface par un trajet canalisé
(cheminée) ou en subissant un mélange avec l’eau de mer de surface à travers le réseau de fissures. Des suintements de fluide refroidi peuvent se
former lorsque le mélange avec l’eau de mer sous le plancher océanique est important (diffuseurs). 4 - les précipités de sulfures métalliques noirs
se forment à la sortie des cheminées ou sous le plancher océanique si un mélange avec l’eau de mer infiltrée a lieu, conduisant à la formation de fumeurs
blancs dans ce dernier cas (précipités de silicates et d’anhydrite). Schémas pris sur http ://www.divediscover.whoi.edu/vents/chemistry.html
et http ://www.divediscover.whoi.edu/vents/basics.html
(b)
14 CHAPITRE 1. INTRODUCTION

1.1. MILIEUX ET MODÈLES 15
La composition de l’eau de mer est modifiée durant ce trajet (figure 1.6(a)). Au cours de l’infiltration,
l’eau réagit avec les roches de la croûte, réductrices, et le K + , le Ca 2+ , l’O 2 sont consommés.
Lors du rapprochement de la zone chaude, l’eau s’enrichit en d’autres composés (ions métalliques
lourds, CO 2 , H 2 S) et devient acide. Sous l’effet de la pression due au chauffage, le fluide hydrothermal
percole vers la surface. La géométrie des voies de sortie détermine la présence d’une émission
localisée de fluide très chaud, sous pression, ou bien celle de diffuseurs où le fluide est déjà dilué par
son passage dans les fissures sous-jacentes du plancher océanique (figure 1.6(b)). Le mélange entre
le fluide hydrothermal chargé d’ions métalliques et l’eau de mer froide provoque une précipitation
et la formation de cheminées hydrothermales pouvant atteindre plusieurs dizaines de mètres de haut.
Les panaches correspondant à la sortie du fluide et à la précipitation des composés minéraux sont à
l’origine de l’appellation usuelle de fumeurs pour désigner ces structures. Les fumeurs noirs correspondent
à la formation de précipités de sulfures métalliques et les fumeurs blancs à celle de silicates
et d’anhydrites. La composition du fluide de sortie peut être modifiée par la nature exacte de la croûte
encaissante, par la dilution avant la sortie au niveau du plancher océanique et par la pénétration plus
ou moins importante de l’eau de mer dans la croûte.
Le tableau 1.3 présente les caractéristiques chimiques et physiques de différents fluides hydrothermaux
(Atlantique, Pacifique) et celle de l’eau de mer du fond adjacente. Les fluides hydrothermaux
sont caractérisés par leur haute température, un pH acide, la présence d’H 2 S, de CH 4 , de métaux
dissous et l’absence d’oxygène. Suite aux échanges avec la croûte, la composition en sels majeurs
de l’eau de mer est également modifiée (variations des teneurs en Na + , K + , et Ca 2+ , élimination
du Mg 2+ ). La composition du fluide hydrothermal varie d’un site à l’autre ; ces variations sont plus
importantes entre les sites Atlantique et Pacifique du tableau 1.3 qu’entre les deux sites Atlantique.
La stabilité temporelle des zones d’émission hydrothermales dépend du type de dorsales : elle est
plus grande pour les dorsales lentes et plus faible pour les dorsales rapides. A l’échelle locale, les sites
hydrothermaux se caractérisent globalement par une durée de vie de l’ordre de la dizaine (dorsale
Sud-Est Pacifique) au millier d’années (dorsale Atlantique), certains sites pouvant être réactivés si
l’activité géologique reprend.
La zone de mélange fluide hydrothermale/eau de mer du fond
Lors des premières explorations des sites hydrothermaux des Galapagos, les communautés vivantes
qui ont été décrites étaient groupées autour des zones d’émission du fluide (Lonsdale, 1977,
Corliss et al., 1979). Au fur et à mesure de l’étude des environnements hydrothermaux et de la faune
associée, il est apparu que les organismes vivants se répartissaient dans une zone de mélange entre le
fluide hydrothermal et l’eau de mer du fond et que la source de carbone organique était une production

16 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
TAB. 1.3 – Composition du fluide hydrothermal de différents sites et de l’eau de mer du fond standard,
pris dans Charlou et al. (2000), Desbruyères et al. (2000), Chausson (2001), Hourdez et Lallier (2007),
Bris et al. (2003). EPR 13°N, site de la dorsale Est Pacifique situé à 13°N ; MAR Lucky Strike et
Menez Gwen, sites de la dorsale Médio-Atlantique situés au niveau du point triple des Açores.
EPR, 13°N MAR, Lucky Strike MAR, Menez Gwen eau de mer standard
Température (°C) 317-380 172-324 275-284 2
pH 3,2 3,65 4,2 7,8
CO 2 (mM) - 24,2 21,7 2,3
O 2 (µM) 0 0 0 250
SO 4 (mM) 0 - - 27,9
H 2 S (mM) 2,9-8,2 1,4-3,3 1,5-2 0
H 2 (µM) - 3,3-727 24-48 4.10 −4
CH 4 (mM) - 0,5-0,97 1,35-2,63 4.10 −7
Alcalinité (-0,74)-(-0,4) - - 2,3
Li (µM) 688 307 263 26
Na (mM) 560 390 315 468
Mg (mM) 0 0 0 52,9
Si (mM) 22 14,4 10 0,1
Cl (mM) 740 465 374 546
K (mM) 29,6 23,4 22,9 10,2
Ca (mM) 55 35,6 31,6 10,3
Mn (µM) 0,8-1,2 249 65,6 0,002
Fe (µM) 1,05-1,85 308 26,1 0,003
Cu (µM) - 10,6 1,9 0,004
Zn (µM) - 29 3,9 0,01
Br (µM) - 840 686 838
Rb (µM) 14,1 28,3 25,2 1,4
Sr (µM) 175 88 105 87
Cs (nM) - 196 285 2
Ba (µM) - 37 27 0,14

1.1. MILIEUX ET MODÈLES 17
FIG. 1.7 – Formation de la zone de mélange entre le fluide hydrothermal et l’eau de mer du fond sur
le site Lucky Strike, d’après Hourdez et Lallier (2007) et les données du tableau 1.3.
primaire locale par chimiosynthèse bactérienne.
Le mélange entre le fluide pur et l’eau de mer du fond crée une zone à très forts gradients présentant
une diminution de la température, de la teneur en H 2 S et en métaux lourds depuis la source
vers l’extérieur, et une augmentation de la teneur en oxygène et du pH (figure 1.7). Ces gradients
présentent globalement une géométrie concentrique autour du site d’émission et sont à l’origine de
variations spatiales des conditions physiques et chimiques à petite échelle (figure 1.8).
Une caractéristique importante de l’émission du fluide est sa variabilité temporelle : l’intensité du
flux varie fortement et provoque un décalage spatial des gradients au cours du temps. La variabilité
temporelle existe à petite échelle (figure 1.8) mais aussi sur des périodes plus longues (cycle de
marées, cycle d’activité des fumeurs) (Chevaldonné et al., 1991). Il existe aussi une variabilité spatiale
à grande échelle dans la mesure où les sources ont une durée de vie limitée : des sources s’éteignent
et d’autres apparaissent le long de la dorsale au fur et à mesure de l’expansion océanique.
La zone dans laquelle vivent les communautés hydrothermales est donc caractérisée par de très
forts gradients des conditions physiques et chimiques et par une grande variabilité spatio-temporelle
des émissions.
Les producteurs primaires des écosystèmes hydrothermaux profonds
Dès la première description des sites hydrothermaux, la concentration locale de nombreux organismes
formant une biomasse importante et contrastant avec la faible biomasse abyssale a interpellé
les scientifiques ; les premières hypothèses émises pour expliquer l’origine de cette forte biomasse
étaient une concentration locale de matière organique détritique par les courants de convection dûs
aux fumeurs (les premiers organismes observés étaient des filtreurs) ou une production primaire chimiosynthétique
bactérienne (Lonsdale, 1977). Il s’est finalement avéré que la production primaire
était effectivement assurée par des organismes chimiosynthétiques.

18 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
FIG. 1.8 – Fluctuations des conditions physiques et chimiques près d’un diffuseur hydrothermal, pris
dans Desbruyères et al. (2001). La température et les concentrations en sulfures et en nitrites sont
mesurées au niveau de différents organismes situés près du diffuseur (petites moules, grandes moules,
crevettes) ainsi que directement dans le fluide émis par le diffuseur.
La synthèse de matière organique par des producteurs primaires nécessite une source d’énergie
(couple oxydo-réducteur) et une source de carbone inorganique. A la surface, l’énergie nécessaire à
la fixation du carbone inorganique provient en général de la photolyse de l’eau (photosynthèse). Au
niveau des sources hydrothermales, elle provient de l’oxydation de composés réduits présents dans le
fluide par des bactéries (chimiosynthèse). Les composés réduits peuvent être le sulfure de dihydrogène
H 2 S, le méthane CH 4 , le dihydrogène H 2 , l’ammonium NH + 4
ou le fer Fe(II). Les équations-bilans
suivantes permettent de comparer les deux processus :
Photosynthèse :
Chimiosynthèse (exemple) :
H 2 O+NADP + + ADP+P i
hν
−→ 1 2 O 2 + NADPH + H + + AT P
HS − + 2O 2 + ADP+P i → SO 2−
4
+ H + + AT P
Dans le cas de la photosynthèse, l’énergie provient du rayonnement lumineux ; dans le cas de
la chimiosynthèse, elle provient de la différence de potentiel d’oxydo-réduction entre le donneur et
l’accepteur d’électrons qui rend l’échange d’électrons possible.
L’énergie produite permet la fixation de carbone inorganique dans des molécules organiques. La
source de carbone inorganique est le CO 2 atmosphérique dans le cas de la photosynhtèse et le CO 2 ou
le CH 4 contenus dans le fluide dans le cas de la chimiosynthèse hydrothermale (on utilise l’appellation
"carbone inorganique" pour désigner le carbone du méthane par abus de langage, pour l’opposer au
carbone incorporé dans des sucres).

1.1. MILIEUX ET MODÈLES 19
FIG. 1.9 – Différentes voies de fixation du carbone chez les chimioautotrophes des sources hydrothermales
profondes (pris dans Nakagawa et Takai (2008). (a) cycle de Calvin-Benson, (b) cycle rTCA,
(c) cycle 3-HP et variante 3-hydroxypropionate/4-hydroybutyrate (3-HP/4-HB) en bleu, (d) voie réductrice
de l’acétyl-CoA. Les enzymes clés de chaque voie sont indiquées en rouge.

20 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
Différentes voies biochimiques permettant cette fixation du carbone inorganique ont été mises en
évidence dans les écosystèmes hydrothermaux (figure 1.9) : le cycle de Calvin-Benson (également
utilisé par les organismes photosynthétiques) utilisé par les ε-protéobactéries et plus récemment le
cycle inverse des acides tricarboxyliques (reductive TriCarboxylic Acid cycle, rTCA cycle) utilisé
par les γ-protéobactéries, le cycle du 3-hydroxypropionate (3-HP) et la voie réductrice de l’acétyl
coenzyme A (acetyl-CoA). Ces voies présentent des rendements énergétiques différents (3 molécules
d’ATP par CO 2 fixé avec le cycle de Calvin-Benson, 1 molécule d’ATP par CO 2 fixé avec le cycle
rTCA) et certaines de leurs enzymes présentent des sensibilités différentes à l’oxygène. Le cycle
rTCA est ainsi utilisé par les bactéries présentes dans les zones anoxique et hypoxique des gradients
de mélange fluide/eau de mer du fond et le cycle de Calvin-Benson dans les zones hypoxique et
normoxique (Nakagawa et Takai, 2008).
Les bactéries sont présentes libres dans l’eau, à la surface des édifices hydrothermaux, ou au
sein de symbioses avec des animaux. Ces symbioses sont un des aspects originaux des écosystèmes
hydrothermaux et sont présentes dans différents phylums (e.g. Annélide Siboglinidé Riftia pachyptila
dont l’endosymbionte possèdent à la fois des enzymes caractéristiques des cycles de Calvin-Benson
et rTCA, Annélide Térébellidé Alvinella pompejana, Mollusques Lamellibranches Bathymodiolus sp
et Calyptogena magnifica, Crustacé Décapode Rimicaris exoculata). Les consommateurs secondaires
peuvent être des brouteurs de bactéries ou des prédateurs (e.g. Gastéropode Alviniconcha hesslerii,
Crustacé Décapode Segonzacia mesatlantica).
Les communautés hydrothermales, relation avec le milieu, contraintes du milieu pour les organismes
Les gradients physiques et chimiques du milieu définissent des ceintures concentriques de répartition
des espèces autour du site d’émission, en fonction de leur résistance à la température, à l’hypoxie
et aux composés toxiques, de leur besoins métaboliques (approvisionnement des symbiontes) et de la
compétition inter-spécifique. On observe ainsi comme sur l’estran une zonation avec des assemblages
faunistiques caractéristiques depuis le pôle chaud jusqu’au pôle froid. Des espèces opportunistes bathyales
mais non endémiques des sources hydrothermales sont observées à proximité des sites et
viennent s’alimenter sur la biomasse locale (e.g. le crabe bathyal Chaceon affinis).
Les communautés de la dorsale Médio-Atlantique sont dominées par les crevettes Rimicaris exoculata
et les moules Bathymodiolus sp.. Au sein d’un même site, ces espèces se répartissent selon un
gradient depuis la zone d’émission et le haut des cheminées, où Rimicaris exoculata est l’espèce la
plus abondante (T° max 25°C), jusqu’aux zones plus diluées colonisées par les moulières de Bathymodiolus
sp. (T° 6-10°C). Au gradient de température décroissant se superpose un gradient décroissant

1.1. MILIEUX ET MODÈLES 21
(a)
(b)
FIG. 1.10 – Spécimens de Carcinus maenas. (a) vue dorsale d’un crabe capturé à Roscoff (photo
David Busti, ENS Lyon). (b) Juvénile de Carcinus maenas sur un sédiment grossier, à marée basse
(île Callot)
de sulfures, de CO 2 et de CH 4 et un gradient croissant de pH et d’oxygénation. Les crevettes Mirocaris
fortunata, Chorocaris chacei et le crabe Segonzacia mesatlantica sont plus opportunistes et
se déplacent sur l’ensemble du gradient. Il existe également une différence de répartition selon la
profondeur des sites, les moules étant les plus abondantes sur les sites les moins profonds (Menez
Gwen, Lucky Strike) et les crevettes R. exoculata sur les sites les plus profonds (Snake Pit, TAG)
(Desbruyères et al., 2001).
1.1.3 Modèles biologiques : les Crustacés Décapodes Brachyoures
Modèle littoral : le crabe vert Carcinus maenas
Carcinus maenas (crabe vert ou crabe enragé) est un Crustacé Décapode Brachyoure de la famille
des Portunidés (figure 1.10). Il s’agit d’une espèce commune originaire des côtes européennes de
l’océan Atlantique. Carcinus maenas vit dans la zone intertidale et dans la zone circalittorale. Il est
euryhalin, hyperosmorégulateur et supporte très bien l’eau dessalée des estuaires (Péqueux, 1995).
Carcinus aestuarii (ou Carcinus mediterraneus) est une espèce proche vivant en Méditerranée. Des
études génétiques ont montré qu’il s’agissait bien d’une espèce différente (Geller et al., 1997) ; les
individus des deux espèces peuvent être distingués par leur morphologie (Yamada et Hauck, 2001).
La taille adulte de Carcinus maenas est d’environ 70-90 mm (largeur du céphalothorax). On peut
le trouver à marée basse dans les mares et sous les algues entourant les rochers. Il vit aussi bien sur
substrat rocheux que sableux ou vaseux. Sa résistance lui a permis de coloniser de nombreux sites en
dehors de son aire de répartition naturelle et il est à présent considéré comme une espèce invasive sur
les côte nord-est et nord-ouest des Etats-Unis, en Californie et en Australie (Carlton et Cohen, 2003)

22 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
FIG. 1.11 – Répartition de Carcinus maenas pris dans Carlton et Cohen (2003) ; en noir et points
noirs, distribution actuelle et observations ponctuelles, en gris, aire de répartition potentielle.
(figure 1.11).
Carcinus maenas est un modèle classique de physiologie pour les Crustacés Décapodes et une
littérature abondante est disponible.
Modèle hydrothermal : le crabe Segonzacia mesatlantica
Segonzacia mesatlantica (Williams 1988) est un Crustacé Décapode Brachyoure de la famille
des Bythograeidés. Tous les crabes endémiques des sources hydrothermales profondes actuellement
connus appartiennent à cette famille (Desbruyères et al., 2006). Segonzacia mesatlantica a été observé
uniquement au niveau de la dorsale Médio-Atlantique, et représente actuellement la seule espèce de
crabe hydrothermal connue sur cette dorsale.
Segonzacia mesatlantica est opportuniste et vit dans la ceinture tiède où il se nourrit essentiellement
de crevettes (Colaço et al., 2002). Contrairement aux crevettes Rimicaris exoculata, il ne
développe pas de symbiose avec des bactéries. Il peut atteindre une taille adulte de 40 mm (largeur
du céphalothorax). Les individus collectés ont une carapace de couleur blanche qui peut prendre une
apparence orangée ou marron lorsqu’elle est couverte d’oxydes métalliques (figure 1.12). Certains
crabes peuvent être recouverts de bactéries filamenteuses sur l’extérieur de leur carapace.
Lorsqu’il est observé sur les sites hydrothermaux, il est très actif et se déplace sur les moulières
et au sein des essaims de crevettes. Des individus ont été observés sur le sédiment meuble, hors de la
zone d’effet du fluide hydrothermal, ainsi qu’à proximité immédiate des zones d’émission du fluide.
Les densités observées sont généralement faibles comparées à celle des crevettes : de 5 à 10 individus

1.2. PHYSIOLOGIE RESPIRATOIRE 23
(a) (b) (c)
FIG. 1.12 – Spécimens de Segonzacia mesatlantica capturés pendant la campagne Momareto 2006
sur la dorsale Médio-Atlantique, au niveau du point triple des Açores. Largeur approximative du
céphalothorax (adulte) : 4-5 cm. (a) Spécimen couvert d’oxydes - vue de dos. (b) Spécimen sans
oxydes - vue de face. (c) Larve de Segonzacia mesatlantica. Photos Patrick Briand, Ifremer.
par m 2 , localement de 40 à 50 petits individus par m 2 au sein des moulières (Chausson, 2001). D’après
des données isotopiques, les crabes se nourrissent plutôt de crevettes et non de moules (Chausson,
2001). Peu de travaux ont été réalisés sur la physiologie de ce crabe à part ceux de Chausson (Chausson,
2001, Chausson et al., 2004). Des données physiologiques sont disponibles pour d’autres crabes
hydrothermaux de la même famille provenant de la dorsale Est Pacifique (Bythograea thermydron et
Cyanagraea praedator) (Chausson et al., 2001, Lallier et al., 1998, Martinez et al., 2001, Gorodezky
et Childress, 1994, Sanders et Childress, 1992).
1.2 Physiologie respiratoire
1.2.1 Généralités sur la respiration cellulaire
Les organismes vivants doivent produire de l’énergie à partir de molécules chimiques pour pouvoir
maintenir l’intégrité de leurs structures cellulaires et rester hors équilibre thermodynamique avec
TAB. 1.4 – Comparaison de différentes voies d’oxydation du carbone organique (ici le glucose) (Voet
et Voet, 1995)
Processus Equation bilan Energie libérée /mol(glucose)
respiration aérobie C 6 H 12 O 6 + 6O 2 → 6CO 2 + 6H 2 O ∆G o ′ = −2823kJ.mol −1
fermentation lactique C 6 H 12 O 6 → 2C 3 H 5 O − 3 + 2H+ ∆G o ′ = −196kJ.mol −1
fermentation alcoolique C 6 H 12 O 6 → 2CO 2 + 2C 2 H 6 O ∆G o ′ = −235kJ.mol −1

24 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
le milieu. Chez les métazoaires, il existe plusieurs voies permettant la production d’énergie à partir de
l’oxydation du carbone organique réduit : la respiration aérobie au niveau des mitochondries et la fermentation
(tableau 1.4). Dans le cas de la respiration aérobie, le carbone organique est complétement
oxydé et le produit final est le dioxyde de carbone. La quantité d’énergie ainsi libérée pour chaque
molécule de glucose et stockée sous forme d’ATP est maximale par rapport aux autres voies d’oxydation.
Cette réaction consomme de l’oxygène et rejette du dioxyde de carbone ; un approvisionnement
convenable des cellules en oxygène doit donc être assuré et le dioxyde de carbone doit être éliminé
afin de maintenir l’équilibre acido-basique des cellules (Dejours, 1988). L’étude de la physiologie
respiratoire d’un organisme considère l’ensemble des mécanismes intervenant dans le transport des
gaz respiratoires (O 2 et CO 2 ) entre le milieu extérieur et les cellules qui constituent l’organisme. La
fermentation, ou métabolisme anaérobie, consiste en l’oxydation partielle de composés organiques.
Bien qu’énergétiquement moins efficace, elle est utilisée par de nombreux tissus chez les métazoaires
lorsque l’apport en oxygène est insuffisant. Chez les Crustacés Décapodes, le produit final de la fermentation
du glucose est essentiellement le L-lactate. Cette molécule intervient dans la régulation de
la respiration à travers son action sur l’hémocyanine (voir partie 1.4.2).
1.2.2 Transport des gaz respiratoires
Les étapes du transport
La respiration au sens physiologique du terme est un transport de gaz respiratoires entre le milieu
extérieur et les cellules de l’organisme. Pour les organismes unicellulaires ou pluricellulaires de
très petite taille, l’approvisionnement des cellules en oxygène et l’élimination du dioxyde de carbone
peuvent se faire par simple diffusion à travers la membrane ou les cellules environnantes, à partir
ou vers le milieu. Chez les métazoaires de plus grande taille, la diffusion n’est plus suffisante et des
systèmes de transport depuis une surface d’échange avec le milieu (tégument, branchies, poumons)
et les organes consommateurs d’oxygène ont été sélectionnés au cours de l’évolution. D’un point de
vue physique, cela revient à une succession d’échanges gazeux par diffusion ou par convection entre
différents compartiments depuis les organes au contact du milieu extérieur jusqu’aux tissus demandeurs
(figure 1.13(a)). Pour un gaz, le potentiel chimique intervenant dans les équilibres réactionnels
est sa pression partielle. Le transport d’un gaz a donc lieu selon un gradient de pressions partielles
décroissantes (figure 1.13(b)).

1.2. PHYSIOLOGIE RESPIRATOIRE 25
(a)
(b)
FIG. 1.13 – Schéma de principe de la chaîne de transport des gaz respiratoires chez un organisme
marin et évolution des pressions partielles entre les compartiments. (a) Schéma des différents compartiments
impliqués dans le transport des gaz respiratoires chez un organisme aquatique possédant
un système vasculaire clos ; d’après Hourdez et Lallier (2007). (b) Disposition relative des différents
compartiments dans le diagramme des pressions partielles P O2 ,P CO2 . I, E, a, v, tis : compartiments eau
inspirée, eau expirée, sang artériel, sang veineux, tissus

26 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
Capacitance d’un gaz dans un milieu
Afin de comprendre les mécanismes de transport des gaz entre différents compartiments, il est
nécessaire de bien différencier la solubilité physique et la capacitance d’un gaz dans un milieu donné.
La solubilité purement physique peut être définie comme étant la quantité de gaz dissoute dans le
milieu pour une pression partielle donnée : C gaz = α gaz .P gaz , où C gaz est la concentration en gaz, P gaz
la pression partielle du gaz et α gaz est son coefficient de solubilité (dimension : mol.l −1 .Torr −1 ).
La capacitance est définie comme étant la variation de concentration du gaz dans le milieu pour une
variation de pression partielle donnée : β gaz = dC gaz
dP gaz
.
β gaz a la même dimension que α gaz , mais la signification des deux quantités est différente : alors
que α gaz correspond uniquement à la solubilité physique, β gaz englobe la fraction physiquement dissoute
dans le milieu et la fraction chimiquement liée, à des protéines de transport par exemple (Dejours,
1988). A titre d’exemple, la capacitance du CO 2 est plus élevée que sa simple solubilité physique
dans les milieux tamponnés en raison de son implication dans l’équilibre des carbonates. La
solubilité et la capacitance des gaz sont donc équivalentes dans des milieux simples (air, eau pure)
mais pas dans les milieux biologiques (sang, hémolymphe). Plus la capacitance est importante, plus
la quantité de gaz échangée pour un changement de pression partielle donné est grande.
Propriétés physico-chimiques de l’air et de l’eau pour les gaz
La nature du milieu extérieur avec lequel ont lieu les échanges gazeux et ses propriétés physicochimiques
conditionnent le fonctionnement du système de transport de l’organisme. Les milieux aériens
et aquatiques présentent des propriétés très différentes (tableau 1.5). En particulier, la capacitance
de l’O 2 est beaucoup plus élevée dans l’air que dans l’eau, alors que celle du CO 2 est pratiquement
identique entre les deux milieux. Cette caractéristique a des conséquences importantes sur
les respirations aérienne et aquatique. Comme noté précédemment, la capacitance du CO 2 dans l’eau
de mer et dans les milieux biologiques est souvent supérieure à la valeur présentée dans le tableau
1.5 car ces solutions sont tamponnées et une partie du dioxyde de carbone entre dans l’équilibre des
carbonates.
La grande capacitance du CO 2 et la faible capacitance de l’O 2 dans l’eau de mer résultent en
général chez les organismes marins en une P CO2 légèrement plus élevée et en une P O2 beaucoup plus
basse que celles du milieu pour maintenir des échanges gazeux corrects étant donné les propriétés
du milieu extérieur. De plus, une augmentation de température ou de salinité diminue la capacitance
des gaz respiratoires dans l’eau de mer tout en agissant sur le métabolisme de l’animal (augmentation
avec la température, régulation de l’équilibre ionique). De tels changements nécessitent une réponse
physiologique de l’organisme pour maintenir des échanges respiratoires corrects.

1.2. PHYSIOLOGIE RESPIRATOIRE 27
TAB. 1.5 – Propriétés physico-chimiques de l’air et de l’eau pour le transport des gaz respiratoires.
Données à 15°C et à une pression de 1 atm ; pris dans (Dejours, 1988)
Air Eau Air/eau
Coefficient de diffusion (cm 2 .s −1 ) D O2 0,198 2,5.10 −5 8000
D CO2 0,155 1,8.10 −5 9000
Capacitance (µmol.l −1 .Torr −1 ) β O2 54,7 1,82 30
β CO2 54,7 51,4 1
Flux des gaz respiratoires entre les différents compartiments
Le moteur du transport des gaz respiratoires est la différence de pression partielle existant pour ces
gaz entre deux compartiments adjacents. La pression partielle des gaz, qui équivaut à leur potentiel
chimique, doit donc présenter un gradient décroissant continu depuis l’extérieur jusqu’aux tissus pour
l’O 2 , et un gradient inverse pour le CO 2 (figure 1.13(b)). La quantité de gaz transportée à chaque étape
est déterminée par l’équation de transport :
Ṁ gaz = G.∆P gaz
où Ṁ gaz est le flux de gaz en mol.s −1 , G est la conductance en mol.s −1 .Torr −1 et ∆P gaz est la différence
de pression partielle en Torr pour ce gaz.
Cette équation de transport est valable pour tous les transferts de gaz de la chaîne respiratoire
d’un organisme. L’expression de la conductance dépend de la nature de la barrière existant entre les
compartiments et de la présence éventuelle de fluides en convection. Le tableau 1.6 présente l’expression
de cette conductance aux différents niveaux. Lorsque les flux de gaz sont à l’équilibre, toutes les
valeurs de Ṁ sont identiques et on peut en déduire une conductance globale de la chaîne, depuis le
milieu extérieur jusqu’aux tissus.
Pour que les besoins métaboliques de l’organisme soient satisfaits sans recourir à des mécanismes
anaérobies, l’offre en oxygène doit être maintenue suffisante. La stabilité de cet équilibre entre offre
et demande métabolique est assurée par l’ensemble des processus de transport, depuis la convection
ventilatoire jusqu’à la diffusion à travers les membranes mitochondriales. L’équilibre peut être rompu
lorsque la demande métabolique augmente (exercice) ou lorsque la quantité d’oxygène disponible
dans le milieu diminue (hypoxie environnementale). Dans ce cas, différents mécanismes physiologiques
permettent de modifier les flux d’oxygène à différents niveaux de la chaîne de transport pour
assurer un approvisionnement correct en O 2 , comme illustré dans le tableau 1.6. On peut observer
une régulation au niveau ventilatoire, une régulation de la surface et de l’épaisseur des épithéliums

28 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
TAB. 1.6 – Equations décrivant le transfert des gaz aux différents niveaux de la chaîne respiratoire, du
milieu vers les tissus, dans le cas d’un organisme marin possédant un système vasculaire. Composé à
partir de Dejours (1988).
Compartiment Flux Conductance Adaptations potentielles à l’hypoxie
eau branchiale Ṁ = G edm .∆P I/E G edm = ˙V edm .β edm augmentation du débit ventilatoire
branchies Ṁ = G br .∆P E/a G br = D br . S br
e br
.β br augmentation de la surface branchiale
diminution de l’épaisseur de l’épithélium branchial
sang Ṁ = G sg .∆P a/v G sg = ˙V sg .β sg augmentation du débit circulatoire
augmentation de la capacitance du sang
tissus Ṁ = G tis .∆P v/tis G tis = D tis . S tis
e br
.β br diminution de l’épaisseur tissulaire à traverser
Global Ṁ = G tot .∆P I/tis G tot =
1
1
G + 1
edm G + 1
br Gsg + G 1
tis
(à l’équilibre, tous les Ṁ sont égaux et l’expression
de G tot peut en être déduite)
Quantité Unité Signification
Ṁ mol.s −1 flux du gaz entre deux compartiments
G edm , G br , G sg , G tis , G tot mol.s −1 .Torr −1 conductance de l’eau de mer, des branchies, du sang, du
tissu et globale respectivement
∆P x/y Torr différence de pression partielle du gaz entre les deux
compartiments x et y
˙V edm , ˙V sg m 3 .s −1 débit ventilatoire et circulatoire respectivement
D br ,D tis m 2 .s −1 constante de diffusion à travers l’épithélium branchial et
les tissus respectivement
S br ,S tis m 2 surface de l’épithélium branchial et des tissus impliqués
dans l’échange
e br ,e tis m épaisseur de l’épithélium branchial et des tissus à franchir
β edm ,β br ,β sg ,β tis mol.m −3 .Torr −1 capacitance de l’eau de mer, des branchies, du sang et des
tissus
NB : les unités utilisées ici sont celles du système international, sauf pour la pression exprimée en Torr au
lieu de Pa ; pour convertir les volumes on utilise la relation l → dm 3
Notation
I,E
a,v
tis
Compartiment
eau inspirée, eau expirée
sang artériel, sang veineux (au sens du chargement en oxygène)
tissus consommateurs d’oxygène

1.3. PIGMENTS RESPIRATOIRES - PRÉSENTATION GÉNÉRALE 29
d’échange séparant le milieu extérieur du milieu intérieur, la régulation circulatoire d’un éventuel milieu
circulant et faisant le lien entre les organes d’échange et les tissus, la diffusion facilitée depuis ce
milieu vers les mitochondries (e.g. présence éventuelle de myoglobine tissulaire).
Effet de la présence d’un pigment respiratoire circulant
La présence de pigments respiratoires dans les milieux intérieurs (liquide vasculaire ou coelomique)
permet d’augmenter leur capacité oxyphorique par rapport à une dissolution purement physique
de l’O 2 dans le fluide, la solubilité de l’O 2 dans ces milieux étant peu élevée (figure 1.14(a)).
L’augmentation de concentration en oxygène qui en résulte est très importante, en particulier pour des
P O2 faibles et des pigments à forte affinité. La présence de pigments coopératifs permet également
d’augmenter la capacitance de l’hémolymphe autour de la P 50 du pigment (figure 1.14(b)). La quantité
d’oxygène transporté par volume d’hémolymphe peut alors être calculé en connaissant P a,O2 et
P v,O2 :
∆C O2a,v =
∫ Pa,O2
P v,O2
β totale dP O2
Cette quantité correspond à l’aire sous la courbe de capacitance comprise entre les valeurs de P a,O2
et P v,O2 . Lorsque les valeurs encadrent la P 50 , la quantité d’oxygène transportée est augmentée car la
saturation du pigment varie beaucoup pour un faible changement de P O2 en raison de la coopérativité
du pigment.
Selon la demande métabolique, la consommation d’O 2 au niveau cellulaire varie. Le métabolisme
peut être influencé par l’état de jeûne, l’exercice musculaire, la température, la salinité (osmorégulation).
Une hypoxie environnementale peut également provoquer une diminution de la quantité d’O 2
transportée dans l’hémolymphe. La modulation des propriétés de fixation de l’O 2 des pigments respiratoires
par des facteurs intrinsèques (e.g. plasticité phénotypique) ou extrinsèques (e.g. effet du
pH, du lactate) permet une réponse physiologique face à de telles variations (Bridges, 2001, Giomi et
Beltramini, 2007).
1.3 Pigments respiratoires - présentation générale
1.3.1 Propriétés générales des pigments respiratoires
Historique
Les pigments respiratoires ont d’abord été décrits comme des substances colorées présentes dans
le sang ou les fluides corporels de différents groupes d’animaux, d’où le terme de pigment. Les dif-

30 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
700
600
O 2 total
CO2 (µmol.l −1 )
(µmol.l −1 .Torr −1 )
β = dC O2
dPO2
500
400
300
200
100
0
60
50
40
30
20
10
O 2 lié à l’Hc
O 2 dissous
0 20 40 60 80 100
P O2 (Torr)
(a)
capacitance totale
capacitance Hc
capacitance O 2 dissous
0
0 20 40 60 80 100
P O2 (Torr)
(b)
FIG. 1.14 – Effet de la présence d’un pigment respiratoire sur la capacité oxyphorique et la capacitance
de l’hémolymphe de Carcinus maenas. (a) Les deux courbes pointillées représentent la
concentration d’O 2 dissous dans l’hémolymphe et lié à l’hémocyanine en fonction de la P O2 de l’hémolymphe.
La courbe continue est la capacité oxyphorique totale résultant de la somme des deux
précédentes. (b) Capacitances dues à la solubilité physique de l’O 2 , à la liaison au pigment respiratoire
et capacitance totale. La capacitance physique est constante et équivaut à la solubilité α O2 . La
capacitance due au pigment est maximale autour de la P50 et tend vers 0 pour les faibles et les fortes
P O2 à cause du caractère coopératif du pigment. Courbes calculées pour une solubilité α O2 = 1,5
µmol.l −1 dans l’hémolymphe à 15°C et une concentration de 40 µg/µl de pigment, une P 50 de 10,92
Torr et une n 50 de 4,5 (crabe en normoxie, pris dans Lallier et Truchot (1989)).

TAB. 1.7 – Caractéristiques des différents types de pigments respiratoires circulants connus chez les métazoaires. Pris dans Riggs (1998), Royer
(1992), Mangum (1992), Hourdez (2000), Seamonds et al. (1971), Terwilliger (1992), Toulmond (1992), Zal et al. (1996), Weber et Vinogradov
(2001), Hourdez et al. (1999), Chabasse (2005), Markl et Decker (1992), van Holde et al. (1992), D. M. Kurtz (1992), Weber et Fänge (1980),
Zhang et D. M. Kurtz (1991), Terwilliger (1998)
Pigment Localisation Structure quaternaire Masse native Masse sous-unité Domaine Taxons
Hémoglobine intracellulaire mono, dimère 16, 32 kDa 16 kDa mono Phoronidiens
(Fe 2+ et hème) vasculaire tétramère 64 kDa 16 kDa mono Vertébrés
tétramère 64 kDa 16 kDa mono Bivalves (Vésicomydés, Calyptogena sp.)
di, tétramère 32, 64 kDa 16 kDa mono Bivalves (Arcidés)
tétramère 64 kDa 16 kDa mono Bivalves (Arcidés, Barbatia reeveana)
multimère 430 kDa 33 kDa di Bivalves (Arcidés, Barbatia reeveana)
coelomique monomère 16 kDa 14-16 kDa mono Polychètes (Térébéllidés, Alvinellidés)
dimère 32 kDa 16 kDa mono Polychètes (Ophélidés, Capitellidés)
di, tétramère 32, 64 kDa 16 kDa mono Echiuriens
désoxy di, oxy tétramère 32, 64 kDa 16 kDa mono Echinodermes
mono à octamère jusqu’à 128 kDa 16 kDa mono Polychètes (Glycera sp.)
tétramère 64 kDa 16 kDa mono Polychètes (Glycera robusta)
extracellulaire Ring-Hb 400 kDa 16 kDa mono Polychètes (Siboglinidés)
vasculaire bicouche hexagonale 3-4 MDa 14-17 kDa mono Annélides
14-mère 208 kDa 14-15 kDa mono Crustacés (Copépodes)
? > 1 MDa 17-19 kDa mono Crustacés (Cirripèdes)
bicouche penta/octagonale 250-800 kDa 30-40 kDa / 130 kDa 2 / 9 Crustacés (Branchiopodes)
chevron 1,8 MDa 175 kDa deca Crustacés (Amphipodes)
bicouche pentagonale 1,7-2,3 MDa 170-220 kDa multi ? Gastéropodes (Planorbidés)
bâtonnet 8-12 MDa 240-320 kDa 14-24 Bivalves (Astartidés, Carditidés)
coelomique di, trimère 124, 153 kDa 58 kDa tetra Polychètes (Polynoïdés)
Ring-Hb 400 kDa 15-17 kDa mono Polychètes (Siboglinidés)
bicouche hexagonale 3-4 MDa 15-17 kDa mono Polychètes (Nephtys sp.)
Chlorocruorine extracellulaire bicouche hexagonale 3-4 MDa 15-17 kDa mono Polychètes (Sabellidés)
(Fe 2+ et hème) vasculaire
Hémocyanine extracellulaire hexa, dodec, 24, 48-mère 450 kDa - 3,6 MDa 75 kDa mono Arthropodes
(Cu + ) vasculaire déca, didécamère 4-9 MDa 450 kDa 7-8 Mollusques
Hémérythrine intracellulaire mono à octamère jusqu’à 108 kDa 13,5 kDa mono Sipunculiens
(Fe 2+ ) coelomique octamère 108 kDa 13,5 kDa mono Brachiopodes
1.3. PIGMENTS RESPIRATOIRES - PRÉSENTATION GÉNÉRALE 31
vasculaire multimère 693 kDa 14,7 kDa mono Polychètes (Magelona sp.)

32 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
férents types de pigments actuellement connus ont été décrits et nommés dès la seconde moitié du
19ème siècle. Le mot hémoglobine fut introduit par Hoppe-Seyler en 1864 à partir de l’observation du
sang des vertébrés, puis les termes érythrocruorine et chlorocruorine furent proposés par Lankester en
1868 pour désigner respectivement la substance rouge présente en solution chez certains Annélides
et le pigment vert présent chez la Sabelle. L’appellation hémérythrine fut ensuite donnée en 1881 par
Krukenberg au pigment rose observé chez le Siponcle par Lankester en 1872. Enfin, le pigment bleu
présent chez la Seiche fut observé par Paul Bert en 1867 et fut nommé hémocyanine chez la Pieuvre
en 1878 par Frédéricq (historique d’après Toulmond et Truchot (1993)). Au début du 20ème siècle, la
présence de protéines héminiques pouvant fixer l’O 2 fut même observée dans les nodules de plantes
fixatrices d’azote par Kubo en 1939 ; ce sont les léghémoglobines, rouges (Fuchsman, 1992).
En 1933, Svedberg publie les résultats de l’application de la centrifugation analytique aux pigments
respiratoires de nombreuses espèces, notamment des invertébrés marins. Ses travaux mettent
en évidence une grande diversité des coefficients de sédimentation selon les groupes et il effectue une
première estimation de la masse de ces composés (2,8 MDa pour l’hémoglobine d’Arenicola marina
et de Lumbricus terrestris) (Svedberg, 1933, Svedberg et Eriksson, 1933a,b).
Définition des pigments respiratoires
Les pigments respiratoires sont des métalloprotéines fixant réversiblement une ou plusieurs molécules
de dioxygène. Cette réaction de fixation peut par exemple s’écrire dans le cas de la myoglobine
(Mb) :
Mb+O 2 ⇄ MbO 2
Cette capacité à fixer réversiblement l’oxygène leur permet d’agir comme des protéines transporteurs
d’O 2 si elles sont mises en mouvement entre différents compartiments dans un liquide coelomique
ou vasculaire. Elles peuvent avoir un rôle de stockage de l’O 2 (réservoirs) ou encore faciliter
la diffusion de l’O 2 entre deux compartiments.
Différents types de pigments ont été sélectionnés au cours de l’évolution. Ils différent par la nature
des atomes métalliques impliqués dans la fixation de l’oxygène (Fe 2+ ou Cu + ), par leurs structures
primaire, tertiaire et quaternaire (monomérique, multimérique), par leur localisation (intra ou extracellulaire,
coelomique ou vasculaire) et par leurs propriétés fonctionnelles. L’histoire évolutive des
pigments respiratoires est complexe et fait actuellement l’objet d’un effort de recherche important.
Elle est liée à l’histoire évolutive des organismes et à celles de grandes familles de métalloprotéines
possédant un hème ou des atomes de cuivre. L’ensemble des fonctions physiologiques des pigments
respiratoires est encore mal connu et de nombreux rôles, autre que le transport de l’oxygène, peuvent

1.3. PIGMENTS RESPIRATOIRES - PRÉSENTATION GÉNÉRALE 33
être remplis par ces molécules : production de peptides antimicrobiens (hémocyanine, hémérythrine),
pouvoir tampon dans les fluides circulants, protéines de réserve, propriétés antioxydantes entre autres.
1.3.2 Les différents types de pigments respiratoires
Les hémoglobines (Hb)
Les globines sont des protéines homologues de 14 à 17 kDa, capables de fixer une molécule de
dioxygène par l’intermédiaire d’un ion Fe 2+ contenu dans un hème. L’hème est un groupement prosthétique
formé par l’association d’un noyau aromatique (protoporphyrine IX) et de l’ion ferreux Fe 2+ .
Le terme d’hèmoglobine désigne les protéines présentant un repliement de type globine et possédant
un hème, c’est à dire les globines au sens large. Le terme d’hémoglobine ne désigne rigoureusement
que les globines circulant dans le sang, et non celles contenues dans le coelome par exemple. Par abus
de langage, le terme hémoglobine est également souvent employé dans une acception générale pour
désigner les pigments de type globines au sens large.
La myoglobine de cachalot a été la première protéine dont la structure 3D a pu être déterminée
par diffaction des rayons X par Kendrew en 1958 (Kendrew et al., 1958). Elle possède un repliement
caratéristique, dit de type globine (globin-fold), très conservé et qui se caractérise par une succession
de 6 à 8 hélices α. La cavité contenant l’hème est formé par 3 hélices faisant face à 3 autres (Weber
et Vinogradov, 2001).
Cette famille de pigments respiratoires présente une très grande diversité de structures (globines
mono ou multidomaines, mono ou multimériques), le repliement de type globine étant toujours très
bien conservé. Les globines peuvent être intra ou extracellulaires, vasculaires ou coelomiques. Elles
sont présentes dans de nombreux groupes taxonomiques (Vertébrés, Annélides, Mollusques, Arthropodes).
Elles sont rouges sombres en l’absence d’oxygène et rouge vif lorsqu’elles sont chargées
en oxygène. Les plus gros édifices protéiques formés par des globines, associées à des chaînes de
structure ne fixant pas l’oxygène (linkers), sont les hémoglobines extracellulaires en double-couche
hexagonale (Hexagonal Bi-Layer, HBL) d’Annélides : d’après les modèles actuels, elles comportent
144 chaînes de globines et de 36 à 42 chaînes de linkers, pour une masse comprise entre 3 et 4 MDa
(Bruneaux et al., 2008).
Des globines ont également été mises en évidence chez les plantes, les bactéries, les protistes, les
algues, les nématodes et la levure (Weber et Vinogradov, 2001). Des gènes de globines ont également
découverts chez la Cione (Ciona intestinalis) (Ebner et al., 2003) et ont permis de raciner l’arbre
phylogénétique des globines de Vertébrés. De nouvelles classes de globines ont également été découvertes
(neuroglobines, cytoglobines). La fonction de ces protéines chez ces différents taxa n’est pas
toujours clairement connue.

34 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
(a)
(b)
FIG. 1.15 – Structure de la myoglobine de Cachalot (cristallographie) et de l’hémoglobine de Lombric
(cryomicroscopie électronique). (a) Myoglobine de Cachalot (Physeter catodon) (1JP6.pdb)
(Urayama et al., 2002). L’hème contient l’atome de fer. Les histidines proximale et distale sont
figurées. (b) Hémoglobine en double couche hexagonale de Lumbricus terrestris (EMD1078.map)
(Mouche et al., 2001). A gauche, vue apicale, à droite, vue latérale. Le diamètre de cette hémoglobine
est de 24 à 27 nm environ.

1.3. PIGMENTS RESPIRATOIRES - PRÉSENTATION GÉNÉRALE 35
Les globines ont un rôle de stockage de l’oxygène (myoglobine) ou dans son transport (globines
circulantes). Chez les Vertébrés, les globines ont aussi un rôle dans le métabolisme de l’oxyde nitrique
(NO). Chez les Invertébrés, de nombreuses fonctions sont suspectées : facilitation de la diffusion de
l’O 2 , transport des sulfures, maintenance de l’équilibre acido-basique, détection ou séquestration de
l’O 2 et activités oxydase ou péroxydase (Weber et Vinogradov, 2001). De par leur caractère ancestral
et les nombreuses fonctions qu’elles peuvent assurer, les globines représentent une famille de protéine
centrale pour la physiologie des êtres vivants (Vinogradov et al., 2006, 2007, Vinogradov et Moens,
2008).
Les chlorocruorines
Les chlorocruorines sont des pigments respiratoires de couleur verte lorsqu’ils sont oxygénés et
dont la structure est identique à celle des hémoglobines extracellulaires géantes à double couche hexagonale
des Annélides. La seule différence réside dans une chaîne latérale du groupement prosthétique,
qui confère la couleur verte caractéristique de ce pigment : un groupement vinyl est remplacé par un
groupement formyl. Les chlorocruorines sont présentes chez des Annélides : les Sabellidés, les Serpulidés,
les Ampharétidés et les Chlorohémidés (Terwilliger, 1992).
Les hémérythrines
Les hémérythrines sont composées de sous-unités de 13 à 14 kDa environ, pouvant s’associer en
dimère, trimère, tétramère ou octamère. Chaque monomère est composé de quatre hélices α presque
parallèles entre lesquelles s’insèrent deux ions ferreux Fe 2+ permettant la fixation d’une molécule
de dioxygène (figure 1.16(a)). Les deux ions ferreux sont complexés par 5 histidines, un aspartate et
un glutamate de la chaîne polypeptidique. Les hémérythrines sont incolores en l’absence d’oxygène
et de couleur rose ou violette lorsqu’elles sont oxygénées. Dans le cas d’une structure octamèrique
(Phascolopsis gouldii), le complexe est formé par l’association de deux anneaux tétramèriques se
faisant face (figure 1.16(b)) (D. M. Kurtz, 1992).
Les hémérythrines ont été observées chez les Sipunculiens, les Priapuliens, les Brachiopodes et
chez certaines familles d’Annélides (Magelonidés, Néréididés et Glossiphoniidés (Terwilliger, 1998,
Vanin et al., 2006)) (certains travaux récents suggèrent que les Sipunculiens et les Priapuliens sont
eux-mêmes des Annélides (Struck et al., 2007)). Elles sont contenues dans des cellules du coelome
ou du sang et dans le cas des Magelonidés, un complexe de 690 kDa probablement formé de sousunités
de 14,7 kDa a été observé. Des myohémérythrines, non-circulantes, sont présentes dans les
muscles de Sipunculiens et d’Annélides (Nereis diversicolor, Riftia pachyptila (Sanchez et al., 2007)).
Une neuro-hémérythrine a aussi été décrite dans le système nerveux central de la sangsue Hirudo

36 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
(a)
(b)
FIG. 1.16 – Monomère et octamère d’hémérythrine chez le Siponcle Phascolopsis gouldii (1I4Y.pdb)
(Farmer et al., 2001). La forme présentée ici est la méthémérythrine. (a) structure d’un monomère.
Les deux atomes de fer sont complexés par 5 histidines, un aspartate et un glutamate. (b) structure
d’un octamère d’hémérythrine. Les quatre chaînes de la première couche sont colorées et celles de la
couche inférieure sont en gris. Les chaînes des deux tétramères se font face au sein de l’octamère.

1.3. PIGMENTS RESPIRATOIRES - PRÉSENTATION GÉNÉRALE 37
medicinalis (Vergote et al., 2004). Des protéines proches des hémérythrines ou des myohémérythrines
ont également été mises en évidence chez des bactéries, du corail et une espèce d’amibe pathogène
(French et al., 2008). Un rôle d’une hémérythrine dans la défense anti-bactérienne a été montré chez
l’Annélide Nereis diversicolor (Deloffre et al., 2003).
Les hémocyanines
Les hémocyanines sont des pigments liant l’oxygène par deux ions Cu + . On distingue deux grands
types d’hémocyanines, pour lesquels la structure de la protéine est différente. Ces deux grands types
correspondent aux hémocyanines de Mollusque et aux hémocyanines d’Arthropode. Chez toutes les
espèces connues possédant une hémocyanine, celle-ci est extracellulaire et librement dissoute dans
l’hémolymphe.
Chez les Mollusques, l’hémocyanine a été observée chez les Polyplacophores, les Gastéropodes,
les Céphalopodes et quelques bivalves Protobranches (van Holde et al., 1992). Chaque monomère de
300 à 450 kDa est composé de 7 à 8 domaines globulaires d’une masse de 50 kDa environ, chaque
domaine possédant un site actif avec deux ions Cu + (figure 1.17(a)). Les monomères s’associent
en décamères de 3-4 MDa ayant une forme de tonnelet (Céphalopodes et Polyplacophores) ou en
didécamères de 8-10 MDa résultant de l’association de deux dodécamères en tonnelet (Gastéropodes)
(figure 1.17(b)). Une recherche de séquences d’ADN codant des hémocyanines a récemment montré
l’absence de séquences de type hémocyanine chez les Scaphopodes et les Solénogastres, mais leur
présence chez les Caudofovéates (Lieb et Todt, 2008).
Les hémocyanines d’Arthropodes seront présentées en détail dans la partie 1.4. Brièvement, ces
hémocyanines sont formées par l’assemblage de sous-unités monodomaines de 75 kDa environ. Les
complexes formés sont des hexamères ou des multiples d’hexamères. On observe principalement des
hexamères et des dodécamères chez les Crustacés, et des 24-mères dans un groupe (Thalassinidés).
Les complexes observés chez les Chélicérates sont des 24-mères et des 48-mères. Récemment, des
hémocyanines ont été mises en évidence chez des Insectes (Hagner-Holler et al., 2004, Pick et al.,
2008).
1.3.3 Le transport de l’oxygène par les pigments respiratoires
Coopérativité et liaison de l’oxygène
Les pigments respiratoires circulants sont généralement des enzymes multimériques qui présentent
la plupart du temps un comportement allostérique. Les pigments allostériques fixent de manière
coopérative l’oxygène sur leurs sites : la fixation d’une molécule d’oxygène sur un site facilite

38 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
(a)
(b)
FIG. 1.17 – Structure de l’hémocyanine de Mollusque. (a) Unité fonctionnelle de l’hémocyanine
d’Octopus dofleini (1JS8.pdb). Les deux ions Cu + ainsi que les chaînes latérales des acides aminés
qui les entourent sont visibles. Un monomère complet est formé par l’enchaînement de 7 unités
fonctionnelles homologues. (b) Structure du décamère d’hémocyanine de Nautilus pompilius (Gatsogiannis
et al., 2007). Chaque monomère est formé de 7 unités fontionnelles représentées de couleurs
différentes. Ici, les unités fonctionnelles de deux monomères apparaissent colorées.

1.3. PIGMENTS RESPIRATOIRES - PRÉSENTATION GÉNÉRALE 39
la fixation des molécules suivantes en modifiant la structure et l’affinité des sites pour l’oxygène. Ce
comportement se traduit par l’allure sigmoïde des courbes de dissociation de l’oxygène S = f(P O2 ),
nombre de sites occupés
où S est la saturation en oxygène du pigment et est définie par S = .
nombre total de sites
On caractérise les propriétés de fixation de l’oxygène d’un pigment par la pression partielle de
demi-saturation P 50 = P O2(demi−sat) et par le coefficient de Hill n 50 qui estime la coopérativité de la
liaison pour une P O2 proche de la P 50 . La figure 1.18 montre l’effet de différentes valeurs de la n 50 et
de la P 50 sur l’allure de la courbe de dissociation de l’oxygène.
L’oxygène est un effecteur homotropique dans la mesure où sa fixation sur le site actif modifie
l’affinité des autres sites actifs. Il existe également des effecteurs hétérotropiques (e.g. protons, 2,3
DPG, lactate) qui se fixent sur des sites différents des sites actifs et qui modifient l’affinité pour
l’oxygène. Dans le cas d’enzymes allostériques, les constantes d’association du premier et du dernier
ligand ne sont pas les mêmes et une énergie libre d’interaction correspondant à la modification de la
structure du pigment peut en être déduite.
La quantité d’O 2 transportée par le pigment peut être calculée à partir de la courbe de dissociation
du pigment dans les conditions de l’hémolymphe ainsi que la P a,O2 et la P v,O2 . On peut ainsi
déterminer la saturation dans les compartiments artériels et veineux et par différence la quantité d’O 2
transportée par volume d’hémolymphe. Un changement de la forme de la courbe modifiera, pour les
mêmes P a,O2 et P v,O2 , la quantité d’O 2 transportée. La forme sigmoïde de la courbe de liaison permet
d’avoir un transport efficace lorsque les pressions partielles artérielle et veineuse encadrent la P 50 ,
même si la différence entre les deux pressions partielles est faible.
Représentation de Hill
La fixation coopérative de n molécules d’oxygène simultanément sur un pigment respiratoire, par
exemple une hémoglobine, avec une constante d’association K ass peut s’écrire :
Hb+nO 2 ⇄ Hb(O 2 ) n avec K ass = [Hb(O 2) n ]
[Hb](P O2 ) n
On a :
S
K ass =
(1−S)(P O2 ) n car S = [Hb(O 2) n ]
D’où :
S
1−S = (P O2) n
K ass
[Hb]+[Hb(O 2 ) n ] .
La représentation de Hill (figure 1.19) est une représentation logarithmique de cette dernière relation
qui permet d’estimer les paramètres (P 50 ,n 50 ) de la protéine à partir de valeurs expérimentales
de P O2 et de S :
log( S
1−S ) = nlog(P O2) − log(K ass ).
Pour S = 0,5, on a log( S
1−S
) = 0. La représentation de Hill coupe donc l’axe des abscisses à la
valeur log(P 50 ). La pente de la représentation de Hill dans cette zone correspond à la n 50 .

40 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
1
P 50 =5
P 50 =15
P 50 =30
S
0.5
0
0 20 40 60
P O2 (Torr)
(a)
1
n 50 =12 n 50 =4,5 n 50 =1
S
0.5
0
0 20 40 60
P O2 (Torr)
(b)
FIG. 1.18 – Effet de l’affinité (P 50 ) et de la coopérativité (n 50 ) sur le chargement de l’oxygène par un
pigment respiratoire multimétique. (a) Effet d’un changement de P 50 pour une coopérativité constante
(n 50 =4,5). Le changement d’affinité déplace la courbe de saturation vers la gauche ou la droite. (b) Effet
d’un changement de n 50 pour une affinité constante (P 50 =15 Torr). Le changement de coopérativité
donne un caractère plus ou moins marqué à la courbe sigmoïde autour de la P 50

1.3. PIGMENTS RESPIRATOIRES - PRÉSENTATION GÉNÉRALE 41
0.4
0.2
n 50 =5,62
log(
1−S S )
0
-0.2
log(P 50 ) = 1,13
-0.4
1.08 1.12 1.16
log(P O2 )
FIG. 1.19 – Représentation de Hill permettant de calculer les valeurs de P 50 et n 50 à partir des données
expérimentales. La courbe log
1−S S = f(log(P O2)) est linéaire pour des valeurs de saturation comprises
entre 30 et 70 % environ. Elle coupe l’axe des abscisses à log(P 50 ) et la pente vaut n 50 .
De plus, on peut montrer que K ass = 1
(P 50 ) n en prenant S = 0,5 dans l’expression de K ass en fonction
de S. La connaissance de ces paramètres (P 50 , n 50 ) permet de générer la courbe théorique de saturation
du pigment selon l’expression simple :
S =
1
1+( P 50
P O2
) n 50
En théorie, la myoglobine a une coopérativité de 1 car elle fixe l’oxygène sous forme de monomères
indépendants ; cela correspond bien aux résultats observés. Par contre, une hémoglobine tétramèrique
ou une hémocyanine hexamérique pourraient lier simultanément 4 et 6 molécules d’oxygène
respectivement en supposant une coopérativité parfaite, c’est à dire un chargement ou un déchargement
toujours simultanés de toutes les molécules d’oxygène portées par une protéine. Dans la
pratique, un tel comportement n’est jamais observé et les valeurs de n 50 mesurées sont toujours inférieures
au nombre de sites de fixation des complexes.
Une représentation de Hill à partir de données expérimentales n’est linéaire que dans une gamme
restreinte autour de la P 50 , de 30 à 70 % de saturation environ. En deçà et au delà, la courbe tend vers
deux asymptotes de pente n = 1 (figure 1.20). D’un point de vue biologique, cela correspond à un
chargement indépendant (non-coopératif) des premières et des dernières molécules d’O 2 . Quand la
P O2 est faible, le chargement va statistiquement se faire sur des protéines différentes qui sont encore
vides ; les sites chargés sont donc statistiquement indépendants. De même, lorsque le pigment est

42 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
presque saturé, les sites vides restant sont statistiquement distribués sur différentes molécules et leur
chargement se fait donc de manière indépendante.
Le modèle Monod-Wyman-Changeux
Différents modèles ont été proposés pour tenter d’expliquer le mécanisme de l’allostérie et pour
interpréter les courbes de Hill ou les données expérimentales. Une première méthode pour modéliser
l’allostérie est de considérer n équilibres chimiques successifs correspondant chacun à l’addition
d’une molécule d’oxygène sur un site actif du pigment. Dans ce modèle proposé par Adair (Adair,
1925, Brouwer, 1992) pour l’hémoglobine tétramérique, il existe n constantes d’association K i pour
chacune de ces réactions. Un modèle proposé en 1965 par Monod, Wyman et Changeux (Monod et
al., 1965) (MWC) postule l’existence de deux états conformationnels de la protéine, un état tendu T
dans lequel les sites ont une faible affinité k T pour le ligand et un état relâché R dans lequel les sites
ont une forte affinité k R pour le ligand. Ce modèle suggère que le changement de conformation est
concerté, c’est à dire que la symétrie de la protéine est conservée et que toutes les sous-unités sont soit
dans l’état T, soit dans l’état R. En plus des constantes k T et k R , ce modèle de transition allostérique
fait intervenir la constante d’équilibre entre les deux états T et R en l’absence d’oxygène : L = [T]
[R] . Ce
modèle et ses dérivés sont très utilisés et permettent dans de nombreux cas de bien décrire les données
observées. L’expression de la saturation selon la P O2 peut être déduite des autres paramètres :
S = LK T P O2 (1+K T P O2 ) q−1 + K R P O2 (1+K R P O2 ) q−1
L(1+K T P O2 ) q +(1+K R P O2 ) q
Dans cette expression, q est le nombre de sites de fixation de l’oxygène qui interagissent ensemble.
D’après ce modèle, un effecteur allostérique qui modifierait l’affinité du pigment pour l’oxygène
pourrait modifier les affinités k T ou k R ou bien la constante d’équilibre entre les deux formes L.
Dans le cas de l’hémocyanine de Carcinus maenas, les valeurs de ces constantes ont été mesurées
pour l’hémocyanine à pH 7,84 et à 10°C, en l’absence et en présence de lactate (Weber et al., 2008).
Une représentation de Hill comprenant de très basses et très hautes saturations présente autour de la
zone linéaire centrale des zones de transition vers un chargement pour lequel n = 1 dans les basses
et les hautes saturations. Ces zones correspondent au chargement des premières molécules d’oxygène
sur la forme T et des dernières sur la forme R, avec des P 50,T et P 50,R pouvant être déterminées en
extrapolant ces portions de courbes jusqu’à leur intersection avec l’axe des abscisses. Les propriétés
d’un pigment peuvent être modulées par un effecteur qui influence la constante d’équilibre L entre les
deux formes T et R (figure 1.20(a)) mais laisse les affinités de chaque forme inchangées, ou par un
effecteur influençant les affinités de chacune des formes. Dans le cas de l’hémocyanine de Carcinus
maenas, l’ajout de lactate augmente l’affinité de la forme T et diminue la constante d’équilibre L sans

1.3. PIGMENTS RESPIRATOIRES - PRÉSENTATION GÉNÉRALE 43
3
2
n 50 =1
log(
1−S S )
1
0
-1
P 50,R
P 50,T
-2
-3
3
2
n 50 =1
L 1
L 2 = 10.L 1
-1 0 1 2 3
log(P O2 )
(a)
n 50 =1
log(
1−S S )
1
0
-1
P 50,R
P 50,T
-2
-3
n 50 =1
0 mM lactate
50 mM lactate
-1 0 1 2 3
log(P O2 )
(b)
FIG. 1.20 – Représentation de Hill du modèle MWC pour l’hémocyanine de Carcinus maenas (Weber
et al., 2008). (a) courbe de chargement obtenue à pH 7,84 à 10°C en absence de lactate (constante
d’équilibre L 1 ). Une courbe théorique présente l’effet d’une augmentation de L 1 d’un facteur 10. Les
droites pointillées de pente 1 correspondent au chargement des formes R et T et sont extrapolées
à partir des zones extrêmes de la courbe de dissociation observée expérimentalement. (b) courbe
de chargement obtenue en présence de 50 mM de L-lactate. Dans ce cas, la constante d’affinité k T
augmente, la constante d’équilibre L diminue, la constante d’affinité k R reste pratiquement inchangée.

44 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
affecter de manière marquée l’affinité de la forme R (figure 1.20(b)).
Le modèle à deux états MWC n’est pas toujours suffisant pour décrire les effets des effecteurs
allostériques et dans le cas de grands complexes faisant intervenir plusieurs niveaux structuraux (tétramère
d’hexamères chez Limulus polyphemus, dodécamère de dodécamères pour les hémoglobines
géantes d’Annélides). Des modèles intermédiaires ont été proposés, faisant intervenir les deux états
T et R mais avec une transition par forcément simultanée pour toutes les sous-unités. En particulier,
dans le cas des hémocyanines d’Arthropodes de plus de 12 sous-unités, la notion d’allostérie
emboîtée propose l’existence de différents niveaux hiérarchiques des transitions allostériques, depuis
l’hexamère jusqu’au 48-mère. Cette notion est particulièrement intéressante car elle relie un modèle
théorique de l’allostérie à une réalité structurale des pigments.
Conséquences physiologiques de la présence de pigments respiratoires allostériques
Comme expliqué précédemment (partie 1.2.2), la présence de pigments respiratoires allostériques
a plusieurs conséquences fonctionnelles sur la physiologie du transport de l’oxygène : elle permet
d’augmenter fortement la capacité oxyphorique du fluide circulant par rapport à une dissolution purement
physique (figure 1.14(a)) et elle augmente la capacitance du fluide circulant, en particulier pour
des P O2 proches de la P 50 du pigment (figure 1.14(b)). Un pigment coopératif augmente les performances
respiratoires en permettant un chargement plus efficace au niveau de l’organe respiratoire, un
transport d’une quantité plus importante d’oxygène à débit circulatoire constant et un déchargement
plus efficace aux tissus si les pressions partielles d’oxygène artérielle et veineuse encadrent la P 50 .
1.4 L’hémocyanine des Crustacés
Toutes les hémocyanines d’Arthropodes possédent une structure similaire basée sur l’assemblage
de sous-unités de 75 kDa présentant un site actif à deux atomes de cuivre. Chacune peut fixer une molécule
de dioxygène sur ce site et les sous-unités s’assemblent en hexamères ou en oligo-hexamères.
Les hémocyanines sont présentes chez les Crustacés Malacostracés, les Chélicérates (Arachnides, Xiphosures),
les Onychophores, les Myriapodes et chez quelques Hexapodes basaux. Les hémocyanines
appartiennent à une superfamille contenant des phénoloxydases d’Arthropodes ayant un rôle dans la
sclérotisation de la cuticule et la défense immunitaire, les cryptocyanines et les hexamèrines d’Insectes.
Ces deux dernières familles ne fixent pas le cuivre et sont considérées comme des protéines de
réserve. Les hexamèrines pourraient aussi être impliquées dans la réponse immunitaire, le transport
d’hormone ou d’autres processus (Burmester, 2004).

1.4. L’HÉMOCYANINE DES CRUSTACÉS 45
1.4.1 Structure des hémocyanines de Crustacés
Structure primaire
Chaque chaîne polypeptidique de 75 kDa possède de 620 à 660 acides aminés environ. Des séquences
primaires sont connues pour certains Crustacés (Cancer magister, Penaeus vannamei, Palinurus
vulgaris, Panulirus interruptus, revu dans Magnus (2006)).
Les séquences issues de Crustacés et d’autres taxa d’Arthropodes sont homologues : la similarité
de séquence est de 33 % entre des sous-unités de Panulirus interruptus et d’Eurypelma californicum
(Markl et Decker, 1992). Les histidines impliquées dans la liaison du cuivre à la chaîne polypeptidique
sont particulièrement bien conservées. Les séquences de chaque site de fixation du cuivre (CuA
et CuB) sont homologues entre elles et résultent probablement d’un événement de duplication de
gène. Par contre, seul le site CuB est retrouvé chez les hémocyanines de Mollusques, le deuxième
site de ce groupe ayant sans doute une origine différente (van Holde et al., 1992). Chez les Arthropodes,
plusieurs sous-unités homologues existent au sein de chaque espèce. Cette diversité permet de
distinguer des espèces cryptiques proches ou des populations en cours de spéciation (Mangum, 1996,
Reese et Mangum, 1994).
Structures secondaire et tertiaire
Chaque monomère d’hémocyanine est formé de 3 domaines successifs dont le repliement global
forme une structure réniforme d’environ 8 nm de long sur 4,5 nm de haut. A ce jour, la structure
cristallographique de l’hémocyanine de Langouste Panulirus interruptus a été obtenu à une résolution
de 3.2 Å (Gaykema et al., 1986, Volbeda et Hol, 1989) (1HCY). Des structures cristallographiques
sont également disponibles pour des sous-unités d’hémocyanine de Limule, sous forme oxygénée et
désoxygénée (1LLA, 1NOL et 1OXY) (Hazes et al., 1993, Magnus et al., 1994).
La structure obtenue pour l’hémocyanine de Panulirus interruptus est visible sur la figure 1.21.
Trois domaines peuvent être délimités sur la base de la mobilité moléculaire des résidus (Volbeda et
Hol, 1989). La description des différents domaines a été résumée clairement dans Markl et Decker
(1992). Le premier domaine comporte 6 hélices α et l’encombrement de ses boucles devant le site
actif suggère qu’il pourrait être impliqué dans la coopérativité de la molécule. Le domaine 2 (75%
de similarité avec les hémocyanines de Chélicérates) est celui qui comporte le site actif. Il possède 6
hélices α et chaque atome de cuivre du site actif est complexé par trois histidines (figure 1.22). Enfin,
le domaine 3 comporte un tonneau formé de 7 brins β antiparallèles, constituant une structure très
stable. La sous-unité présente également un résidu glycosylé et un pont disulfure intrachaîne. Une des
hélices α du domaine 1 est absente des hémocyanines de Chélicérates ; son encombrement stérique
pourrait empêcher chez les Crustacés la formation des 24-mères présents chez les Arachnides.

46 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
FIG. 1.21 – Structure cristallographique d’une sous-unité de l’hémocyanine de Panulirus interruptus
(PDB 1HCY, (Volbeda et Hol, 1989)). En cyan, domaine 1 ; en vert, domaine 2 ; en orange, domaine
3. Les deux atomes de cuivre sont représentés en violet. Les chaînes latérales des histidines coordinant
les atomes de cuivre sont également représentées. Image générée avec le logiciel UCSF Chimera
FIG. 1.22 – Représentation stéréoscopique du site actif de l’hémocyanine de P. interruptus (1HCY).
Les numéros des résidus histidine correspondent à la numérotation du fichier pdb. Afin de distinguer
les chaînes latérales impliquées dans la complexation des atomes de cuivre, l’orientation de la
molécule est différente de celle de la figure 1.21. Image générée avec le logiciel UCSF Chimera.

1.4. L’HÉMOCYANINE DES CRUSTACÉS 47
Structure quaternaire
Les assemblages observés chez les Crustacés Malacostracés sont des oligo-hexamères : hexamères
chez les Isopodes, le krill (Euphausiacées), les crevettes (Caridés et Dendrobranchiates), les
langoustes (Palinuridés) et dodécamères chez les crabes Brachyoures, les homards et les langoustines
(Astacidés), les pagures (Anomoures) (Markl, 1986, Markl et Decker, 1992). Chez les Thalassinidés,
une structure particulière en 4×6-mères existe (Miller et al., 1977, Taylor et al., 2000). Les structures
observées chez les autres Arthropodes présentent la même organisation : 6×6-mères chez les
Myriapodes, 8×6-mères chez les Limules (Xiphosures), 4×6-mères chez les Arachnides (également
2×6-mères et 6-mère chez certaines espèces) (Burmester, 2004) (figure 1.23).
Ces assemblages de haut poids moléculaire (450kDa et 900kDa pour un hexamère et un dodécamère)
sont librement dissous dans le sang. Les concentrations observées chez les organismes vont de
10-20 mg/ml à 140/160 mg/ml. Des concentrations supérieures à 200 mg/ml ont également été observées
ponctuellement chez l’espèce hydrothermale Segonzacia mesatlantica (observation personnelle).
Des approches de microscopie et de cryomicroscopie électronique ont permis d’obtenir la structure
tridimensionnelle des complexes. La structure de l’hexamère de Palinurus elephas est ainsi disponible
(Meissner et al., 2003). Récemment, la structure du 48-mères de Limule a pu être obtenue
et la nature des contacts entre sous-unités a été déterminée grâce à des approches de modélisation
moléculaire à l’intérieur du volume obtenu en cryomicroscopie (Martin et al., 2007).
Un hexamère présente une symétrie diédrique D2. Trois monomères sont disposés dans un même
plan, le domaine 2 tourné vers l’intérieur et définissant ainsi une première symétrie centrale d’ordre
3 (C3). Les trois autres monomères font face aux trois premiers sur un plan parallèle, de manière
décalée. Au vu des interactions existant entre les monomères, il est plus juste de parler d’un trimère
de dimères que d’un dimère de trimères. Les 6 sous-unités définissent un canal central dont l’ouverture
est modifiée en fonction de l’oxygénation de la molécule : d’après des données de microscopie
électronique, ce canal central est ouvert chez Panulirus interruptus en l’absence d’oxygène et fermé
quand la protéine est oxygénée. Les dimensions extérieures du complexe restent inchangées, ce qui
suggère un mécanisme semblable à celui du diaphragme d’un appareil photo (Haas et al., 1993).
Deux hexamères s’assemblent en dodécamères chez les espèces qui en possédent (figure 1.24).
Dans une telle structure, les deux hexamères sont en contact par leur tranche, l’un étant tourné d’environ
180° par rapport à l’autre dans le cas des Crustacés (sauf chez un Stomatopode, voir figure
1.23).
Selon les espèces, des homohexamères peuvent être produits à partir de sous-unités purifiées mais
l’association en dodécamères fait intervenir des sous-unités particulières qui interagissent de manière
non-covalente (Stöcker et al., 1988). Deux sous-unités peuvent également être liées par un pont disul-

48 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
FIG. 1.23 – Différentes structures quaternaires d’Hcs observées chez les Arthropodes (pris dans Markl
et Decker (1992)). (a) dodécamère habituellement présent chez les Crustacés (Cancer pagurus), (b)
dodécamère observé chez certaines Araignées (Cupiennius salei), (c) 24-mère des crevettes Thalassinidés
(Callianassa californiensis), (d) 24-mère présent chez de nombreux Arachnides (Andronoctus
australis, Eurypelma californicum), (e) dodécamère de Crustacé inhabituel observé chez le Stomatopode
Squilla mantis, (f) 36-mère du Myriapode Centipède Scutigera coleoptrata, (g) 48-mère de
Limulus polyphemus.

1.4. L’HÉMOCYANINE DES CRUSTACÉS 49
FIG. 1.24 – Hémocyanine de Carcinus maenas vue en microscopie électronique. Coloration négative
d’une préparation de dodécamères purifiés ; la barre noire mesure 50 nm. Insert haut : agrandissement
d’un dodécamère en coloration négative. Insert bas : agrandissement d’un dodécamère en cryomicroscopie.
Photos Patrick Bron.

50 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
fure comme chez l’écrevisse Cherax destructor (Jeffrey et al., 1978).
Les complexes purifiés sont stables et ne tendent pas vers un équilibre des différentes formes
d’oligo-hexamères. Chez une seule espèce (Paralithodes camtschaticae), l’assemblage de dodécamère
à partir d’un seul type de sous-unité a été observé, ainsi qu’un équilibre dynamique entre hexamère
et dodécamère (Molon et al., 2000).
1.4.2 Caractéristiques et modulation des propriétés fonctionnelles des hémocyanines
de Crustacés
La présence de monomères interagissant au sein de complexes permet d’avoir un comportement
coopératif. La figure 1.14(a) montre le chargement de l’oxygène en fonction de la P O2 sur une hémocyanine
de Crustacé. Les propriétés observées pour les hémocyanines de Crustacés sont très variables
selon les espèces, la P 50 pouvant varier de 93,7 Torr (Orchestia gammarellus) à 2,2 Torr (Segonzacia
mesatlantica) (Truchot, 1992, Chausson et al., 2004).
Les propriétés fonctionnelles de ces pigments sont souvent très sensibles à l’action de divers
effecteurs ou modulateurs présents dans l’hémolymphe. D’après la définition de Morris (1990), les
effecteurs sont les espèces présentes en conditions normales dans l’hémolymphe (i.e. constitutives) et
ayant donc une influence constante sur les propriétés fonctionnelles. Les modulateurs sont les espèces
présentes en réponse à des conditions environnementales particulières ou à un stress (i.e. inductibles)
et modifient les propriétés de l’hémocyanine par rapport à celles dans l’hémolymphe au repos.
Effet du pH
La plupart des hémocyanines de Crustacés présentent un effet Bohr normal correspondant à une
augmentation de l’affinité pour l’oxygène avec le pH ( ∆P 50
∆pH
< 0). L’intensité de l’effet Bohr varie
selon les espèces et selon la gamme de pH considérée. Il est généralement fort comparé aux valeurs
observées pour les hémoglobines.
D’un point de vue physiologique, le pH de l’hémolymphe peut être modifié en particulier en
condition d’hypoxie environnementale ou d’activité physique. L’hypoxie tissulaire résultant de telles
conditions induit un métabolisme anaérobie dont les produits acidifient le milieu intérieur. D’autre
part, l’hyperventilation provoquée par une hypoxie environnementale conduit à une baisse de la P CO2
de l’hémolymphe et à une alcalose respiratoire. Une telle réaction permet d’augmenter l’affinité d’un
pigment présentant un effet Bohr normal et d’améliorer le chargement du pigment aux branchies.
Un effet facilitateur de l’acidification liée au métabolisme des tissus actifs pour le déchargement de
l’oxygène peut exister si les pH artériels et veineux sont suffisamment différents ; cependant cette
différence est généralement faible chez les Crustacés.

1.4. L’HÉMOCYANINE DES CRUSTACÉS 51
Un changement de pH pouvant être dû à un changement de P CO2 , l’effet spécifique de la molécule
de CO 2 à pH constant a été étudié chez plusieurs espèces. La plupart des espèces de Crustacés ne présente
pas de sensibilité spécifique au CO 2 , mais chez un petit nombre de Décapodes une augmentation
de la P CO2 à pH constant augmente l’affinité du pigment (Truchot, 1992).
Effet des ions inorganiques
L’hémolymphe des Crustacés marins est souvent proche de l’équilibre osmotique avec l’eau de
mer environnante ; selon les espèces, les capacités d’osmorégulation sont variables et la concentration
en ions inorganiques est donc un paramètre à prendre en compte dans la physiologie de ces animaux.
Les ions inorganiques peuvent influencer de deux façons l’affinité de l’hémocyanine pour l’oxygène
: d’une part, en modifiant la force ionique globale de l’hémolymphe (effet aspécifique des ions),
et d’autre part en interagissant spécifiquement avec l’hémocyanine (effet spécifique de certains ions).
Une augmentation de la concentration totale en ions de l’hémolymphe augmente l’affinité de l’hémocyanine
chez les Crustacés. Les cations divalent Ca 2+ et Mg 2+ sont responsables spécifiquement
d’une grande part de l’effet des ions inorganiques sur l’affinité de l’hémocyanine. Ils augmentent
l’affinité du pigment en se interagissant de manière allostérique avec la protéine. Les ions Mg 2+
augmentent également la valeur de l’effet Bohr (Truchot, 1975).
Les ions Cl − ont également un effet sur l’affinité de l’hémoyanine ; le sens de la variation induite
dépend des espèces.
Le thiosulfate S 2 O 2−
3
a un effet sur l’affinité de l’hémocyanine de certaines espèces. Il est produit
par oxydation du sulfure d’hydrogène (H 2 S) qui est ainsi détoxifié. Les espèces hydrothermales
profondes et celles vivant dans des sédiments réduits sont particulèrement exposées à ce composé.
Un effet du S 2 O 2−
3
a été observé chez le crabe hydrothermal Bythograea thermydron, chez l’isopode
Saduria entomon et chez la crevette Thalassinidé Calocaris macandreae, mais pas chez la crevette
Crangon crangon, le crabe Carcinus maenas ou la langoustine Nephrops norvegicus (Sanders et Childress,
1992, Hagerman et Vismann, 1999, Taylor et al., 1999). Il semblerait que cette effet thiosulfate
ne soit présent que chez les espèces soumises de manière soutenue au sulfure d’hydrogène (sources
hydrothermales et sédiments vaseux) et pouvant oxyder le sulfure en thiosulfate (Bridges, 2001).
Effet des ions organiques
Le L-lactate et l’urate sont deux effecteurs importants de l’affinité de l’hémocyanine chez les
Crustacés. Le L-lactate est produit par le métabolisme anaérobie des cellules, dû à une hypoxie environnementale
ou à un exercice physique (Truchot, 1980). Chez la plupart des Crustacés, une augmentation
de la concentration en L-lactate provoque une augmentation de l’affinité du pigment, ce qui

52 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
améliore le chargement aux branchies. Cette fixation se fait de manière stéréospécifique, et les analogues
du L-lactate (et même le D-lactate) n’ont pas un effet aussi important (Johnson et al., 1984).
Chez certaines espèces, la sensibilité au lactate est faible ou nulle : c’est le cas des crevettes Thalassinidés
(Taylor et al., 2000) et de la cigale de mer Scyllarides latus (Sanna et al., 2004). En général
l’effet lactate diminue avec le passage à un mode de vie terrestre et la ventilation aérienne (Bridges,
2001). Un effet inverse a été observé chez le crabe terrestre Gecarcoidea natalis (Adamczewska et
Morris, 1998).
L’urate et de manière plus générale les dérivés de purines augmentent également l’affinité de l’hémocyanine
de Crustacés. Toutes les espèces ne présentent pas cet effet. Comme le L-lactate, l’urate ne
modifie pas la valeur de l’effet Bohr. L’urate est produit par l’activité de la xanthine déshydrogénase et
dégradé par l’uricase. En conditions normoxiques, l’activité de l’uricase est 8 fois plus importante que
celle de la xanthine déshydrogénase ; en hypoxie, l’activité de l’uricase est inhibée par l’absence d’O 2
et l’urate s’accumule (Dykens, 1991). La concentration d’urate dans l’hémolymphe de Carcinus maenas
est effectivement corrélée à l’oxygénation du milieu (Lallier et al., 1987). Par contre, l’exercice
physique n’induit pas forcément une production d’urate (Lallier et Walsh, 1990). L’augmentation de
concentration d’autres dérivés puriques (hypoxanthine et inosine) a été observée chez le crabe d’eau
douce Potamon warreni au cours de l’exercice (Bridges, 2001).
Effet de la température
La température peut également être considérée comme un effecteur (ou modulateur) de l’affinité
de l’hémocyanine. Elle peut agir de deux manières : d’une part par un effet sur le pH de l’hémolymphe,
résultant en une modification de l’affinité due à l’effet Bohr, et d’autre part par un effet thermodynamique
sur la réaction de liaison de l’oxygène qui est généralement exothermique. Lorsque
la température augmente, le pH de l’hémolymphe diminue, induisant une diminution de l’affinité
lorsque l’effet Bohr est normal. Cet effet s’ajoute à la diminution d’affinité causée par l’augmentation
de température dans le cas d’une liaison exothermique.
Chez certaines espèces, la chaleur d’oxygénation ∆H peut être nulle ou positive, résultant en
une absence d’effet température ou en un effet température inverse (augmentation de l’affinité du
pigment avec la température). D’un point de vue physiologique, un tel effet est adaptatif pour des
espèces vivant dans des environnements où les conditions thermiques sont variables ou dans lesquels
une augmentation de température est corrélée avec une diminution de l’oxygénation, comme c’est
le cas dans l’environnement hydrothermal. Les espèces hydrothermales présentent souvent un effet
température faible ou inverse, de même que certaines espèces littorales exposées à des températures
variables (Hourdez et Lallier, 2007).

1.4. L’HÉMOCYANINE DES CRUSTACÉS 53
Autres effecteurs
La différence d’affinité existant entre un échantillon d’hémolymphe natif et un échantillon dialysé
ne peut pas toujours être entièrement expliquée par l’ensemble des effecteurs cités plus hauts. Cela
a conduit à proposer l’existence d’autres effecteurs, de faible masse moléculaire, dont la nature reste
à déterminer. Les neurohormones de type monoamines, relargués par le péricarde pendant un stress,
peuvent augmenter l’affinité de l’hémocyanine mais possède une durée de vie limitée dans l’hémolymphe
(Bridges, 2001). Chez Rimicaris exoculata et Cyanagraea predator, un facteur inconnu diminue
l’affinité de l’hémocyanine (Lallier et Truchot, 1997, Lallier et al., 1998). Un facteur diminuant
l’affinité de l’hémocyanine est également présent chez les crabes terrestres et semi-terrestres Bigrus
latro et Ocypode sp. (Bridges, 2001).
Plasticité phénotypique
Comme décrit dans la partie 1.4.1, les hémocyanines de Crustacés présentent une grande plasticité
phénotypique potentielle, due à l’existence de différents types de sous-unités homologues et
d’assemblages non-covalent de plusieurs types (dodécamères, hexamères). Cette diversité permet en
théorie une grande plasticité des combinaisons possibles. Si les sous-unités ou les assemblages ont
des propriétés différentes, ces combinaisons peuvent avoir un rôle physiologique.
Il a par exemple été montré chez l’écrevisse Astacus leptodactylus qu’une acclimation à différentes
températures induisait un changement de la proportion des complexes d’hémocyanine : des
températures croissantes favorisent la formation d’hexamères. De plus, les hexamères de cette espèce
ont une affinité plus élevée pour l’oxygène (Decker et Foll, 2000). Dans ce cas, la plasticité
phénotypique s’exprime au niveau des complexes et semble avoir un effet physiologique.
La plasticité au niveau des sous-unités peut également jouer un rôle. Elle a été observé au cours
du développement chez Cancer magister et Cancer productus pour lesquels des types différents de
sous-unités sont exprimés entre les différents stades, de la larve à l’adulte (Terwilliger et Terwilliger,
1982, Wache et al., 1988, Terwilliger et Dumler, 2001). Des changements d’expression des sousunités
chez l’adulte en fonction des conditions d’acclimatation ont été observés chez le crabe bleu
Callinectes sapidus et chez la langouste Panulirus elephas (Bellelli et al., 1988, Mangum, 1994). Ces
changements de composition ont un effet sur les propriétés fonctionnelles du pigment au moins chez
C. sapidus, P. elephas et P. mauritanicus (Mangum et Rainer, 1988, Bellelli et al., 1988, Condó et al.,
1991).

54 CHAPITRE 1. INTRODUCTION
1.5 Questions biologiques et objectifs de la thèse
Plusieurs questions concernant les adaptations respiratoires des Crustacés Décapodes ont été abordées
pendant cette thèse. Ces questions sont centrées sur l’aspect moléculaire de la fonction respiratoire
et sur le transport de l’oxygène par l’hémocyanine dans des environnements marins hypervariables.
Une des propriétés des hémocyanines permettant aux Crustacés de supporter de tels environnements
est sa plasticité fonctionnelle et sa capacité à répondre à la présence d’effecteurs hémolymphatiques
dans des conditions de stress environnemental. La première moitié de la thèse s’intéresse aux
relations moléculaires entre l’hémocyanine et certains de ces effecteurs chez Carcinus maenas.
Dans le premier chapitre, les techniques utilisées pour l’étude de la structure des hémocyanines
dans le reste de la thèse sont présentées à travers un article de revue réalisé pendant la thèse et incorporant
des données personnelles. Cet article fait le bilan des données structurales obtenues sur les
hémoglobines géantes d’Annélides et les hémocyanines de Crustacés par spectrométrie de masse et
par diffusion de lumière multi-angulaire.
Dans le deuxième chapitre, les interactions entre l’hémocyanine et le L-lactate et les cations divalents
ont été étudiées par spectrométrie de masse en conditions non-covalentes (MS supramoléculaire).
Cette technique d’utilisation relativement récente en biologie est de plus en plus utilisée pour
l’étude des interactions protéine/protéine et protéine/ligand.
La deuxième moitié de la thèse s’est intéressée à l’intégration de la plasticité de l’hémocyanine
dans la réponse aux variations des conditions environnementales chez Carcinus maenas et Segonzacia
mesatlantica, en se focalisant particulièrement sur la plasticité phénotypique de l’Hc.
Le troisième chapitre présente ainsi les études réalisées chez des crabes Carcinus maenas acclimatés
en laboratoire à différentes conditions expérimentales et dont la structure de l’Hc a été analysée
par la suite. Une étude sur une population naturelle estuarienne est également présentée.
Le quatrième et dernier chapitre s’intéresse enfin à la plasticité phénotypique et à la réponse
hémolymphatique à différentes conditions environnementales chez le crabe hydrothermal Segonzacia
mesatlantica. Ces travaux ont été réalisés sur des échantillons collectés au cours de la campagne
MoMARETO 2006 au sud des Açores.
Les travaux réalisés sur ces deux modèles permettent de comparer les mécanismes d’adaptation
respiratoire mis en jeu au niveau moléculaire dans des milieux hypervariables différents.

Chapitre 2
La spectrométrie de masse et la diffusion de
lumière appliquées à l’étude des pigments
respiratoires : article de revue
55

56 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPLIQUÉS AUX PIGMENTS RESPIRATOIRES
Les pigments respiratoires présentent une grande diversité de structures quaternaires. En particulier,
les pigments respiratoires d’invertébrés marins comme les hémoglobines géantes (HBL-Hbs)
d’Annélides ou les hémocyanines (Hcs) de Crustacés Décapodes sont formés par l’association noncovalente
d’un grand nombre de sous-unités de différents types. La détermination des structures de
ces pigments nécessite des techniques adaptées à de tels édifices.
Ce chapitre présente à travers un article de revue réalisé pendant la thèse et intégrant des données
personnelles l’utilisation couplée de la spectrométrie de masse et de la diffusion de lumière à l’étude
de la structure de ces pigments respiratoires. Les principes des techniques sont brièvement rappelés
avant l’article.
2.1 L’ESI-MS et les pigments respiratoires
2.1.1 Principe et historique de la spectrométrie de masse
Un spectromètre de masse est un appareil permettant de déterminer très précisément la masse de
composés ionisées en les séparant en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). Une analyse en
spectrométrie de masse (MS) comporte trois étapes successives : l’ionisation et le passage en phase
gazeuse des composés préparés en phase solide ou liquide, la séparation des ions produits selon leur
rapport m/z et enfin la détection des ions séparés. Différentes méthodes d’ionisation et de séparation
existent et déterminent le type de spectromètre de masse (figure 2.1).
Historiquement, la première mesure d’un rapport m/z fut réalisée par J.J. Thomson en 1897 sur
l’électron (Griffiths, 1997). J.J. Thomson sépara également un faisceau contenant des cations selon
les différentes trajectoires paraboliques caractéristiques des rapports m/z des composés (Vinh, 1999).
En 1920, A.J. Dempster crée une source à impact électronique dans laquelle un faisceau d’électrons
est produit par le chauffage d’un filament et en 1933 F.W. Aaston mesure les masses atomiques et les
distributions isotopiques de presque tous les éléments chimiques (Vinh, 1999).
L’application de la spectrométrie de masse à la biologie nécessite une source permettant d’ioniser
des molécules de masse moléculaire importante. Dans les années 1970, plusieurs types de sources
permettent de mesurer les masses de peptides (PDMS, Plasma Desorption MS, SIMS, Secondary Ion
MS, FAB, Fast Atom Bombardment, LISMS, Liquid Secondary Ion MS) mais les plus hautes masses
atteintes sont de 25 kDa environ et la sensibilité limitée des appareils exige des dizaines de pmol
d’échantillon. De plus, les mélanges protéiques perturbent le signal et les spectres obtenus sont trop

2.1. L’ESI-MS ET LES PIGMENTS RESPIRATOIRES 57
FIG. 2.1 – Principe d’un spectromètre de masse. Les molécules contenues dans l’échantillon sont
ionisées par la source et passent en phase gazeuse, puis sont séparées selon leur rapport m/z par
l’analyseur et enfin les ions séparés sont comptés par le détecteur. L’ESI et le MALDI sont les sources
les plus utilisées en biologie, classiquement associées à des analyseurs quadripôle (Q) ou temps de
vol (TOF) ou à une géométrie en tandem (Q-TOF par exemple).
sélectifs (Vinh, 1999). En 1988, deux techniques d’ionisation nouvelles sont mises au point : l’ESI
(ElectroSpray Ionization) par John Fenn et le MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)
par Franz Hillenkamp. Ces deux techniques d’ionisation sont les principales utilisées en biologie
aujourd’hui et ont ouvert la voie à de nouvelles performances en terme de masse et de résolution.
2.1.2 L’ESI-MS en biologie
La spectrométrie de masse (MS) est une technique à présent couramment employée en biologie.
Elle permet de déterminer de manière beaucoup plus précise et exacte la masse moléculaire des
composés analysés que d’autres techniques comme l’électrophorèse sur gel ou l’ultracentrifugation
analytique. C’est une technique au développement relativement récent qui fut d’abord employée pour
déterminer la masse de petits composés (fortuitine de 1,4 kDa, insuline de 5,8 kDa (Vinh, 1999))
puis d’édifices plus importants avec le développement des sources ESI et MALDI (hémocyanine de
2,2 MDa, capside du batériophage MS2 de 2,5 MDa (Sanglier et al., 2003, Tito et al., 2000)). Elle a
de nombreuses applications en biologie (séquençages, phénotypage, interactions protéine/protéine ou
protéine/substrat, association et dissociation de complexes, cinétiques).
Les sources et les analyseurs utilisés en biologie
Le MALDI et l’ESI sont les deux principales méthodes d’ionisation actuellement utilisées. Le
MALDI consiste à déposer un mélange solide contenant l’échantillon et une matrice de dépôt sur
une plaque métallique, la cible, puis à l’exposer à une décharge laser permettant d’ioniser le mélange
matrice/échantillon et de produire les ions envoyés dans le détecteur (Karas et Hillenkamp, 1988,
Tanaka et al., 1988). L’ESI est une méthode plus douce consistant à produire un spray (nébulisation)
à partir de l’échantillon en phase liquide, au niveau d’un cône possédant un fort potentiel électrique

58 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPLIQUÉS AUX PIGMENTS RESPIRATOIRES
FIG. 2.2 – Principe de l’ESI (pris dans Vinh (1999)). L’échantillon en solution est expulsé par une
aiguille portée à un fort potentiel. Les gouttelettes formées sont chargées et le solvant s’évapore lors du
passage vers l’entrée de l’échantillonneur grâce au flux de gaz sec (N 2 ), provoquant la concentration
des charges surfaciques et l’explosion coulombienne des gouttelettes jusqu’à ce que les molécules
soient désolvatées plus ou moins complétement.

2.1. L’ESI-MS ET LES PIGMENTS RESPIRATOIRES 59
permettant de charger la surface des gouttelettes. Le spray traverse ensuite un flux de gaz sec et chaud
provoquant l’évaporation du solvant et la concentration des charges ; les gouttelettes explosent en
gouttelettes plus petites lorsque la répulsion électrostatique est plus forte que les forces de tension
superficielles, jusqu’à concentrer les charges sur les composés contenus dans l’échantillon (figure
2.2) (Fenn et al., 1989). Contrairement au MALDI qui produit généralement des ions monochargés
(M+H + ) + , la source ESI produit des ions multichargés (M+nH + ) n+ . Ceci permet de mesurer des rapports
m/z pour des macromolécules de haute masse dans la gamme de mesure m/z des analyseurs
actuels. L’ESI est également utilisée pour l’analyse de complexes non-covalents (ESI supramoléculaire)
car elle permet de conserver intacts ces complexes. Des particules virales de virus de plantes
collectées après une ionisation par ESI sont toujours capables d’infecter des hôtes, démontrant ainsi
que la conformation native et fonctionnelle des complexes est conservée lors du processus (Siuzdak et
al., 1996). La mise au point de sources miniaturisées pour l’ESI (nanospray, picospray) a également
permis d’augmenter la sensibilité de l’analyse et de diminuer les quantités d’échantillons requises,
certaines expériences permettant de mesurer la masse de composés à partir d’une seule cellule (Vinh,
1999).
La deuxième étape de l’analyse MS, après l’ionisation des composés, est la séparation des ions
dans l’analyseur et la mesure de leur rapport m/z. Les deux principales méthodes de séparation actuellement
utilisées sont le quadripôle (Q) et le temps de vol (time of flight, TOF).
Un quadripôle est constitué de quatre électrodes allongées disposées le long de la trajectoire des
ions. Les électrodes opposées deux à deux sont portées au même potentiel électrique, les deux couples
d’électrodes étant soumis à des potentiels opposés. Le potentiel imposé est la somme d’une composante
sinusoïdale et d’une composante continue. Lors de leur passage dans le quadripôle, les ions
suivent une trajectoire oscillante sous l’effet de la composante alternative. Les ions ayant un rapport
m/z inférieur à une valeur seuil dépendant de l’amplitude et de la fréquence de la composante alternative
ont une amplitude d’oscillation trop élevée et sont arrêtés par les barres du quadripôle. De même,
les ions dérivent sous l’effet de la composante continue et ceux ayant un rapport m/z supérieur à une
valeur seuil dépendant de la valeur de la composante continue ont trop dévié à la sortie du quadripôle
et ne sont pas détecté par la cellule du détecteur (figure 2.3). Le quadripôle agit donc comme un filtre
passe-bande et permet l’acquisition d’un spectre en balayant la gamme m/z transmise au cours d’une
analyse.
Le principe du TOF est différent : les ions sont stockés pendant un bref instant en amont du tube
de TOF, puis sont soumis à une accélération dans un champ électrique. Leur accélération dépend de
leur rapport m/z. Ils passent ensuite dans le tube de vol libre de champ électrique dans lequel ils ne
sont plus accélérés et se déplacent à la vitesse acquise pendant l’accélération. La détection se fait au
bout du tube selon le temps d’arrivée des ions, les ions les plus accélérés (rapport m/z faible) arrivant

60 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPLIQUÉS AUX PIGMENTS RESPIRATOIRES
(a)
(b)
(c)
FIG. 2.3 – Principe des analyseurs quadripôle (Q) et temps de vol (TOF) (pris dans Vinh (1999)).
(a) dans un quadripôle, seuls les ions résonnants présentant un rapport m/z adéquat (dépendant des
valeurs U, V et ω) sont transmis par l’appareil et détectés. (b) TOF linéaire (ici associé à une source
MALDI) dans lequel les ions sont accélérés, puis traversent une zone sans champ électrique avant
d’être détectés. (c) TOF avec réflectron dans lequel les ions effectuent un demi-tour dans le réflectron
puis effectuent un nouveau trajet sans accélération avant d’être détectés. Le réflectron permet d’augmenter
la distance parcourue par les ions sans augmenter la longueur du tube de vol et refocalise les
ions de même rapport m/z ce qui permet de corriger la dispersion cinétique.

2.1. L’ESI-MS ET LES PIGMENTS RESPIRATOIRES 61
en premiers (figure 2.3). La présence d’un rélectron en bout de tube permet de refocaliser les ions de
même rapport m/z et de corriger la dispersion cinétique des ions, tout en augmentant la distance de
vol sans augmenter la taille de l’appareil. Le TOF ne présente pas de limite théorique au rapport m/z
détectable puisqu’il s’agit d’un chronométrage du temps de vol des ions (Verentchikov et al., 1994,
Tang et al., 1994).
Des systèmes en tandem existent afin de caractériser des peptides précis présents dans un mélange.
Une première analyse en Q peut par exemple révéler un ion que l’on désire caractériser ; il est
alors sélectionné et transmis par le premier analyseur, puis traverse une chambre de collision à faible
pression de gaz dans laquelle l’ion est fragmenté. Les produits de collision sont alors séparés par le
deuxième analyseur. Ce type d’analyse permet par exemple d’obtenir des microséquences protéiques.
On caractérise un analyseur de ce type par l’association des deux analyseurs : Q-TOF, TOF-TOF. Un
analyseur en tandem de type Q-TOF peut aussi être utilisé avec une composante continue nulle (mode
RF, Radio Frequence) sur le quadripôle afin d’agir uniquement comme un focaliseur avant l’analyse
en TOF.
Spectres obtenus à en ESI-MS
Le spectre brut obtenu en MS présente des données en terme de rapport m/z. La masse m d’un
composé peut être déterminée si la charge z est connue. Dans le cas d’une source MALDI, les ions
sont en général monochargés : z = 1, ce qui permet de calculer m. Dans le cas d’une source ESI, une
distribution d’ions multichargés (M+nH + ) n+ est en général obtenue pour chaque composé. Le spectre
présente alors une série de pics différant chacun d’une charge. La masse peut être calculée en utilisant
deux pics successifs de rapport m/z p 1 et p 2 et de charge n et n+1pour lesquels on a :
p 1 = m+n.m H +
n
La masse d’un ion H + étant de 1 g.mol −1 , on déduit :
et p 2 = m+(n+1)m H +
n+1
n = p 1 − 1
p 2 − p 1
et m = (p 1 − 1)(p 2 − 1)
p 2 − p 1
Dans la pratique, un spectre ESI-MS obtenu à partir d’un mélange peut rapidement devenir très
complexe en raison du chevauchement des distributions. Des programmes de déconvolution sont alors
utilisés pour convertir le spectre en m/z en un spectre dit zéro de charge, en m uniquement (programme
MaxEnt pour Maximum Entropy).
D’un point de vue quantitatif, les spectres de masse ne permettent pas de quantifier des abondances
de composés de manière absolue, car l’intensité d’un pic dépend également de la facilité avec laquelle

62 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPLIQUÉS AUX PIGMENTS RESPIRATOIRES
une molécule peut être ionisée et non pas uniquement de son abondance. Une approche quantitative
en spectrométrie de masse doit être menée avec précaution et en contrôlant la méthode pour chaque
molécule. Cependant, entre échantillons contenant des protéines similaires, une comparaison relative
d’échantillon à échantillon pour chaque protéine est possible.
L’ESI-MS en conditions dénaturantes
Selon le type d’analyse désiré, on peut préparer les échantillons et régler les paramètres de la
source de manière à séparer les constituants des complexes non-covalents et à dénaturer les molécules
pour mesurer les masses des chaînes polypeptidiques, ou au contraire conserver les interactions noncovalentes
et mesurer les masses des complexes associés à leur substrat.
Pour réaliser une analyse en conditions dénaturantes, l’échantillon est dilué dans un mélange
eau/solvant organique tel que l’acétonitrile ou le méthanol avec une faible proportion d’acide organique.
Un mélange typique est par exemple eau/acétonitrile/acide formique dans les proportions volumiques
50 :50 :1. Le pH final de la préparation est acide ( pH 3) et les interactions non-covalentes sont
détruites. Les molécules sont protonées et multi-chargées. Dans ce cas, on peut mesurer la masse des
sous-unités constituant un complexe, et celle de groupements prosthétiques éventuellement présents.
Dans le cas des hémoglobines géantes d’Annélides, on peut mesurer la masse des chaînes de globines
et des chaînes de structure (linkers). Un pic à 616 Da correspond à l’hème dissocié des chaînes de
globines. En réalisant des modifications chimiques sur l’échantillon avant analyse (e.g. réduction des
ponts disulfures, coupure des liaisons glycosidiques, carbamidométhylation), on peut obtenir d’autres
informations structurales comme le nombre de cystéines libres et impliquées dans les ponts disulfures
ou la présence de chaînes glycosylées. De plus, en réalisant des analyses sur des échantillons du même
type mais provenant d’individus différents par exemple, une comparaison relative entre échantillons
pour les mêmes ions peut être réalisée.
L’ESI-MS supramoléculaire
Comparée au MALDI, l’ESI-MS est une source douce réalisant une ionisation à pression atmosphérique
et sans impact sur l’échantillon, permettant de conserver les interactions non-covalentes
entre les molécules si le solvant de départ est adapté et si les paramètres de la source sont correctement
ajustés (pression du gaz de nébulisation à 1 bar, augmentation du potentiel de sortie de capillaire
à 400 V par exemple). L’ESI a ainsi ouvert la voie à l’analyse de complexes non-covalents par MS
(Fenn et al., 1989). Le tampon utilisé peut être de l’eau ou plus généralement un tampon aqueux et
volatile à pH compris entre 6 et 8. Ces conditions sont plus proches des conditions physiologiques et
permettent a priori de se rapprocher de la conformation native des molécules. Le tampon doit contenir

2.1. L’ESI-MS ET LES PIGMENTS RESPIRATOIRES 63
peu de sels afin de limiter le bruit et la formation d’adduits lors de l’analyse. Les tampons les plus
souvent utilisés sont l’acétate d’ammonium NH 4 CH 3 CO 2 et le carbonate d’ammonium NH 4 HCO 3 en
raison de leur volatilité, dans des concentrations de 1 à 100 mM.
Des interactions non-covalentes entre protéines et protéines et entre protéines et cofacteurs, ligands
ou groupement prosthétiques ont été observées par cette méthode (Katta et Chait, 1991, van
Duijn et al., 2006, Potier et al., 1997, Ganem et al., 1991a,b, Robinson et al., 1998, McCammon et
al., 2004, Oldham et al., 2003, Robinson et al., 2007, Benesch et Robinson, 2006). L’utilisation du
TOF permet en outre de détecter de hauts rapports m/z sans limite supérieure théorique, ce qui est
nécessaire lorsque des complexes de haute masse sont étudiés. La technique du nanospray permet
d’introduite de petites quantités d’échantillon (Wilm et Mann, 1994). Des complexes de très haute
masse moléculaire ont ainsi pu être analysés : GroEL, la capside du virus MS2, le ribosome (Rostom
et Robinson, 1999, Tito et al., 2000, Rostom et al., 2000). En faisant varier les conditions expérimentales,
on peut accéder à des constantes d’association protéine-ligand ou à des constantes cinétiques.
L’analyse de la structure tertiaire est également possible par cette méthode (Robinson et Radford,
1995, Ashcroft et al., 2002, Konermann et al., 2001, Ganem et al., 1991a).
Lorsque des complexes non-covalents sont analysés par ESI-MS supramoléculaire, une question
importante est de savoir si les interactions observées en phase gazeuse correspondent effectivement
aux interactions existant en solution, c’est à dire si les interactions en solution sont conservées durant
l’ionisation et l’analyse en MS. Etant donné que pour une espèce en solution, un changement de pH
ou de force ionique peuvent être suffisants pour induire une modification des interactions existantes,
il faut examiner avec précaution l’effet d’un changement de phase. Les mécanismes précis ayant lieu
lors de l’ESI ne sont pas encore connus exactement (Nguyen et Fenn, 2007) mais il est probable que
les différents types d’interactions pouvant exister sont modifiés de manière différente. Les interactions
hydrophobes disparaîtraient et les interactions hydrophiles et de Van der Waals seraient renforcées
(Robinson et al., 1998). Des études par simulation informatique de l’évaporation du solvant suggèrent
que la conformation est influencée par le processus mais que les éléments structuraux principaux
(structures secondaires) sont conservés (Patriksson et al., 2007). L’utilisation de composés basiques
à la place de l’acétate d’ammonium pour la préparation de l’échantillon pourrait également aider à
conserver une conformation plus proche de celle en solution en limitant la charge de la protéine en
phase gazeuse (Catalina et al., 2005). La possibilité de collecter des virus viables après un passage en
ESI-MS et à travers un quadripôle suggère que la conformation native est retenue durant l’ensemble
du processus (Siuzdak et al., 1996). Une limite maximale pour la taille des particules analysables par
ESI-MS seraient la taille de la gouttelette dans le spray (C. J. Hogan et al., 2006).

64 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPLIQUÉS AUX PIGMENTS RESPIRATOIRES
FIG. 2.4 – ESI-MS supramoléculaire et dénaturante appliquées à l’Hc de Crustacé. A partir d’un
échantillon natif, les conditions d’analyse peuvent permettre de conserver les interactions noncovalentes
et donc d’ioniser des complexes intacts qui sont séparés par l’analyseur (en haut). Dans des
conditions dénaturantes, les complexes sont dissociés en sous-unités qui sont ionisées puis séparées
(en bas).
2.1.3 Application de l’ESI-MS à l’étude des pigments respiratoires
Les capacités de l’ESI-MS en font un outil de choix pour l’étude des pigments respiratoires multimériques
de haute masse moléculaire. Son utilisation en conditions dénaturantes permet d’accéder au
nombre de sous-unités différentes, à leur taille, au nombre d’hèmes liés dans le cas des hémoglobines,
au nombre de cystéines libres et liées et à des informations sur la présence de chaînes glycosylées.
L’ESI-MS supramoléculaire permet d’avoir la masse des complexes natifs (hémocyanines de Crustacés)
ou des sous-ensembles non-covalents (dodécamères de globines des HBL-Hb d’Annélides)
(figure 2.4). La forme native d’une HBL-Hb d’Annélide (3-4 MDa) n’a pas encore été observé en
raison d’un manque de sensibilité dans cette gamme de masse et de l’élargissement des pics de cette
espèce moléculaire dû à la présence d’adduits. La connaissance des masses natives des complexes
(par ESI-MS supramoléculaire ou par diffusion de lumière) et celle des masses des sous-unités (par
ESI-MS en conditions dénaturantes) permet de proposer des modèles structuraux pour ces protéines.
2.2 Le MALLS et les pigments respiratoires
2.2.1 Principe de la diffusion de lumière
Lorsqu’une molécule polarisable est excitée par une onde électromagnétique (e.g. laser), un dipôle
oscillant est induit au sein de la molécule qui réémet à son tour une onde électromagnétique (figure
2.5). La quantité de lumière réémise dépend la polarisabilité des molécules qui peut être estimée par

2.2. LE MALLS ET LES PIGMENTS RESPIRATOIRES 65
leur coefficient dn/dc (variation d’indice de réfraction d’une solution en fonction des variations de
concentration des solutés). L’intensité diffusée dépend aussi de la quantité de molécules et double pour
une quantité double de molécules. Lorsque deux molécules forment un dimère, leurs mouvements
browniens se synchronisent et les ondes diffusées par chacune sont alors en phase. L’intensité diffusée
est alors le double de la somme des intensités diffusées individuellement (figure 2.6). En connaissant
la concentration des solutés, la masse molaire peut donc être déduite par la mesure des intensités
diffusées.
La diffusion de lumière par une particule se fait dans toutes les directions de l’espace. La diffusion
peut être isotrope (identique dans toutes les directions) : c’est le cas des petites particules globulaires
(e.g. BSA). Selon la forme et la taille des particules, elle peut également être anisotrope (l’intensité
mesurée dépend de l’angle d’observation).
Les premiers appareils construits pour exploiter le principe de la diffusion de lumière ne pouvaient
mesurer la lumière diffusée qu’à un seul angle. Pour pouvoir déduire la masse molaire d’un échantillon
avec une seule mesure, il faut en principe réaliser la mesure à 0° par rapport au rayon incident :
l’intensité dépend alors uniquement de la masse molaire et non de la forme. Dans la pratique, cet
angle correspond également à celui du rayon transmis par la cellule et la mesure était réalisée à un petit
angle proche de 0° pour ne pas mesurer l’intensité du rayon simplement transmis par l’échantillon.
Dans les années 1970, P.J. Wyatt développa un appareil permettant de mesurer l’intensité diffusée
à plusieurs angles. Ce type de mesure permet d’extrapoler la valeur de la mesure à 0° et de déduire
avec précision la masse du composé analysé, tandis que la dépendance angulaire de l’intensité diffusée
permet de déduire la taille de la particule (rayon de gyration R g correspondant au rayon moyen de la
particule pondéré par la distribution de masse autour de son centre de gravité). Ce type de méthode
est appelé MALLS pour Multi-Angle Laser-Light Scattering (diffusion de lumière laser à plusieurs
angles).
Le MALLS est une méthode d’emploi relativement récent en biologie, permettant une détermination
de la masse moléculaire de composés en solution sans établir de calibration a priori comme c’est
le cas par exemple lors d’une calibration de système SEC avec des molécules de masses connues.
La détermination du rayon de gyration permet également de déduire la forme générale des particules
lorsque les populations sont légèrement polydisperses en représentant log(R h ) en fonction de
log(MM) : la pente de la courbe indique si les particules ont plutôt une forme de bâtonnet, de sphère
ou de pelote statistique.

66 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPLIQUÉS AUX PIGMENTS RESPIRATOIRES
FIG. 2.5 – Induction d’un dipôle oscillant sous l’effet d’un laser. L’onde électromagnétique excitatrice
induit l’oscillation de charges au sein de la particule polarisable qui émet à son tour une onde. Les
illustrations proviennent du site de la société Wyatt Technology hhtp ://www.wyatt.com/theory.
(a)
(b)
FIG. 2.6 – Diffusion de lumière d’un dimère. (a) deux particules isolées diffusent la lumière avec
un déphasage aléatoire dû à leurs mouvements browniens indépendants ; l’intensité diffusée est la
somme simple des deux intensités. (b) deux particules liées subissent le même mouvement brownien
et la lumière est diffusée en phase par les deux particules ; l’intensité diffusée est le double de
celle de deux monomères isolés. Les illustrations proviennent du site de la société Wyatt Technology
hhtp ://www.wyatt.com/theory.

2.2. LE MALLS ET LES PIGMENTS RESPIRATOIRES 67
FIG. 2.7 – Schéma d’un système SEC-MALLS. Les signaux mesurés sont les intensités I θ diffusées
aux angles θ par la cellule de mesure, illuminée par l’intensité incidente I.
2.2.2 Utilisation du MALLS pour l’étude de complexes non-covalents
Le principe d’une analyse en diffusion de lumière (light scattering) est de mesurer l’intensité
lumineuse diffusée par une cellule de mesure transparente contenant l’échantillon et illuminée par une
source avec une intensité incidente connue. L’intensité diffusée dépend de l’intensité incidente, de la
masse molaire et de la concentration du composé, de sa forme et de l’angle d’observation. L’intensité
incidente et les angles de mesure étant connus, il est nécessaire de déterminer la concentration dans
la cellule pour obtenir l’information de masse et de forme (rayon de gyration).
Le système MALLS est en général couplé à un système de séparation afin de réaliser les mesures
sur des composés séparés purs (e.g. SEC) (figure 2.7). Il est associé à une mesure de la concentration
de l’échantillon passant dans la cellule, en général par mesure du changement d’indice de réfraction
(refractive index, RI) ou par mesure de l’absorbance à 280 nm pour les protéines.
Les profils d’indice de réfraction ou d’absorbance obtenus peuvent être déconvolués en pics gaussiens
à l’aide du logiciel Origin afin de déterminer le nombre d’espèces différentes présentes dans
l’échantillon, leurs abondances relatives et les zones de recouvrement. La figure 2.8 présente le profil
classique obtenu pour de l’hémolymphe native de Carcinus maenas. Deux espèces protéiques majoritaires
sont présentes (absorbance à 280 nm) ; il s’agit d’Hc fonctionnelle (vérifié par l’absorbance
caractéristique à 337 nm, coefficient d’extinction plus faible qu’à 280 nm). L’analyse par MALLS
donne des masses de 922 kDa et 486 kDa, correspondant respectivement au dodécamère et à l’hexamère
d’Hc. Une déconvolution en pics gaussiens montre la présence d’une troisième espèce en faible
quantité qui élue avant le dodécamère et qui correspond à un 18-mère. L’erreur due aux calculs lors

68 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPLIQUÉS AUX PIGMENTS RESPIRATOIRES
(a)
0.8
0.7
réel
gaussien
reconstitué
1e+007
Abs. 280nm (UA)
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
1e+006
Masse molaire (g/mol)
0.1
0
9 10 11 12 13 14 15 16
100000
volume (ml)
(b)
FIG. 2.8 – Profil SEC-MALLS typique de l’hémolymphe de Carcinus maenas. (a) Profil FPLC (SEC).
Le dodécamère est majoritaire devant l’hexamère (en général l’hexamère représente de 5 à 20 %
de l’hémocyanine totale). Une faible fraction de 18-mère est présente. L’hémocyanine représente la
quasi-totalité des protéines présentes dans l’hémolymphe après centrifugation et culottage des protéines
coagulantes. (b) Profil SEC-MALLS des complexes. Les masses estimées correspondent au
18-mère, au dodécamère et à l’hexamère (1 314 kDa, 923 kDa, 486 kDa). 3 pics gaussiens sont suffisants
pour reconstituer le profil.

2.2. LE MALLS ET LES PIGMENTS RESPIRATOIRES 69
d’une estimation de masse par MALLS est faible et est en général inférieure à 1 %. Par contre, l’erreur
réelle possible est de l’ordre de 10 % en raison de l’incertitude introduite lors de la détermination des
lignes de base et du coefficient dn/dc qui varie suivant la glycosylation des protéines.
Pour les acquisitions MALLS sur des échantillons d’Hc de Crustacés, les expériences ont eu lieu
avec un débit de 0,25 ou 0,5 ml/min. Le coefficient dn/dc utilisé est 0,190 g/ml, typique des protéines
non-glycosylées. Une normalisation des détecteurs a été réalisée en utilisant de la BSA (Sigma). La
méthode de Zimm a été utilisée pour calculer les masses à partir des intensités diffusées avec le
logiciel Astra 4.90.08 (Wyatt Technology Corp., Santa Barbara).
2.2.3 Autres possibilités du MALLS
Les méthodes présentées précédemment mesurent la diffusion statique de la lumière, c’est à dire la
diffusion due à des particules dont les mouvements browniens sont moyennés sur le temps d’acquisition
des détecteurs. Ce type de mesure donne accès à la masse et au rayon de gyration des molécules.
Il existe une méthode d’acquisition utilisant des compteurs de photons rapides qui permettent de
mesurer les fluctuations de l’intensité diffusée au cours du temps ; il s’agit alors de diffusion de lumière
dynamique ou QELS pour Quasi-Elastic Light Scattering (diffusion de lumière quasi-élastique).
Ces fluctuations sont dues aux mouvements aléatoires des particules diffusant la lumière, qui provoquent
des interférences alternativement constructives et destructives des ondes émises par chacune
d’entre elles. La corrélation entre les intensités diffusées sur un petit intervalle de temps dépend de la
constante de diffusion des particules dans le solvant. Il est donc possible de déduire la constante de
diffusion à partir d’une mesure en QELS, puis de calculer le rayon hydrodynamique R h des particules.
Le rapport R g /R h donne une indication sur la forme de la particule.
Le MALLS permet également de mesurer le second coefficient de viriel A 2 , qui estime l’interaction
entre les molécules analysées et le solvant.
2.2.4 Application du MALLS à l’étude des pigments respiratoires
Le MALLS est une méthode permettant de déterminer la masse des pigments respiratoires de
haute masse moléculaire en solution de manière relativement précise et rapide (typiquement 1 à 2 h
pour une acquisition en SEC-MALLS). Cette technique permet de tester l’effet de différents tampons,
physiologiques ou non, sur la structure des complexes et ainsi de suivre des processus de dissociation
ou de réassociation (Rousselot et al., 2006). Elle a été utilisée notamment pour déterminer la masse
des hémoglobines géantes d’Annélides (non encore accessible en ESI-MS) et celle de l’Hc de certains
Crustacés Décapodes. Les données de masses natives acquises en MALLS peuvent être utilisées avec

70 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPLIQUÉS AUX PIGMENTS RESPIRATOIRES
les masses des sous-unités mesurées en ESI-MS dénaturante pour établir des modèles structuraux. De
plus, le MALLS peut donner des indications sur la forme des particules étudiées (R g et R h ).
2.3 Article de revue : The Structural Analysis of Large Noncovalent Oxygen
Binding Proteins by MALLS and ESI-MS : A Review on Annelid Hexagonal
Bilayer Hemoglobin and Crustacean Hemocyanin
Les travaux réalisés sur les hémoglobines géantes d’Annélides et sur les hémocyanines de Crustacés
en utilisant ces deux techniques ont été revus dans un article rédigé pendant la thèse ; des données
personnelles concernant les Hcs figurent également dans l’article. Cet article est reproduit ici tel qu’il
est paru ; sa bibliographie n’a pas été reprise dans la bibliographie générale de la thèse.

150 Current Protein and Peptide Science, 2008, 9, 150-180
The Structural Analysis of Large Noncovalent Oxygen Binding Proteins by
MALLS and ESI-MS: A Review on Annelid Hexagonal Bilayer Hemoglobin
and Crustacean Hemocyanin
Matthieu Bruneaux 1,2 , Morgane Rousselot 1,2 , Emmanuelle Leize 3 , François H. Lallier 1,2 and
Franck Zal 1,2,*
1 UPMC Univ. Paris 06, UMR 7144, Equipe Ecophysiologie: Adaptation et Evolution Moléculaires, Station Biologique
de Roscoff, 29682, France; 2 CNRS, UMR 7144, Station Biologique de Roscoff, 29682, France; 3 CNRS-ULP, UMR 7177,
Laboratoire de Dynamique et Structure Moléculaire par Spectrométrie de Masse, Institut de Chimie, ISIS, 67083 Strasbourg,
France
Abstract: Understanding the function of macromolecular complexes is related to a precise knowledge of their structure.
These large complexes are often fragile high molecular mass noncovalent multimeric proteins. Classical biochemical
methods for determination of their native mass and subunit composition were used to resolve their quaternary structure,
sometimes leading to different models. Recently, the development of mass spectrometry and multi-angle laser light scattering
(MALLS) has enabled absolute determination of native masses and subunit masses. Electrospray ionization mass
spectrometry (ESI-MS) was used in denaturing and native conditions to probe subunit composition and noncovalent assemblies
masses up to 2.25 MDa. In a complementary way, MALLS provides mass and size estimation in various aqueous
solvents. ESI-MS method can also give insights into post-translational modifications (glycosylation, disulfide bridges …).
By combining native mass and subunit composition data, structural models can be proposed for large edifices such as annelid
extracellular hexagonal bilayer hemoglobins (HBL-Hb) and crustacean hemocyanins (Hc). Association/dissociation
mechanisms, protein-protein interactions, structural diversity among species and environmental adaptations can also be
addressed with these methods. With their absolute mass determination, the very high precision of spectrometry and the
versatile nature of light scattering, ESI-MS and MALLS have provided a wealth of data helping to resolve parts of controversies
for HBL-Hb models and opening access to new fields of investigation in structural diversity and molecular adaptation.
In this review we will focus on annelid HBL-Hb and on crustacean Hc and on the original contributions of ESI-
MS and MALLS in this field.
Keywords: Hemoglobin, hemocyanin, mass spectrometry, light scattering, noncovalent macromolecular complexes, structural
model, quaternary structure.
INTRODUCTION
Many biological functions necessary for cellular life are
performed by multimeric protein complexes. Their constituents
can interact noncovalently through electrostatic forces,
hydrogen bonds, van der Waals forces or hydrophobic forces
or be covalently linked by disulfide bonds. These complexes
are either homo- or hetero-polymers. Each subunit can exhibit
an independent activity without any particular properties
emerging from the association step; on the contrary,
some subunits may depend on the interactions within the
complex to gain full activity. To understand the biochemical
mechanisms undertaken by multimeric proteins, the need to
elucidate the subunits identity and arrangement (quaternary
structure) as well as their biochemical properties arises. Once
able to determine structures and resulting functions, and by
relating them to in vivo physico-chemical parameters and
individual life history and environment, one can expect to
lead an integrated physiological approach and to gain insight
into physiological adaptations at the molecular level.
*Address correspondence to this author at the UPMC Univ. Paris 06, UMR
7144, Equipe Ecophysiologie: Adaptation et Evolution Moléculaires, Station
Biologique de Roscoff, 29682, France; Tel: 0033 (0)298292309; Fax:
0033 (0)298292324; E-mail: zal@sb-roscoff.fr
The study of respiratory adaptations in animals is a pertinent
field for leading such an integrated physiological approach.
Respiration is essential for animal life and many
animal phyla have evolved specialized transport molecules in
their circulating fluid permitting enhanced oxygen delivery
to the demanding tissues. These oxygen binding proteins or
respiratory pigments, so-called because of their various colors
when oxygenated, exhibit high structural diversity among
the different groups [1-4].
Biochemical study of the multimeric respiratory pigments
calls for methods able to resolve quaternary structure
of the molecules and identification of the constituting
subunits, as well as characterization of their interactions.
When investigating these complexes, the ideal analytical
technique must be able to preserve these often fragile interactions.
Methods widely used for determination of the native
mass are sedimentation velocity (SV), sedimentation equilibrium
(SE), scanning transmission electron microscopy
(STEM) and size exclusion chromatography (SEC). More
recently, supramolecular mass spectrometry (MS) and multiangle
laser light scattering (MALLS) were also used to ob-
1389-2037/08 $55.00+.00 © 2008 Bentham Science Publishers Ltd.
71

The Structural Analysis of Large Noncovalent Oxygen Binding Proteins Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 151
tain precise and accurate masses of native molecules [5, 6].
To obtain the masses of each constituent, gel electrophoresis
has been widely used but the current method of choice is
mass spectrometry under denaturing conditions. By associating
data concerning both the native protein and its subunits,
new insights into the quaternary structure and the fine tuning
of its physiological functions can be achieved.
1. INVERTEBRATE OXYGEN BINDING PROTEINS:
THE EXAMPLE OF GIANT HEXAGONAL BILAYER
HEMOGLOBIN AND HEMOCYANIN
Oxygen binding proteins occur in all phyla but reach a
high diversity in metazoans [2-4]. They exhibit a high diversity
of localization and structure. They are found in tissues
and in coelomic or vascular fluids. They can be stored in
cells (intracellular pigments) or freely dissolved in the internal
fluids (extracellular pigments). They are metalloproteins
in which either iron (hemoglobin, hemerythrin) or copper
(hemocyanin) reversibly bind O 2 .
In hemoglobins, one iron atom is bound to the tetrapyrrole
ring to form the heme group. The heme is linked to a
polypeptide which presents a typical globin-fold [4]. They
have been notably observed in annelids, arthropods and molluscs.
They range from single chains (e.g. myoglobin, cytoglobin,
leghemoglobin) found in bacteria, algae, protozoa
and plants to large, multisubunit, multidomain complexes
found in nematodes, molluscs and crustaceans, and the giant
annelid hemoglobins comprised of globin and nonglobin
subunits [4]. In hemocyanins, two copper atoms are bound to
histidine residues of the polypeptide chain; the resulting
“blue” proteins are present in molluscs and arthropods.
In this review, we will focus on the analytical structure of
two classes of multimeric respiratory pigments: the annelid
extracellular hexagonal bilayer hemoglobins (HBL-Hb) and
crustacean hemocyanins (Hc). These pigments exhibit high
complexation levels and the wide range of living environments
of the concerned animal phyla allows for different
functional properties among species. In addition, the recently
proposed use of Arenicola marina Hb (AmHb) as a model
for a potential blood substitute [7, 8] and the use of arthropod
Hc as a model for nested allostery further support the
interest of structural investigation of these complexes [9-12].
1.1. The Hexagonal Bilayer Hemoglobin (HBL-Hb) of
Annelids
The annelid phylum comprises over 8000 species subdivided
into terrestrial oligochaetes, aquatic leeches, and marine
polychaetes. Annelids are present in a wide variety of
biotopes, from aerated soil (Lumbricus terrestris) to challenging
hypoxic or toxic environments (intertidal muds for
Arenicola marina; deep-sea hydrothermal vents for Alvinella
pompejana). Most of them have extracellular or intracellular
hemoglobins (Hbs) and sometimes both [13, 14]. However,
in many annelids, oxygen transport relies on giant extracellular
respiratory proteins (~3.6 x 10 6 Da), known as either
erythrocruorins or hexagonal bilayer hemoglobins (HBL-
Hbs). Such large complexes offer a number of important
advantages as oxygen transport vehicles: HBL-Hbs are readily
retained in the vascular system as freely dissolved entities,
each complex possesses large oxygen binding capacity
and subunits can be arranged to permit cooperative oxygen
binding and additional regulatory features enhancing oxygen
transport. The HBL-Hbs are heteromultimeric complexes
consisting of globins (14-18 kDa) and nonglobin, linker
chains (23-28 kDa) in an approximate 2:1 ratio, and represent
a summit of complexity for heme proteins binding O 2
reversibly. Chlorocruorins (Chl) are respiratory pigments
structurally similar to HBL-Hb except for a different side
group in the tetrapyrrole ring. Their absorption spectrum is
thus modified so that the oxygenated form is green rather
than red. They are found in some annelid families (Sabellidae,
Serpulidae, Chlorohaemidae, Amphateridae [4]).
The HBL-Hbs of the polychaete A. marina and the oligochaete
L. terrestris were among the first proteins investigated
by ultracentrifugation [15] and electron microscopy
[16]. They exhibit a highly symmetric hexagonal bilayer
appearance (HBL), with dimensions of about 20 nm x 30 nm
[17]. The first biochemical studies by Svedberg and collaborators
yielded sedimentation constant for numerous erythrocruorins,
ranging from 54.1 S to 61.5 S, and also produced a
first estimation of the mass for A. marina and L. terrestris
hemoglobins of about 2.8 MDa [15, 18].
HBL-Hbs exhibit some original and remarkable properties,
such as an acidic isoelectric point, a high resistance to
auto-oxidation and self-assembling properties, which could
be explained by the selection of robust structures for oxygen
transport as a freely dissolved molecule in the blood. The
high aggregation degree also permits a broad range of cooperativity
(from n 50 = 0.91 in Amphitrite ornata [19] to n 50 =
6.5 in Megascolides australis [20]). A large affinity range is
also observed between species (P 50 = 0.2 Torr for Alvinella
pompejana Hb at 20°C; P 50 = 80 Torr for Spirographis spallanzanii
Chl at 20°C [21]).
As the global structure detected by transmission electron
microscopy (TEM) seems quite uniform in annelids from
different biotopes, the understanding of the inner structural
organization of these respiratory complexes is of crucial interest
to point out potential specific molecular adaptations to
the environmental conditions.
The determination of the precise composition and structure
of these complexes has been a major issue in invertebrate
Hb biochemistry for a long time. Determination of a
model called for knowledge of the complex mass, the
subunit masses and stoichiometry and the spatial arrangement
of the chains. Several models were proposed to account
for the hexagonal bilayer structure observed for all extracellular
giant hemoglobins and the relationship between globin
and linker subunits. Determinations of native masses sometimes
led to different results as is the case for L. terrestris
[22, 23]. Availability of high resolution methods for determination
of native and denatured masses was a keystone in
the resolution of parts of the controversies in this field.
1.2. Arthropod Hemocyanin (Hc)
Hemocyanin is the respiratory pigment responsible for
dioxygen transport in many arthropods and molluscs. It is a
polypeptide complex of high molecular mass, ranging from
450 kDa (crustaceans) to about 10 MDa (gastropods). They
share a seemingly similar active site involving two Cu atoms
72

152 Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 Bruneaux et al.
linked to histidine residues to bind one O 2 molecule [3].
However, apart from the fact that Cu is the metallic atom
responsible for O 2 binding in both phyla, arthropod and molluscan
Hc have very different structures.
Arthropod hemocyanin basic functional subunit is a
~75 kDa polypeptide chain with only one active site. Hexamer
is the basic aggregation state met in the hemolymph but
dodecamers and complexes of higher molecular mass can be
formed from hexamer association, depending on the species.
The largest known assembly stands for Limulus polyphemus
with a 48-mer (~3.6 MDa) resulting from the association of 8
hexamers. The spatial arrangement of the hexamers in the
whole assembly can vary from one group to another. In crustacean,
Hc is usually found as hexamers and dodecamers.
Many species can produce different subunits and thus different
complexes can be formed. The combination of high aggregation
states and basic subunit diversity leads to a very
high potential structural plasticity.
Such hierarchical levels of assembly enable modulation
of the oxygen binding properties of the pigments. Affinity
and cooperativity can be affected by various factors such as
H + , Ca 2+ , Mg 2+ and other inorganic ions, organic cofactors or
the aggregation state itself [24, 25]. These mechanisms allow
individuals to rapidly modulate their pigment properties
when facing a change in environmental conditions. The role
of structural plasticity in the response to environmental challenge
has also been demonstrated in some species [26-29].
Considering the aggregation properties of hemocyanins
and the subunit diversity in each species, it is crucial to know
which complexes are present and their precise composition
in order to be able to compare between species of the same
phyla and between different conditions for a unique species.
2. METHODS USUALLY EMPLOYED TO INVESTI-
GATE MACROMOLECULAR COMPLEX MASS AND
STRUCTURE
Determination of protein mass and structure has been a
central field of investigation since the beginning of biochemistry.
Numerous methods have been developed along the
decades to obtain information about mass, size, composition,
subunit arrangement and physical or biochemical constants.
Commonly used methods in this field are sedimentation velocity
(SV), sedimentation equilibrium (SE), gel electrophoresis,
size-exclusion chromatography (SEC), scanning electron
transmission microscopy (STEM), cryoelectron microscopy
(cryo-EM), crystallography and primary sequence determination.
SV and SE are powerful methods for investigation of
native mass, diffusion coefficient, hydrodynamic shape, protein
interactions and stoichiometry of assemblies [30, 31].
However, an inaccuracy on the specific volume of the molecule
can exist and results in an up to 10 % error [32]. SEC
also allows determination of native masses but is very inaccurate
because of the influence of the protein shape and potential
interaction with the matrix [33, 34]. Both SEC and
ultracentrifugation techniques can use various solvents to
test their effect on protein stability. The STEM method permits
determination of native mass with a 3-10 % precision
while providing images of the macromolecules for visual
control and local mass mapping [35]. Unfortunately very few
laboratories have access to the needed instrumentation. On
the contrary, gel electrophoresis methods can be relatively
easily developed in a laboratory and provides rapid analysis
of samples. The resolution and accuracy are low but close
proteins can sometimes be separated depending on their
isoelectric point in 2D gel electrophoresis. Low quantification
reproducibility can also be a limitation [36]. Nonetheless
the rapidity and ease of use of classical SDS-PAGE
make it very convenient for rapid monitoring of protein purification
for example. Protein spots can also be excised and
analyzed by mass spectrometry.
Crystallography or 3D reconstruction by cryoelectron
microscopy [37] are useful for determining subunits spatial
arrangement and interactions between them. Crystallography
can yield almost all structural information (active-site structure,
interaction) if the structure is well resolved but it is
really difficult to obtain a crystal structure of a large biopolymer
such as hexagonal-bilayer hemoglobin or hemocyanin.
Polypeptide chain mass can also be calculated from
cDNA sequence. However, these methods cannot reveal heterogeneous
post-translational modifications. Major difficulties
of crystallography are the production of pure protein and
the determination of crystallization conditions. Cryo-EM can
be easier to achieve but also calls for highly specialized material
and yields a lower resolution. However, hybrid approaches
combining cryo-EM, sequence analysis and X-ray
can yield molecular model of entire complexes.
All the cited techniques are of major interest for investigation
of protein mass and structure: they can either provide
high quality information (SE, SV, STEM, crystallography
and cryo-EM) or provide rapid and convenient analysis (gel
electrophoresis, SEC). Major limitations are either accuracy
or precision: the resulting error for sedimentation techniques
and gel electrophoresis can be as high as 10% for invertebrate
respiratory pigments [32]. Another limitation is the
need for a very specific instrumentation (e.g. crystallography,
STEM) or the delay from the beginning of the process
until achievement (e.g. crystallography, cDNA sequencing).
In this context and to study high molecular mass noncovalent
complexes such as invertebrate respiratory pigments,
one would expect to use methods enabling relatively
rapid analysis of samples, in native and denaturing conditions
to obtain information about quaternary structure, with a
high precision to be able to detect slight variations in close
molecular species. Multi-angle laser light scattering
(MALLS) and mass spectrometry are two complementary
approaches permitting to satisfy most of these requirements.
3. TWO COMPLEMENTARY TECHNIQUES YIEL-
DING PROTEIN MASS: LIGHT SCATTERING AND
MASS SPECTROMETRY
3.1. Multi-Angle Laser Light Scattering (MALLS)
Recent improvements in instrumentation have made the
light scattering (LS) technique a powerful method to determine
the absolute molecular mass of proteins. On-line connection
of advanced laser LS devices with high-performance
liquid chromatography (HPLC) equipment can provide quick
and accurate molecular mass determinations for proteins and
help to characterize protein-protein interactions in solution.
73

The Structural Analysis of Large Noncovalent Oxygen Binding Proteins Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 153
Light scattering is a phenomenon directly related to the
mass of protein molecules in solution. As an electromagnetic
wave passes through the particle, the oscillating electromagnetic
field induces an oscillating dipole in the particle itself
which in return reemits an electromagnetic wave: a particle
excited by a laser beam will remit (scatter) light in all directions.
Scattered intensity increases with increasing mass and
concentration of the particles. Scattered intensity is also direction
dependent. Small particles will scatter light equally
in all directions while bigger particles will scatter light in an
anisotropic way, depending on their size and shape. This
information can be used either statically (static light scattering
- SLS) by averaging the light intensity for estimating the
mass of the scattering particle or dynamically (dynamic light
scattering - DLS), by analyzing the fluctuation of the scattered
light, for computing the hydrodynamic radius of the
scattering particle (under Brownian motion hypothesis).
The principle of Multi-Angle Laser Light Scattering
(MALLS) is to illuminate a sample cell with a laser beam
and to detect the intensities scattered by the particles at several
angles around the cell. A relationship exists between
scattered intensity at a given angle, molar mass, concentration,
size and shape of the particle: when measuring the concentration
by the mean of a refractive index (RI) detector, the
other parameters can be deduced from the light-scattering
pattern. The amount of scattered light is directly proportional
to the product of the weight-average molar mass and the solute
concentration: LS~Mw.c. This relationship is based on
Zimm’s formalism of the Rayleigh Debye-Gans light scattering
model for dilute polymer solutions [38-43]. While lowangle
light scattering only provides mass determination,
multi-angle detection also allows determination of size and
shape. Since scattering intensity is strongly dependent on
particle radius, a small amount of large materials in the sample
would give a large response with the light scattering detector,
although their concentration, as measured by UV or
RI response, is very small. The MALLS detector is much
less sensitive to small molecules [34].
To obtain accurate measurements, LS experiments must
be carried out with a particle sorting system connected before
the actual LS device. If no separation is performed before
LS analysis, then average values of molar mass and root
mean square (rms) radius are determined for all particles in
the sample. The necessity for a stable scattering baseline
when performing acquisition forbids use of solvent gradient
as in affinity or reverse-phase chromatography. Commonly
used systems are size-exclusion chromatography (SEC) or
field flow fractionation (FFF) in which the eluting solvent
has a constant composition. The quality of LS measurements
depends on the separation performed before analysis: if two
molecular species co-elute or overlap during elution, the
molar mass values will be averaged and no precise determination
can be made. Heterogeneity in a seemingly pure elution
peak can be assessed by calculating the polydispersity
over the peak.
To obtain reliable values for masses and rms radius with
MALLS the choice of the fitting method is very important.
Three methods are usually employed (Zimm, Debye and
Berry methods). They rely on plotting a function of scattered
intensities versus sin 2 (/2) where is the scattering angle
and on extrapolating the curves towards 0° angle value. Mass
is calculated from the intercept and rms radius from the slope
at 0°. If the molecules are small (

154 Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 Bruneaux et al.
tion mass spectrometry (ESI-MS) is well suited for the detection
of noncovalent protein complexes and opened a new
era in protein characterization due to the high accuracy of
molecular mass determination [50, 51].
Compared to MALDI, ESI is a gentle method of ionization-desorption
of the sample at atmospheric pressure. In the
last decades, it was successfully applied to biomolecules
when it was made possible to transfer macromolecules into a
gas phase. The inherently mild ionization has allowed the
successful examination of noncovalent interactions of proteins
with ligands, cofactors and prosthetic groups, including
peptides, with other proteins and of the quaternary structure
of proteins [5, 50-54]. Until ten years ago, observation of
large noncovalent multi-protein complexes in aqueous solutions
at neutral pH has been limited by the upper m/z range
of about 4000 available on most commercial mass spectrometers.
The development of orthogonal time-of-flight
(ToF) mass analyzers [55, 56] and their commercial exploitation
has dramatically extended the experimentally available
m/z range to at least 25000. At the present time, the most
appropriate mass spectrometers for studying proteins and
protein complexes under native conditions have a time-offlight
analyzer [56], with a theoretically unlimited m/z range
in addition to parallel detection ensuring high sensitivity
[55]. Hybrid instruments of the quadrupole-time-of-flight
geometry are also well-suited for the analysis of native proteins
and protein complexes [57]. In addition, nanospray
development [58] has allowed the introduction of small
amounts of sample and enabled the determination of the
masses of very large protein complexes such as GroEL [59],
the intact MS2 virus capsid [60] and ribosome [61].
Under standard denaturing conditions, the protein is dissolved
in a mixture of water and organic solvent such as acetonitrile
or methanol, with a trace of an added organic acid
(e.g. formic acid). The resulting solution has a pH~3.0. Under
these conditions noncovalent bonds are broken, the protein
sample is protonated and generates an m/z spectrum that
has a wide distribution of multiply charged ions from which
the mass of the protein can be calculated according to the
formula m /z = M + nH +
, where M is the molecular mass of
n
the protein and n is the number of protons associated with it.
The mass accuracy of the ESI-MS analysis under these denaturing
conditions is typically 0.01% of the protein mass using
a modern mass spectrometer. In addition, as ESI-MS
analyses proteins from a liquid phase, the solvent conditions
can be adapted so that the protein can be studied under more
physiological conditions, for example in water alone or more
typically in an aqueous, volatile buffer at pH 6-8. The use of
a buffered solution at neutral pH is a typical method permitting
preservation of the native state of the protein in solution,
which is required for successful analysis of noncovalent
macromolecular complexes. The solvent must not contain
too much inorganic salts which would result in low signal/noise
ratio, but must be of enough ionic strength to maintain
the assembly. Besides, the use of a buffer can add a variety
of metallic or other ions or small molecules to the analyte
that may complicate the spectra due to formation of adduct
with the protein. The choice of buffer and data interpretation
are thus of paramount importance [62]. The two most
commonly used buffers are ammonium acetate and ammonium
hydrogen carbonate, due to their pH range and volatility,
at concentrations of 1-100mM. In such cases, as the protein
remains in its native, folded state, the generated m/z
spectrum exhibits a narrower distribution of charge states. In
general the protein is less charged because protonation is less
efficient than in its denatured state.
Noncovalent analysis requires adjusted parameters of the
ESI source such as increased pressure in the nebulization
chamber, decreased declustering potential and extended m/z
detection range. For respiratory pigments, samples are usually
dissolved in aqueous ammonium acetate 10 mM, pH 6.8
[62]. It has been shown that the experimental masses decreased
slightly with increased declustering potential (60 to
160 V) and were generally 0.1 to 0.2 % higher than the calculated
masses, due probably to complexation with cations
and water molecules [63].
Such data not only allow the mass of the protein to be
calculated, but also enable an assessment of the protein’s
conformation to be made due to the preservation of its tertiary
structure during the analysis [64]. Co-populated protein
conformers can often be identified if each population gives
rise to a unique charge state distribution [5, 65, 66]. The
evaluation of quaternary structures such as noncovalently
bound macromolecular protein complexes and the interaction
of proteins with DNA, RNA and other ligands are also
within reach. The first examples of non-covalently bound
protein complexes monitored by ESI-MS were reported in
1991 [5, 52, 67], just two years after ESI-MS development.
Since then, there has been significant progress in this field:
many instrumental developments have been made and a
wealth of examples of quaternary structures increasing in
size and complexity has accumulated.
The high precision of the method also allows determination
of post-translational modifications such as glycosylation
[68, 69]. By using reducing conditions, occurrence of intraand
inter-chain disulfide bridges can be investigated and
monomers from covalent complexes identified. Carbamidomethylation
of free cysteine (Cys) can provide the number
of free Cys residues. Characteristic differences in successive
species masses can be linked with modifications such as
methylation, phosphorylation and others. As the intensity of
the detected signal depends on the ionization behavior of the
molecule, quantification from deconvoluted spectrum should
be approached with extreme care. No absolute quantification
can be made but abundance of identical species in different
samples can be compared. The technique is of great interest
when studying macromolecular complexes as it gives insight
into the subunit composition and their structural relation (disulfide
bridges) [70]. From the subunit masses models can be
constructed provided the macromolecular complex mass is
known. Noncovalent ESI-MS was recently successfully applied
to invertebrate hemoglobins [63, 71, 72] and to crustacean
hemocyanins [62, 73, 74].
An important issue in noncovalent ESI-MS is whether
the detected species are relevant to the species present in
biological conditions. Since different buffer conditions (e.g.
pH, ionic strength) are sufficient to induce dissociation or
aggregation in solution, the question of the effect of a trans-
75

The Structural Analysis of Large Noncovalent Oxygen Binding Proteins Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 155
fer into a gas phase is pertinent. To obtain reliable masses,
the interactions between subunits must be maintained
throughout the ionization and analysis process. The mechanism
of ESI is not fully understood yet [75]. During ionization
the different kinds of interaction are probably modified
in different ways: hydrophobic interactions are thought to be
broken while hydrogen bonds and electrostatic and van der
Waals interactions could be favored [53]. Successful recovery
of viable viruses after ESI and quadrupole filtering
strongly suggests that native conformation is retained
throughout the ionization process [76]. However, a limit for
the size of analyzed macromolecular assemblies could be the
droplet size in the spray [77]. Recent studies using computer
simulation of solvent evaporation suggested that the conformation
is influenced but the major structural features such as
secondary structures are conserved [78]. It was also suggested
that the use of basic compounds rather than ammonium
acetate in sample preparation could help to reproduce
more closely the solution-phase conformation in the gasphase
since the charge of the protein would be reduced and
would be less likely to influence the structure [79].
MALLS and ESI-MS have proved to be useful techniques
for monitoring interactions between proteins and
ligands, association and dissociation kinetics, protein folding
and enzymatic mechanisms. The complementarity of
MALLS solvent versatility and ESI-MS high mass accuracy
allows new and original approaches for investigation of large
noncovalent protein structures. We have recently been using
this kind of approach in the study of annelid HBL-Hbs and
crustacean Hc.
4. REBUILDING RESPIRATORY PIGMENT
STRUCTURE FROM EXPERIMENTAL DATA: THE
EXAMPLE OF ANNELID HBL-HB AND CRUS-
TACEAN HC
By using a broad spectrum of biophysical and biochemical
techniques and particularly ESI-MS and MALLS, we
were able to provide precise and coherent structural information
on the subunit types and masses, on the assemblies of
subunits, as well as on the mass, subunit composition, and
isoform multiplicity of the native respiratory pigment.
4.1. Building Models for Lumbricus terrestris and Arenicola
marina HBL-Hb from the Masses
The hexagonal bilayer hemoglobins are ~3.6 MDa complexes
of globin chains and non-globin linker chains found
in annelids and related species. To comprehend the quaternary
structure and to conceive models of these giant Hb has
been a challenge over several years, aiming to understand the
structure-function relationships of these hetero-multimeric
complexes. Even though a total agreement has not yet been
attained, a general consensus emerges from these studies. All
HBL-Hb examined so far are built from 12 subassemblies
composed of globin chains (14-17kDa) and linked together
by a complex central structure comprised of linker chains
(24-32 kDa). Major milestones in this field were the recent
reconstructions of LtHb and AmHb from crystallographic
data [80, 81] (Fig. 1).
The knowledge of the accurate molecular mass of the
native HBL-Hb is crucial for the calculation of the number
of polypeptide chains involved in the hetero-multimeric
complex. However, there is appreciable scattering in the
published values for the mass of HBL-Hb obtained with different
techniques and preparation conditions [32]. In most of
the studies related to structural modeling, MALLS has been
used as a quasi absolute method for determining the molecular
mass of macromolecules since it does not require any
“universal” calibration or other a priori hypothesis.
Since 1996, significant efforts have been devoted by several
laboratories to elucidate in greater details the arrangements
between the subunits of HBL-Hb from the structural
point of view. Ten years ago, Brian N. Green was one of the
first to be able to use maximum entropy deconvolution
(MaxEnt) of the raw ESI-MS spectra of several native and
chemically modified annelid [23, 82-84], vestimentiferan
[68, 85] and pogonophoran [86] Hb in order to obtain complete
zero charge spectra of all their constituent subunits and
polypeptide chains and to determine their masses with an
undreamed accuracy of ± 1-3 Da (for subunits ranging from
16 x 10 3 to 50 x 10 3 Da). MaxEnt analysis of ESI-MS spectra
produces semiquantitative relative intensity data: an estimation
of the number of copies of each chain in the whole
molecule can be derived assuming that each chain behave
similarly, i.e., that the ratio K=(peak intensity)/(number of
copies) is the same for each component [63, 71, 87, 88].
In summary, knowing the mass of the HBL-Hb complexes
as obtained by MALLS (Fig. 1c) and the exact masses
of each chain as determined by ESI-MS [22, 23, 83, 89] (Fig.
1e), and further assuming that the molecule possesses a D 6
point-group symmetry, as evidenced by TEM (Fig. 1a), 3D
reconstruction by cryoelectron microscopy [90, 91] (Fig. 1b)
and crystallography in some cases [80, 81] (Fig. 1g), structural
models can be proposed for the HBL-Hbs (Fig. 1f).
The entire HBL-Hb complexes of ~3 600 kDa have not
yet been observed by mass spectrometry even if an unresolved
signal at ~22500 m/z could be attributed to AmHb
HBL-Hb as observed in Fig. (7a). Several reasons can explain
this fact. Firstly, divalent cations are needed to maintain
the quaternary structure but provoke adduct formation
and peak enlargement. The existence of a structural polymorphism
which has been evidenced recently for AmHb (see
below –[92]) in combination with a much lower resolution at
this m/z scale makes the detection harder. However, the noncovalent
subassembly comprising 12 globin chains (204 to
214 kDa) was observed directly by electrospray ionization
time-of-flight mass spectrometry in the native hexagonal
bilayer hemoglobins from several annelids [63]. All the native
HBL-Hb complexes analyzed so far exhibited peaks
with charge distributions from 32+ to 38+ and masses from
204 to 214 kDa (Fig. 1d). These were attributed to dodecameric
globin subassemblies on the basis of correspondence
between the experimental and calculated molecular masses
(Table 1,2).
Several HBL-Hb complexes from representative species
of the three groups of annelids (achaetes, oligochaetes and
polychaetes) were investigated using the complementarity of
MALLS and ESI-MS under denaturing and non-denaturing
conditions (see Table (1)). In this review, we will focus on
the proposed structural model of the most extensively stud-
76

156 Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 Bruneaux et al.
77

The Structural Analysis of Large Noncovalent Oxygen Binding Proteins Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 157
Fig. (1). Experimental data and models for AmHb and LtHb.
(a) The bracelet model of HBL-Hb. Left: Electron micrographs of HBL-Hb, negatively stained. The arrows indicate the two frequent orientations;
top view (t) and side view (s). Right: The bracelet model where 12 dodecamers decorate a framework of linkers. (b) Surface representation
at a threshold displaying the expected molecular volume (EMV) of the native AmHb (left) and LtHb (right).The molecules observed
along their 6-fold axis are displayed in such a way that the upper hexagonal layers have exactly the same orientations with the broken line
joining opposite vertices vertically oriented. The vertices of the lower layer are 1° clockwise and 16° anticlockwise rotated relatively to those
of the upper layer in AmHb and LtHb respectively. Another consequence of this rotation is the different shape of the holes (bordered by a
black line). Because of the eclipsed disposition of the two layers, the hole is large in AmHb while the 16° rotation strongly reduces its size in
LtHb (reprinted from [91], with permission from Elsevier). (c) The molecular weight of AmHb and LtHb determined by SEC-MALLS. Left:
MALLS analysis of AmHb give an average molecular mass of 3 648 ± 24 kDa with a slight polydispersity as indicated by the slope of the
individual estimates. Right: The calculated apparent molecular weight of the CO-hemoglobin of L. terrestris across the chromatographic peak
(reprinted from [96], with permission from ASBMB). The calculated weight-average molecular mass for the entire peak is 4.10 ± 0.1 MDa
78

158 Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 Bruneaux et al.
(Legend Fig. 1) contd….
on the basis of the measured dn/dc value of 0.185 ml/g. (d) ESI m/z spectrum of the ~200 kDa subassembly from AmHb (left) and LtHb
(right). Inset, result of deconvoluting the ESI spectrum over the m/z range 5700-7500 by MaxEnt. M, T and D set for the monomer chain, the
trimer and dodecamers subassembly respectively. The number after the colon indicates the number of charges on the ion. (reprinted from
[71], with permission from ASBMB). (e) MaxEnt-processed spectra of native AmHb (left) and LtHb (right) analyzed under denaturing conditions.
a1-2, b, c, d1-3 design the monomeric chains, T1-4; the trimer subunits and L1-4; the linkers monomer and D1-2; the dimeric linkers
(reprinted from [83] and [23], with permission from Elsevier for [23]). (f) Structural model proposed for AmHb (left) and LtHb (right). Drawing
of typical HBL-Hb on top view displaying the subunits for half a Hb molecule. Left: Each AmHb one-twelfth is constituted of one trimer
(T3, T4 or T5), with nine monomeric chains; M 9 T. The one-twelfth is detailed showing the possible arrangement of polypeptide chains [83].
Right: Each LtHb one-twelfth is constituted of three trimers T, with three monomeric chains; M 3 T 3 . (g) 3D reconstruction from crystallographic
data. Left: The 6.2 Å electron density of AmHb. Density corresponding to the globin chains is depicted dark violet, the linker chains
associated with the top of the molecule are shown in orange, while those associated with the bottom linker subunits are shown in blue (reprinted
from [81], with permission from Elsevier). Right: The 5.5 Å electron density of LtHb. Density corresponding to the globin chains is
depicted magenta, the linker chains associated with the top of the molecule are shown in yellow, while those associated with the bottom linker
subunits are shown in blue (reprinted from [80], copyright PNAS).
ied HBL-Hbs of the oligochaete Lumbricus terrestris (LtHb)
and the polychaete Arenicola marina (AmHb).
Prior to the use of ESI-MS and MALLS, the bracelet
model was the first model proposed for HBL-Hb based on
observation of dissociation products of LtHb. It consists of
12 dodecamers decorating a bracelet or framework of 30-40
linkers [93, 94] (Fig. 1a). On the basis of the mass provided
by STEM analysis (3.55 x 10 6 Da) and subunit masses estimated
by SDS-PAGE, the authors were able to propose a
structural model where the 12 dodecamers (2.13 x 10 5 x 12 =
2.56 x 10 6 Da) account for 72 % of the total mass, in excellent
agreement with the iron and heme content data [37].
Another proposed model suggested that LtHb was comprised
of 192 globin subunits and 24 linkers. This model was based
on native mass from light scattering measurement (4.1 x 10 6
Da), subunit masses from mass spectrometry and linker proportion
from capillary electrophoresis and HPLC experiments
[22, 95, 96].
Concurrent ESI-MS investigations of LtHb [23] and
AmHb [83] were led to obtain the molecular masses of their
constituent chains and subunits as well as their relative proportions.
Fig. (1d) shows the raw ESI-MS spectra of AmHb
and LtHb respectively obtained under non-denaturing conditions
and Fig. (1e) shows the resulting deconvolution on a
zero charge mass scale, using the MaxEnt analysis of the
ESI-MS spectra under denaturing conditions. The mass spectra
under denaturing conditions of the native HBL-Hb in
combination with those of reduced, reduced and carbamidomethylated
and unreduced carbamidomethylated forms
permit the determination of the total number of Cys residues
as well as the number of free and disulfide bound Cys residues.
ESI-MS has also provided unambiguous determination
of the nature of glycosylation, either of globin or of linker
subunits [69]. This detailed mass information coupled with
the MALLS determination of the molecular mass of the
whole HBL-Hb complexes has allowed to propose suitable
models for the quaternary structures with much greater confidence
than was possible heretofore [23, 82-85] (Fig. 1f).
Table 2 sums up representative masses and their SD of
polypeptide chains and the globin and linker subassemblies
observed in the native HBL-Hb of A. marina and L. terrestris
and the closest matching masses calculated for a dodecamers
globin subassembly and other possible combinations
of globin subunits. Intensity-weighted mean masses for
the globin subunits were derived from these data and used to
generate the calculated subassembly masses in Table 2.
When allowance was made for variations in the relative intensity
measurements, the estimated errors in the calculated
subassembly masses shown in Table 2 were < 0.05 %. It
should be noted that among the oligochaete and polychaete
Hb that have been investigated, there are two different patterns
of globin subunits [97, 98] as well as linker subunits
(see Table 1 and below). They are composed of one or more
~17 kDa monomer globin chains (M) and one or more disulfide-bonded
~50 kDa trimer subunits (T) [83, 84, 88, 99] and
the linker chains are either present as monomers or disulfidebound
dimers. This diversity in the small globin subunits can
obviously lead to more than one combination of these
subunits to give a dodecamer subassembly.
LtHb contains four globin chains (chains a-d) ranging in
mass from 15962 Da to 19390 Da, with the monomer
subunit (chain d) existing as three isoforms (d1-d3), and
chain a occurring as four glycosylated isoforms (a1-a4); the
latter forms four different disulfide-bound trimer subunits
with chains b and c [23]. Four monomeric linkers (L1-L4)
are observed (Table 2). AmHb contains eight different globin
chains (a1,a2,b1,b2,b3,c,d1 and d2) ranging in mass from
15 922 to 17 032 Da, with the b, c and d chains forming five
of the six possible disulfide-bound trimers (T1-T5)
(c+b1+d1, c+b1+d2, c+b1+d2, c+b2+d1, c+b2+d2, and
c+b3+d2) [83]. The two linkers (L1-L2) are disulfide-bound
to form hetero- or homo-dimers as detailed in Table 2.
The complete ESI-MS determination of the masses of the
constituent globin and linker chains and the disulfide-bound
trimer subunit of LtHb provided a calculated mass of
213.434 kDa for the assembly [M] 3 [T] 3 [23] (Fig. 1d, Table
2). Furthermore, the calculated masses for the Hb comprised
of 12 subassemblies and 36 or 42 linker chains are 3.523 and
3.687 MDa, respectively, in good agreement with the masses
determined by scanning transmission electron microscopy
and sedimentation equilibrium (3.56 ± 0.13 and 3.41 ± 0.39
MDa, respectively) [23]. However, the structural model of
the AmHb dodecamers proposed by Zal and collaborators
[83] (Fig. 1f) is slightly different than the model proposed by
Green and collaborators: D=M 3 T 3 . A model of the quarternary
structure of Arenicola marina HBL-Hb has been proposed
by Zal and collaborators based on ESI-MS analysis
and MALLS measurements (Fig. 1f). Three and six copies of
79

The Structural Analysis of Large Noncovalent Oxygen Binding Proteins Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 159
Table 1.
Experimental Subunit Masses, Native Masses, Calculated Masses and Architectural Features of Annelid HBL-Hbs
Species
Clitellata
Hirudinida
Erpobdellidae
Nephelopsis
oscura
Number
and type of
subunits a
Subunit Composition Dodecamer Mass Native Mass
Expl mass
(Da) ±s.d.
Subunits from
covalent
complexes b
Expl mass
(Da) ±s.d.
Expl mass
(Da) ±s.d.
[reference]
Cltd mass
(model)
Expl mass
(kDa) ±s.d.
Method c
[reference]
Calculated
Mass (kDa)
144G + 36L
model
[reference]
3D Structure
type I/II p and
central piece
[reference]
3 MG 16534.5 ±1 208670 ±40 208330 nd 3398 nd
17170.5 ±1 6M + 3D [144]
(Hb) 17314.7 ±1 [144] ESI-MS data
2 DG 32949.5 ±3 3 G < DG 16321.8 ±1
33125.4 ±3 16498.6 ±1
16632.4 ±1
5 ML 24512.3 ±2
24585.5 ±2
24978.9 ±2
25005.8 ±2
25565.8 ±2
[144]
Haemopidae
Haemopis grandis 4 MG 16634,1 ±0,5 207550 ±191 207437 3710 d SE 3361 nd
17013,4 ±0,5 6M + 3D [146] [32]
(Hb) 17592,9 ±0,5 [63] ESI-MS data
17573,3 ±0,8
2 DG 32501,1 ±0,7 3 G < DG 16100,4 ±0,5
32629,6 ±0,8 16405,8 ±0,4
16705,2 ±0,5
3 ML 24004,2 ±0,4
24449,2 ±1,1
24548,9 ±0,6
[145]
Hirudinidae
Macrobdella
decora
2 MG 16770,1 ±0,2 206528 ±16 206371 3560 ±160 STEM 3357 e type I
16841,9 ±0,5 6M + 3D [147] toroid
(Hb) 3 DG 32586 ±1,1 4 G < DG 16052,2 ±0,5 [63] 3804 ±70 MALLS [149]
32714,5 ±0,8 16537,3 ±0,6 [148]
32842,9 ±1,3 16666,7 ±1
16792,9 ±0,6
3 ML 24340,1 ±0,7
24398,6 ±0,3
24420 ±0,4
[82]
Oligochaeta
Glossoscolecidae
Glossoscolex
paulistus
4 MG 16372 ±18 212833,5 e 3100 SV 3500 e
16447 ±19 3M + 3T [151]
(Hb) 16613 ±7 3200 SAXS
16750 ±70 [152]
1 DG 32520 f
1 TG 51933 3 G < TG 16492 ±24
17363 ±17
18258 ±30
3 ML 25817 ±50
26761 ±16
34130 g
[150]
Lumbricidae
Lumbricus
terrestris
3 MG 15992,4 ±1 213593 ±203 213436 3560 ±130 STEM 3531 type I
15978 ±1 3M + 3T [23] [23] toroid
(Hb) 15962,1 ±1 [63] 3410-3660 SE ESI-MS data [153]
4 TG 52922,6 6 G < TG 16254,4 ±1 [23] 3516 ±16
52760 17289,2 ±1 3755 ±80 MALLS [32]
52598,5 19389,9 ±1 h [148] statistical model
3 ML 27607 i
52435,4 19227,4 ±1 h 4100 ±100 MALLS
32104,3 ±5
24912,9 ±2
24090 j
[23]
19065,3 ±1 h [22]
19065,3 ±2 h
80

160 Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 Bruneaux et al.
(Table 1) contd….
Species
Number
and type of
subunits a
Subunit Composition Dodecamer Mass Native Mass
Expl mass
(Da) ±s.d.
Subunits from
covalent
complexes b
Expl mass
(Da) ±s.d.
Expl mass
(Da) ±s.d.
Cltd mass
(model)
Expl mass
(kDa) ±s.d.
Method c
[reference]
Calculated
Mass (kDa)
144G + 36L
model
[reference]
Tubificidae
Tubifex tubifex ? MG 15810,7 205817 ±64 204734 3010 SE 3368
? TG 49968,1 3M + 3T [154] [32]
(Hb) [63] [63] 3630 LS ESI-MS data
[155]
3090 ±150 SAXS
[156]
3D Structure
type I/II p and
central piece
[reference]
Polychaeta
Palpata
Alvinellidae
Alvinella caudata 3 MG 16163,2 ±1 3517 ±14 MALLS 3401 k
16203,2 ±1 [87]
(Hb) 16531,8 ±1
TG 51133,9 ±4 3 G < TG 16148 ±1
16929,8 ±1
18064,7 ±1
3 ML 23025,2 ±2
24368,2 ±2
26362,2 ±2
[87]
Alvinella
pompejana
4 MG 16348,9 ±1 211739 ±227 211733 3833 ±14 MALLS 3428 k type II
16419,6 ±1 3M + 3T [88] [157] toroid
(Hb) 16532,4 ±1 [63] [158]
16633,4 ±1
TG 51431,9 ±4 3 G < TG 16477,5 ±1
16916,1 ±1
18048,8 ±1
4 ML 22887,1 ±2
24230,5 ±2
26233,6 ±2
25974,4 ±2 l
[88]
Paralvinella 4 MG 16616,8 ±1 3750 ±150 MALLS 3482 k
palmiformis 16660,5 ±1 [87]
(Hb) 16745,9 ±1
16790,1 ±1
TG 50983,2 ±4 3 G < TG 16247,6 ±1
16723,9 ±1
18020,2 ±1
1 ML 26598,8 ±2
[87]
Paralvinella 2 MG 16685,1 ±1 3822 ±28 MALLS 3426 k
grasslei 16814,1 ±1 [87]
(Hb) TG 51059,2 ±4 3 G < TG 16247,8 ±1
16754,5 ±1
18064,5 ±1
4 ML 24303,7 ±2
24334,8 ±2
24349,8 ±2
26565,7 ±2
[87]
Eunicidae
Marphysa sp. 3609 ±60 MALLS 3370
(Hb) [148] [32]
ESI-MS data
Nereididae
Tylorrhynchus 1 MG 15575,4 ±1 203953 ±209 204329 3370 SE 3422
heterochaetus 1 TG 50068,4 ±4 3 G < TG 16601,9 ±1 3M + 3T [159] [32]
(Hb) 16680,4 ±1 [63] ESI-MS data
16794 ±1
3 ML 23233,8 ±2
24835,4 ±3
81

The Structural Analysis of Large Noncovalent Oxygen Binding Proteins Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 161
(Table 1) contd….
Species
Number
and type of
subunits a
Subunit Composition Dodecamer Mass Native Mass
Expl mass
(Da) ±s.d.
Subunits from
covalent
complexes b
Expl mass
(Da) ±s.d.
Expl mass
(Da) ±s.d.
Cltd mass
(model)
Expl mass
(kDa) ±s.d.
Method c
[reference]
Calculated
Mass (kDa)
144G + 36L
model
[reference]
3D Structure
type I/II p and
central piece
[reference]
25326,9 ±2
2 DL 52609,4 ±4 2 L < DL 26317,2 ±2
nd 28202,2 ±2
[84]
Sabellidae
Eudistylia
vancouverii
3 DG 33207,2 ±0,3 6 G < DG,QG 16051,5 ±0,1 205863 3261 ±80 MALLS 3539 type I
33373,8 ±0,6 16172,4 ±0,4 3Q [148]
12Q + 48D +
42L
ellipsoid
(Chlr) 33149,7 ±1 16853,5 ±0,3 207043,3 3480 ±225 STEM 3288 [161]
1 QG 66154,8 ±2,5 17088,9 ±0,6 3D [160]
12Q + 48D +
36L
17161,2 ±0,7 [70] [70]
17103,6 ±0,8 m 208000
10 ML 25000,4 ±2,5 ±23000
25017,9 ±2,5 [160]
25039,6 ±2,5
25057 ±2,5
25074,4 ±2,5
25096,8 ±2,5
25402,7 ±2,5
25446 ±2,5
25461,6 ±2,5
25478,3 ±2,5
[70]
Myxicola
? QG
infundibulum
67841,2 n 211304 ±52 210946 nd
[63] 3Q
(Chlr) [63]
Sabella
spallanzanii
2800 SD 3360 type I
[21] [32] ellipsoid
Chlr) Sequence data [162]
Siboglinidae
Riftia pachyptila 2 MG 16133,3 ±1,5 199488 ±1173 3396 ±540 STEM 3284 ±10 type I
16805,6 ±1,5 statistical model [85] [32] toroid
(Hb) 1 DG 31720,8 ±3 2 G < DG 15578,5 ±1,5 [32] 3503 ±13 MALLS statistical model [163]
16150,2 ±1,5 [85]
4 ML 23505,2 ±3
23851,4 ±3
26342,4 ±3
27425,8 ±3
[68]
Tevnia
jerichonana
3 MG 16045,2 ±1,5 200638,8 o 3336 ±9 MALLS 3325 e
16059,1 ±1,5 [148]
(Hb) 16710,7 ±1,5
1 DG 31695,5 ±3 2 G < DG 15578 ±1,5
16124 ±1,5
3 ML 23742,6 ±2,5
26274,2 ±2,5
26435,7 ±2,5
[148]
Terebellidae
Amphitrite ornata ? MG 16744,8 n 206712 ±15 206490 nd
? TG 49619,3 3M + 3T
(Hb) [63] [63]
Scolecida
Arenicolidae
Arenicola marina 2 MG 15952,5 ±1 204481 ±37 204340 3648 ±24 MALLS 3385 type II
15974,8 ±1 3M + 3T [83] [32] ellipsoid
(Hb) 5 TG 49560,4 ±4 6 G < TG 15921,8 ±1 [63] 3510 ±108 MALLS ESI-MS data [91]
49613,9 ±4 16019,6 ±1 [89]
49658,6 ±4 16036 ±1
49706,8 ±4 16664,4 ±1
49724,5 ±4 16981,5 ±1
17032,4 ±1
3 ML 23122 ±1
82

162 Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 Bruneaux et al.
(Table 1) contd….
Species
Number
and type of
subunits a
Subunit Composition Dodecamer Mass Native Mass
Expl mass
(Da) ±s.d.
Subunits from
covalent
complexes b
Expl mass
(Da) ±s.d.
24065 ±1
24219 ±1
2 DL 50323,1 ±4 2 L < DL 25170 ±2
51981,5 ±4 26827,3 ±2
[83,89]
Expl mass
(Da) ±s.d.
Cltd mass
(model)
Expl mass
(kDa) ±s.d.
Method c
[reference]
Calculated
Mass (kDa)
144G + 36L
model
[reference]
3D Structure
type I/II p and
central piece
[reference]
Orbiniidae
Methanoaricia 4 MG 15824,8 ±1,5 210000 191515,2 o 3500 SEC 3265 e
dendrobranchiata 15835,1 ±1,5 SEC [164]
(Hb) 15864,5 ±1,5 [164]
16255,4 ±1,5
DG 31972,6 ±3 2 G < DG 15375,7 ±1,5
16602,1 ±1,5
4 DL 48715,5 ±3 3 L < DL 24366,2 ±3
48755,1 ±3 24390 ±3
48777,4 ±3 24413,1 ±3
48804,9 ±3
[164]
aAbbreviations: MG, globin monomer; DG, globin dimer; TG, globin trimer; QG, globin tetramer; ML, linker monomer; DL, linker dimer.
bLegend: '

The Structural Analysis of Large Noncovalent Oxygen Binding Proteins Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 163
Table 2.
ESI-MS-determined Masses of AmHb and LtHb Polypeptide Chains and Subunits
A .marina
L. terrestris
Globin Chains/Subunits
Chain/
Subunit
Mass Mass +
(Da) a heme b
(Da)
References
Chain/
Subunit
Mass Mass +
(Da) a heme b
(Da)
References
Monomer (M)
Monomer (M)
a1 15954.4 16569.0 [83] d1 15992.4 16608.9 [23]
a2 15976.8 16591.3 d2 15978.0 16594.5
b1 15920.9 16538.3 d3 15962.1 16578.6
b2 16020.1 16636.1 b 16254.4 16870.9
b3 16036.2 16652.5 c 17289.2 17905.7
c 16664.8 17280.9 a 17524.0 18140.5
d1 16983.2 17598.0 a1 19389.9 20006.4
d2 17033.1 17648.9 a2 19227.4 19843.9
a3 19065.3 19681.8
a4 18902.9 19519.4
M c 15966.7 16583.2 M c 15983.4 16599.9
Trimer (T)
Trimer (T)
T1 49560.4 51409.9 b1+c+d1 [83] T1 52922.6 54772.1 b+c+a1 [23]
T2 49613.9 51463.4 b1+c+d2 T2 52760.0 54609.5 b+c+a2
T3 49658.6 51508.1 b2+c+d1 T3 52598.5 54448.0 b+c+a3
T4 49706.8 51556.3 b2+c+d2 T4 52435.4 54284.9 b+c+a4
T5 49724.5 51574.0 b3+c+d2
T c 49680.7 b+c+d T c 52695.2 54544.7 b+c+a
Dodecamer (D)
Dodecamer (D)
D 204600 g [71] D 214200 g [71]
200779 e M9T= [(3a1)3 (3a2)9T] 203943 e M9T
202560 e M6T2 208689 e M6T2
204340 e M3T3 213436 e M3T3= [d3(bac)3]
284578 e M4T4 284578 e M4T4f
Non-globin Chains/Subunits (Linkers)
Monomer (L)
Monomer (L)
L1 25174.1 [83]
L1a 27702.4
[23]
L2 26829.7
L1b 27540.8
L1 25837.5
Dimer
L2 32104.3
L3 24912.9
84

164 Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 Bruneaux et al.
(Table 2) contd….
Chain/
Subunit
Mass Mass +
(Da) a heme b
(Da)
References
Chain/
Subunit
Mass Mass +
(Da) a heme b
(Da)
References
D1 50323.1 L1+L1 [83]
L4a 24169.9
D2 51981.5 L1+L2
L4b 24102.3
L4c 24019.0
a-Estimated error of measurement ± 1.0Da for M and ± 4.0Da for T
b-Mass(heme)= 616.5 Da
c-Weighted mean based on relative intensities [23]
d-Estimated error of measurement ± 5.0 Da
e-Calculated mass using average, intensity weighted masses of the apo-monomer (M) and apo-trimer (T) subunits: 15 983.2 and 52 696.1 Da for LtHb and 15 966.7 and 49 680.7 Da
for AmHb respectively. At each calculated mass, 12 hemes are added.
f-Subassembly proposed by Riggs and collaborators for LtHb [95, 96]
g-Representative measured mass of the dodecamers obtained by ESI-MS under non-denaturing conditions
were determined by denaturing ESI-MS. Given these
masses, the structure the most likely to explain dodecamer
masses was found to be M 3 T 3 (3 monomers and 3 trimers).
From this structure and using relative proportions from ESI-
MS data, a random assembly model of the dodecamers can
be performed. For M and T, chains are selected from the
existing pool for each species with probabilities depending
on their proportion in the ESI-MS spectrum, and incorporated
independently of each other in the dodecamer. Calculated
expected masses are 213 436 ± 319 Da and 204 342 ±
80 Da for Lumbricus and Arenicola, respectively. These are
in good agreement with measured masses of 214 200 Da and
204 600 Da. The calculated expected range and the experimental
mass range are both larger for Lumbricus than for
Arenicola. This supports the M 3 T 3 model for these species
and suggests than the broader experimental mass range for
Lumbricus is due to a higher number of possible combinations
for dodecamer assemblies (200 versus 140 for Arenicola).
It is worthwhile to note that masses obtained by the
statistical model and by simple intensity-average mass calculation
are the same since the model incorporates probabilities
based on intensity from ESI-MS. However the statistical
approach also gives the expected range and the standard deviation
which are in good agreement with experimental data
and thus supports the model.
Another work investigated the theoretical mass distribution
of the whole assembly for Lumbricus terrestris and
Riftia pachyptila HBL-Hb [32]. Considering subunit masses
and proportions from ESI-MS data, mass distributions were
calculated for dodecamers, for 12 dodecamers, for linkers
and finally for the whole HBL-Hb structure. For the dodecamer
distribution, the M 3 T 3 model was used for Lumbricus
while Riftia dodecamers were built from a random number
of monomers and dimers totalizing 12 globin chains. At each
step additions of different subunits were considered independent
from each other. Expected masses for the whole
assemblies were 3 516 ± 16 kDa and 3 284 ± 10 kDa for
Lumbricus and Riftia HBL-Hb, respectively. These masses
were shown to be in very good agreement with the mean of
known masses for Lumbricus (3 524 ± 481 kDa) and the
mean of all the known polychaete HBL-Hb masses for Riftia
(3 209 ± 389 kDa). MALLS values of 3 755 ± 80 kDa and
3 503 ± 13 kDa were obtained for Lumbricus and Riftia, respectively
[32, 85]. The corresponding differences represent
6.8 % and 6.7 % variations. The higher heterogeneity of
Lumbricus linker subunit masses compared to Riftia results
in calculated variation values (ratio range/expected mass) of
30.2 % for Lumbricus and 15.9 % for Riftia, for the linker
subassembly.
Probabilistic approaches are thus a convenient way to
reproduce theoretical assembly from subunit masses and
proportions. Expected masses and variations can support a
model when compared to experimental measurements and
ought to be closer to biological reality since they deal with
mass distribution rather than with a unique determined mass.
5. REBUILDING RESPIRATORY PIGMENT STRUC-
TURE FROM EXPERIMENTAL DATA: THE
EXAMPLE OF CRUSTACEAN HC
In his thorough study of respiratory pigments by sedimentation
velocity and sedimentation equilibrium, Svedberg
examined sedimentation constant and molecular mass for
various decapod crustacean Hc [104]. Two values were determined
for sedimentation constants: 16.9 S and 23.4 S. The
forms present in the hemolymph depended on the species.
Remarkably, Svedberg had observed the two main Hc forms
found in crustacean hemolymph and had accurately determined
their sedimentation constant values. However, the
determined masses (360 kDa and 640 kDa instead of 450
kDa and 900 kDa, respectively) were underestimated, as was
the case for annelid hemoglobins.
Nowadays MALLS is a rapid and convenient way to determine
the mass of an unknown Hc complex and to assess
the polydispersity of the different fractions. Fig. (2) presents
a typical MALLS analysis displaying the calculated molecular
mass versus elution volume during a SEC experiment on
Rimicaris exoculata hemolymph [105]. Crustacean samples
analyzed by SEC-MALLS usually exhibit one or two Hc
peaks with molecular masses around 900 kDa and 450 kDa.
Since the known mass of a single subunit is about 75 kDa,
these masses fit unambiguously with dodecameric and hexameric
forms, respectively. This is confirmed by TEM observation
of hemolymph samples in which globular particles
are visible either isolated (hexamers) or associated by two
(dodecamers). When analyzing Hc from different decapod
species, dominant forms can be observed within each group
and permit to outline some evolutionary patterns [106] (see
85

The Structural Analysis of Large Noncovalent Oxygen Binding Proteins Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 165
below). Crossed immunoelectrophoresis suggested that a
particular type of subunit, subunit beta, is necessary for dodecamer
assembly in most species, but that a few groups
have independently evolved the ability to produce dodecamers
from the other subunit types [106].
The quality of the MALLS analysis depends on the efficiency
of the separation process: two badly-resolved molecular
species will yield an average molecular mass with high
polydispersity. In addition, a limitation of the MALLS
method is that complexes with the same number of subunits
but of slightly different types will differ only very slightly in
mass. They cannot be resolved by SEC and thus MALLS
will only give an average mass for all complexes of the same
order. ESI-MS can provide further characterization in this
case.
ESI-MS has also been used recently for investigation of
crustacean Hc. Noncovalent ESI-MS can resolve different
molecular species in hemolymph without any prior separation.
However, the sample preparation is a critical step in the
ESI-MS procedure and Hc samples are desalted thoroughly
in 10 mM ammonium acetate through at least 7 cycles of
concentration/dilution on centrifugal filters before analysis;
an incomplete desalting causes low signal-to-noise ratio.
Under the adjusted conditions of noncovalent ESI-MS
[62, 73] (see before), the different species are clearly visible
as several Gaussian peak distributions along the m/z axis as
presented in Fig. (3a). These distributions are well separated
between different aggregation states (hexamers versus dodecamers);
for a given aggregation state several close distributions
are sometimes detected, corresponding to a slight mass
difference. In Fig. (3a), two distributions are observed for
hexamer (a,b) and dodecamer (c,d). As previously noted,
such discrimination is not possible using the average mass
determined by MALLS because of the very close mass and
coelution of these complexes. Thus ESI-MS is a complementary
method enabling thorough investigation of the complex
native masses.
In addition to being a technique allowing high mass accuracy
measurements, ESI-MS can also detect species present
in low amount or hardly or not resolved by MALLS due to
coelution of different complexes. In Fig. (3a) a higher aggregate
is observed with a mass of 1 374 136 Da (18-meric
form). Higher masses corresponding to 24-mers and even
30-mers can be also be found [62]. It is known that aggregation
can occur in the ESI when sample concentration is too
high but it is unlikely that the assemblies observed here
could be artifacts at least for the 18-mer as it can be observed
by MALLS under low flow rate (0.25 ml/min, personal observation).
However, the very low detected amount of these
“unusual” complexes raises the question of their biological
significance ; since no study by electron microscopy was
performed on them, it is still possible that they arise from
random post-translational cross-linking.
For such high masses, charge state assignation may be
difficult due to peak enlargement and the consecutive proximity
of standard deviation values calculated for subsequent
charge states [62, 74]. Even the use of deconvolution programs
like MaxEnt cannot resolve the problem. The precision
of the determined masses decreases with increasing
masses but is nonetheless sufficient to unambiguously determine
the number of subunit for each distribution as the
uncertainty is inferior to the subunit average mass.
Fig. (2). SEC-MALLS analysis obtained for a Rimicaris exoculata hemolymph sample.
Analysis was performed with a Superose 6-C column. Optical density at 280nm (full curve) and estimated molecular weight (dots) are represented
as a function of the eluted volume. Insert: cumulative molecular weight curve (reprinted from [105], with permission).
86

166 Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 Bruneaux et al.
Fig. (3). ESI-MS analysis of Carcinus maenas Hc.
(a) ESI-MS spectrum obtained in native conditions. Charge state of
main peaks and magnification are indicated on the spectrum.
Analysis was performed on whole, desalted hemolymph in 10mM
ammonium acetate buffer, pH 6.8 (b) Deconvoluted mass spectrum
obtained in denaturing conditions from whole, desalted hemolymph
diluted in 50:50:1 water-acetonitrile-formic acid mixture, pH 2.3
(reprinted from [62]).
Analysis of Hc with denaturing ESI-MS reveals a high
subunit diversity, from 4 to 8-9 different subunits for a given
species (Table 3 and Fig. 3b). All subunits have a molecular
mass close to 75 kDa. Due to its high mass accuracy, ESI-
MS can detect more subunits than polyacrylamide gel electrophoresis
(PAGE) [107]. ESI-MS is thus the method of
choice for complete investigation of subunit composition.
The structural diversity observed in the decapod species
which have been studied by MS indicates a narrow range of
structures (hexamer assemblies comprised of ~75 kDa
chains), but high diversity within this range (see below).
Whereas immunochemistry permitted the identification of
subunit types differing in function, methods such as PAGE
and ESI-MS can help to detect additional heterogeneities
which could be functionally neutral but nevertheless useful
for phylogenic studies.
MALLS and ESI-MS analysis produce robust data for Hc
structural modeling. Hc structure is much easier to analyze
than annelid HLB-Hb structure: the lower native mass allows
ESI-MS analysis of the native assembly and the excellent
agreement between the model, subunit masses and native
masses dismiss any ambiguity. Crystallographic and cryo-
EM data of native proteins confirm these models [108, 109].
ESI-MS results are very useful to investigate the heterogeneity
of the Hc complexes. It has higher resolution than
MALLS and is more sensitive for high order complexes in
low amount. However the system is also much more expensive
and requires competent and specialized users for operation.
While MALLS provides masses in a physiological
buffer, ESI-MS measures masses of gas-phase ions. Thus
MALLS and ESI-MS are complementary methods to explore
structure heterogeneity and its relevance in biological conditions.
Fig. (4a) permits to compare between native masses
determined by non-covalent ESI-MS and MALLS and theoretical
masses calculated from subunit masses. The good
agreement between the determined masses shows the reliability
of the method and validates the use of ESI-MS for
investigation of noncovalent assemblies representative of the
native state in solution. It is worthwhile to note that MALLS
gives higher masses than those predicted from subunit
masses (see below). For Carcinus maenas, slightly higher
differences (up to 7%) are observed when several complexes
with the same aggregation state exist. A more accurate study
of phenotypic plasticity shows that specific subunits can account
for these differences (see below). Another possibility
is the presence of adduct products such as small organic ions
(lactate, urate or other) which are of functional and physiological
relevance and which would be conserved in the
physiological buffer but could be removed in the ESI-MS
analysis conditions. In any case, these differences are small
and the native state of observed products in ESI-MS is unambiguously
verified by the agreement with MALLS determined
masses.
6. USING MASS DATA TO EXPLORE DISSOCIA-
TION/REASSOCIATION MECHANISMS IN GIANT
HBL-HB
6.1. Interest of the Knowledge of Dissociation/ Reassociation
Mechanisms
Protein denaturing involves disruption of the higher order
structure, such as their secondary and tertiary structure. It
may be reversible or irreversible and be caused by temperature,
pH, shear forces, surface area changes, surfactants,
buffers, ionic strength, freeze-thaw cycles, organic solvents,
and exposure to interfaces or denaturing chemicals often
leading to aggregation and precipitation phenomena. Denaturation
also typically involves reversible or irreversible unfolding
depending on various factors. Size-exclusion chromatography
(SEC) can provide information as to the levels
of aggregation and fragmentation in a pharmaceutical protein,
and combined with light scattering detection offers an
easy, accurate and reliable alternative technique to investigate
the association of macromolecules in solution. An additional
benefit of this calculation lies in the molecular mass
being simply that of the dissolved protein in solution. SEC-
MALLS associated with ESI-MS analysis can provide useful
results on the mechanism of dissociation/reassociation of
HBL-Hb. We will illustrate these assumptions with the example
of AmHb [6].
Polymerization is needed in extracellular respiratory proteins
for retention in the vascular system and for adequate
oxygen capacity at a manageable osmotic pressure, but this
size requirement poses issues for a spontaneous assembly.
The in vivo association of such complex proteins remains
unclear in polychaete annelids. The pathway of folding of
87

The Structural Analysis of Large Noncovalent Oxygen Binding Proteins Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 167
Table 3.
Experimental Subunit Masses, Native Masses, Calculated Masses of Crustacean Hcys
Species
Ag. state
Subunit Composition Native Mass Calculated Mass
Expl Mass
(Da) ±s.d. a
Method
[ref]
Ag. state
Expl mass
(Da) ±s.d.
Relative
Abundance
Method
[ref]
Cltd mass
from mean
subunit mass
Difference %
Pleocyemata
Caridea
Bresiliidae
Rimicaris 6 74 816,2 ±1 ESI-MS 12 935 000 ±40 000 0,03 MALLS 905 060,8 3,20
exoculata 6 74 865,3 ±2,3 [165] 6 469 000 ±9 000 0,89 [105] 450 283,9 3,99
6 74 902,5 ±1,5 1 80 000 ±10 000 0,08
6 74 939,6 ±2,6
6 74 979,8 ±4,5
6/12 75 018,5 ±6
12 75 326,4 ±5,1
12 75 539,3 ±6,2
Brachyura
Bythograeidae 6/12 75 008,3 ±1,2 ESI-MS 12 nd 0,45 905 212,65
Cyanagraea 6/12 75 062,2 ±4,2 [107] 6 0,55 [107] 452 173,4
praedator 6/12 75 110,3 ±2,2
6/12 75 321,6 ±1,3
6/12 75 375,9 ±6
12 75 419,1 ±5,3
6/12 75 533,1 ±1,1
12 75 628,6 ±3,8
Bythograea nd 74 454 ESI-MS 2 235 051 ±303 ESI-MS 2 242 410 0,33
thermydron 74 549 [62]
30 b 2 256 550 ±396 [62] 2 242 410 0,63
74 647 24 1 804 368 ±284 1 793 928 0,58
74 722 18 1 354 950 ±480 0,01 ESI-MSc 1 345 446 0,70
74 728 12 902 570 ±110 0,13 SEC (proportions) 896 964 0,62
6 450 310 ±260 0,67 [73] 448 482 0,41
1 74 999 ±85 0,18
Segonzacia nd 75 234 ESI-MS 18 1 364 968 ±264 ESI-MS 1 361 574 0,25
mesatlantica 75 322 [62] 1 347 998 ±300 [62] 1361574 1,01
75 541 12 909 628 ±157 907 716 0,21
75 967 6 453 889 ±45 453 858 0,01
Portunidae
Carcinus nd 73 931 ESI-MS 18 1 374 136 ±280 ESI-MS 1 349 334 1,80
maenas 74 049 [62] 12 975 332 ±151 [62] 899 556 7,77
74 117 888 652 ±299 899 556 1,23
74 966
12 b 902 675 ±392 899 556 0,35
75 088 6 487 337 ±35 449 778 7,71
75 161 450 541 ±44 449 778 0,17
75 234
75 459 12 915 913 ±3 032 MALLS 899 556 1,79
75 519 6 466 631 ±10 110
personal
observations
449 778 3,61
Dendrobranchiata
Penaeoidea
Penaeidae
Penaeus nd 24d 1 800 000 MALLS nd
monodon 12 950 000 [166]
6 nd
a
When subunit is present in dodecamer and hexamer, mean of dodecamer and hexamer determinations is given; given sd is the maximum sd of the determinations
b
Precise charge state assignment is ambiguous and two mean masses are possible
c
For mass data; similar results for 18,12,6 and 1-mer were obtained by [62]
d
The 24-mer is a minor component; the major component is the hexamer
88

168 Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 Bruneaux et al.
weight; retention times do not vary between different hemolymph
samples (b) Masses obtained for LtHb. Values for MALLS is taken
from [32]. Partially native value for ESI-MS is based on the native
mass obtained by [63] for the dodecamer; it is calculated for 12
dodecamers and 36 linkers. The linker average mass is calculated
from [23] data, with abundances from [167] (27 659.94 Da). Values
for other methods are taken from [116] and include LS, STEM, EM
and SE determination. The model mass was taken from [32]. (c)
Masses obtained for Arenicola marina HBL-Hb. MALLS values are
from [89]. Partially native ESI-MS values were calculated from
native dodecamer mass from [64] and from the average linker dimer
mass calculated from [83] (50 945 Da). It is calculated for 12
dodecamers and 18 linker dimers. Values for other methods are
taken from [32], considering only data posterior to 1950. They includes
SE, SD and SAXS. The model mass was calculated from the
dodecamer mass calculated by [71] from denaturing ESI-MS data
and from the average linker dimer mass calculated from [83]. It
should be noted that the partially native ESI-MS determination for
HBL-Hb masses shares the linker data with the calculated model
mass.
Fig. (4). Comparison between masses estimated by MALLS,
ESI-MS and other methods for Hc and HBL-Hb.
Bars are mean values with s.d.; the dashed line corresponds to a
model calculated from masses obtained in denaturing ESI-MS (a)
Masses obtained for Carcinus maenas Hc. The same samples
(n=16) were analyzed by MALLS and ESI-MS except for one
which could not analyzed by ESI-MS. The model mass was calculated
for a dodecamer using an intensity-weighted mean subunit
mass with two copper atoms of 74 826.91 Da, obtained from all
samples in denaturing conditions. The SEC mass was obtained after
calibration of a Superose 6 column by markers of known molecular
HBL-Hb has been reported to involve independent folding of
individual domains followed by domain interaction for the
oligochaete Lumbricus terrestris Hb [110]. The stability of
the quaternary structure of annelid HBL-Hbs has been studied
by changing the chemical composition of the medium: by
varying pH, incubation in the presence of chaotropic salts, or
denaturing agents. There is an increasing interest in understanding
the dissociation and association process of this Hb
because it provides useful information about subunit interactions
necessary to maintain the quaternary structure. Moreover,
AmHb has been proposed as useful model system for
developing therapeutic extracellular blood substitute [7, 8]
and required a full study of subunit interactions in order to
find the correct storage and transfusion buffer composition.
In order to analyze the interactions between globin and linker
subunits constituting HBL-Hb, dissociation and reassociation
experiments were carried out under several conditions: exposure
to urea and alkaline pH and the effect was followed by
SEC-MALLS and ESI-MS. Thanks to the complementarity
of information obtained with ESI-MS and MALLS analysis,
Rousselot and collaborators have bring to light a novel and
complex mechanism of dissociation for AmHb compared to
other annelid extracellular Hbs studied to date [6]. Even
though the chemically-induced dissociation triggers partial
degradation of some subunits, spontaneous reassociation was
observed to some extent. Parallel dissociation of LtHb under
similar conditions shows striking differences that allow us to
propose a hypothesis on the nature of the intersubunit contacts
that are essential to form and to hold such a complex
quaternary structure.
6.2. An Application Example: The Case of Arenicola marina
HBL-Hb
MALLS analysis of partially dissociated AmHb at
slightly alkaline pH yielded profiles shown in Fig. (5), with
molecular masses Mw (Fig. 5a) and gyration radius Rg
(Fig. 5b) estimated during the elution profile at 3 different
incubation times. The estimated Mw (Fig. 5a) decreases during
incubation time and the polydispersity estimated by the
molar mass slopes assumes a downward curvature shape,
89

The Structural Analysis of Large Noncovalent Oxygen Binding Proteins Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 169
Fig. (5). Evaluation of the molecular weight and gyration radius during the dissociation process of AmHb.
Dissociation of AmHb followed by MALLS during the elution from a gel exclusion column (Superose 6-C). The solid curve represents the
refractive index (RI) profile overlaid with the dotted curve which represents the light scattering profil at 90° (LS), versus the retention time.
The RI and LS data have been scaled to make the comparison easier. (a) Distribution of the molecular weight values at different incubation
times: Mw profiles of AmHb immediately after exposure at pH 7.8 (red crosses), after 2 hours dissociation (black squares) and 24 hours dissociation
(blue triangles). The RI and LS profile correspond to a dissociation time of 2 hours. (b) Distribution of the gyration radius values at
different incubation times: Rw profiles of AmHb immediately after exposure at pH 7.8 (red crosses), after 2 hours dissociation (black
squares) and 24 hours dissociation (blue triangles).
characteristic of a less homogenous population. The polydispersity
of the peak I HBL indicates that it includes intermediates
of dissociation which are truncated HBL AmHb (Fig.
5a). Truncated HBL-Hb (partially dissociated HBL-Hb particles
lacking 1/6 to 1/2 of the HBL structure) are also observed
on the TEM images of I HBL fraction purified by gel
filtration (Fig. 6b). Even if the estimated gyration radius
average values (Fig. 5b) are close to the angular variation
detection limit of 10 nm, Rg decreases after 2 hours with an
important scattering and increase after 24 hours of incubation
for I 1 and I 2 . The same samples were analyzed by ESI-
MS under non-denaturing conditions and provided the results
shown in Fig. (7a,c). ESI-MS spectrum of partially dissociated
AmHb under non-denaturing conditions (Fig. 7a)
reveals the presence of a subunit of ~224 kDa which should
correspond to the 1/12 th subunits (D+L). However, ESI-MS
spectrum of entirely dissociated AmHb under denaturing and
non-denaturing conditions (Fig. 7c) revealed the presence of
a subunit of ~204 kDa which correspond to the dodecamers
D. Several simultaneous dissociations of a HBL-Hb structure
can be envisioned as proposed for Lumbricus Hb dissociation
[111]. However, the dissociation process of AmHb is
more complex to interpret. The dissociation leads to the
rapid formation of the 1/12 th subunits (D+L) through truncated
HBL. Indeed, SEC-MALLS (Fig. 6a), TEM (Fig. 7b)
and ESI-MS results (Fig. 7a,b) reveal the presence of a small
amount of truncated HBL at the early stage of the dissociation
process and the formation of one major peak I D (Fig. 5)
interpreted as the 1/12 th subunits (D+L) because of the
higher Mw of peak I D (MALLS and ESI-MS results,
Fig. 7a,b). All indicate that the dodecamer is still associated
with linkers at the beginning of the dissociation. Then, the
linkers dissociate from the dodecamer resulting in a decrease
of Mw (peak I D , Fig. 7c). The dodecamer does not dissociate
into stable trimers and monomers as observed for Lumbricus
Hb [111] but into higher Mw units (peaks I 1 and I 2 , Fig.
5a,7a), in low abundance and transitory. The denaturation of
these subunits is evident from the variation of the gyration
radius Rg (Fig. 5b). Rg increases while the molecular mass
decreases after 24 hours dissociation. These variations
90

170 Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 Bruneaux et al.
Fig. (6). Dissociation/reassociation properties of AmHb followed by SEC-MALLS and electron micrographs.
(a) After dissociation of AmHb (red), some rearrangements are observed when the sample is returned to neutral pH (blue). This rearrangment
is only observed in the presence of partially dissociated HBL-Hbs and the 1/12th subunits (D+L) and led to a recovery of the structure of the
1/12th subunits at different degree of polymerisation, and up to a completely reassociated HBL-Hb. (b) Electron micrographs of AmHb, negatively
stained showing self-association properties of Arenicola Hb. (Native) View of native AmHb. (Dissociated) View of truncated HBL and
dodecamers of AmHb isolated by gel filtration after dissociation. (Reassociated) View of reassociated AmHb isolated by gel filtration. The
yellow and pink arrows indicate the top and side view of the AmHb HBL-Hb, respectively.
of Rg are characteristic of an extended unfolded conformation
during the dissociation process. The decrease of Rg after
2 hours of dissociation is explained by the formation of
smaller subunits with smaller radius. The important scatter is
due to the presence of a mix of small structured subunits and
small destructed subunits which have a higher gyration radius.
After 24 hours of dissociation most of these dissociated
subunits are denaturated so the scattering is less important.
The extent of reassociation of AmHb was investigated by
MALLS after dissociation at alkaline pH. Since scattering
intensity is strongly dependent on particle radius, a small
amount of large particles in the sample would give a large
response with the light scattering detector, although their
amount, as measured by the RI response, is low. These interesting
properties allowed us to observe a reassembly of
AmHb which was not so easily observed using gel filtration
only (Fig. 6). The reassociation is limited, as revealed by the
RI profiles of peak I HBL after reassociation and the proportion
of reassociated HBL-Hb (Fig. 8). The observation of the
reassociation is characterized by the differences of the LS
signals for the I HBL peak before and after the reassociation
(Fig. 8). The reassociation is not observed after 1 hour of
dissociation at alkaline pH (Fig. 8c) and is less important as
pH increases (Fig. 8b) and coincides with the absence of
truncated HBL-Hbs (retention time between 20 and 25 min)
as revealed by MALLS profile (Fig. 8c). The reassociation is
confirmed by the TEM images of I HBL isolated by gel filtration
after reassociation process (Fig. 6b). We can distinguish
truncated HBL-Hbs in a more structured conformation than
before reassociation (Fig. 6a) and structured HBL-Hb similar
to native Arenicola HBL-Hb (Fig. 6b).
91

The Structural Analysis of Large Noncovalent Oxygen Binding Proteins Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 171
Fig. (7). MALLS and ESI-MS analysis of dissociated AmHb.
(a,b) Partially dissociated AmHb analyzed by ESI-MS under non-denaturing conditions (a) and by SEC-MALLS (b). (a) The smoothed and
subtracted multiply charged spectrum of partially dissociated AmHb, analyzed under non-denaturing conditions. The molecular weight of the
components A, B and C were respectively 229 399.22, 70 387.7 and 449 558.7 Da calculated with MaxEnt. The number after the colon in the
Inset indicates the number of charges on the ion. The components A were attributed to the 1/12th subunit (D+L), B to a transitory dissociated
product and C to truncated HBL-Hb. MaxEnt does not allow the calculation of the other components because of low resolution. They could
correspond to other truncated HBL-Hb. The envelop at ~22 000 m/z could correspond to the native HBL-Hb. (b) The SEC-MALLS chromatogram
of partially dissociated AmHb allow the observation of native AmHb HBL-Hb at 3608 kDa, of the truncated HBL-Hb and of the
1/12th subunits at 228.8 kDa. (c) The smoothed and subtracted spectrum of AmHb analysed under non-denaturing conditions. Three envelops
are observed and MaxEnt allowed the calculation of the component A: 203 660 Da and B: 399 419 Da which correspond respectively to
AmHb Dodecamer (D) and dimerisation of D probably due to the high concentration used for the analysis. The complementarities of these
data allowed to propose a novel dissociation mechanism for AmHb, through the formation of truncated HBL-Hb, 1/12th subunits and the
dissociation of linkers from the dodecamer D [6].
92

172 Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 Bruneaux et al.
(a)
4000
Lt
y = 1,807x - 2318
R 2 = 0,8485
MALLS mass (kDa)
3800
3600
Rp
Md
Am
Ms
Am
Ac
Ap
Pg
Pp
Lt
y = 1,0576x + 46,043
R 2 = 0,9582
3400
Tj
y = 1,1252x - 304,64
R 2 = 0,9971
Ev
3200
3200 3400 3600 3800
Model mass (kDa)
4000
(b)
16
Group 3
14
∆(MALLS mass – model mass) %
12
10
8
6
4
2
(12)
Group 1
(6)
Group 2
0
Fig. (8). Self-association properties of AmHb.
Self-association properties of AmHb followed by MALLS detector
during the elution on a gel exclusion column (Superose 6-C). The
solid curve represents the refractive index (RI) profile overlaid with
the dotted curve which represents the light scattering profil at 90°
(LS), versus the retention time. The red curves set for AmHb after
dissociation and the blue curves set for AmHb after reassociation.
(a) AmHb immediately after exposure in 0.1 M Tris-HCl buffer pH
8.0 and immediately reassociated. (b) AmHb dissociated immediately
after exposure in 0.1 M Tris-HCl buffer pH 9.0 and immediately
reassociated. (c) AmHb dissociated in 0.1 M Tris-HCl buffer
pH 8.0 after 1 hour and reassociated. The percentages of HBL are
indicated after dissociation (red) and after reassociation (blue).
They are calculated from the integration of HPLC chromatogram at
414 nm.
7. INVESTIGATING RESPIRATORY PIGMENT DI-
VERSITY AMONG PHYLA
7.1. HBL-Hb Diversity in Annelids
Annelid HBL-Hbs share the same global quaternary
structure, as demonstrated by the typical shape observed in
electron microscopy for these molecules. However, precise
structural studies and three-dimensional reconstructions of
their volume in the recent years shed light on high diversity
among the different groups. Table 1 presents available data
- 2
Ev Cm Tj Ac Am Cm Lt Rp Ms Pp Am Pg Ap Md Lt
Species
Fig. (9). Comparison between native mass (MALLS) and model
mass (ESI-MS).
Comparison between measured native mass determined by MALLS
and model mass calculated from ESI-MS data. The masses are
taken from in Table 1. (a) Plot of MALLS mass versus model mass
for annelid HBL-Hbs. The dashed line corresponds to equality between
MALLS and model masses. The three linear regression displayed
were performed on each group mentioned in (b). (b) Relative
difference between MALLS and model masses. The species are
sorted by increasing difference value. The values for Carcinus
maenas dodecamers (12) and hexamers (6) are added for comparison.
Three groups were considered based on the difference values.
Ac, Alvinella caudata; Am, Arenicola marina; Ap, Alvinella pompejana;
Cm, Carcinus maenas; Ev, Eudistylia vancouverii; Lt,
Lumbricus terrestris; Md, Macrobdella decora; Ms, Marphysa sp.;
Pg, Paralvinella grasslei; Pp, Paralvinella palmiformis; Rp, Riftia
pachyptila.
concerning subunit composition of HBL-Hbs from different
species.
Denaturing ESI-MS is very useful for subunit diversity
investigation. It is worthwhile to note that the MS analyses
were often performed on a pool from several individuals.
Hence the observed diversity is rather representative of the
pool and single individuals could exhibit lesser diversity. All
93

The Structural Analysis of Large Noncovalent Oxygen Binding Proteins Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 173
groups present a high diversity of polypeptide chains and
subassemblies. They have from 2 to 4 monomeric globin
chains, except for Eudistylia vancouverii (no monomeric
chain) and Tylorrhynchus heterochaetus (one monomeric
chain). Concerning linker chains, 3 or 4 different monomeric
chains are usually found, except for Paralvinella palmiformis
which surprisingly has only one linker chain, thus
evidencing that one linker type is sufficient to build HBL-Hb
structure [87]. A few polychaete species have linker dimers
(Methanoaricia dendrobranchiata, Tylorrhynchus heterochaetus,
Arenicola marina). The case of Eudistylia Chl is
original since globin chains are arranged in divalent dimers
and tetramer and 10 monomeric linker chains are present.
Few data are available for other Chl; it would be of interest
to analyze other Chl with the same precision in order to test
whether such high variability is specific to sabellids or if
Eudistylia is an isolated case [70].
As previously reported, groups can be separated on the
basis of their globin covalent assemblies [37]. In hirudinids
(achaetes), globin chains are monomeric and dimeric and
globin dodecamers are made of 6 monomers and 3 dimers. In
oligochaetes, globin chains are monomeric and trimeric (except
for Glossoscolex paulistus with a small amount of dimer)
and dodecamers are made of 3 monomers and 3 trimers.
In polychaetes, globin chains are mostly monomeric and
trimeric except for Methanoaricia dendrobranchiata, Riftia
pachyptila and Tevnia jerichonana which present dimeric
chains and sabellids with dimeric and tetrameric globin
chains. Interestingly, dimeric globin chains are also observed
in the 400 kDa vascular Hb from Riftia pachyptila and the
shallow water pogonophoran Oligobrachia mashikoi [68,
86]. These observations suggest that the occurrence of a dimeric
globin chain cannot be linked simply to a particular
annelid group (present in Palpata and Scolecida) nor to an
environmental condition (present in species living in shallow
water and deep-sea communities).
Thus subassembly structure does not seem to follow simple
taxonomic distribution. However general trends can be
drawn: hirudinids, oligochaetes and polychaetes have mainly
a 6M+3D, 3M+3T and 3M+3T structure, respectively. A
number of exceptions exist concerning polychaetes. It is
tempting to relate the high diversity within the polychaete
group either with its broader taxonomic diversity or with the
high diversity of habitats these species live in. Whereas oligochaetes
and achaetes are limited to fresh water and terrestrial
habitats, polychaetes are found in various and contrasted
marine habitats, e.g. intertidal mud, shallow water, deep-sea
hydrothermal vents and cold seeps. In addition, annelid
phylogeny is still under debate and could be reconsidered in
the forthcoming years [112-115].
The high diversity evidenced by ESI-MS analysis also
exists at the spatial level, as illustrated by the occurrence of
architectural type I or II and toroid or ellipsoid central piece
in the different groups (Table 1). However no relation between
spatial arrangement and subunit composition can be
observed with the available data.
ESI-MS has helped to determine precise distribution of
subunit among species and to characterize some of their
structural features. The global scheme which is depicted is a
globally well-conserved organization of HBL-Hb with
subunit assemblies that are typical of some groups, whereas
some particular features such as dimeric globin chain presence,
architectural type and central piece nature seem to follow
no phylogenic determination.
Fig. (9) presents the comparison between MALLS
masses and model masses calculated from a typical LtHb
model (144 globins + 36 linkers), from denaturing ESI-MS
mass data. MALLS mass is almost always superior to model
mass. A slight difference seems consistent with Carcinus
maenas data. In C. maenas case, the comparison occurs between
MALLS mass and native ESI-MS mass (personal
data). The resulting ~2-4 % difference is thus occurring between
two molecular species which are certainly the same
(native Hc). Three main groups can be observed in Fig. (9b).
The first one exhibit mass differences ~2-4 %, which is consistent
with C. maenas observed differences and
suggests a good agreement between MALLS mass and
model. The second group presents mass differences of about
6 to 7 % and the third one is well separated with differences
over 10 % (Paralvinella grasslei, Alvinella pompejana,
Macrobdella decora and one measurement for Lumbricus
terrestris). Several elements can be proposed to explain
these differences. As already mentioned, differences below
5% can be thought of as standard (observed for C. maenas
for the same structure in MALLS and ESI-MS). Higher differences
can mean that the proposed structural model 144
globins + 36 linkers is not well adapted for these species [83,
87, 88]. Daniel and collaborators [116] have proposed that
the discrepancy observed in LtHb native masses could be
due to the existence of two forms, one form of 4.4 MDa with
192 globin and 36 linker chains, and the classical form of
3.6 MDa with 144 globin and 36 linker chains. They proposed
that the 4.4 MDa form would be the truly native form
present in the hemolymph corresponding to the 144 + 36
model associated with 48 globins in the central part. The 3.6
MDa form would result from the dissociation of the fragile
former one. They support this hypothesis with the observation
of Riftia pachyptila V2 hemoglobin of ~430 kDa, composed
of 24 globin chains [68, 85]. The observed differences
in Fig. (9) could result from a partial degradation of a hypothetical
192 + 36 form in the sample: species with differences
5 % would present a mixture of
complete and dissociated HBL-Hbs (192 + 36 and 144 + 36)
and thus an average mass would be measured. In this case,
the two groups (differences of about 6-7 % and >10 %)
could differ in the fragility of their HBL-Hbs. A higher
thermostability and resistance to reduction has already been
observed for Alvinella pompejana Hb [88, 117].
7.2. Hc Diversity in Crustaceans
Two main features can be studied when investigating Hc
diversity in crustaceans: the dodecamer and hexamer proportions
and the subunit heterogeneity. These domains have
been thoroughly investigated in past decades [106, 118] but
to our knowledge MALLS and MS have been applied only a
very few times and very recently to this kind of study, even
if light scattering was frequently used for investigation of
molluscan Hc and sporadically crustacean Hc [119-122].
The determination of aggregation forms in crustacean
hemolymph was performed most of the time by using sedi-
94

174 Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 Bruneaux et al.
mentation methods to separate 24S and 16S species (corresponding
to dodecamer and hexamer, respectively). Hexamer
is the dominant form in isopods, euphausiids (krill), carideans
(shrimps), penaeids (prawns), most palinurids (spiny
lobsters) and Uca species (brachyuran). Dodecamer is dominant
in brachyurans (except Uca), astacids (lobsters, crayfishes),
anomurans (hermit crabs) and some Scyllarus species
(palinurid). Thalassinid shrimps (ghost shrimps) are
original since they present a 24-mer aggregation state [106].
MALLS was used to determine Hc aggregation states for
the hydrothermal shrimp Rimicaris exoculata (caridean)
[105]. A dominant hexameric form was observed with a
mass of 469 ± 9 kDa, along with minor monomeric and dodecameric
forms. This is consistent with the data previously
observed in other caridean species from shallow water.
MALLS determined masses of 950 000 kDa (12-mer) and
1 800 000 kDa (24-mer) were obtained for Penaeus monodon,
with a dominant 6-mer (mass undetermined) and a minor
24-mer [123]. Non-covalent ESI-MS was also used to
determine the complex masses for the brachyurans Bythograea
thermydron, Segonzacia mesatlantica and Carcinus
maenas (Table 3). Dodecamers and hexamers were detected
in agreement with previous observations, and their mass
could be precisely determined. Higher aggregation states
were also discovered in these crabs [62].
Subunit diversity in a given species was investigated in
several groups [29, 106, 118, 124-127]. These works used
native PAGE and evidenced high heterogeneity among species
but no clear relation was found between native PAGE
pattern and taxonomic position. However, Hc subunit heterogeneity
revealed as a useful tool for asserting cryptic or
morphologically similar species [118, 125]. An hypothesis is
that Hc could be among the first protein to diverge when a
speciation event occurs [118, 126].
Denaturing ESI-MS experiments allowed determination
of subunit masses for caridean and brachyuran species (Table
3). This method showed higher subunit diversity than
could be previously detected by PAGE method. Application
of these methods to comparison of Hc diversity within other
decapod groups should be of interest since subunits could be
identified precisely and unambiguously and precise mass of
complexes could be determined. Since no relation was observed
between PAGE pattern and taxonomy, it is possible
that no other relation could be observed even with the high
resolution of MS. Even in this case, MS would indubitably
be of great interest for distinguishing between sibling species
or even for populations within a unique species.
8. FROM STRUCTURE TO BIOLOGICAL POPULA-
TIONS: HB POLYMORPHISM IN ARENICOLA
MARINA
Structural models have been proposed for the giant extracellular
hemoglobin of A. marina based on the complementarities
of ESI-MS and MALLS [83], on ESI-MS under
non-denaturing conditions [71] and from crystallographic
data [81], all established from a pool of lugworm blood
(Fig. 1). They concluded to different structural models;
AmHb dodecamers subassemblies is either M 3 T 3 or M 9 T,
with or without a central unit [83]. Nowadays, no such accurate
method as ESI-MS exists to validate one structural
model. However, they might be all correct. Indeed, very recent
results obtained on AmHb analyzed individually by
ESI-MS, have revealed the existence of a structural polymorphism
[92].
The extracellular Hb are invariably synthesized intracellularly
and are then secreted. Because they lack the cellular
microenvironment where effector levels maybe regulated as
invertebrates, their operating conditions are more dependent
on the vagaries of ambient conditions than the Hbs enclosed
in ion regulating cells. Invertebrates abundantly display Hbs
heterogeneity that involves both multiplicity (different
isoHbs occurring in the same individual organisms) and
polymorphism (different Hbs components, Hbs patterns, or
relative concentrations occurring in different genetic strains).
This phenomenon is well known for branchiopod groups
[128] but has never been evidenced in annelids so far. The
preliminary observations for AmHb suggest that it is not a
differential gene expression but rather a genetic polymorphism
[92]. This structural polymorphism was evidenced
thanks to the ESI-MS mass accuracy which allowed to evidence
different globin chains and subunits composition
among AmHb taken individually while the individuals were
collected under exactly the same conditions.
Fig. (10) shows 3 different and characteristic MaxEnt
processed spectra of unreduced and reduced AmHb obtained
from 20 A. marina from the same population. Table 4 summarizes
the three different profiles and highlights the possible
existence of a genetic polymorphism with homozygoteand
heterozygote-like profiles as detailed in Fig. (10) and
Table 4. This assumption is actually under investigation
however preliminary mRNA results seems to confirm this
fact [92]. The resolution of ESI-MS under non-denaturing
conditions and of the SEC-MALLS does not allow to evidence
the existence of a structural polymorphism from the
mass of the dodecamers subunits or from the entire HBL-
Hbs.
The results obtained here revealed that the structure of
the AmHb is not unique but different possible models exist
for the species. However, HBL-Hb are always composed of
the association of globin monomer and globin disulfidebound
trimers. Today, we can also imagine that blood of one
A. marina individual is composed of several structurally different
HBL-Hb.
9. INVESTIGATING THE ROLE OF PHENOTYPIC
PLASTICITY IN RESPONSE TO ENVIRONMENTAL
CHALLENGE AT THE MACROMOLECULAR AND
SUBUNIT LEVELS
9.1. Monitoring Aggregation State of Crustacean Hc
As crustacean Hc can exist under several aggregation
states in some groups, the knowledge of their proportions
and how these evolve between different environmental conditions
or between different species is of interest for physiological
studies [106, 129]. The aggregation states of the respiratory
pigment from an individual can be rapidly determined
by SEC-MALLS. A spectrophotometric monitoring at
340 nm enables to discriminate between the pigment and
other non-respiratory proteins.
A physiological buffer is used for elution to maintain the
same chemical environment as in the animal as far as we can
95

The Structural Analysis of Large Noncovalent Oxygen Binding Proteins Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 175
(a) ESI-MS under denaturating conditions
100
15952
15974
49581
49531
49650
49708
49724
(b) ESI-MS under denaturating and reduced conditions
15975
100 15952
16662
AB
%
49781.0
%
15891
16018
16034
16981 17031
0
∫∫
0
B
100
%
15974
49581
49620
49724
100
%
15930
15891
15975
16035
16662
17031
0
15900 16000
∫∫
49500 50000
0
49670
16662
16000 16500 17000
100
15950
49655
100
A
%
49528 49696
%
15952
16018
16981
0
15900 16000
∫∫
49500 50000 50500
0
15891
16000 16500 17000
Mass (Da)
Mass (Da)
Fig. (10). MaxEnt-processed spectra of three AmHb structural profiles.
MaxEnt-processed spectra of native (a) and reduced (b) AmHb characterizing three different structural profiles (A, B and AB). AB is the
combination of A and B. The Mw of each globin subunit and chains characterizing each profile are summarized Table 4.
Table 4.
Tree Different Structural Profils of AmHb Obtained from ESI-MS Analysis
Profils
Mass (Da) of Globin Subunits
A AB B
Monomers (± 2Da)
M1–15921 X X
M2–15975 X X
T1–49528 X X
T2–49581 X X
T3–49620 X X
Trimers (± 4Da)
T4–49655 X X
T5–49670 X
T6–49708 X
T7–49724 X X
Mass (Da) of globin chains
Monomers (± 2Da)
M1–15921 X X
M2–15975 X X
96

176 Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 Bruneaux et al.
(Table 4) contd….
Profils
A AB B
Mass (Da) of Globin Subunits
M3–15891 T1 T1 T2
M4–15930 T3 T3
Monomers forming the disulfide
bounded trimers (±2Da)
M5 – 16 018 T4 T4,6
M6 – 16 035 T5,7 T7
M7 – 16 664 T1,4 T1,3,4,6,7 T2,3,7
M8 – 16 981 T1,4 T1,4,5
M9 – 17 032 T2,3,6,7 T2,3,7
reproduce it. This condition is essential to obtain biologically
relevant data and to avoid any experimental degradation or
aggregation due to inadequate solvent. It also permits to test
the effect of changes in buffer composition on the aggregation
state, for example to test the influence of divalent
cations on complex stability and to follow dissociation and
association mechanisms. Light scattering at one angle is very
widely used to follow dissociation and reassociation of multimeric
proteins; it was an important method used by
Herskovits to investigate the dissociation of gastropods
hemocyanins [122, 130].
MS can also be used to investigate differences between
experimental conditions. Aggregation states in hydrothermal
vent crabs exposed to hypoxia and hyperoxia were monitored
by noncovalent ESI-MS [74]. Segonzacia mesatlantica
were held at deep-sea pressure under hypoxia or hyperoxia
alternatively for 6h periods. ESI-MS analysis detected hexamers,
dodecamers and 18-mers in crabs from both conditions.
Two overlapping distributions were detected for the
dodecamer and 18-mer ion series, revealing the presence of
two different forms for each aggregation state. Most interestingly,
a difference in the proportion of each dodecamer species
was detected between the two conditions (ratio 21:79
after hypoxia and 27:73 after hyperoxia). These experiments
were made on hemolymph pooled from 4 crabs and it is still
possible that random interindividual variability might exist
within the pools, but these results suggest an environmental
effect upon dodecamer proportions and in any case demonstrate
the possibility to detect precise adjustment in proportion
of very close complexes in different experimental conditions.
9.2. Investigating the Role of Phenotypic Plasticity in Response
to Environmental Challenge at the Subunit Level
As mentioned earlier, crustacean Hc present a very high
potential phenotypic plasticity due to (a) the simultaneous
existence of several aggregation states made of numerous
subunits (mainly hexamer and dodecamer) and (b) the diversity
of the subunits types. These two elements allow many
potential combinations to be produced at the molecular level,
with modulation of oxygen binding properties. Crustaceans
can live in a wide variety of habitats: some are terrestrial
species (e.g. land crab Birgus latro) and most are aquatic
species. They are found from fresh water to sea water, from
the intertidal zone to deep-sea hydrothermal vents. The comparative
study of physiological mechanisms occurring in the
very large range of conditions experienced by the different
groups is of great interest. It is also very appealing to study
some species of which individuals can support changing
conditions. Contrary to the crab Cancer pagurus, which can
only survive in non-diluted sea water, Carcinus maenas and
Callinectes sapidus can support very diluted sea water in
estuary areas and large pO2 range. Deep-sea hydrothermal
vent species living in the mixing zone between sea water and
hydrothermal fluid are exposed to rapid and unpredictable
changes [131].
The diversity of experienced environment suggests the
presence of original physiological adaptations. Many
mechanisms are at work: ventilatory and circulatory rates
compensation, metabolism adjustment [132]. Hemocyanin
oxygen affinity can be modified by hemolymph modulators
(inorganic and organic ions) [25]. Phenotypic plasticity has
been observed in several situations. It is related to ontogeny
when different subunits are expressed during successive developmental
stages as in the Dungeness crab Cancer magister
[133-135], as is observed for some vertebrates which
switch from fetal hemoglobin to adult hemoglobin. Environmental
changes induce phenotypic changes in the blue
crab Callinectes sapidus or the spiny lobster Panulirus elephas:
individuals caught from different conditions exhibit
different subunits [27, 29]. Genetic differences cannot explain
this observation since the subunit expression pattern
changes when individuals are transferred to different conditions.
It has been proved that these composition changes are
related with functional property changes in the case of
C. sapidus, P. elephas and P. mauritanicus [26-28]. An environmental
influence has also been evidenced in the case of
the Hb from the microcrustacean Daphnia magna [136].
Two approaches to comparative phenotypic plasticity are
possible. Comparison between different species living in
different environments should help to outline long-term adaptations.
On the other hand, comparison between individuals
of the same species exposed to different conditions
should help to detect short-term phenotypic adaptations.
Subunits are to be identified precisely to investigate phenotypic
plasticity involved in short-term adaptation. As mass
spectrometry is a very precise and accurate method for de-
97

The Structural Analysis of Large Noncovalent Oxygen Binding Proteins Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 177
termining molecular masses, it can be used with great profit
for unambiguous determination of subunit identity by their
masses.
In the previously mentioned study of Hc from a hydrothermal
vent crab, subunit composition was also determined
[74]. In both experienced conditions (hypoxia and hyperoxia),
the same 4 polypeptide chains were detected. However,
when comparing MaxEnt deconvoluted spectra from
the two samples, a change in the abundance of one subunit
can be observed: the 75 541 Da subunit is more abundant
after hyperoxia. Since it has often been demonstrated that an
oligo-hexameric state of arthropod Hc can depend on the
presence or absence of certain subunit types, the observed
change in the 75 541 Da subunit abundance could be suggested
as a cause for the change in aggregation states within
such a short period observed in the same experiment. Once
again, even if interindividual variations could still have interfered
with condition-induced variations, this results shows
that a small change in subunit abundance can be detected by
ESI-MS and encourage to perform such analysis on individual
samples. This is made possible by the high sensitivity of
the method and would permit to distinguish between interindividual
variability and reproducible trends induced by experimental
conditions. ESI-MS is a powerful method to explore
subunit plasticity for these complexes, considering the
similarities existing between subunits and the need to identify
them precisely.
CONCLUSION: WHICH QUESTIONS DO MALLS
AND ESI-MS HELP TO SOLVE ?
All the results presented here clearly reveal the complementarities
of ESI-MS and MALLS analysis to investigate
the structure of noncovalent multimeric complexes such as
HBL-Hb and Hc.
Indeed, the molecular masses of native proteins determined
by light scattering systems agree well with known
molecular masses based on gel permeation chromatography
or analytical centrifugation, and LS technologies can be alternatives
to these conventional methods. In theory, SEC-
MALLS provides the capability of determining the “absolute”
molecular masses of proteins and their protein-protein
complexes as it is in solution. Molecular masses determined
by SEC-MALLS depend only on the readings obtained from
the downstream MALLS and refractive index (RI) detectors
and not on the SEC elution position [38-41]. As for analytical
centrifugation, the resulting average mass is independent
of any external calibration. Other advantages of
SEC-MALLS are that it is a “non-invasive” technique without
incorporation of a radioactive or fluorescent tag and it is
non-destructive. The sample may thus be recovered for use
in subsequent studies. Compared with techniques such as
analytical centrifugation, SEC-MALLS is more rapid and
samples may be analyzed easily at various pH values, ionic
strengths, and temperature and in the presence or absence of
ligands. SEC-MALLS is a particularly useful tool for studying
homoassociations and heteroassociations of proteins and
other biological macromolecules [38-41, 137] as illustrated
with AmHb dissociation/reassociation mechanism. In conclusion,
SEC-MALLS offers a powerful tool for characterization
of the biophysical properties of such proteins and their
biologically relevant complexes in solution. MALLS and
analytical centrifugation are the techniques the most likely to
keep molecules in their native state, in particular for fragile
assemblies such as annelid HBL-Hb in which the central
piece may be lost by other techniques.
Concerning protein conformation, the MALLS system
can measure the rms gyration radius (Rg) of globular proteins
but values are generally below the angular variation
detection limit of 10 nm, making the determination unreliable.
Conformational changes in the protein molecules during
aggregation/denaturation can be predicted from these
measurements. More accurate measurements of the conformation
of these molecules would require the determination
of additional parameters such as hydrodynamic radius (Rh)
and are limited by difficulties in accurately measuring Rg of
these globular proteins by MALLS.
Even if MALLS gave plausible information on the mass
of the native pigment in solution, it lacks the resolution capability
to test for the existence of similar-sized isoforms.
This can be achieved with a variety of mass spectrometric
(MS) approaches. Indeed, MS can be used to determine molecular
masses more accurately than by SEC-MALLS, but
the ESI process may break fragile noncovalent interactions
and the reliability of the method must be tested first. The
good agreement between MALLS and ESI-MS results suggests
that the interactions maintaining the complex are conserved
during ionization. Thus the species observed by ESI-
MS are likely to be representative of the species in solution
and the high mass accuracy of the method can be used to
distinguish between very close isoforms.
The utility of MS for detection and quantification of noncovalent
protein-protein interactions under native, equilibrium
conditions in solution can be limited by several factors.
Although the m/z range of the time-of-flight analyzer is
theoretically unlimited, in practice it is often difficult to detect
larger proteins and noncovalently bound macromolecular
complexes in excess of 100kDa as their flight through
technique used for improving the detection of these large
structures is collisional cooling [138-143]. However, this
seems to be protein dependent as revealed by the analysis of
hemocyanin complexes presented in this review. In this case,
ESI-MS in native mode enables to measure absolute mass of
native complexes similar to the species in solution. MALLS
has the advantage that it can be performed on-line with separative
techniques such as FPLC using a physiological buffer
as eluent, thus minimizing sample manipulation and possible
deterioration, but does not permit to distinguish isoforms.
When native masses can be determined by both techniques,
small differences (2 to 4 % for Carcinus maenas) are
often observed between MALLS and ESI-MS, with MALLS
masses often being superior to MS masses. Two hypotheses
can be proposed to explain this. First, as the two techniques
are based on different physical principles, the differences
could be inherent to the devices themselves and reflect no
real difference. On the other hand, one can consider that during
the ionization process in ESI-MS, labile solvent molecules
and ions could be separated from the protein complex
during vaporization in the nebulization chamber, while the
MALLS measurement could take into account divalent
cations or other physiological adducts and solvating layer
98

178 Current Protein and Peptide Science, 2008, Vol. 9, No. 2 Bruneaux et al.
involved in the pigment structure in the physiological buffer,
hopefully the same as in the hemolymph. This is supported
by the progressive decrease in mass observed with increasing
denaturation/desolvatation: native MALLS mass is superior
to native ESI-MS mass, which is superior to model mass
from denatured subunits (Fig. 7). It is thus possible that what
is really measured is not always exactly the same from one
method to another. However, the good agreement between
these two methods using different principles suggest that
both of them provides accurate results and support further
use of them in a complementary approach to study macromolecular
complexes and protein-protein interactions.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors would like to thank their academic structures
(CNRS, UPMC, ULP) for supporting their work. M.B. was
funded by a MRT grant, n°18213-2005.
ABBREVIATIONS
Hb = Hemoglobin
HBL-Hb = Hexagonal bilayer hemoglobin
Chl = Chlorocruorin
Hc = Hemocyanin
TEM = Transmission electron microscopy
STEM = Scanning transmission electron microscopy
ESI-MS = Electrospray ionization mass spectrometry
FFF = Field flow fractionation
MALLS = Multi-angle laser light scattering
n 50 = Hill-coefficient at half-saturation
P 50 = Oxygen partial pressure at half-saturation
LS = Light scattering
HPLC = High performance liquid chromatography
SDS-PAGE =
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis
rms = Root mean square
Rg = Gyration radius
Rh = Hydrodynamic radius
cryo-EM = Cryoelectron microscopy
AmHb = Arenicola marina hemoglobin
LtHb = Lumbricus terrestris hemoglobin
SAXS = Small-angle x-ray scattering.
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Received: April 14, 2007 Revised: October 02, 2007 Accepted: November 27, 2007
101

102 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPLIQUÉS AUX PIGMENTS RESPIRATOIRES
2.4 Conclusion : intérêt de la spectrométrie de masse et de la diffusion de lumière
pour l’étude de l’Hc
L’étude de la structure des complexes non-covalents servant de pigments respiratoires aux invertébrés
marins repose sur deux aspects complémentaires : d’une part la détermination des masses natives
des complexes, dans des conditions aussi proches que possible de la réalité physiologique, et d’autre
part l’identification et la détermination des masses des sous-unités qui composent ces complexes. Le
MALLS permet d’obtenir les masses dans des conditions de tampons physiologiques, alors que l’ESI-
MS permet de déterminer les masses des sous-unités de manière très précise (et donc de déterminer
le phénotype d’un individu) et également celles des complexes, au moins pour les Hcs de Crustacés.
Ces deux aspects sont mis à profit dans les chapitres suivants de cette thèse.
Enfin, l’ESI-MS supramoléculaire permet également d’étudier les interactions protéine/ligand.
Cette technique est utilisée dans le chapitre suivant pour l’étude des interactions entre l’Hc et deux de
ses effecteurs physiologiques : le L-lactate et les cations divalents.

Chapitre 3
Interaction de l’hémocyanine de Carcinus
maenas avec le L-lactate et les cations
divalents : étude par spectrométrie de masse
103

104 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC DE C. MAENAS PAR ESI-MS
Chez les Crustacés Décapodes, la régulation de la fonction respiratoire d’un individu fait intervenir
une modulation des propriétés de fixation de l’oxygène par l’hémocyanine à l’échelle moléculaire.
Afin de comprendre les mécanismes mis en jeu, il est important de connaître les interactions entre le
pigment respiratoire et ses modulateurs physiologiques.
Ces interactions sont non-covalentes et réversibles et sont donc plus fragiles que des liaisons
chimiques covalentes ; elles doivent être étudiées par des techniques permettant de les conserver lors
de l’analyse. La spectrométrie de masse supramoléculaire, de développement relativement récent,
permet de conserver ce type d’interaction et d’observer la masse de complexes non-covalents ; c’est
un outil performant et puissant pour l’étude des interactions entre molécules biologiques de type
protéine/protéine et protéine/ligand (Invernizzi et al., 2007).
L’objectif du travail exposé dans ce chapitre est de caractériser par cette méthode les interactions
entre l’hémocyanine de Carcinus maenas et deux modulateurs importants : le L-lactate et les cations
divalents. Le principe de la spectrométrie de masse par nébulisation électrique (ElectroSpray Ionization
Mass Spectrometry, ESI-MS) est d’abord présenté ; cette méthode est utilisée en particulier dans
ce chapitre mais aussi dans les études portant sur la plasticité phénotypique de Carcinus maenas et
Segonzacia mesatlantica. Le contexte biologique de l’étude est ensuite présenté, puis les travaux et
les résultats obtenus sont détaillés dans le manuscrit d’un article issu de cette étude et reproduit ici
(actuellement en cours de soumission).
L’ensemble des travaux présentés dans ce chapitre ont été réalisés en collaboration avec Peran Terrier
de l’équipe LDSM2 de l’UMR 7177 (CNRS - Université Louis Pasteur) dirigée par Emmanuelle
Leize-Wagner.
3.1 Problématique et objectifs de l’étude
3.1.1 Liaison et effet du L-lactate
Chez les Crustacés, le L-lactate est un effecteur organique important de l’Hc (voir partie 1.4.2
dans l’introduction, page 51) (figure 3.1) (Truchot, 1980). Comme expliqué précédemment, il est
produit par le métabolisme anaérobie de l’animal lors d’une hypoxie environnementale ou métabolique.
Le L-lactate augmente en général l’affinité de l’hémocyanine pour l’oxygène (Truchot, 1980,
1992, Bridges, 2001) mais chez certaines espèces le pigment est peu ou pas sensible au L-lactate (par
exemple chez des crevettes Thalassinidés vivant dans la vase (Taylor et al., 2000) ou chez Scyllarides

3.1. PROBLÉMATIQUE ET OBJECTIFS DE L’ÉTUDE 105
FIG. 3.1 – Structure du L-lactate. Le L-lactate est asymétrique au niveau du carbone central (*). Sa
masse molaire est de 90 g.mol −1 et son pKa à 25°C, 100 kPa est de 3,85. Il est donc présent sous
forme d’ion lactate à pH physiologique.
latus (Sanna et al., 2004)). Un effet lactate inverse a même été observé chez une espèce terrestre, Gecarcoidea
natalis (Adamczewska et Morris, 1998). La diminution de la sensibilité au lactate semble
corrélée avec le passage à un mode de vie plus terrestre et à la ventilation aérienne (Morris et Bridges,
1994, Bridges, 2001).
Des expériences avec des analogues du L-lactate et l’absence d’effet du D-lactate suggèrent que
le L-lactate se lie de manière stéréospécifique à un site de l’hémocyanine (Johnson et al., 1988) et
que la liaison se fait par l’intermédiaire des 4 positions autour du carbone chiral (Graham, 1985). Des
expériences de calorimétrie (ITC, Isothermal Titration Calorimetry) réalisées sur des hémocyanines
sensibles et insensibles au L-lactate ont montré que les hémocyanines insensibles ne liaient pas le
L-lactate, contrairement aux hémocyanines sensibles (Taylor et al., 2000).
Pour l’hémocyanine du crabe bleu Callinectes sapidus, des titrations du lactate donnent une valeur
de constante de dissociation du lactate de 1,8 mM pour l’état oxygéné et 2,2 sites de fixation
par hexamère, et des mesures par ultrafiltration donnent une valeur de 3,2 mM pour la constante de
dissociation et 2,8 sites par hexamère (Johnson et al., 1984). Pour l’hémocyanine de la langouste Panulirus
interruptus, une purification des sous-unités et la formation d’homohexamères sensibles ou
insensibles a montré que la sensibilité au lactate dépend des sous-unités présentes (Johnson et al.,
1987). L’analyse des courbes de dissociation de l’oxygène montre chez cette espèce la présence d’environ
un site de fixation seulement par homohexamère et non six, ce qui suggère que le site n’est pas
localisé sur une seule sous-unité mais émergerait de l’association des sous-unité en structure quaternaire
(figure 3.2(c)) (Johnson et al., 1987). Pour l’hémocyanine du homard Homarus vulgaris, des
expériences d’ultrafiltration et de dialyse à l’équilibre en utilisant des ligands marqués ont montré la
présence d’environ 2 sites de fixation du lactate par dodécamère, ce qui est en accord avec les données
obtenues pour Panulirus interruptus. L’urate aurait autant de site de fixation mais les sites de fixation
du lactate et de l’urate seraient distincts et indépendants (Nies et al., 1992). Le lactate ne se lie pas de

106 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC DE C. MAENAS PAR ESI-MS
(a) (b) (c)
FIG. 3.2 – Différentes modalités hypothétiques de fixation du L-lactate à l’Hc. Représentation schématique
d’un dodécamère d’Hc de Crustacé formé de sous-unités différentes (bleu clair, moyen,
foncé) et fixant le L-lactate (rouge). (a) Fixation aspécifique du L-lactate sur chaque type de sousunité,
(b) Fixation spéficique du L-lactate sur un type de sous-unité seulement, (c) Fixation spécifique
du L-lactate dans un site formé par la structure quaternaire de l’Hc.
manière coopérative à l’hémocyanine, ce qui suggère que les changements conformationnels induits
par la fixation d’une molécule de lactate sur un site n’influencent pas l’autre site (Nies et al., 1992).
Une autre étude chez Homarus americanus par SAXS (diffusion des rayons X aux petits angles) ainsi
que par microscopie électronique suggère que l’addition de 10 mM de L-lactate provoque le rapprochement
des 2 hexamères constituant le dodécamère d’environ 1,1 nm (Hartmann et al., 2001). Cela
suggère que des changements locaux au niveau de sites de fixation peuvent entraîner une modification
de la structure quaternaire globale de la protéine.
Une étude récente réalisée chez Carcinus maenas a mesuré la liaison de 0,35 ion lactate par unité
fonctionnelle, soit 4 sites par dodécamère (analyse de courbes de dissociation de l’oxygène) (Weber
et al., 2008). Ces données diffèrent de celles obtenues pour Homarus vulgaris et Panulirus interruptus
mais concordent avec celles du crabe brachyoure Callinectes sapidus.
Ces études fournissent des informations sur la stoechiométrie et la spécificité de la liaison du L-
lactate à l’hémocyanine. Le site de liaison ainsi que les acides aminés impliqués dans cette liaison
restent à mettre en évidence.
3.1.2 Rôle structural et effet des cations divalents
Le rôle des cations divalents et du pH dans le maintien de la structure des complexes d’Hc a été
mis en évidence par de nombreuses études (Herskovits, 1988). En particulier, le rôle du pH dans la

3.1. PROBLÉMATIQUE ET OBJECTIFS DE L’ÉTUDE 107
stabilité des hémocyanines était connu dès 1936 avec les études d’Eriksson et Svedberg en centrifugation
analytique (Eriksson-Quensel et Svedberg, 1936). A pH alcalin et en présence d’EDTA, les
complexes d’hémocyanine se dissocient en sous-unités et ne peuvent plus lier l’oxygène (Molon et al.,
2000, Olianas et al., 2006). Cette dissociation est réversible dans certaines limites en présence d’ions
Ca 2+ et à pH physiologique. Les cations divalents et le pH ont également un effet sur les propriétés
fonctionnelles de l’hémocyanine (voir partie 1.4.2).
Les travaux étudiant la stoechiométrie de la fixation des cations divalents ainsi que les constantes
d’association impliquées montrent l’existence de deux types de sites de fixation : quelques sites à
haute affinité pour les cations divalents (de 1 à 3 par hexamère) et de nombreux sites avec une affinité
de 10 à 100 fois moins forte (jusqu’à 42 sites par hexamère). Une étude sur l’hémocyanine
de Panulirus interruptus a mesuré une affinité similaire des sites de liaison pour les ions Ca 2+ et
Mg 2+ (Andersson et al., 1982). En conditions physiologiques, les sites à haute affinité sont saturés en
permanence et ont probablement un rôle structural alors que ceux à faible affinité ont une saturation
dépendant de la concentration de Ca 2+ dans des gammes physiologiques et ont probablement un rôle
dans la modulation de l’affinité du pigment par les cations divalents.
3.1.3 Problématique et approche expérimentale
L’objectif initial de l’étude de l’hémocyanine de Carcinus maenas par ESI-MS supramoléculaire
est la caractérisation de l’interaction du L-lactate avec les sous-unités et le complexe d’hémocyanine
(figure 3.2). Le L-lactate interagit-il avec un type particulier de sous-unité ? La structure quaternaire
est-elle effectivement nécessaire pour avoir une interaction comme le suggèrent les études précédentes
?
Dans ce cadre, la démarche expérimentale suivie consiste à tester l’interaction du lactate avec des
sous-unités séparées tout en restant dans des conditions d’analyse ESI-MS permettant de conserver
les interactions non-covalentes. Le principe est de dissocier les complexes en tampon aqueux à pH
alcalin, puis d’ajouter du lactate tout en revenant à un pH physiologique afin de tester s’il est possible
de détecter au cours des analyses en ESI-MS supramoléculaire des sous-unités isolées dont la masse
augmente de la masse du lactate (90,4 g.mol −1 ). D’autre part, si la réassociation des sous-unités peut
effectivement être suivie par ESI-MS il est intéressant de tester l’effet de la chélation des cations
divalents sur la réassociation des complexes ainsi que de comparer les mécanismes de réassociation
entre hexamères et dodécamères purifiés.
La démarche expérimentale suit donc le plan suivant :
– réaliser une dissociation à pH alcalin des complexes en sous-unités
– comparer la réassociation par acidification en présence et en absence de L-lactate

108 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC DE C. MAENAS PAR ESI-MS
– comparer les mécanismes de réassociation entre les dodécamères et les hexamères
– tester l’effet d’une chélation des cations divalents sur la réassociation
L’hémocyanine de Carcinus maenas est choisie pour cette étude en raison des données abondantes
existant pour cette espèce et de la possibilité d’obtenir des échantillons en quantité importante.
3.2 Manuscrit : Structural study of Carcinus maenas hemocyanin by supramolecular
ESI-MS : interaction with L-lactate and divalent cations
Les travaux de ce chapitre ont fait l’objet d’un manuscrit actuellement en cours de soumission.
Ce manuscrit est reproduit ici ; les références bibliographiques citées dans le texte ont été insérées
dans les références globales de la thèse.

3.2. MANUSCRIT : STRUCTURAL STUDY OF C. MAENAS HC BY ESI-MS 109
Structural study of Carcinus maenas hemocyanin by supramolecular
ESI-MS : interaction with L-lactate and divalent cations
Matthieu Bruneaux 1,2 , Peran Terrier 3,4 , Emmanuelle Leize 3 , Jean Mary 1,2 , François H. Lallier 1,2 ,
Franck Zal 1,2 *
1 UPMC Univ. Paris 06, UMR 7144, Equipe Ecophysiologie : Adaptation et Evolution Moléculaires,
Station Biologique de Roscoff, 29682 Roscoff, France
2 CNRS, UMR 7144, Station Biologique de Roscoff, 29682 Roscoff, France
3 CNRS-ULP, UMR 7177, Laboratoire de Dynamique et Structure Moléculaire par Spectrométrie
de Masse, Institut de Chimie, ISIS, 67083 Strasbourg, France
4 CNRS-UEVE, UMR 8587, Laboratoire Analyse et Modélisation pour la Biologie et l’Environnement,
Université d’Evry-Val d’Essonne, 91025 Evry, France
M.B. was funded by a MRT grant, n°18213-2005. P.T. was funded by an ANR grant, n°ANR-05-
MIIM-030-03 and an ATER grant from UEVE.
*Corresponding Author : F. Zal, Station Biologique de Roscoff, Place Georges Teissier, BP74,
29682 Roscoff cedex, FRANCE Phone : 0033 (0)298292309 Fax : 0033 (0)298292324 E-mail :
zal@sb-roscoff.fr
Running title : Structural study of C. maenas hemocyanin by supramolecular ESI-MS
Abbreviations : AcNH4, ammonium acetate ; DPG, D-2,3-diphosphoglycerate ; ESI-MS, electrospray
ionization mass spectrometry ; FA, formic acid ; MWC model, Monod-Wyman-Changeux
model ; SEC, size-exclusion chromatography ; TEA, triethanolamine

110 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC DE C. MAENAS PAR ESI-MS
Abstract
The interaction of L-lactate and divalent cations with Carcinus maenas hemocyanin has been
probed by electrospray ionization mass spectrometry in non-covalent conditions (supramolecular ESI-
MS). Carcinus maenas native hemocyanin in the hemolymph occurs mainly as dodecamers and to a
lesser extent as hexamers. A progressive acidification with formic acid after alkaline dissociation
resulted in the preferential recruitment of the two lightest subunits into light dodecamers, a molecular
complex absent from native hemolymph, in addition to regular dodecamers and hexamers. Addition
of L-lactic acid also induced the recruitment of these subunits, even at alkaline pH. A dodecamerspecific
subunit is needed to enable aggregation over the hexameric state. Experiments with EDTA
suggested the existence of different binding sites and association constants for divalent cations within
hexameric structures and at the interface between two hexamers. L-lactic acid specific interaction
with the lightest subunits was not inhibited by removal of the divalent cations.

3.2. MANUSCRIT : STRUCTURAL STUDY OF C. MAENAS HC BY ESI-MS 111
3.2.1 Introduction
Hemocyanin, the blue respiratory pigment responsible for oxygen transport in decapod crustaceans,
is a macromolecular complex comprised of 75 kDa subunits. These subunits can each reversibly
bind one dioxygen molecule between the two copper ions of their active site and they associate
into non-covalent complexes which can be hexamers (e.g. in isopods, krill, shrimps, prawns, spiny
lobsters), dodecamers (e.g. in brachyurans, lobsters, crayfishes, hermit crabs) and in some species
24-mers (e.g. in thalassinid shrimps) (Markl, 1986, Markl et Decker, 1992, Terwilliger, 1998). Hemocyanin
circulates as a freely dissolved protein in the hemolymph of the animals. Its functional
properties can be modulated by various effectors such as H+, divalent cations and organic ions (Truchot,
1992, Bridges, 2001). Among them, the L stereoisomer of lactate is an important allosteric
effector produced by the anaerobic metabolism of the animal, which can be driven by either environmental
or metabolic hypoxia (Truchot, 1980, Truchot et Lallier, 1992). Divalent cations and pH have
an effect both on the structure and on the properties of the complexes since most hemocyanins can be
dissociated under alkaline pH and by dialysis against EDTA (Herskovits, 1988).
Arthropod hemocyanins are useful models for studying allosteric regulation mechanisms. The
existence of several types of allosteric effectors and the occurrence of huge hierarchical quaternary
structures in some groups (e.g. 24-mers in arachnids, 48-mers in the horseshoe crab Limulus polyphemus
(Markl et Decker, 1992)) allow for investigation of allosteric mechanisms with different
molecular actors and using original models such as nested allostery (Decker, 1990, Menze et al.,
2005). In most decapods, an increase in lactate concentration increases the oxygen affinity of the
pigment (Truchot, 1992, Bridges, 2001, Truchot, 1980). However, some decapods exhibit low or no
sensitivity to lactate (e.g. thalassinid mud-shrimps (Taylor et al., 2000), the slipper lobster Scyllarides
latus (Sanna et al., 2004)), notably when the lifestyle becomes more terrestrial (Bridges, 2001, Morris
et Bridges, 1994). For one terrestrial species, Gecarcoidea natalis, a reverse lactate effect has been observed
(Adamczewska et Morris, 1998). The use of chemical analogs and the fact that D-lactate does
not affect O2 affinity suggested that lactate binds stereospecifically to a specific site of hemocyanin
(Johnson et al., 1984) and that the binding occurs at all four positions around the chiral carbon (Graham,
1985). For Callinectes sapidus hemocyanin, lactate titrations gave values of lactate dissociation
constant of 1.8 mM for the oxy-state and 2.2 binding sites per hexamer, and ultrafiltration techniques

112 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC DE C. MAENAS PAR ESI-MS
gave values of 3.2 mM for the dissociation constant and 2.8 sites per hexamer (Johnson et al., 1984).
For the spiny lobster Panulirus interruptus, purification of each subunit type and reassembly into homohexamers
showed that the sensitivity to lactate was subunit-dependent : some homohexamers were
sensitive whereas others were not (Johnson et al., 1987). However, in native hexamers as well as in
sensitive reassociated homohexamers, analysis of oxygen equilibrium curves showed that there was
approximately only one binding site per hexamer, evidencing that the specific site was not located
on a single subunit but was formed within the quaternary structure of the protein (Johnson et al.,
1987). For Homarus vulgaris, ultrafiltration and equilibrium dialysis using labelled ligands showed
that there were approximately 2 molecules bound per dodecamer, which is consistent with the finding
of one site per hexamer for Panulirus interruptus ; the same result was observed for urate but urate
and lactate binding sites were different and independent (Nies et al., 1992). Moreover, lactate does
not bind to hemocyanin in a cooperative way, suggesting that the conformational changes induced
by fixation on one site does not influence the other site (Nies et al., 1992). However, a small angle
X-ray scattering study (SAXS) of Homarus americanus hemocyanin along with electron microscopy
showed that upon addition of 10 mM lactate the two hexamers constituting the dodecamer got closer
by about 0.5 nm (Hartmann et al., 2001), thus implying that even local changes at the binding sites
may have a global effect on the quaternary structure of the protein. Isothermal titration calorimetry
performed on sensible and insensible hemocyanins revealed that insensible hemocyanins did not bind
lactate, whereas the sensible ones did (Taylor et al., 2000). A recent study of O2-dissociation curves
of Carcinus maenas hemocyanin reported the binding of 0.35 lactate ion per functional subunit, that
is to say 4 sites per dodecamer or 2 sites per hexamer (Weber et al., 2008). This is different from the
data from Homarus vulgaris and Panulirus interruptus but close to the results for Callinectes sapidus, a
brachyuran crab like Carcinus. In this context, the precise mechanism of lactate binding, the involved
amino-acids and the induced conformational changes remained to be determined.
Many studies have also demonstrated the crucial role of calcium and pH for hemocyanin structure
and function. Upon dialysis against EDTA to remove calcium and pH increase, complexes are dissociated
and O2-binding capacity is lost (Herskovits, 1988, Molon et al., 2000, Brenowitz et al., 1983,
Olianas et al., 2006). Some species show unusual stability against dissociation (Beltramini et al.,
2005). Usually, reassociation occurs upon return to physiological pH values and addition of calcium.
Divalent cations and pH are also known to modify hemocyanin oxygen-binding properties (Truchot,
1992, Bridges, 2001, Olianas et al., 2006, deFur et al., 1990, Andersson et al., 1982, Morimoto et
Kegeles, 1971).
In recent years, mass spectrometry (MS) has emerged as a new and potent tool for structural
analysis of protein complexes and protein interactions with various ligands (Chausson et al., 2004,
Sanglier et al., 2003, Zal et al., 2002, Bruneaux et al., 2008, Oldham et al., 2003, Robinson et al.,

3.2. MANUSCRIT : STRUCTURAL STUDY OF C. MAENAS HC BY ESI-MS 113
2007). The possibility of preserving the fragile non-covalent interactions through the electrospray ionization
(ESI) process has allowed probing quaternary structures of various assemblies and following
association and dissociation of non-covalent complexes and incorporation of small organic molecules
or inorganic ions (Potier et al., 1997, van Duijn et al., 2006, Tahallah et al., 2002, van den Heuvel
et al., 2004, Rogniaux et al., 2001, Levy et al., 2008). All these works are examples illustrating the
structural studies made possible by ESI-MS ; numerous works have successfully used the ESI source
since its development.
In this context, it was interesting to attempt using an ESI-MS approach to study the interaction
between L-lactate and Carcinus maenas hemocyanin and the effect of divalent cations on its structure.
C. maenas hemocyanin is the major protein found in the hemolymph of the crab and occurs mainly as
dodecamers and to a lesser extent as hexamers. pH, lactate and divalent cations are known to have an
effect on its properties (Truchot, 1980, 1975). Its constituting subunits were characterized by ESI-MS
in denaturing conditions and the complexes by ESI-MS in native conditions, as described in the study
by Sanglier and collaborators (Sanglier et al., 2003). In this paper, we expose an attempt to dissociate
the subunits at alkaline pH and to probe their potential association with L-lactate in non-covalent
conditions. An investigation of the influence of divalent cations on the reassociation of subunits was
also performed using EDTA.
3.2.2 Experimental procedures
Animal collection and hemocyanin sampling and purification
Carcinus maenas individuals were caught by baited traps in the intertidal zone in Roscoff, France,
and kept in running sea water at ambient temperature (salinity 35-35.4 , temperature 15-17.5°C).
Hemolymph was withdrawn with a syringe through the articular membrane of a walking leg and immediately
put on ice. Samples were centrifugated for 10 min at 10000 g to pellet cells and coagulated
proteins. For whole hemolymph study, the supernatant was recovered and frozen at -20°C. For purified
complexes study, dodecamers and hexamers were separated by size-exclusion chromatography (SEC)
using a Superose-6 10/300 GL column (Amersham Bioscience) at an elution rate of 0.25 ml/min with
a crustacean physiological saline buffer (500 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgSO4, 20 mM CaCl2,
50 mM Tris, pH 7.8, modified from (Chausson et al., 2004)). Collected fractions purity was assessed
with the same system. Purified samples were frozen at -20°C.
For preliminary analyses of hemocyanin in denaturing and non-covalent conditions, samples were
withdrawn from several individuals kept in running sea water under several salinity and oxygenation
conditions. For all dissociation and association experiments using triethanolamine (TEA), formic acid
(FA), L-lactic acid and EDTA, the whole-hemolymph samples were issued from the same individual

114 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC DE C. MAENAS PAR ESI-MS
and the purified complexes were issued from another single individual ; those samples were withdrawn
one day after catching the crabs.
Sample preparation for ESI-MS
All samples used for ESI-MS were desalted through concentration-dilution cycles using 10 kDa
Microcon (Millipore) prior to analysis. Typically, 30 µl of native hemolymph diluted in 470 µl 10 mM
ammonium acetate (AcNH4), pH 6.8 or 250 µl of purified sample (protein concentration about 1-
3 µg/µl) were first concentrated to almost dryness and then resuspended in 400 µl 10 mM AcNH4.
At least 10 successive similar concentration-dilution steps were performed in order to ensure that the
samples were correctly desalted prior to ESI-MS analysis. The samples were stored at 4°C in 10 mM
AcNH4 until analysis. The desalting was realised just prior to MS analysis and desalted samples for
non-covalent analysis were not kept more than 2 days at 4°C because of dissociation occurring upon
longer storage.
Non-covalent and denaturing ESI-MS
Mass spectrometry experiences were performed on a MicroTOF instrument (BRUKER Daltonics,
Bremen, Germany) equipped with an ESI source.
For non-covalent analysis, desalted samples were diluted in 10 mM AcNH4 at a final concentration
of approximately 1.5 µM (for 900 kDa dodecamers). The injection rate for the samples was
4 µl/min. The nebulization voltage was set to 5 kV, nebulization gas (N2) pressure was 1 bar, drying
gas flow was 4 l/min, source temperature was 200°C and the capillary exit voltage was set to 400 V.
The calibration was made using 1 mg/ml CsI in water/isopropanol (50 :50 volume). The acquisition
range was 500 to 20000 m/z. Spectra were smoothed using a Savitzky-Golay method and baseline
subtracted. Complexes masses were estimated using an in-built ruler (BRUKER DataAnalysis v3.2
software).
For denaturing analysis, desalted samples were diluted in a water/acetonitrile/formic acid mix
(H2O/ACN/FA 50 :50 :1 volume) at a final concentration of approximately 4 µM (for 75 kDa subunits).
The nebulization gas (N2) pressure was 0.3 bar, drying gas flow was 3 l/min, and the capillary
exit voltage was set to 160 V. Calibration was performed using myoglobin (SIGMA-ALDRICH).
Mass spectra were analysed using maximum entropy deconvolution (BRUKER DataAnalysis v3.2
software).
In the following, denaturing analysis refers to ESI-MS analysis in H2O/ACN/FA with classical
instrumental parameters. In these conditions, all non-covalent interactions are broken. Non-covalent
analysis refers to ESI-MS analysis in AcNH4 with "gentle" instrumental parameters. In this case, non-

3.2. MANUSCRIT : STRUCTURAL STUDY OF C. MAENAS HC BY ESI-MS 115
covalent interactions are preserved during the analysis, even if biochemical treatments can partially
dissociate the complexes before analysis.
Dissociation in TEA
For alkaline denaturation of hemocyanin, desalted samples were diluted in 10 mM AcNH4 with
various TEA concentrations (from 0.005 % to 0.05 % TEA in volume, pH 7.52 to 9.02 respectively)
and incubated for 15 min at ambient temperature before non-covalent ESI-MS analysis was performed.
Reassociation with formic acid
For acidic reassociation, desalted hemocyanin was first dissociated in 10 mM AcNH4, 0.03 %
TEA (pH 8.6) for 15 min at ambient temperature and then formic acid was added to a final concentration
of 0.001 % to 0.04 % (pH 8.48 to 4.22, respectively) ; the preparation was incubated for another
15 min before performing non-covalent ESI-MS analysis to allow for reassociation.
Effect of L-lactic acid
For investigation of L-lactic acid effect, desalted hemocyanin was first dissociated in 10 mM
AcNH4, 0.03 % TEA (pH 8.6) for 15 min at ambient temperature and then lactic acid was added to
a final concentration of 2 mM (L(+)-lactic acid, SIGMA-ALDRICH), along with TEA to counterbalance
the acidifying effect of lactic acid. After addition, the final TEA concentration ranged from
the original 0.03 % to 0.07 %, and pH values ranged from 5.89 to 8.58. The preparation was left to
incubate for 15 min at ambient temperature before non-covalent ESI-MS analysis.
Effect of chelation of divalent cations by EDTA
Divalent cations were removed using EDTA in order to investigate their structural role. Two
10 mM Na+-EDTA, 10 mM AcNH4 mixes were prepared with different pH, one with 0.11 % TEA
(approximative pH 7.5) and the other with 0.15 % TEA (approximative pH 9). A desalted total hemolymph
sample was diluted 20-fold in each of these mixes, concentrated on a 10 kDa Microcon filter,
diluted in the same EDTA mix again and then washed by 6 concentration-dilution steps in 10 mM
AcNH4, 0.005 % TEA and 0.05 % TEA respectively in order to remove the Na+ and EDTA salts
along with the chelated cations. Non-covalent analysis was performed at this step. Then, L-lactic acid
was added up to 2 mM final concentration with TEA to adjust pH either at 7.5 or 9 approximately and
the preparation was left to incubate for 15 min at ambient temperature before analysis.

116 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC DE C. MAENAS PAR ESI-MS
TAB. 3.1 – Subunit masses for Carcinus maenas hemocyanin obtained by ESI-MS
Subunit
name
m/z value for
the (17 H + )
peak
Mass obtained
by in denaturing
Average mass
Sanglier et al. ESI-MS (Da
(2003) (Da) a ±s.d.) b
Mass difference
Examples of
ESI-MS (Da) c denaturing ESI-MS
masses estimated between noncovalent
by non-covalent
and
(Da) d
n°1 n°2 n°1 n°2
Cm1 73931 73922 ±1.3 4360 74116 74090 194 168
Cm2 74049 74043 ±1.1 4368 74218 74207 175 164
Cm3 75088 75073 ±3.2 4418 75106 75089 33 16
Cm4 75161 75187 ±5.8 4426 75253 75214 66 27
Cm5 75234 75224 ±1.8 4435 75344 75355 120 131
Cm6* 75459 75449 ±0.9 4450 75684 75629 235 180
*Dodecamer specific subunit
a Nine masses were determined by Sanglier and collaborators ; the masses that were the closest to those we determined
are reported here
b Average masses and standard deviations are calculated from data for 14 different individuals ; the number of values for
each subunit varies from 9 to 35 depending on the occurrence of each subunit in different individuals and in purified
fractions for each individual
c These masses were calculated from the monomers charge-state distributions from two different experiments
d These differences were calculated using the average masses determined in denaturing conditions in this study ;
molecular masses of potential adducts in non-covalent conditions are for example 127.1Da (the two Cu of the active
site), 23Da (Na), 24.3Da (Mg), 40.1Da (Ca) and combinations thereof
3.2.3 Results
Preliminary analysis of Carcinus maenas hemocyanin
28 different hemolymph samples from 14 different male individuals issued from control or acclimation
experiments were analysed by ESI-MS in denaturing conditions. Six main subunits were
most frequently observed, of which one was only observed in the dodecameric fraction when analyses
were performed on SEC-separated, purified complexes. No covalently bound dimer was ever observed.
Table 3.1 presents the masses obtained in our study for these subunits and the nearest masses
obtained in a previous study by Sanglier and collaborators (Sanglier et al., 2003). In this previous
study, a total of nine subunits were identified by the authors with four of them exhibiting low intensity
peaks, the other five being identical to the subunits identified in our study.
Hemocyanin analysis by ESI-MS in non-covalent conditions produced two main charge-state distributions
corresponding to dodecameric and hexameric species (figure 3.3). The observed dodecamer
to hexamer ratio is similar to the one determined by SEC ; this confirms that the desalting steps do
not markedly alter the oligomerization equilibrium provided that the analysis is made just after desalting
(storage shorter than 2 days at 4°C). Some high-mass distributions can also be observed with a
lower intensity, corresponding to 18-meric and 24-meric complexes (up to 13 and 7 %, respectively).

3.2. MANUSCRIT : STRUCTURAL STUDY OF C. MAENAS HC BY ESI-MS 117
FIG. 3.3 – Mass spectrum of Carcinus maenas native hemolymph analysed in non-covalent conditions.
Spectra were acquired using individual whole hemolymph samples. Aggregation state, estimated
mass and m/z value for the main peak of each distribution are indicated. Insert : focus on the
10000 m/z area of a spectrum showing two overlapping distributions for the hexameric state. The
higher mass hexamer was observed only in one individual and is likely to be made of six 81 kDa
non-hemocyanin subunits (observed in denaturing conditions) (see the text for details).
SEC experiments coupled with light-scattering mass determination (not presented here - personal observation)
also revealed the presence of a slight amount of these high molecular-mass complexes. It
is worth noting that for one crab, two different distributions were observed for the hexamer (figure
3.3, insert) ; this crab also harbored an original subunit with a molecular mass of 80962 Da (data not
shown). The mass of the second hexameric species for this crab fits well with a complex made of
six such subunits. This original hexamer could be a non-hemocyanin protein such as cryptocyanin
which has a similar hexameric quaternary structure and is closely related to hemocyanin but cannot
bind dioxygen (Terwilliger et al., 2005). Further analysis is required to unambiguously identify this
protein.

118 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC DE C. MAENAS PAR ESI-MS
FIG. 3.4 – Alkaline dissociation of Carcinus maenas hemocyanin by TEA. Left part, mass spectra
of a whole hemolymph sample desalted in 10 mM AcNH4 with increasing quantities of TEA (0.005,
0.03 and 0.05 % TEA for pH 7.55, 8.55 and 9, respectively). m, monomers peaks, h, hexamer peaks
(450 kDa), d, dodecamer peaks (900 kDa), dl, light dodecamer peaks (885 kDa). Right part, successive
focuses on the monomers peak distributions. Six overlapping distributions can be observed. Masses
obtained in non-covalent and denaturing conditions for each subunit are compared in table 1.

3.2. MANUSCRIT : STRUCTURAL STUDY OF C. MAENAS HC BY ESI-MS 119
Alkaline dissociation of complexes by TEA
A native hemolymph sample was progressively dissociated in its constituting subunits by adding
increasing quantities of TEA (figure 3.4). Before addition of TEA, one main species is observed
and corresponds to a 900 kDa mass (dodecamer). A less intense signal is visible corresponding to a
hexamer mass around 450 kDa and a slight monomer signal is also visible. It can be noted that the
particular native sample shown here contains almost only dodecamers and only very few hexamers.
Experiments on SEC-purified dodecamers and hexamers are detailed later. Upon TEA addition, the
intensity of the dodecamer distribution decreases while the monomers peaks get more intense. A second
distribution with higher m/z values is observed ; precise charge-state assignment is difficult for
this due to the high mass of the complex. This distribution can correspond either to an 885 kDa or to
an 864 kDa mass. Given that no subunit of 864/12 = 72 kDa is observed in denaturing conditions, this
distribution can be identified unambiguously with the 885 kDa mass. This mass fits well with a dodecamer
reassociated from the lightest subunits (below 74 kDa) produced by alkaline dissociation. The
occurrence of this species before acidic reassociation suggests that a dynamic equilibrium between it
and the free subunits exists as soon as dissociation of the dodecamers begins. Relative abundance of
residual dodecamer after alkaline dissociation could vary slightly from one experiment to the other,
but a massive dissociation was always observed.
The monomer charge-state distributions can be examined to determine the different subunits
which are present during the course of the dissociation (figure 3.4). Six main charge-state distributions
are visible, corresponding to six subunits. The estimated masses are depicted in table 3.1. They
could vary slightly from one experiment to another, but were almost always superior to the masses
observed in denaturing conditions.
Acidic reassociation of subunits by formic acid
After alkaline dissociation of the complexes into their subunits, the preparation is acidified by progressive
addition of formic acid (figure 3.5). The presence of dissociated subunits at various stages
of the acidification process can be monitored by examining the distribution around m/z 4400, corresponding
to the monomers with a 17 H+ charge. When pH decreases from 8.55 to 7.5, a progressive
and partial reassociation into complexes is observed, mainly into light dodecamer (885 kDa) and dodecamer
(900 kDa) complexes. In the meantime, a progressive disappearance of the Cm1 and Cm2
peaks corresponding to the lightest monomers suggests that these subunits are preferentially recruited
for reassociation into complexes. When pH becomes strongly acidic (below the isoelectric point),
complexes are dissociated anew and all subunits peaks are visible again.

120 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC DE C. MAENAS PAR ESI-MS
FIG. 3.5 – Acidic reassociation of Carcinus maenas hemocyanin by formic acid. Left part, mass
spectra of a whole hemolymph sample dissociated in 10 mM AcNH4, 0.03 % TEA and acidified
with increasing quantities of formic acid (0, 0.004, 0.0045 and 0.04 % formic acid for pH 8.55, 7.94,
7.7 and 4.22, respectively). For pH 4.22, the isoelectric point is passed since a precipitate forms for
slightly higher pH values. m, monomers peaks, h, hexamer peaks (450 kDa), d, dodecamer peaks
(900 kDa), dl, light dodecamer peaks (885 kDa). Right part, focus for each mass spectrum on the
4300-4600 m/z range, in which the 17 H+ charged peak of each monomer is expected. The presence
or absence of each dissociated subunit can be determined by examining the peaks visible in this m/z
range.

3.2. MANUSCRIT : STRUCTURAL STUDY OF C. MAENAS HC BY ESI-MS 121
Reassociation by L-lactic acid
L-lactic acid also induced a partial reassociation of the subunits into complexes, as observed with
formic acid (figure 3.6). The main complex observed is the light dodecamer, with a relative intensity
higher that in the case of formic acid reassociation. A preferential mobilization of the lightest subunits
is observed again, which is consistent with the appearance of light dodecamer. While this preferential
recruitment is also observed with formic acid, there is an important difference since L-lactic acid
induces an immediate disappearance of the two light subunits (Cm1 and Cm2) as soon as it is added,
even if the pH is maintained over 8.4. This specific and immediate effect contrasts with the progressive
effect observed with formic acid. Cm1 and Cm2 remain undetectable at pH 5.9, over the isoelectric
point.
Experiments on purified complexes (dodecamers and hexamers)
Dissociation/reassociation experiments were performed on purified complexes, using formic acid
as the acidifying agent. Figure 3.7 presents the results obtained for purified dodecamers and hexamers.
In both cases, dissociation is induced at alkaline pH. When pH is returned to 7.5, dissociated
dodecamer subunits reassociate partially into dodecamers and light dodecamers (a very small signal
for hexamers is also visible) whereas dissociated hexamer subunits only reassociate up to hexamers
and no dodecamers is formed. Hexamers were not fully dissociated upon alkalinization ; however for
dodecamers also the efficiency of the dissociation could vary from one experiment to another.
Chelation of divalent cations by EDTA
When divalent cations are removed by EDTA washing after alkaline dissociation of whole hemolymph
preparation, returning to pH 7.52 by washing with a 10 mM AcNH4, 0.005 % TEA solution
induces a partial reassociation mainly into hexamers and to a lesser extent into dodecamers (figure
3.8). Interestingly, all dissociated monomers peaks disappear upon reassociation except for the 4450
peak corresponding to the subunit specific of the dodecameric assembly. Addition of L-lactic acid to
the sample after removal of EDTA still resulted in the disappearance of the lightest subunits peaks
(figure 3.8). No major dissociation into hexamers or monomers was observed upon addition of EDTA
at neutral pH (data not shown).

122 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC DE C. MAENAS PAR ESI-MS
FIG. 3.6 – Acidic reassociation of Carcinus maenas hemocyanin by lactic acid. Left part, first spectrum,
mass spectrum of a whole hemolymph sample dissociated in 10 mM AcNH4, 0.03 % TEA.
Second and third mass spectra, mass spectra of the dissociated hemocyanin treated with 2mM lactic
acid and with or without addition of a further 0.04 % TEA (pH 8.58 and 5.89, respectively). m, monomers
peaks, h, hexamer peaks (450 kDa), d, dodecamer peaks (900 kDa), dl, light dodecamer peaks
(885 kDa). Right part, focus for each mass spectrum on the monomer peaks m/z range.

3.2. MANUSCRIT : STRUCTURAL STUDY OF C. MAENAS HC BY ESI-MS 123
FIG. 3.7 – Alkaline dissociation and formic acid reassociation of purified Carcinus maenas hemocyanin dodecamers
and hexamers. Left part, mass spectra for purified dodecamers. Right part, mass spectra for purified hexamers. First row,
purified complexes in 10 mM AcNH4, pH 6.66. Second row, complexes dissociated by addition of 0.03 % TEA (pH 8.55).
Third row, complexes reassociated by addition of 0.0045 % formic acid (pH 7.7). Fourth row, complexes dissociated anew
by the addition of formic acid to a final concentration of 0.065 % (pH

124 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC DE C. MAENAS PAR ESI-MS
FIG. 3.8 – Alkaline dissociation and acidic reassociation of Carcinus maenas hemocyanin coupled with chelation of
divalent cations by EDTA. Whole hemolymph sample was washed by an EDTA mix (pH 9) as explained in the materials
and methods section and salts were then removed by washing with 10 mM AcNH4 containing TEA at various concentrations.
Left part, whole mass spectra, right part, focus in the monomer peaks m/z range. Spectra were acquired as follow :
first spectrum, washing with 0.05 % TEA (pH 9.02) ; second spectrum, washing with 0.005 % TEA (pH 7.52) ; third
spectrum, washing with 0.05 % TEA and addition of 2 mM lactic acid (pH 8.09) ; fourth spectrum, washing with 0.005 %
TEA and addition of 2 mM lactic acid (pH 7.35). m, monomers peaks, h, hexamer peaks (450 kDa), d, dodecamer peaks
(900 kDa), dl, light dodecamer peaks (885 kDa). On the third spectrum (pH 8.09, 2mM lactate), the hexamer peaks could
correspond to a classical hexamer and to a "light" hexamer.

3.2. MANUSCRIT : STRUCTURAL STUDY OF C. MAENAS HC BY ESI-MS 125
3.2.4 Discussion
Subunits masses in denaturing and non-covalent conditions
The masses observed in denaturing conditions are in good agreement with those previously published
by Sanglier and collaborators, also in denaturing conditions (Sanglier et al., 2003). The five
most abundant subunits observed in Sanglier’s study are part of the six subunits observed here.
In our study, a slight and variable difference is observed between masses estimated from denaturing
and from non-covalent conditions. The higher masses estimated in non-covalent conditions can
be accounted for by the occurrence of various adducts to the dissociated subunits in these conditions,
such as alkaline ions, divalent cations or unremoved copper ions in the active site. These adducts are
permitted by the unusual conditions used here, namely an alkaline dissociation observed in ESI-MS
conditions preserving the remaining non-covalent interactions during the analysis. Desolvation conditions
also differ between ESI-MS in denaturing and in non-covalent conditions, hence the amount of
the remaining solvent is likely to be different.
Complexes masses and abundances in non-covalent conditions
The use of ESI-MS in non-covalent conditions enables to acquire signal for high-molecular mass
non-covalent complexes in their native state (dodecamers and hexamers). The good agreement between
dodecamer to hexamer ratios from ESI-MS and SEC confirms that our supramolecular ESI-MS
data are relevant for studying complexes occurring in solution. For occurrence of 18-mer and 24-mer,
aggregation is known to be possible during the ESI process but a slight fraction of 18-mer and 24-
mer is also visible by SEC coupled with a light-scattering system (personal observation for Carcinus
maenas hemocyanin ; Beltramini et al. (2005) for Penaeus monodon hemocyanin). However, 24-mers
can be detected from purified 12-mers in figure 5. This is unlikely to come from a contamination
during the purification step since no 18-mer is visible, but must be due to aggregation of the sample
during preparation or during the ESI-MS process. Whatever the extent of aggregation process is for
these high-mass complexes (18-mer and 24-mer), their concentration is always very low compared to
dodecamer and hexamer. Even if they may really exist in the hemolymph of the animal and not be
formed during the sampling and storage, they are probably of very little physiological significance
due to this low concentration.
In Sanglier and collaborators study, the hexamer peak intensity was higher than the dodecamer
peak intensity, which is in contradiction with our results (figure 3.3). We found a lower signal for
hexamers ; this is in accordance with the relative proportions found by SEC, with a typical hexamer
abundance of 5 to 20 % of whole hemocyanin in native hemolymph. The difference with Sanglier’s
study must be due to storage in liquid nitrogen whereas our samples were kept at -20°C, since partial

126 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC DE C. MAENAS PAR ESI-MS
dissociation of the higher complexes is known to occur at low temperatures (39).
Alkaline dissociation and reassociation (native and purified)
Crustacean hemocyanin dissociation is known to be induced by high or low pH (Herskovits, 1988),
with varying stability ranges depending on the species : for example, contrary to other crustacean
hemocyanins, Penaeus monodon hemocyanin has been shown to have a high stability against dissociation
at high pH and in the presence of EDTA (Beltramini et al., 2005). For other crustaceans,
various experiments have shown that alkaline dissociation was reversible and that complexes could be
reassociated from whole subunit sets or from selected purified subunits (Johnson et al., 1987, Dainese
et al., 1998). In our study the dissociation is induced by alkaline pH and yields separated subunits
from the complexes. The dissociation efficiency could vary from one experiment to another, and part
of the complex could resist the dissociation ; however most of the time the dissociation was almost
complete, showing that ESI-MS can be used to monitor a process taking place in solution and that the
different aggregation states present in the aqueous phase are likely to be conserved during the ionization
and analysis processes. Previous studies (Dainese et al., 1998, Chantler et al., 1973) also showed
the dissociating effect of EDTA and alkaline pH on a close species (Carcinus aestuarii = Carcinus
mediterraneus).
The reassociation by returning to a more neutral pH could also be monitored by ESI-MS. Complete
reassociation was never observed and the fact that the lightest subunits are reassociated first, as
evidenced by the monomers peaks and by the occurrence of the light dodecamer, shows that the reassociation
process after dissociation is not exactly identical to the one occurring naturally. A dynamic
equilibrium between subunits and light dodecamer is also observed (figure 3.4). In several species,
homohexamers could be reassociated from purified subunits but reassociation into dodecamers necessitated
the occurrence of specific subunit types (Stöcker et al., 1988). However, it was suggested in a
study of Paralithodes camtschaticae hemocyanin that homododecamers could be formed for this species
but this case is original because dodecamers and hexamers seem to exist in a chemical equilibrium
(Molon et al., 2000). Here we cannot distinguish if two light homododecamers are produced since the
distributions would overlay, but the fact that the purified hexamers cannot reassociate into dodecamers
evidences that the dodecamer specific subunit is compulsory to form dodecamers. Hence, we should
have a simultaneous association of the light subunits and of the dodecamer-specific subunit when
reassociating dodecamers from alkaline dissociation. This implies different association constants and
different interactions between subunit types.

3.2. MANUSCRIT : STRUCTURAL STUDY OF C. MAENAS HC BY ESI-MS 127
Specific effect of L-lactate
L-lactic acid addition has the same effect that acidification by formic acid since the same light
subunits are mobilized first and light dodecamers are formed first. However, the fact that lactic acid
has an effect even at a high pH where formic acid has no effect yet shows a specific effect of the
molecule. Moreover, it triggers the formation of light dodecamers much more than classic dodecamers,
enabling a specific stabilization/association of this form. Based on the previously published data
suggesting the occurrence of a site emerging from the association of several subunits and the specificity
of some subunits for lactate sensitivity in Panulirus interruptus (Johnson et al., 1987), it can
be hypothesized that these two lactate-sensitive subunits interact together to form a lactate-binding
site within the quaternary structure of the dodecamer. Another possibility is that each of the lactatesensitive
subunit is self-sufficient for the formation of a lactate binding site, and that two types of
sites involving one or the other light subunit exist within the quaternary structure of the dodecamer.
The interaction of L-lactate with the binding site could stabilize the subunits association and hence
explain the complexes formation even at high pH. For Carcinus maenas, 4 such lactate binding sites
would exist per dodecamer according to Weber and collaborators (Weber et Fänge, 1980). However
our data are not of a type helping to resolve the number of binding sites per dodecamer. As noted by
Graham and collaborators (Graham, 1985), the existence of a binding site arising from the quaternary
structure of the complex and not from the tertiary structure of a single subunit would be similar to the
organophosphate binding site of vertebrate tetrameric hemoglobin.
Effect of chelation of divalent cations
Divalent cations are known to have both functional and structural roles in hemocyanins (Bridges,
2001, Truchot, 1975). Here, the reassociation of subunits into complexes is still possible after alkaline
dissociation and chelation of the divalent cations by EDTA but the reassociation tends to stop at the
hexamer level, and at least part of the dodecamer-specific subunit remains unassociated. The incorporation
of the specific subunit must involve lower association constants or need more cations that the
rest of the assembly process since Ca2+ and Mg2+ are removed or at least severely depleted upon
chelation by EDTA. The dodecamer formation process can be limited either by lower incorporation
of the specific subunit in hexameric assemblies or by a lower rate of hexamers association into dodecamers
even with the specific subunit incorporated within the hexameric structure. As underlined by
Stöcker and collaborators, the inter-hexamer link varies between species : it can be an ionic bond with
divalent cations as for Homarus americanus or a disulfide linked dimer as for Astacus leptodactylus
and Cherax destructor (Markl et Decker, 1992, Stöcker et al., 1988, Marlborough et al., 1981). The
same group also suggested that subunits could substitute during the hexamer formation due to homo-

128 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC DE C. MAENAS PAR ESI-MS
TAB. 3.2 – Association constants and number of sites for calcium binding with hemocyanin
High-affinity sites
Species K Ca (M −1 ) number
of sites
per
hexamer
Low-affinity sites
K Ca (M −1 )
number
of sites
per
hexamer
pH
references
Panulirus interruptus 1×10 4 50 7.6 Kuiper et al. (1979)
Panulirus interruptus 3×10 4 1 1-5×10 3 3-17 7.0 Andersson et al. (1982)
Callinectes sapidus 4-9.1×10 4 2.4-3 2-10×10 2 14-42 Brouwer et al. (1983)
Callinectes sapidus 7.1×10 2 1.6-2 a 7.01 Johnson et al. (1988)
Callinectes sapidus 3.3 ×10 2 3.5-5.4 a 7.55 Johnson et al. (1988)
Scyllarides latus 5.6×10 4 1.3 7.0 Sanna et al. (2004)
a The number of sites calculated in this study corresponds only to oxygen-linked binding sites and not to the total number
of binding sites ; the difference with results from Brouwer and collaborators led the authors to the conclusion that many
of the calcium binding sites did not affect oxygen binding
logous interaction sites between them whereas some specific interactions between precise subunits
could be needed to form the dodecamer, hence explaining the reassociation limited to hexamers. In
Carcinus maenas hemocyanin, the interactions between hexamers must be ionic since no covalentlybound
dimer can be found. The study of the hemocyanin of Paralithodes camtschaticae by Molon and
collaborators (Molon et al., 2000) also showed that after dialysis against EDTA, dodecamers were dissociated
into hexamers. However, the hemocyanin of this anomuran exists as a chemical equilibrium
between the two forms (dodecamers and hexamers) in native conditions and homododecamers and
homohexamers can be formed from one purified subunit type. In this case, one type of monomer is
able to form all the interactions needed to form both forms. The fact that dissociated hexamers cannot
reassociate into dodecamers in our study implies that for Carcinus only some specific monomers are
able to establish the interactions needed for the dodecamer assembly.
Typically, two different types of calcium-binding sites with high and low affinities are observed for
crustacean hemocyanins (table 3.2) (Sanna et al., 2004, Molon et al., 2000, Andersson et al., 1982) and
in the case of Andersson’s study Ca2+ and Mg2+ were shown to have similar affinities for the binding
sites. There are usually a few sites with high affinity (1 to 3 sites per hexamer) and numerous with a
10 to 100-fold lower affinity (1.6 to 42 sites per hexamer). Given the physiological range of calcium
concentration, the sites with the highest affinity are always saturated and would rather play a structural
role while the sites with the lowest affinity would have a modulating effect on oxygen affinity since
their saturation can vary depending on the calcium concentration in the hemolymph (Andersson et al.,
1982, Johnson et al., 1988). It is likely that the structural calcium and magnesium ions bound to the
high-affinity sites are retained throughout the desalting process while the others divalent cations and

3.2. MANUSCRIT : STRUCTURAL STUDY OF C. MAENAS HC BY ESI-MS 129
Na+ ions are removed (consistent with a 100-fold lower affinity of hemocyanin for Na+ (Andersson
et al., 1982)). Since no EDTA effect is observed here without prior alkaline dissociation, these sites
must be located at the interface between different subunits (Hazes et al., 1993) and be accessible to
chelation by EDTA only after separation of the subunits. The reassociation into hexamers rather than
dodecamers after removal of the structural cations can indicate that less cationic bridges are needed
between subunits within a single hexamer than between two hexamers implicated in a dodecamer.
Another possibility is the existence of some intra-hexamer sites which would retain divalent cations
with a very high affinity. The fact that the specific effect of L-lactate is not inhibited by EDTA shows
that no low-affinity bound divalent cations are necessary for the direct interaction between lactate and
hemocyanin.
3.2.5 Conclusion
Crustacean hemocyanin is a very complete model for the study of structural and functional properties
of respiratory pigments and more generally allosteric proteins. The multimeric structure made
of functionally different yet similar subunits and the diversity of effectors and of their effect allow
for numerous biochemical issues to be addressed. Here, we used non-covalent ESI-MS to probe the
structural effects of L-lactate and divalent cations on Carcinus maenas hemocyanin. The specific interaction
of L-lactate with 2 subunits and its stabilizing effect have been evidenced, as well as the role
of divalent cations for multimeric assembly. The question of the precise structure of the binding site
of L-lactate remains to be solved. The specificity of interaction with some subunits, the symmetry of
the quaternary structure and the L-lactate asymmetry are to be considered (Johnson et al., 1984). The
fact that sensitive homohexamers only harbor one site and that the number of observed sites per hexamer
is about two for brachyuran crabs suggests that the sites are located on the three-fold axis of the
hexamer, and hence possess the same symmetry. How does the binding between such a symmetric site
and a chiral ligand occur ? The site may present three potential positions for lactate binding and the
binding of one molecule on one site would prevent the binding at the other sites by steric hindrance.
Another possibility is that the binding site is stabilized in an asymmetric conformation when L-lactate
binds to it. Arnone showed for human hemoglobin that the crystallographic map of the protein with
the asymmetric ligand D-2,3-diphosphoglycerate (DPG) showed the same non-crystallographic dyad
axis as the map for the protein alone, and deduced that the binding of DPG occurred in two symmetric
orientations related by a 180° rotation (Arnone, 1972). More recent studies with lower-salt crystals or
using 31P nuclear magnetic resonance in solution showed that the binding site of DPG was actually
asymmetric in the presence of the ligand (Richard et al., 1993, Pomponi et al., 2000). Molecular dynamics
simulations also suggested that a dynamic heterogeneity existed in the hemoglobin tetramer

130 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC DE C. MAENAS PAR ESI-MS
and that DPG influences the tertiary states explored by the protein (Laberge et Yonetani, 2008). A similar
mechanism can be postulated for hemocyanin, with the occurrence of a dynamic heterogeneity
influenced by the presence of effectors such as oxygen and lactate, resulting in a stabilized asymmetric
binding site when L-lactate is effectively bound. Performing studies similar to those made on
hemoglobin and DPG with hemocyanin and L-lactate would help to test this hypothesis.
It has been showed that the oxygenated Hc hexamer of Panulirus interruptus has a reduced channel
along the three-fold axis compared to the deoxygenated form (Haas et al., 1993). Using the simple
Monod-Wyman-Chnageux (MWC) model for Carcinus maenas Hc dodecamer, Weber and collaborators
showed that L-lactate increases O2 affinity in part by shifting the allosteric equilibrium towards
the high-affinity R state (Weber et al., 2008). From these data it can be suggested that the potential
binding of lactate in the reduced central channel could stabilize the oxygenated R conformation. Such
a hypothesis must be considered with care and at the hexamer scale, since SAXS studies of the Hc dodecamer
of Homarus americanus have showed that the oxygenated dodecamer exists in two different
forms, the one without lactate and the one in the presence of lactate with the two hexamers closer
by 0.5 nm. In this case the simple MWC model is not longer relevant and nested allostery must be
considered (Hartmann et al., 2001).
It would also be of interest to perform studies similar to those conducted here using hemocyanin
from terrestrial crabs or mud shrimps with little or no lactate effect, and to test the effect or other
effectors such as urate or D-lactate.
Acknowledgments :
The authors would like to thank their academic structures (CNRS, UPMC, ULP) for supporting
their work. We would also like to thank the people from the Service Mer et Observation (Station
Biologique de Roscoff) for supplying the Carcinus maenas specimens.

3.3. BILAN ET PERSPECTIVES 131
3.3 Bilan et perspectives
Les études présentées dans ce chapitre ont permis de mettre en évidence l’interaction spécifique
du L-lactate avec les deux sous-unités les plus légères de l’Hc de Carcinus maenas. La liaison du L-
lactate sur chacune de ces sous-unités isolées n’a pas été observée ; le site de fixation est plutôt formé
par la structure quaternaire de l’Hc, au niveau de l’axe de symétrie d’ordre 3 des hexamères. Ainsi
la fixation du L-lactate à l’Hc de Carcinus maenas fait intervenir à la fois des sous-unités spécifiques
avec lesquelles il interagit et la structure quaternaire globale du complexe.
Le rôle central des cations divalents dans l’assemblage des dodécamères a également été mis en
évidence : l’incorporation de la sous-unité spécifique du dodécamère est inhibée par la chélation des
ions divalents et l’assemblage est essentiellement limité à la forme hexamèrique. Les interactions
entre les sous-unités et les cations divalents impliquées dans la formation des hexamères sont différentes
de celles impliquées dans la formation des dodécamères.
Ces résultats fournissent des informations sur les modalités de l’interaction entre le L-lactate et
l’hémocyanine mais ne permettent pas de déterminer les acides aminés formant le site actif ni les
changements structuraux provoqués par la fixation du L-lactate. Ces données seraient intéressantes
pour comprendre de quelle manière la liaison du L-lactate augmente l’affinité du pigment pour l’oxygène.
La cristallisation d’un complexe d’Hc en présence de L-lactate pourrait donner des informations
sur la localisation précise du site actif mais peut se révéler difficile à mettre en oeuvre. Une approche
en cryomicroscopie électronique pourrait permettre de reconstruire le volume du complexe en l’absence
et en présence de L-lactate et d’observer les changements résultant de la fixation du L-lactate.
Le chapitre suivant présente des travaux réalisés selon cette méthode.

132 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC DE C. MAENAS PAR ESI-MS

Chapitre 4
Etude de la plasticité phénotypique de l’Hc
de Carcinus maenas
133

134 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS
L’hémocyanine des Crustacés présente une grande plasticité fonctionnelle grâce à l’existence
de nombreux effecteurs physiologiques pouvant moduler les propriétés de liaison à l’oxygène des
pigments. Ces mécanismes représentent une plasticité liée à des facteurs extrinsèques au pigment.
L’existence de multimères non-covalent formés de différents types de sous-unités rend possible une
grande plasticité combinatoire qui peut être associée à des changements d’expression des sous-unités.
Ces mécanismes peuvent également modifier les propriétés fonctionnelles des Hcs et constituent une
plasticité phénotypique intrinsèque du pigment. Dans quelle mesure ces mécanismes peuvent-ils être
impliqués dans l’adaptation à court terme chez Carcinus maenas ?
4.1 Introduction : la plasticité phénotypique des Hc de Crustacés
Les Hc de Crustacés présentent une très grande diversité inter et intra-spéficique de sous-unités,
ainsi que des variations des abondances des complexes. Ces variations peuvent avoir des origines
évolutives (entre les espèces, les populations) ou adaptatives (dans une même espèce, entre individus
exposés à différentes conditions environnementales). Le rôle de l’hétérogénéité moléculaire de l’Hc
dans la plasticité adaptative des Crustacés a été récemment revue par Giomi et Beltramini (Giomi et
Beltramini, 2007).
4.1.1 La plasticité interspécifique
Du point de vue des complexes, il existe deux grands groupes d’espèces : celles présentant à la
fois des dodécamères et des hexamères d’Hc, les dodécamères étant généralement majoritaires (Brachyoures,
Homards, Ecrevisses, Paguridés), et celles présentant presque uniquement des hexamères
(Isopodes, Krill, Crevettes, Langouste) (Markl, 1986, Markl et Decker, 1992, Terwilliger, 1998). La
répartition taxonomique de ces assemblages peut être corrélé au moins partiellement avec les 3 grands
types immunologiques de sous-unités α, β et γ et avec l’histoire évolutive des taxons (Markl, 1986).
De nombreuses études ont également montré que la réassociation de dodécamères à partir de monomères
purifiés nécessitait en général la présence de certaines sous-unités indispensables (Stöcker et
al., 1988).
La diversité des sous-unités varie grandement d’une espèce à l’autre. De 3 à 7 sous-unités différentes
sont souvent observées. Des études ont montré qu’il n’existait pas de relation simple entre
la diversité des sous-unités au sein d’une espèce et sa position phylogénétique (Hodgson et Spicer,

4.1. INTRODUCTION : LA PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DES HC DE CRUSTACÉS 135
2001). Par contre, des espèces très proches peuvent présenter des profil similaires (Giomi et al., 2007).
A l’inverse, des espèces cryptiques ou en cours de spéciation peuvent être différenciées par leur profil
d’Hc en gel natif (Mangum, 1996, Mangum et McKenney, 1996).
4.1.2 La plasticité intraspécifique
Au sein d’une même espèce, des profils de sous-unités différents ou des proportions variables des
complexes peuvent être observées. Ces variations peuvent être liées au stade de développement de
l’individu, à son sexe, à son état physiologique (mue), aux conditions environnementales (Terwilliger,
1998, Giomi et Beltramini, 2007). Des études récentes d’expression de gènes permettent une étude
fine de la régulation des gènes de la famille des Hcs (Brouwer et al., 2004, Brown-Peterson et al.,
2008, Terwilliger et al., 2006, Brouwer et al., 2007).
Plasticité intrinsèque : développement, sexe et mue
Il a été montré chez Cancer magister que différents types de sous-unités étaient exprimées au
cours du développement : 4 types sont présents chez la larve mégalope et 6 chez l’adulte. Ces Hcs
ont des affinités intrinsèques différentes ; il a été proposé que ces différences d’affinité permettaient
de maintenir une affinité identique dans l’animal sous l’effet des différentes concentrations de Mg 2+ ,
qui varient entre la larve et l’adulte (Terwilliger et Brown, 1993, Terwilliger et Terwilliger, 1982,
Brown et Terwilliger, 1998, Durstewitz et Terwilliger, 1997, Terwilliger et Dumler, 2001) (chez Cancer
productus Wache et al. (1988)). Des études similaires portant sur la production séquentielle des
différents profils de sous-unités chez Homarus americanus ont également été réalisées (Giomi et
Beltramini, 2007). Une expression régulée au cours du développement est également observée pour
l’hémoglobine des Vertébrés (passage de l’hémoglobine foetale à l’hémoglobine adulte après la naissance).
Des différences liées au sexe de l’animal peuvent aussi exister. Cela a notamment été montré chez
la Langouste (Bellelli et al., 1988).
Des changements de composition ont également été observés en relation avec le cycle de mue,
notamment chez C. maenas et C. magister : une protéine proche de l’Hc, la cryptocyanine, est produite
avant la mue puis mobilisée lors de la mue (Truchot, 1978, Terwilliger et al., 2005). Des changements
ont également été observés chez Astacus leptodactylus (Giomi et Beltramini, 2007).
Plasticité extrinsèque ou adaptative : environnement
La plasticité des Hcs de Crustacés peut également être mise en jeu dans des adaptations à l’environnement.
Le crabe Callinectes sapidus a été beaucoup étudié ; la composition de son Hc varie

136 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS
suivant les conditions d’oxygénation et de salinité du milieu et conduit à des proportions différentes
de complexes, eux-mêmes présentant des affinités différentes pour l’oxygène. Des individus transférés
d’une condition à une autre modifient leur profil d’Hc, démontrant la nature phénotypique de
ces adaptations (Mangum, 1994, Mangum et Rainer, 1988, deFur et al., 1990, Mangum et al., 1991,
Rainer et al., 1985). Des variations saisonnières ainsi que liées à la température ont été observées chez
la Langouste (Bellelli et al., 1988, Condó et al., 1991). Chez l’amphipode estuarien Chaetogammarus
marinus, une exposition à une eau hyposaline induit en 2 jours un changement de l’abondance
d’une sous-unité et de l’affinité pour l’oxygène (Spicer et Hodgson, 2003). Des réponses à une hypoxie
environnementale pendant le développement au niveau de la composition en sous-unités des
hémoglobines des Branchiopodes Artemia, Daphnia magna et Triops longicaudatus ont également
été observées (Terwilliger et Ryan, 2001, Zeis et al., 2004, Guadagnoli et al., 2005). Ces réponses
sont réversibles chez D. magna et Artemia mais pas chez T. longicaudatus.
Les proportions des complexes pouvant dépendre de la composition en sous-unité, il a été montré
chez certaines espèces que les variations des profils de sous-unités induisait une modification des proportions
des complexes. Des modifications des proportions de complexes en réponse à une acclimatation
à différentes températures ont été mises en évidence sans être corrélées avec des changements
de composition en sous-unités chez Astacus leptodactylus ; la proportion d’hexamères augmente avec
la température et les hexamères sont plus affins pour l’oxygène que les dodécamères (Decker et Foll,
2000).
Différentes sous-unités au sein d’une même espèce peuvent avoir des propriétés différentes. En
plus des travaux montrant un changement de la composition en sous-unité et un changement d’affinité
sur l’Hc native, des expériences de réassociation de complexes à partir de sous-unités purifiées ont
montré que les sous-unités avaient des affinités pour l’oxygène différentes ainsi que des sensibilités
aux effecteurs différentes (exemple des sous-unités sensibles ou non à l’effet du L-lactate, Johnson et
al. (1987)).
Les changements de concentration ou de composition de l’Hc peuvent avoir lieu à différentes
échelles de temps. Ils sont saisonniers chez la Langouste et journaliers chez le Krill chez lequel l’Hc
est consommée pendant la période à plus forte profondeur, plus pauvre en nourriture (Bellelli et al.,
1988, Spicer et Strömberg, 2002). De manière générale, la réponse à un changement de conditions
environnementales semble activée rapidement (de 1 à 4 jours après le début du stimulus) (Giomi et
Beltramini, 2007).
Plus récemment l’expression de gènes ou de famille de gènes dans des situations de stress physiologiques
a été suivie par hybridation soustractive (SSH), par PCR quantitative, par macroarrays et
microarrays (Brouwer et al., 2004, Brown-Peterson et al., 2008, Terwilliger et al., 2006, Brouwer et
al., 2007). Des travaux ont permis de montrer la diminution de la transcription de l’Hc après 5 jours

4.2. OBJECTIFS DE L’ÉTUDE 137
en hypoxie chez Callinectes sapidus alors que la concentration d’Hc augmente dans l’hépatopancréas
(montré par Western Blot), ce qui pourrait être dû à une augmentation rapide de l’expression d’Hc
puis à une diminution de sa transcription lors du passage à un métabolisme anaérobie alors que les
protéines ne sont pas encore dégradées (Brouwer et al., 2004). Chez Palaemonetes pugio, l’hypoxie
induit une augmentation de l’expression d’Hc après 3 jours avant de revenir à une expression normale
(Brouwer et al., 2007, Brown-Peterson et al., 2008).
4.1.3 Bilan
La plasticité phénotypique des Hcs de Crustacés joue un grand rôle dans les capacités d’adaptations
de ce groupe et dans la colonisation de milieux très différents. Une grande variabilité de fonction
et de structure permet d’une part à une espèce de s’adapter à différentes conditions environnementales
(variations saisonnières par exemple), et d’autre part de coloniser de nouvelles niches, ce qui
peut conduire à des événements de spéciation.
Quand la plasticité phénotypique des Hcs est considérée d’un point de vue physiologique, deux
échelles existent : l’adaptation à long terme qui correspond à la sélection de certaines propriétés structurales
et fonctionnelles de l’Hc d’une espèce au cours de l’évolution, en relation avec ses conditions
de vie, ou l’adaptation à court terme à l’échelle d’un individu confronté à différents environnements et
présentant des réponses adaptatives rapides. Les deux niveaux peuvent être liés dans la mesure où une
forte plasticité à court terme peut permettre, en bordure d’aire de répartition ou de niche, de coloniser
de nouveaux milieux à long terme.
4.2 Objectifs de l’étude
Les adaptations respiratoires à court terme mises en jeu chez Carcinus maenas lors d’un stress
environnemental sont relativement bien connues au niveau anatomique et fonctionnel (ventilation,
circulation), hémolymphatique (pH, concentrations des effecteurs) et métabolique (consommation
d’oxygène). Des travaux réalisés par Burnett ont déjà montré une différence d’affinité intrinsèque de
l’Hc de C. maenas entre des individus du Maine (USA) et d’Arcachon (France) (Burnett et Mangum,
1991). Cette différence est-elle due à une réponse des individus à des conditions différentes et seraitelle
réversible en conditions contrôlées ou bien s’agit-il d’une divergence génétique au niveau de l’Hc
entre les deux populations ?
L’objectif des travaux de ce chapitre est de déterminer si la plasticité phénotypique à court terme
est un mécanisme mis en jeu dans l’adaptation de C. maenas au milieu hypervariable de l’estran.
La démarche choisie consiste à acclimater des individus à différentes conditions expérimentales afin

138 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS
de déterminer si des changements de structure de leur hémocyanine sont induits par les différentes
conditions.
Les premiers travaux présentés sont des expériences préliminaires réalisées sur des échantillons
d’hémolymphe de crabes acclimatés à différentes conditions de salinité, les échantillons ayant subi
une congélation à -80°C. La seconde partie consiste en l’acclimatation de crabes à différentes conditions
de salinité et d’oxygénation et à l’étude des variations individuelles grâce à des prélévements
appariés sur les même crabes avant et après acclimatation. Enfin, la troisième partie présente des
analyses réalisées sur des individus prélevés dans un estuaire et exposés naturellement à un habitat
hyposalin afin de déterminer si des effets de l’environnement existent dans le milieu naturel.
4.3 Matériels et méthodes communs
Les méthodes d’analyse utilisées pour l’ensemble de ce chapitre sont présentées ici. Certaines
méthodes sont décrites dans d’autres parties de la thèse ; dans ce cas il est fait référence à la partie en
question. Les démarches utilisées pour chaque étude du chapitre sont présentées au début de chaque
étude.
4.3.1 Prélévement d’hémolymphe sur les crabes
L’hémolymphe est prélevée à l’aide d’une seringue hypodermique au niveau de la membrane
articulaire des pattes locomotrices, à leur jonction avec le céphalothorax, sur la face dorsale. Un sinus
branchial situé à cet endroit permet de prélever facilement une quantité importante d’hémolymphe.
Les échantillons sont conservés sur glace pendant le prélévement puis immédiatement centrifugés
pendant 10 min à 10000 trs/min, à 4°C. Le surnageant est ensuite récupéré et conservé à 4°C ou
congelé pour utilisation ultérieure.
4.3.2 Dosage de protéine
Les protéines totales ont été dosées en utilisant le réactif de Bradford (Biorad) et en réalisant une
gamme étalon à partir de BSA (Sigma).
4.3.3 Chromatographie et MALLS
La chromatographie liquide d’exclusion de taille (SEC) a été utilisée pour caractériser les composants
présents dans l’hémolymphe et pour purifier les différents complexes d’Hc (dodécamère,
hexamère). Les protocoles utilisés sont expliqués dans les parties 3.2.2 (page 113) et 5.4.2 (page

4.3. MATÉRIELS ET MÉTHODES COMMUNS 139
186). Briévement, les chromatographies sont réalisées dans un tampon 500 mM NaCl, 10 mM KCl,
30 mM MgSO4, 20 mM CaCl2, 50 mM Tris, pH 7,8 sur une colonne Superose 6 10/300 (Amersham)
à un débit de 0,25 à 0,5 ml/min. 50 µl d’échantillon natif dilué au 1/40 sont injectés pour les analyses
et environ 3 à 5 mg de protéine sont injectés pour les purifications.
La diffusion de lumière multi-angulaire (Multi-Angular Laser Light Scattering, MALLS) a été
utilisée pour déterminer la masse des complexes analysés à l’aide d’un appareil Dawn EOS (Wyatt
Technology Corp.,Santa Barbara) et du logiciel Astra 4.90.08.
4.3.4 Electrophorèse sur gel d’acrylamide
SDS-PAGE
Les électrophorèses en conditions dénaturantes sont réalisées sur gel SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate
polyacrylamide gel electrophoresis) (système mini-protean, Biorad). Un gel de compression
(stacking ou upper) à 4 % d’acrylamide et un gel de séparation (resolving ou lower) à 7 % sont utilisés,
contenant 0,1 % de SDS. Les échantillons sont dilués dans un tampon Tris HCl pH 6,8 125 mM,
4 % SDS, 20 % glycerol et 10 % β-mercapto-éthanol puis incubés à 95°C pendant 90 s avant dépôt.
La coloration après migration est réalisée au bleu de Coomassie.
PAGE natif
Les électrophorèses en conditions natives sont réalisées avec un gel de compression à 4 % et
un gel de séparation à 7 %. Les échantillons sont dilués (dilution au moins 1/2) dans un tampon de
dissociation EDTA 50 mM, Tris HCl pH 9,1 50 mM, 30 % glycerol pendant 10 min avant dépôt. Pour
suivre la migration, 10 µl d’une solution de bleu de bromophénol peuvent être ajoutés dans chaque
échantillon. La coloration après migration est réalisée au bleu de Coomassie.
4.3.5 Spectrométrie de masse
Les analyses en spectrométrie de masse sont réalisées par ESI-MS en conditions dénaturantes
et non-covalentes (ESI-MS supramoléculaire). Elles ont été réalisées avec Peran Terrier et Emmanuelle
Leize dans l’équipe LDSM2 à Strasbourg (UMR 7177, CNRS-ULP). Le protocole utilisé est
détaillé dans les parties 3.2.2 (page 114) et 5.4.2 (page 186). L’utilisation de l’ESI-MS en biologie est
présentée dans la partie 2.1 (page 56).

140 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS
4.3.6 Analyses statistiques
Les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant principalement les fonctions rdaTest et
graph.rdaTest écrites par Pierre Legendre et Sébastien Durand en langage R. La fonction rdaTest
permet de réaliser des analyses canoniques de redondance sous forme de MANOVA, en réalisant des
tests de signification par permutation ce qui la rend utilisable pour des échantillons de petite taille et
ne suivant pas une distribution normale. Elle est présentée dans la partie 5.4.2 et son utilisation est
détaillée pour l’analyse des données concernant Segonzacia mesatlantica dans la partie 5.4.3 (page
191). Le cas échéant, deux groupes d’échantillons ont pu être comparés entre eux en utilisant le test
non-paramètrique de Wilcoxon-Mann-Whitney.
4.4 Etude n°1 : Expérience préliminaire d’acclimatation à différentes salinités
4.4.1 Démarche expérimentale
Des crabes adultes Carcinus maenas capturés sur l’estran à Roscoff ont été acclimatés pendant 3
semaines à différentes conditions de salinité (hyposalinité 1/2 et 3/4, hypersalinité 5/4). Les crabes
étaient régulièrement nourris et l’eau était oxygénée par bullage. L’hémolymphe des crabes a été
prélevée après acclimatation, centrifugée puis le surnageant a été stocké pendant 1 mois et demi à
-80°C.
Les différents échantillons ont été décongelés sur glace puis analysés par SEC-MALLS et par gels
d’électrophorèse natifs afin de détecter un éventuel changement de structure après acclimatation.
4.4.2 Résultats
Profils SEC-MALLS
Le profil FPLC de tous les échantillons décongelés, quelle que soit la condition d’acclimatation,
est très différent de celui observé sur de l’hémolymphe fraîche : des agrégats ont été formés et une
dégradation a eu lieu ; d’autre part un pic supplémentaire S apparaît à la suite du pic d’hexamère
(figure 4.1). L’absorbance à 337 nm montre pour les espèces Agr., D, H et S qu’elles sont bien formées
d’Hc encore fonctionnelle.
Afin de vérifier les masses et l’identité des pics et notamment du pic S, une analyse en MALLS a
été réalisée (figure 4.2). Pour l’échantillon présenté, les masses des pics de dodécamère et d’hexamère
correspondent bien à l’ordre de grandeur des masses attendues. De manière surprenante, la masse
estimée pour le pic S ne correspond pas à des sous-unités isolées mais est très proche de celle estimée
pour l’hexamère : ce pic est donc composé d’une fraction hexamérique. De plus, la déconvolution

4.4. ETUDE 1 : EXPÉRIENCE PRÉLIMINAIRE (ACCL. SALINITÉ) 141
en pics gaussiens révèlent un autre composé probablement hexamérique : une déconvolution à 4 pics
ne permet pas de reconstituer correctement le signal alors qu’une déconvolution à 5 pics est correcte
(figure 4.2a,b). Le pic d’hexamère est alors visiblement constituté de 2 pics proches.
Les profils obtenus varient selon les conditions d’acclimatation des crabes : les agrégats et les
produits de dissociation sont plus abondants dans les échantillons hypersalins. Une analyse RDA à un
facteur (salinité) montre que l’effet de l’acclimatation est statistiquement significatif sur les aires des
différents pics à 337 nm (R 2 =0,46 ; p-value=0,009) (figure 4.3). L’abondance des dodécamères et des
hexamères classiques est plus importante dans les échantillons hyposalins et le pic supplémentaire et
les agrégats sont plus abondants dans les échantillons hypersalins.
Composition en sous-unités par PAGE
Afin de vérifier si les différences observées au niveau de l’abondance des différents complexes est
corrélée avec des composition en sous-unités différentes, les échantillons ont été analysés en PAGE
natif (figure 4.4). Trois bandes sont présentes chez tous les individus ; une bande est présente chez
un individu de chaque condition. A part cette bande, aucune différence marquée de profil PAGE n’est
observée entre les deux conditions d’acclimatation.
4.4.3 Discussion
L’hémolymphe décongelée comporte une fraction dodécamèrique et 3 fractions hexamériques de
masse proche. Les hexamères présents doivent différer dans leur conformation puisqu’ils éluent à des
temps différents, ce qui peut être dû à des rayons hydrodynamiques différents ou des interactions
différentes avec la matrice.
La salinité d’acclimatation a un effet sur les proportions des complexes. Cet effet peut être direct
(changement de la composition en sous-unités chez le crabe) ou indirect (conservation différente
d’une même structure pendant la congélation). D’après les profils PAGE, la composition en sousunités
ne différe pas d’une condition à l’autre. Il est donc probable que la différence de salinité qui
résulte en une osmolarité différente de l’hémolymphe agit sur les proportions des complexes par une
conservation différente à -80°C selon la force ionique de l’hémolymphe des crabes.
Cette expérience préliminaire ne montre donc pas de changement du profil de sous-unités après
3 semaines d’acclimatation à différentes salinités. Cependant, il est également possible que des sousunités
migrent au même endroit sur le gel et que certaines soient ainsi "masquées". L’usage de la
spectrométrie de masse dans l’étude suivante permet de résoudre ce problème.

142 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS
(a)
(b)
FIG. 4.1 – Spectres FPLC d’hémolymphe totale de crabes acclimatés à une hypo ou une hypersalinité.
(a) Spectre FPLC d’un crabe maintenu à une salinité de 1/2, (b) crabe maintenu à une salinité de 5/4.
Les échantillons ont subi une congélation à -80°C. Une forte aggrégation, une forte dégradation et un
pic supplémentaire sont présents. Ag., agrégats, D, dodécamère, H, hexamère, S, pic supplémentaire,
Dgr., produits de dégradation.

4.4. ETUDE 1 : EXPÉRIENCE PRÉLIMINAIRE (ACCL. SALINITÉ) 143
1
0.9
réel
gaussien
reconstitué
H
1e+007
0.8
Abs. 280nm (UA)
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
D
1e+006
Masse molaire (g/mol)
0.2
S
0.1
0
8 10 12 14 16 18
100000
volume (ml)
(a)
1
1e+007
0.9
0.8
Abs. 280nm (UA)
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
1e+006
Masse molaire (g/mol)
0.2
0.1
0
8 10 12 14 16 18
100000
volume (ml)
(b)
FIG. 4.2 – Détermination des pics gaussiens d’un échantillon hyposalin. (a) 5 pics gaussiens permettent
de reconstituer le profil expérimental. (b) 4 pics gaussiens ne permettent pas de reconstituer
correctement le profil expérimental entre 16-18 ml.

144 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS
FIG. 4.3 – Biplot de l’effet de la salinité sur l’abondances des différents complexes. L’analyse a
été réalisée avec un seul facteur explicatif (salinité) ; le deuxième axe correspond aux résidus. Les
variables descriptives sont en rouge. Les points ouverts sont les crabes acclimatés à l’hyposalinité, les
points fermés sont ceux acclimatés en hypersalinité.
FIG. 4.4 – PAGE natif sur hémolymphe de crabes acclimatés à différentes salinités. Trois bandes sont
toujours présentes (en bas) et une n’est présente que chez 2 individus (bande notée *). Les accolades
désignent les bandes attribuées aux complexes non-dissociés.

4.4. ETUDE 2 : EFFET DE LA SALINITÉ ET DE L’OXYGÉNATION 145
4.5 Etude n°2 : Acclimatation à différentes salinités et oxygénation en laboratoire
4.5.1 Démarche expérimentale
Collecte et acclimatation des crabes à différentes conditions
Des crabes mâles adultes Carcinus maenas ont été capturés par des nasses appâtées disposées à
marée basse sur l’estran en face de la Station Biologique de Roscoff et récupérées le lendemain. Ces
crabes ont été gardés une journée en aquarium d’eau de mer courante avant d’être transférés dans les
aquariums expérimentaux d’acclimatation.
Trois expériences ont été réalisées (les valeus de n correspondent au nombre de crabes survivants
à la fin de l’acclimatation) :
a) une expérience à trois salinités différentes, en normoxie, pendant 20 jours (n=21) ;
b) une expérience en normoxie et en oxygénation variable, à salinité constante, pendant 10 jours
(n=12) ;
c) une expérience associant différentes salinités et une hypoxie progressive, pendant 13 jours
(n=10).
Le suivi des conditions d’acclimatation est présenté dans la figure 4.5.
Les échantillons d’hémolymphe ont été prélevés avant et après acclimatation de manière appariée
pour chaque crabe. Pendant toute la durée des expériences, les crabes étaient nourris régulièrement
au chinchard ou à l’arénicole.
Analyse des échantillons
Les échantillons ont été analysés par SEC-MALLS, par gel SDS-PAGE et PAGE natif et par
ESI-MS. Les protéines ont également été dosées. Les proportions de dodécamères et d’hexamères
ont été mesurées sur les profils à 280 nm lorsqu’ils étaient identiques à ceux à 337 nm en raison du
meilleur rapport signal/bruit. Pour certains échantillons présentant des hexamères non-fonctionnels
(cryptocyanine, voir partie suivante), les proportions ont été mesurées sur le profil à 337 nm afin de
toujours obtenir les proportions de complexes fonctionnels.

146 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS
180
50
160
140
40
PO2 (Torr)
120
100
80
60
hyposalin
normosalin
hypersalin
sal ()
30
20
a)
40
20
0
0 5 10 15 20
temps (jours)
10
0
hyposalin
normosalin
hypersalin
0 5 10 15 20
temps (jours)
180
50
160
140
40
PO2 (Torr)
120
100
80
60
40
20
normoxie
variable
sal ()
30
20
10
normoxie
variable
b)
0
0 3 6 9 12
temps (jours)
0
0 3 6 9 12
temps (jours)
180
160
140
hyposalin
normosalin
hypersalin
50
40
PO2 (Torr)
120
100
80
60
40
20
sal ()
30
20
10
hyposalin
normosalin
hypersalin
c)
0
0 3 6 9 12
temps (jours)
0
0 3 6 9 12
temps (jours)
FIG. 4.5 – Conditions d’acclimatation en laboratoire pour Carcinus maenas. a) trois salinités testées,
en normoxie. b) deux conditions d’oxygénation testées (normoxie et oxygénation variable), en
normosalinité. c) trois salinités testées couplées à une hypoxie progressive.

4.5. ETUDE 2 : EFFET DE LA SALINITÉ ET DE L’OXYGÉNATION 147
4.5.2 Résultats expérience a : effet de la salinité
Proportions des complexes
L’analyse des échantillons congelés lors de l’étude précédente avait montré des différences au
niveau des proportions des complexes et la présence de plusieurs formes d’hexamères (profils SEC-
MALLS), mais cependant sans différence au niveau de la composition en sous-unités. Les analyses
présentées ici sont réalisées sur des échantillons frais et permettent de vérifier quelles sont les parts
respectives de l’acclimatation et de la congélation dans les résultats préliminaires exposés précédemment.
Après 20 jours d’acclimatation à différentes salinités, la plupart des crabes présente une diminution
des concentrations en protéines dans l’hémolymphe (tableau 4.1). La salinité n’a pas d’effet
sur la valeur absolue des concentrations en protéines après acclimatation (R 2 =0,03 ; p-value=0,48)
mais elle a un effet faible mais presque significatif sur la variation relative de concentration en protéines
dans l’hémolymphe (R 2 =0,17 ; p-value=0,06), la diminution de concentration étant plus forte
en hypersalinité.
La salinité n’a pas d’effet sur la proportion en dodécamère après acclimatation (R 2 =0,05 ; p-
value=0,18). Les crabes présentent une proportion de dodécamère classique aux environs de 90 %.
Une seule fraction hexamérique est observée pour tous les échantillons ; un crabe présentait des hexamères
non-fonctionnels et une bande correspondant à la bande * (figure 4.4) en gel natif. Cette particularité
était observée avant et après acclimatation pour ce crabe. La nature de ce complexe nonfonctionnel
est discutée plus loin. L’absence d’effet de la salinité sur les proportions des complexes
d’échantillons frais contredit l’hypothèse selon laquelle les différentes proportions observées dans les
résultats préliminaires sont une réponse à l’acclimatation à différentes salinités.
TAB. 4.1 – Données obtenues à différentes salinités chez Carcinus maenas. t0, avant acclimatation,
t1, après acclimatation. Les proportions des complexes à t0 n’ont pas pu être déterminées.
Hyposalin (n=8) Normosalin (n=6) Hypersalin (n=7)
Protéines t0 (mg/ml) moy ± d.s. 40,3 ± 29,4 41,4 ± 21,7 40,5 ± 25,7
Protéines t1 (mg/ml) moy ± d.s. 30,2 ± 23,3 27,2 ± 18,6 23,2 ± 15,3
∆([prot]) moy ± d.s. -28 % ± 18 -36 % ± 19 -43 % ± 3
% dodécamère t1 ± d.s. 89,2 ± 2,7 88,8 ± 3,5 91,3 ± 1,9

148 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS
Après stabulation
Avant stabulation
FIG. 4.6 – PAGE natif des échantillons provenant de crabes acclimatés à différentes salinités. Trois
échantillons représentatifs de chaque condition sont présentés. Les accolades désignent les complexes
non-dissociés et les 3 flèches du bas les sous-unités séparées en gel natif.
Composition en sous-unités
Une analyse de la composition en sous-unités par PAGE natif ne révèle pas non-plus de variations
entre les échantillons prélevés avant et après l’acclimatation de 20 jours, quelle que soit la condition
considérée. Ces observations sont en accord avec celles réalisées sur les échantillons congelés.
Aucun effet de la salinité sur la structure de l’Hc n’a donc été observé dans les conditions expérimentales
utilisées.
4.5.3 Résultats expérience b : effet de l’oxygénation
L’analyse par gel d’acrylamide ne permet pas de séparer avec une résolution suffisamment bonne
les différentes sous-unités. La quantification sur gel est également peu précise et peut être gênée par
des migrations différentes d’un gel à l’autre suivant les conditions de polymérisation de l’acrylamide.
Afin de réaliser une caractérisation plus précise de la composition en sous-unité et de pouvoir réaliser
une quantification relative des sous-unités présentes, des échantillons de dodécamère et d’hexamère
purifiés ont été analysés en ESI-MS en conditions dénaturantes. Des échantillons d’hémolymphe
totale d’individus acclimatés à différentes conditions ont également été analysés en ESI-MS supramoléculaire
afin de caractériser les complexes présents.

4.5. ETUDE 2 : EFFET DE LA SALINITÉ ET DE L’OXYGÉNATION 149
TAB. 4.2 – Données obtenues à différentes oxygénations chez Carcinus maenas. t0, avant acclimatation,
t1, après acclimatation.
Normoxie (n=8)
Ox. Variable (n=4)
Protéines t0 (mg/ml) moy ± d.s. 67,1 ± 21,7 79,3 ± 23,4
Protéines t1 (mg/ml) moy ± d.s. 53,3 ± 18,4 75,6 ± 28,3
∆([prot]) moy ± d.s. -17 % ± 22 -6 % ± 10
% dodécamère t0 ± d.s. 87 ± 3,8 87,5 ± 2,8
% dodécamère t1 ± d.s. 88,7 ± 3,2 88,4 ± 2,7
∆(prop.dodec) moy ± d.s. 2 % ± 3 1 % ± 4
Proportions des complexes
Après 10 jours d’acclimatation à une oxygénation variable (hypoxie avec retours brusques à la normoxie)
ou en normoxie, à une salinité constante (normosalinité), la plupart des crabes présentent une
diminution de la concentration de protéines dans l’hémolymphe. Les conditions d’oxygénation n’ont
d’effet ni sur la concentration absolue en protéines après acclimatation (R 2 =0,14 ; p-value=0,10), ni
sur les variations relatives de concentrations en protéines (R 2 =0,08 ; p-value=0,49).
Les conditions d’acclimatation n’ont pas d’effet sur les proportions des complexes observées,que
ce soit en valeurs absolues après acclimatation (R 2 =0 ; p-value=0,87) ou en variations relatives (R 2 =0,02 ;
p-value=0,70). Les crabes présentent environ 88 % de dodécamère avant et après acclimatation avec
des variations relatives très faibles pour chacun des crabes.
Dans cette expérience, certains crabes présentent encore les complexes hexamériques non-fonctionnels ;
ces crabes possèdent ce complexe avant et après acclimatation, et l’acclimatation ne semble pas avoir
d’effet sur la présence de ce complexe.
Composition en sous-unités
L’hémolymphe native ainsi que les complexes purifiés de 4 crabes ont été analysés en ESI-MS,
avant et après acclimatation. Les hauteurs des pics ont été normalisées de manière à ce que leur
somme soit égale à 1 pour chaque spectre ; elles permettent de quantifier les abondances relatives
des sous-unités et de les comparer d’un spectre à l’autre (figure 4.11). Il est à noter que cette quantification
permet une comparaison relative d’un échantillon à l’autre et est donc utilisable dans les
analyses statistiques, mais qu’elle ne reflète pas forcément les abondances relatives réelles présentes
dans l’échantillon car les sous-unités peuvent avoir un comportement différent lors de l’ionisation et
être ionisées plus ou moins facilement.
Les analyses statistiques sur les compositions en sous-unités sont détaillées dans la partie concernant
Segonzacia. Pour tester l’effet de l’acclimatation, on peut utiliser uniquement les échantillons

150 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS
FIG. 4.7 – Spectre ESI-MS des complexes natifs d’Hc de Carcinus maenas. Cet échantillon provient
d’un crabe acclimaté à une oxygénation variable. Les distributions de pics correspondant à l’hexamère
(450 000 kDa), au dodécamère (900 000 kda) et à des complexes de plus haute masse moléculaire (18-
mère et 24-mère) sont visibles. Pour l’hexamère, les pics sont légèrement dédoublés à leur sommet,
ce qui permet de calculer deux masses différentes.

4.5. ETUDE 2 : EFFET DE LA SALINITÉ ET DE L’OXYGÉNATION 151
FIG. 4.8 – Spectre ESI-MS des complexes natifs d’Hc présentant un hexamère particulier (observé
chez deux crabes seulement, sans lien avec les conditions d’acclimatation). Cet échantillon provient
d’un crabe avant acclimatation. L’acclimatation ne modifie pas la présence de l’hexamère supplémentaire.
En conditions dénaturantes, une sous-unités de 80962,2 Da est également observée ; l’hexamère
observée ici est formé de 6 exemplaires de cette sous-unités. Il est tentant d’assimiler cette hexamère à
l’hexamère de cryptocyanine observé chez certains crabes ; cependant il est à noter qu’une corrélation
entre la présence de cette hexamère en ESI-MS et celle de la cryptocyanine en SEC-MALLS n’a pas
encore été observée.

152 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS
FIG. 4.9 – Spectre ESI-MS en conditions dénaturantes d’hexamère de Carcinus maenas. Cet échantillon
provient d’un crabe acclimaté à une oxygénation variable. 4 sous-unités majoritaires sont observées.

4.5. ETUDE 2 : EFFET DE LA SALINITÉ ET DE L’OXYGÉNATION 153
FIG. 4.10 – Spectre ESI-MS en conditions dénaturantes de dodécamère de Carcinus maenas. Cet
échantillon provient d’un crabe acclimaté à une oxygénation variable. 5 sous-unités majoritaires sont
observées. La sous-unité de 75450 Da n’est observée que dans les fractions dodécamèriques, jamais
dans les fractions hexamèriques.

154 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS
(a)
(b)
FIG. 4.11 – Abondance des sous-unités en normoxie et en oxygénation variable. (a), abondances
relatives des sous-unités dodécamériques après acclimatation. (b) différences en abondances relatives
entre les échantillons avant et après acclimatation. La sous-unité spécifique du dodécamère (75450
Da) est celle présentant le moins de variations.

4.5. ETUDE 2 : EFFET DE LA SALINITÉ ET DE L’OXYGÉNATION 155
TAB. 4.3 – Données obtenues à différentes oxygénations et salinités chez Carcinus maenas. t0, avant
acclimatation, t1, après acclimatation.
Hyposalin (n=3) Normosalin (n=4) Hypersalin (n=3)
Protéines t0 (mg/ml) moy ± d.s. 58 ± 53,7 37,3 ± 37,5 37,3 ± 29,4
Protéines t1 (mg/ml) moy ± d.s. 41 ± 27,5 30,9 ± 18,1 27,8 ± 18,5
∆([prot]) moy ± d.s. -15 % ± 38 7 % ± 47 -21 % ± 10
% dodécamère t0 ± d.s. 93,1 ± 2 91,2 ± 2,4 91,2 ± 4,5
% dodécamère t1 ± d.s. 93,7 ± 2 91,9 ± 2,4 91,1 ± 4,8
∆(prop.dodec) moy ± d.s. 1 % ± 1 1 % ± 1 0 % ± 1
issus de normoxie et comparer la composition des dodécamères entre t0 et t1. Dans ce cas, l’effet
n’est pas significatif (p-value=0,39). L’effet de l’oxygénation est testé en comparant les abondances
relatives des sous-unités entre les deux groupes de crabes à t1. L’oxygénation n’a d’effet ni sur la
composition des dodécamères (p-value=0,91) ni sur la composition des hexamères (p-value=0,82).
Comme l’oxygénation n’a pas d’effet, on peut tester l’effet global de l’acclimatation en regroupant
tous les individus et en comparant les compositions en sous-unités des dodécamères entre t0
et t1. L’acclimatation n’a pas d’effet non-plus avec ces données sur la composition en sous-unités
(p-value=0,60).
Les prélévements sur les crabes ont été réalisés de manière appariée ; il est donc possible de
tester l’effet de l’oxygénation non sur les abondances mesurées à t1 mais sur les variations relatives
observées pour chaque sous-unité et pour chaque crabe, ce qui permet de s’affranchir des variations
interindividuelles. En considérant les dodécamères pour lesquels les données sont disponibles à t0 et
t1, le test de l’effet de l’oxygénation n’est pas significatif (p-value=0,95).
Les résultats obtenus montrent que l’acclimatation en aquarium n’a pas d’effet sur la composition
en sous-unités. L’oxygénation variable (alternance hypoxie / normoxie) n’a pas d’effet non plus sur
la composition en sous-unités. En revanche, une sous-unité est observée uniquement dans la fraction
dodécamérique pour tous les échantillons (sous-unité à 75449 Da) (figure 4.9, 4.10).
4.5.4 Résultats expérience c : couplage salinité/hypoxie
Proportions des complexes
Après 2 épisodes d’acclimatation en hypoxie progressive pendant 6 jours à des salinités différentes,
les données observées ne montrent pas d’effet des différentes salinités sur les concentrations
en protéines à t1 (R 2 =0,07 ; p-value=0,47) ou sur les variations relatives de concentrations entre t0 et
t1 (R 2 =0 ; p-value=0,85). La salinité n’a pas d’effet non-plus sur les proportions de dodécamère à t1

156 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS
(R 2 =0,02 ; p-value=0,3) ou sur les variations des proportions de dodécamère entre t0 et t1 (R 2 =0,08 ;
p-value=0,44). Les proportions de dodécamère restent à peu près constantes entre t0 et t1, les crabes
présentant environ 91 % de dodécamère.
Les spectres observées en ESI-MS sont semblables à ceux observés précédemment.
Composition en sous-unités
Pour cette expérience, des échantillons totaux d’hémolymphe ont été analysés en conditions dénaturantes.
Les abondances relatives des sous-unités sur lesquelles les tests statistiques sont réalisés
correspondent aux abondances dans l’hémolymphe totale (figure 4.12).
L’effet de la taille des individus sur la composition en sous-unité n’est pas significatif, en se
basant sur les données avant acclimatation (R 2 =0,25 ; p-value=0,29). En comparant les compositions
en sous-unités à t1, l’effet de la salinité n’est pas significatif (p-value=0,46). Comme la salinité n’a pas
d’influence sur la composition en sous-unités, tous les échantillons peuvent être utilisés pour tester
l’effet de l’acclimatation à l’hypoxie progressive (comparaison entre t0 et t1). Un effet très significatif
de l’acclimatation est observé (R 2 =0,45 ; p-value=0,004) (figure 4.13). L’effet le plus important est
une augmentation de l’abondance de la sous-unité de 73946 Da, et une légère diminution de la sousunité
de 75459 Da (visible sur la figure 4.12).
4.5.5 Discussion
Les expériences réalisées ont montré qu’il n’y avait pas de changement des proportions des complexes
de l’Hc de Carcinus maenas lors d’une acclimatation en hypo ou hypersalinité pendant 20
jours. Les proportions des complexes ne sont pas modifiées non plus par une oxygénation variable
(alternance hypoxie et normoxie) ou par une hypoxie progressive de plusieurs jours. La salinité n’a
pas non plus d’effet sur la composition en sous-unités. Si une oxygénation variable n’a pas d’effet
sur la composition en sous-unité, une hypoxie progressive de plusieurs jours a en revanche un effet
et induit une augmentation de l’abondance de la sous-unité de 73946 Da et une diminution de la
sous-unité spécifique des dodécamères (75459 Da). Cette diminution de la sous-unité spécifique des
dodécamères ne résulte pas en une diminution des proportions des dodécamères.
Il est intéressant de noter que la sous-unité de 73946 Da correspond à une des sous-unités légères
sensibles au lactate mises en évidence dans le chapitre 3. De même, la deuxième sous-unité
légère sensible au lactate présente également une tendance à l’augmentation, même si elle n’est pas
significative (figure 4.12).
D’après nos résultats, la plasticité phénotypique n’est pas impliquée dans l’acclimatation à court
terme à l’hypoxie ou à long terme à des changements de salinité. En revanche, un changement de

4.5. ETUDE 2 : EFFET DE LA SALINITÉ ET DE L’OXYGÉNATION 157
(a)
(b)
FIG. 4.12 – Abondances relatives des sous-unités en acclimatation couplée à l’hypoxie et à différentes
salinités. (a) abondances des sous-unités avant et après acclimatation. (b), différences des abondances
relatives avant et après acclimatation.

158 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS
FIG. 4.13 – Effet de l’acclimatation en hypoxie sur la composition en sous-unités.
la composition en sous-unités est observé pour une hypoxie à long terme (6 jours d’hypoxie). Ces
changements peuvent avoir des conséquences fonctionnelles dans la mesure où les sous-unités interagissant
spécifiquement avec le L-lactate sont plus abondantes après hypoxie. Des études détaillées
des propriétés fonctionnelles de ces pigments (effet Bohr, effet lactate) à l’échelle de l’individu seront
nécessaires pour vérifier cette hypothèse.
D’un point de vue structural, deux masses d’hexamères sont souvent observées, 448 641 Da et
449 632 Da (tableau 4.4). Ces masses suggèrent que l’association des sous-unités constituant les
hexamères ne s’associent pas de manière aléatoire : un calcul de l’ensemble des masses possibles à
TAB. 4.4 – Bilan des masses des complexes d’Hc obtenues en ESI-MS supramoléculaire.
Complexe Masse moyenne ± d.s. Fréquence observée
6-mère 448 641 ± 85 Da fréquent
6-mère 449 632 ± 210 Da habituel
6-mère 486 572 Da rare
12-mère 900 531 ± 328 Da habituel
18-mère 1 350 320 ± 662 Da habituel
18-mère 1 387 052 Da rare
24-mère 1 800 918 ± 686 Da habituel

4.5. ETUDE 3 : ÉTUDE D’UNE POPULATION NATURELLE ESTUARIENNE 159
partir des 4 masses des sous-unités formant les hexamères donne une distribution avec 5 valeurs de
masses plus probables que les autres (voir annexe B).
Carcinus maenas est un crabe présentant une grande capacité à supporter les eaux dessalés des
estuaires. Afin de vérifier si les populations naturelles ne présentent pas une plasticité phénotypique
qui n’aurait pas été observée dans les conditions du laboratoire, il est intéressant de procéder à l’étude
d’une population estuarienne.
4.6 Etude n°3 : Plasticité phénotypique d’une population naturelle dans un
estuaire (rivière Penzé)
4.6.1 Démarche expérimentale
Afin de déterminer si des changements de composition en sous-unités sont détectables dans des
populations naturellement exposées à une eau plus douce, des échantillonnanges ont été réalisés sur
des populations de crabes vivant dans l’estuaire de la Penzé.
Deux sites ont été échantillonnés, à différents niveaux dans l’estuaire (figure 4.14). Le site le plus
en amont est celui du Pont Eon. Les crabes ont été capturés à marée basse dans la vase du lit de la
rivière. L’eau courante est douce mais des entéromorphes sont présentes dans le lit immergé et des
Fucus sur des cailloux sur les côtés du lit. Des crabes sont présents dans la vase, sous les cailloux. Les
individus sont petits (taille ∼ 3 cm). L’eau interstitielle dans la vase a une salinité de 24 environ.
Les autres animaux présents sont de petites anguilles et des annélides. Le deuxième site est celui du
Pont de la Corde. Il est plus en aval de la rivière et l’eau y présente une salinité de 28 , les berges
sont rocheuses avec une couverture d’Ascophyllum et de Fucus, le sédiment est un peu vaseux en bas
de berge. Des éponges et des hydraires sont présents sur les rochers. Les crabes sont trouvés sous les
algues. Les individus sont un peu plus gros qu’au site du Pont Eon.
Les crabes sont transportés dans des bacs secs jusqu’à la station puis placés en stabulation dans
de l’eau de mer courante. Certains crabes sont mous, ce qui indique une mue récente. L’hémolymphe
de ces crabes n’est pas prélevée. Les crabes sont nourris une fois par semaine pendant 4 semaines
(chinchard).
Un premier prélévement est réalisé immédiatement à l’arrivée à la station sur 8 crabes du Pont
Eon (largeur du céphalothorax moyenne 31,5 ± 1,7 mm) et 5 crabes du Pont de la Corde (taille 34,6
± 6,2 mm), soit environ deux heures après la capture sur site. La petite taille des individus rend les
prélévements difficiles. Un deuxième prélévement a lieu après 4 semaines de stabulation dans l’eau
de mer courante sur 6 crabes du Pont Eon et 4 crabes du Pont de la Corde.

160 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS
FIG. 4.14 – Sites de prélévement des populations estuariennes. Les populations habituelles sont prélevées
près de la Station Biologique, en eau de mer. Les sites du Pont de la Corde et du Pont Eon sont
situés dans l’estuaire de la rivière Penzé.

4.6. ETUDE 3 : ÉTUDE D’UNE POPULATION NATURELLE ESTUARIENNE 161
4.6.2 Résultats
Maintien des individus en eau de mer courante
Une forte mortalité et un nombre important de mues ont été observées dans les aquariums de
stabulation. La mortalité peut être attribuée au prélévement d’un volume important d’hémolymphe
sur des individus de petite taille qui n’ont sans doute pas pu récupérer ; le nombre important de mues
est lié au fait que les crabes sont jeunes et en période de croissance rapide. Un certain nombre de
crabes trouvés morts venaient juste de muer.
Profil SEC-MALLS avant et après stabulation
Les profils FPLC obtenus avant stabulation sont de deux types. On observe des profils présentant
une forte quantité d’hexamère (absorbance à 280 nm) dont seulement une faible proportion est
fonctionnelle (absorbance à 337 nm) (figure 4.15). Si on considère uniquement le profil à 337 nm,
il présente les proportions classiques d’hexamères (de 0 à 20 %). Une fraction excédentaire d’hexamères
non-fonctionnels est donc présente. Le deuxième type de profil observé correspond aux profil
classique obtenu pour Carcinus maenas, avec une bonne correspondance des profils à 280 nm et à
337 nm (figure 4.16).
Avant stabulation, les crabes du Pont Eon présentent un profil avec des hexamères non-fonctionnels
et ceux du Pont de la Corde un profil classique (la différence entre les deux groupes est significative
avec une p-value de 0,004 pour un test de Wilcoxon-Mann-Whitney sur les abondances d’hexamère
non-fonctionnel). Après stabulation, les crabes du Pont Eon présentent les deux types de profils et
certains crabes du Pont de la Corde présentent des hexamères non-fonctionnels (la différence pour les
rapports des abondances d’hexamères entre les deux sites n’est plus significative, p-value de 0,19).
En revanche, si on considère uniquement les profils à 337 nm (Hc fonctionnelle), les deux sites ne
différent ni avant stabulation (p-value de 0,72) ni après (p-value de 0,90). Entre avant et après stabulation,
les crabes du Pont Eon présentent une diminution significative de l’abondance de l’hexamère
non-fonctionnel (p-value=0,006) mais ceux du Pont de la Corde ne présentent pas de différence.
Les masses estimées en MALLS différent légèrement au niveau de l’hexamère selon les échantillons
; elles ont tendance à augmenter avec la proportion d’hexamère non-fonctionnel. Cela peut être
dû à la coélution simultanée de deux hexamères (le fonctionnel f et le non-fonctionnel n f ) de masses
différentes. La masse estimée par MALLS dépend de la proportion des deux espèces f et n f dans le
pic d’élution.
Afin de vérifier si ce modèle est valide et de déterminer les masses des composés, une représentation
graphique des données des différents crabes est utilisée (voir annexe A page 228). Les masses
obtenues sont de 444 kDa pour l’hexamère fonctionnel et 518,2 kDa pour l’hexamère non-fonctionnel.

162 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS
(a)
abs. 280nm
abs. 337nm
Abs. 280nm (UA)
0.1
1e+006
Masse molaire (g/mol)
0
8 10 12 14 16 18
volume (ml)
(b)
100000
FIG. 4.15 – Profil SEC-MALLS de l’hémolymphe d’un crabe du Pont Eon avant stabulation. Masse
estimée pour la fraction correspondant au dodécamère : 908,2 kDa, à l’hexamère : 494,6 kDa.

4.6. ETUDE 3 : ÉTUDE D’UNE POPULATION NATURELLE ESTUARIENNE 163
(a)
abs. 280nm
abs. 337nm
Abs. 280nm (UA)
0.05
1e+006
Masse molaire (g/mol)
0
8 10 12 14 16 18
volume (ml)
(b)
100000
FIG. 4.16 – Profil SEC-MALLS de l’hémolymphe d’un crabe du Pont de la Corde avant stabulation.
Masse estimée pour la fraction correspondant au dodécamère : 924,5 kDa, à l’hexamère : 460 kDa.

164 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS
TAB. 4.5 – Changements protéiques avant et après stabulation. Lorsque la proportion d’hexamère
à 337 nm est supérieure à celle à 280 nm (chez quelques crabes), la proportion d’hexamère nonfonctionnelle
est considérée comme nulle.
Pont Eon
Pont de la Corde
Avant stab. Après stab. Avant stab. Après stab.
protéines ± d.s. (mg/ml) 89,6 ± 17,3 39,9 ± 21,9 36 ± 37,8 23,3 ± 4,9
proportions d’hexamère n f ± d.s. 22,4 ± 8,2 13,4 ± 11,7 0,2 ± 0,4 2,3 ± 3,5
Nb crabes avec bande * / Nb total 7/8 5/6 1/5 4/4
Profils PAGE
Les protéines totales des échantillons d’hémolymphe prélevés ont été dosées : avant stabulation,
les individus capturés en amont ont une concentration en protéines supérieure à celle des individus
pris en aval. Après acclimatation, les teneurs en protéine sont faibles dans les deux groupes.
La composition en sous-unités des crabes a été analysée en PAGE dénaturant et natif (figure 4.17).
Les profils des crabes provenant des deux sites sont similaires en gel dénaturant avec 3 bandes bien
visibles d’une masse d’environ 75 kDa. En gel natif, trois bandes migrant rapidement sont observées
dans tous les échantillons et une bande est observée chez 7 individus sur 8 de Pont Eon avant stabulation
et 1 sur 5 du Pont de la Corde. Après stabulation, cette bande est observée chez les 4 individus
restant du Pont de la Corde. La présence de cette bande est corrélée avec la présence d’hexamère
non-fonctionnel et constitue probablement ce complexe. En gel dénaturant après stabulation, la bande
la plus lente est plus importante chez les individus présentant une forte bande * en gel natif et doit
correspondre à cette sous-unité.
Profils PAGE des complexes purifiés
Afin de vérifier si la bande * est bien reliée à la fraction hexamérique, les complexes des échantillons
prélevés après stabulation ont été purifiés par SEC et les fractions récupérées analysées en
PAGE (figure 4.18). La bande * est présente dans la fraction hexamèrique uniquement ; l’intensité de
la bande * est corrélée à l’abondance d’hexamère non-fonctionnel dans l’hémolymphe (gels natifs).
Cette bande * est également visible sur les gels dénaturants au niveau de la bande la plus lente. En
dehors de cette bande, les profils observés après stabulation pour les différents complexes sont très
similaires pour les crabes des deux sites.

Avant stabulation
Après stabulation
Dénaturant
Natif
FIG. 4.17 – Profils PAGE dénaturant et natif de crabes estuariens
4.6. ETUDE 3 : ÉTUDE D’UNE POPULATION NATURELLE ESTUARIENNE 165

Dénaturant
Natif
FIG. 4.18 – Profils PAGE dénaturant et natif de complexes purifiés après stabulation. D et H, fractions dodécamérique et hexamérique. Les pourcentages
indiqués correspondent à la proportion d’hexamère non-fonctionnel présente dans l’hémolympe (en tenant compte des dodécamères et des
hexamères fonctionnels).

4.6. ETUDE 3 : ÉTUDE D’UNE POPULATION NATURELLE ESTUARIENNE 167
4.6.3 Discussion
Les deux populations échantillonnées à différentes salinités présentent avant stabulation des profils
SEC-MALLS qui différent par la présence d’un complexe n’absorbant pas à 337 nm chez les individus
du site le plus hyposalin (Pont Eon, en amont). Ce complexe élue en même temps que les hexamères
fonctionnels d’Hc et il est constitué de monomères séparables de l’Hc en gel natif ; sa masse native
est environ de 518,2 kDa, soit 86 kDa par monomère. Cette valeur est cohérente avec la migration
de cette sous-unité spécifique avec les sous-unités d’Hc les plus lentes en gel dénaturant. Cette sousunité
est absente des échantillons possédant uniquement de l’Hc fonctionnelle. Il ne s’agit donc pas
d’apo-Hc car la migration très différente en gel natif indique une structure primaire différente des
autres sous-unités fonctionnelles. Ce complexe peut être proposé comme étant de la cryptocyanine.
Ce complexe appartient à la famille de l’Hc et est un hexamère de structure semblable à l’Hc. Il est
vraisemblablement en relation avec les cycles de mue (Terwilliger et al., 2005).
Du point de vue de l’Hc fonctionnelle, les deux populations ne différent ni par l’abondance des
complexes ni par la composition en sous-unités telle qu’elle est observée en gel PAGE, que ce soit
avant ou après stabulation. Ces résultats suggèrent l’absence d’expression spécifique de certaines
sous-unités d’Hc selon les conditions de salinité du milieu dans cette population estuarienne.
En revanche, l’abondance de la cryptocyanine varie au cours de l’expérience. Ces variations se
répercutent sur les concentrations en protéines totales, qui est élevée chez les crabes du Pont Eon avant
stabulation. Avant stabulation, ces crabes présentent clairement de la cryptocyanine alors qu’elle est
peu présente chez les crabes du site en aval. Après trois semaines en stabulation, les crabes du site
amont présentent toujours la cryptocyanine mais elle est également observée, avec des abondances
plus faibles, chez les crabes du site en aval.
Les crabes collectés étaient de petite taille et de nombreuses mues ont été constatées dans les
aquariums, ce qui indique que ces individus subissent des cycles de mues rapprochés. La cryptocyanine
est impliquée dans les mécanismes ayant lieu à la mue et sa présence peut être le reflet de cet
état physiologique. Les individus prélevés au Pont de la Corde étaient un peu plus gros, ce qui pourrait
expliquer qu’un seul crabe sur 4 présentait de la cryptocyanine avant stabulation. Le fait que les
niveaux de cryptocyanine augmentent après stabulation est peut-être le signe d’un déclenchement du
cycle de mue par la mise en eau normosaline.
Les masses des hexamères déterminées à partir des données de MALLS correspondent relativement
bien aux masses obtenues en spectrométrie de masse supramoléculaire pour un échantillon
présentant deux distributions de pics donnant des masses de 449 809 Da et 486 572 Da. La cryptocyanine
pourrait donc être un hexamère de 486 kDa formé de sous-unités de 81 kDa environ.

168 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS
4.6.4 Conclusion et perspective
Aucun effet de la salinité plus faible de l’estuaire n’a pu être observé sur la structure de l’Hc.
Les populations présentes étaient des populations jeunes, que l’on trouve préférentiellement dans ces
milieux en raison de la pression de prédation moindre. Les cycles de mue rapides que subissent ces
jeunes individus rajoutent un changement dans la présence de la cryptocyanine, de structure proche
de l’Hc mais sans fonction de transport de l’oxygène, et qui complique l’interprétation des données
obtenues.
Il serait intéressant de pouvoir réitérer ces travaux en se basant sur une population de crabes
adultes vivant dans un milieu estuarien. Il existe des populations de C. maenas adultes vivant dans
l’estuaire du Guillec, à l’ouest de Roscoff, dans le sédiment meuble des berges. Des suivis de cette
population et une acclimatation à l’eau de mer sont envisageables.
Du point de vue développemental, il pourrait également être intéressant de travailler sur les premiers
stades de développement de C. maenas. Il a été montré chez Cancer magister que la composition
de l’Hc varie au cours du développement de l’animal entre la larve mégalope, les mues juvéniles
et l’adulte et que les différents complexes ont des propriétés différentes (Terwilliger et Brown, 1993).
Une expérience sur une cohorte de crabes élevées au laboratoire permettrait de vérifier si cela est aussi
le cas chez C. maenas
Enfin, les échantillons de ces expériences n’ont pas été analysés en spectrométrie de masse. Un
examen attentif des gels natifs avant et après stabulation suggère qu’il pourrait exister une légère différence
de stoichiométrie entre les trois sous-unités rapides, celle migrant le moins rapidement semblant
être un peu moins abondante par rapport aux deux autres après stabulation. Une quantification relative
en ESI-MS permettrait de vérifier si cette différence est réelle ou non.
4.7 Bilan général et perspectives
Carcinus maenas est un crabe supportant des modifications rapides et importantes des conditions
de son environnement (estran) ainsi qu’une vie prolongée dans les estuaires (juvéniles notamment).
Ces capacités lui ont permis de se répandre dans de nombreuses zones côtières en dehors de son aire
de répartition naturelle et font de lui une espèce invasive dans beaucoup de zones littorales.
D’un point de vue physiologique, la plasticité phénotypique ne semble pas impliquée dans l’adaptation
à court terme à l’hypoxie ou dans l’adaptation à l’hyposalinité. En revanche, elle semble impliquée
dans des réponses à plus long terme (6 jours dans nos expériences) qui sortent du cadre du
milieu intertidal. La réponse phénotypique observée en hypoxie longue correspond à une abondance
plus élevée d’une sous-unité sensible au L-lactate et pourrait donc avoir des conséquences fonction-

4.7. BILAN GÉNÉRAL ET PERSPECTIVES 169
nelles sur le transport de l’oxygène. Les hypoxies rencontrées dans le milieu naturel sont plus courtes
et correspondent davantage aux expériences d’oxygénation variable qui n’ont pas induit de changement
phénotypique. Il peut être suggéré que le coût métabolique d’un ajustement du pH ou de la
concentration en effecteurs dans l’hémolymphe est moindre pour une réponse à court terme par rapport
à un changement de production de protéines. De plus, ces réponses hémolymphatiques peuvent
être mises en route très rapidement (quelques heures). Le basculement vers une réponse phénotypique
peut refléter l’avantage à long terme de posséder un pigment intrinséquement plus adapté aux
conditions et permettant de relâcher la pression physiologique sur la régulation de la composition de
l’hémolymphe.
Pour étayer ces hypothèses, une étude détaillée des propriétés fonctionnelles de ces pigments est
nécessaire. Une expérience d’acclimatation longue à une hypoxie sévère, en réalisant des prélèvements
quotidiens pour suivre les concentrations en effecteurs et le pH hémolymphatique ainsi que la
composition et les propriétés des pigments constituerait la prochaine étape de l’étude de la plasticité
phénotypique de l’Hc.
En ce qui concerne les populations naturelles, le suivi dans la rivière Penzé n’a pas révélé de
changements de composition en sous-unité en relation avec la salinité du milieu. L’ESI-MS pourrait
permettre de confirmer ces résultats, de préférence en choississant une population de crabes adultes
présentant moins d’interférence avec les protéines hémolymphatiques impliquées dans la mue. Un
suivi saisonnier d’une population marine naturelle serait également intéressant afin de vérifier si la
plasticité phénotypique peut être impliquée dans des adaptations à long terme dans le milieu naturel
(cycle de température annuel).
D’un point de vue méthodologique, ces études nous ont permis de vérifier la pertinence de l’emploi
de la spectrométrie de masse pour le phénotypage de nos individus. Même si l’équipement nécessaire
est moins facilement accessible et si moins d’analyses peuvent être réalisées que par des analyses
de routine type PAGE, la qualité des données recueillies, la possibilité de quantifier les abondances de
manière relative et d’appliquer des méthodes statistiques aux résultats en font une méthode de choix
pour étudier les variations de faible amplitude dans l’expression de protéines proches en masse.

170 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS

Chapitre 5
Adaptations respiratoires du crabe
hydrothermal Segonzacia mesatlantica
171

172 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
En comparaison avec le milieu côtier, relativement peu d’espèces de crabes hydrothermaux ont
été décrites jusqu’à présent (56 espèces de Crustacés Décapodes observés sur les sites hydrothermaux
d’après Desbruyères et al. (2006), dont seulement 13 Brachyoures réellement inféodés au milieu hydrothermal,
tous de la famille des Bythograeidae). Quelques études de physiologie respiratoire déjà
réalisées sur certaines d’entre elles ont permis de mettre en évidence des adaptations particulières
des propriétés de l’Hc de ces crabes au milieu hydrothermal ; cependant les études sur les réponses
de l’animal à différentes conditions d’acclimatation sont encore peu nombreuses. Segonzacia mesatlantica
est l’unique crabe hydrothermal présent sur la dorsale Médio-Atlantique et des expériences
d’acclimatation à l’hypoxie et à l’hyperoxie ont déjà été réalisées sur cette espèce : la caractérisation
de pools d’Hc issus de ces individus a suggéré que la plasticité phénotypique pourrait être impliqué
dans la réponse aux différentes conditions (Chausson et al., 2004).
Afin d’établir plus précisément si la plasticité phénotypique est mise en oeuvre lors de la réponse
à l’hypoxie ainsi que les réponses hémolymphatiques aux stress environnementaux, il est nécessaire
de pouvoir travailler sur des échantillons séparés pour chaque individu. L’opportunité d’une campagne
sur la dorsale Médio-Atlantique et la possibilité d’utiliser des enceintes pressurisées couplées
à un système de régulation de la composition de l’eau de mer a permis de réaliser des expériences
d’acclimatation sur S. mesatlantica et d’analyser les échantillons individuellement afin de caractériser
la réponse physiologique de cette espèce aux variations de son environnement, à la fois en terme
de composition de l’hémolymphe et de structure de l’Hc. Les propriétés de l’Hc ont également été
caractérisées.
5.1 Segonzacia mesatlantica et le contexte hydrothermal
5.1.1 Micro-environnement de Segonzacia mesatlantica
L’espèce modèle Segonzacia mesatlantica a été décrite dans la partie 1.1.3 (page 22). Segonzacia
mesatlantica est la seule espèce de crabe hydrothermal endémique de la MAR. Il n’a pas été observé
sur les autres dorsales et les autres espèces de crabes observées à proximité des sites Atlantique sont
des espèces bathyales opportunistes (Chaceon affinis).
S. mesatlantica est très actif sur les édifices hydrothermaux et il a été observé depuis la zone
meuble entourant les édifices hors de l’influence du fluide hydrothermal jusqu’à proximité immédiate
des zones d’émission (crabes couverts de bactéries filamenteuses) mais non dans le fluide (réflexe de

5.1. SEGONZACIA MESATLANTICA ET LE CONTEXTE HYDROTHERMAL 173
TAB. 5.1 – Caractéristiques des micro-environnements rencontrés par S. mesatlantica (pris dans
Chausson (2001)). Les valeurs présentées ici sont celles qui ont pu être mesurées. La présence de
S. mesatlantica près des zones d’émission et celle de bactéries filamenteuses sur sa carapace indique
qu’il doit subir des températures et des teneurs en CO 2 et en H 2 S plus élevées, et un pH et une teneur
en O 2 plus bas que ceux présentés ici.
Vers le fluide
vers l’eau de mer
Température (°C) 27 4
pH 6,3 8
H 2 S (µM) 75 0,4
CO 2 (µM) 3100 1700
O 2 (µM) 0-50 250
Cu (µM) 12,5 0
Pb (µM) 0,53 0
Cd (µM) 0,12 0
retrait des pattes au contact du fluide) (Chausson, 2001). Il a été observé sur tous les sites hydrothermaux
de la dorsale Médio-Atlantique entre l’équateur et les Açores, depuis Menez Gwen (850 m)
jusqu’aux sites les plus profonds (TAG, 3650 m). Il est donc exposé à des pressions comprises entre
85 et 365 bars.
Les données chimiques des micro-environnements rencontrés par S. mesatlantica ont été compilées
par Fabienne Chausson (tableau 5.1) (Chausson, 2001). S. mesatlantica peut supporter une
très large gamme de conditions physiques et chimiques ; il est mobile et peut changer rapidement de
localisation et donc d’environnement (figure 5.1).
5.1.2 Adaptations respiratoires dans les environnements hydrothermaux profonds
Adaptations fonctionnelles et hémolymphatiques
Des études physiologiques ont déjà été réalisées chez des Crustacés hydrothermaux, notamment
les crabes Bythograea thermydron, Cyanagraea praedator, et les crevettes Rimicaris exoculata, Chorocaris
chacei et Mirocaris fortunata.
Des études sur la régulation du rythme cardiaque chez B. thermydron ont montré que le rythme
cardiaque dépendait de la température et de l’oxygénation et que lorsque la pression hydrostatique
diminue, des troubles cardiaques apparaissent. Ces troubles sont sans doute liés à des modifications
de la fluidité et de la perméabilité des membranes des cellules nerveuses.
Des études portant sur l’hémolymphe des Crustacés hydrothermaux ont montré que les concen-

174 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
FIG. 5.1 – Segonzacia mesatlantica dans l’environnement hydrothermal. Les crabes sont présents
au niveau des moules, des cheminées, près des diffuseurs. Ils sont parfois difficiles à remarquer en
raison de la couleur ocre des oxydes qui les recouvrent. Lorsque les moules sont cassées par la pince
de prélévement, les crabes mangent les tissus accessibles. Photographies prises durant la campagne
MoMARETO 2006 aux Açores (Ifremer).

5.1. SEGONZACIA MESATLANTICA ET LE CONTEXTE HYDROTHERMAL 175
trations ioniques (Na + , K + , Ca 2+ , Mg 2+ , Cl − ) sont proches de celle observées chez des espèces
littorales. Les espèces hydrothermales sont isotoniques pour le Na + et légèrement hypotoniques pour
le Cl − . Elles peuvent être exposées à des variations de salinité, en particulier pour le Mg 2+ et le Ca 2+ ,
lorsqu’elles se déplacent le long du gradient de mélange (fluide hydrothermal pauvre en magnésium
et plus riche en calcium). Ces ions divalents peuvent avoir un effet sur l’affinité de l’Hc pour l’oxygène.
B. thermydron est sténohalin et osmoconformeur, mais s’adapte plus rapidement (15-24 h) à un
changement de salinité que les espèces littorales (plusieurs jours) (Martinez et al., 2001). En revanche,
les espèces hydrothermales présentent une forte accumulation de cuivre libre dans leur hémolymphe
(entre 730 et 1240 µM) alors que les doses létales chez Carcinus maenas sont de l’ordre de 150-220
µM (Chausson, 2001).
Les espèces hydrothermales présentent aussi de fortes concentrations en composés soufrés (thiosulfate
S 2 O 2−
3
, sulfate SO2−
4
et sulfure S 2− ) (Chausson, 2001). Ces composés proviennent de la détoxification
des sulfures du milieu par oxydation. Le thiosulfate peut avoir un effet sur l’affinité de
l’Hc pour l’oxygène (Sanders et Childress, 1992). Il a été montré chez B. thermydron qu’une exposition
à des sulfures augmentait le métabolisme des individus (Gorodezky et Childress, 1994, Vetter
et al., 1987) et que des crabes capturés récemment avaient un pH hémolymphatique plus acide et des
concentrations en L-lactate plus élevées que des crabes acclimatés dans des aquariums sans sulfures
(Sanders et Childress, 1992).
Les espèces hydrothermales ont également de fortes concentrations des modulateurs organiques
de l’affinité de l’Hc (L-lactate et urate). Chez B. thermydron, la teneur en lactate augmente en hypoxie
sous pression atmosphérique ou sous pression du fond (Chausson, 2001). Ce crabe peut supporter une
anoxie de 12 h (Mickel et Childress, 1982b).
Les espèces hydrothermales ont aussi de fortes concentrations moyennes en protéines (de l’ordre
de 100 mg/ml), plus élevées que celles observées chez les espèces littorales.
Adaptations moléculaires de l’Hc
D’un point de vue structural, les Hc hydrothermales sont similaires à celles des espèces littorales :
sous-unités de 75 kDa de différents types, assemblages en dodécamères et en hexamères. Les espèces
de Brachyoures hydrothermales présentent cependant une plus forte proportion en hexamères que les
espèces littorales.
Les Hc des Crustacés hydrothermaux présentent toutes une très forte affinité pour l’oxygène et
un fort effet Bohr. Ces éléments permettent d’une part un chargement efficace aux branchies même
en milieu hypoxique (forte affinité) et un déchargement facilité au niveau des tissus actifs (fort effet
Bohr).

176 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
FIG. 5.2 – Carte des sites hydrothermaux de la MAR connus situés entre l’équateur et les Açores. Pris
sur le site MOMARNET (http ://www.ipgp.jussieu.fr/rech/lgm/MOMARNET.
L’effet température est souvent nul ou inverse, ce qui est adaptatif dans la mesure où l’augmentation
de température est corrélée avec l’hypoxie environnementale dans le milieu hydrothermal :
l’absence d’effet température normal permet d’éviter une baisse de l’affinité en hypoxie.
Les effecteurs organiques ont des effets variables : le L-lactate a pas ou peu d’effet sur les Hc
hydrothermales, le thiosulfate augmente l’affinité de l’Hc de B. thermydron et il existe également un
facteur dialysable de naure inconnue au moins chez R. exoculata qui diminue l’affinité de l’Hc pour
l’oxygène (Lallier et Truchot, 1997).
Ces adaptations révèlent une sélection des caractères avantageux dans des situations d’hypoxie
environnementale. Ces adaptations sont présentes chez d’autres espèces colonisant des milieux similaires
comme les sédiments anoxiques (e.g. l’isopode Saduria entomon, Hagerman et Vismann (1999,
2001)) ou le milieu terrestre (facteurs X présents diminuant l’affinité de l’Hc observés chez deux
espèces semi-terrestres, Ocypode saratan et Ocypode ryderi, Bridges et Taylor (1992)).
5.2 Matériels et méthodes utilisés pour l’étude d’une espèce hydrothermale
5.2.1 Collecte des individus
La collecte de spécimens en provenance des environnements hydrothermaux profonds nécessite
l’utilisation de moyens lourds : navire océanographique hauturier et engin submersible habité ou commandé
à distance (figure 5.3). Les individus utilisés dans cette étude ont été collectés lors de la cam-

5.2. M&M POUR L’ÉTUDE D’UNE ESPÈCE HYDROTHERMALE 177
FIG. 5.3 – Equipements de la campagne MoMARETO 2006 : le navire océanographique Pourquoi
Pas ? avec le portique arrière de mise à l’eau visible (port de Horta, Açores), le ROV Victor 6000 à
la récupération et l’aspirateur à faune utilisé sur une cheminée hydrothermale. Photos Jean-Baptiste
Burnet (Pourquoi Pas ?), Michel Gouillou (Victor 6000), Ifremer.

178 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
FIG. 5.4 – Systèmes DESEARES et SYRENE utilisés pour l’acclimatation sous pression. A gauche,
la colonne de mélange est visible ainsi que les systèmes de contrôles des mélanges gazeux et de
régulation du pH. L’eau de la colonne est envoyée vers la pompe haute-pression alimentant les 3
chambres pressurisées (à droite).
pagne MoMARETO 2006 dans la zone du point triple des Açores (http ://www.ifremer.fr/momareto/)
(figure 5.2). Le navire océanographique utilisé était le N/O Pourquoi Pas ?. Il s’agissait de la deuxième
campagne océanographique opérationnelle du navire après la campagne Vicking au niveau des suintements
froids au large des côtes de Norvège. Le submersible embarqué était le sous-marin commandé
à distance (ROV, Remotely Operated Vehicle) Victor 6000. La campagne s’insérait dans le cadre du
programme européen Exocet/D.
Les échantillons animaux peuvent être capturés par aspiration (crabes, crevettes, faune vagile de
petite taille), par pince (moules) ou par nasses appâtées. Les individus de Segonzacia mesatlantica
ont été capturés à l’aspirateur à faune ; ils n’ont pas été trouvés dans les nasses appâtées.
5.2.2 Acclimatation à bord
Les invertébrés profonds supportent plus ou moins bien la remontée à la surface à pression et à
température ambiante. Les Crustacés présentent en général des troubles du comportement (mouvements
désordonnées, pas de réflexe de retournement quand mis sur le dos) à la remontée. Ces troubles
disparaissent après acclimatation à la pression atmosphérique ou repressurisation immédiate.
Afin de réaliser des expériences de physiologie sur les animaux vivants et de se rapprocher des
conditions réelles du fond, un dispositif de chambres pressurisées alimentées par un mélange d’eau
de mer contrôlé a été mis en place (figure 5.4). Les aquariums DESEARES forment un ensemble de 3
chambres d’un litre alimentées par une pompe haute-pression ; la pression dans les chambres peut être
régulées de 1 à 350 bars. Un système de double-enveloppe permet la circulation d’un fluide calopor-

5.3. PROBLÉMATIQUE ET OBJECTIFS DE L’ÉTUDE 179
teur afin de réguler la température des enceintes. Le mélange délivré par la pompe haute-pression est
contrôlé par le système SYRENE composé d’une colonne de mélange de 20 l dans laquelle la composition
en gaz dissous ainsi que le pH sont régulés. Une voie supplémentaire permet éventuellement
d’introduire d’autres composés (e.g. métaux dissous).
Lors de la campagne, les crabes recoltés étaient immédiatement récupérés à la remontée du robot.
Les individus utilisés provenaient principalement de Lucky Strike (1600 m) et aussi de Rainbow (2200
m). Après une éventuelle stabulation à 4°C dans des aquariums d’eau de mer de surface en fonction de
la disponibilité des enceintes pressurisées, des individus étaient placés en acclimatation sous pression
pendant 16 h alors qu’un lot témoin était disséqué lors de la mise sous pression des aquariums afin de
connaître l’état physiologique avant mise sous pression.
5.3 Problématique et objectifs de l’étude
Les mécanismes physiologiques mis en jeu dans l’adaptation à des changements de conditions
environnementales peuvent être étudiés en acclimatant les animaux à différentes conditions. Dans
le cas des espèces hydrothermales, peu d’études de ce type sont disponibles. L’étude d’organismes
hydrothermaux a conduit au développement d’enceintes pressurisées permettant de reproduire la pression
hydrostatique du fond. L’objectif de notre étude est d’examiner les réponses physiologiques d’un
crabe hydrothermal, Segonzacia mesatlantica, à des conditions d’acclimatation différentes (température,
oxygénation) tout en reproduisant la pression de son milieu afin de pouvoir déterminer quels
sont les mécanismes physiologiques lui permettant de supporter les variations qu’il rencontre dans
son milieu naturel.
Afin de répondre à cette question, deux conditions de température et d’oxygénation sont testées
de manière croisée. Les échantillons d’hémolymphe prélevés ont été analysés au laboratoire pour déterminer
la composition en ions majeurs, la quantité d’Hc présente, la concentration des modulateurs
organiques (L-lactate et urate) et la structure de l’Hc (proportion des complexes et composition). Les
propriétés fonctionnelles de l’Hc ont également été examinées. La comparaison de ces données avec
les autres espèces hydrothermales et les espèces littorales permet de mettre en évidence les adaptations
communes et particulières aux différents environnements.
5.4 Manuscrit : Respiratory adaptations of the deep-sea hydrothermal vent crab
Segonzacia mesatlantica in response to hypoxia and temperature changes
Les travaux de ce chapitre ont fait l’objet d’un manuscrit actuellement en cours de soumission.

180 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
Ce manuscrit est reproduit ici ; les références bibliographiques citées dans le texte ont été insérées
dans les références globales de la thèse.

5.4. MANUSCRIT : RESPIRATORY ADAPTATIONS OF S. MESATLANTICA 181
Respiratory adaptations of the deep-sea hydrothermal vent crab
Segonzacia mesatlantica in response to hypoxia and temperature
changes
Matthieu Bruneaux 1,2 , Jérémy Pasquier 1,2 , Peran Terrier 3 , Pierre Legendre 4 , Emmanuelle Leize 3 ,
François H. Lallier 1,2 , Franck Zal 1,2 *
1 UPMC Univ. Paris 06, UMR 7144, Equipe Ecophysiologie : Adaptation et Evolution Moléculaires,
Station Biologique de Roscoff, 29682 Roscoff, France
2 CNRS, UMR 7144, Station Biologique de Roscoff, 29682 Roscoff, France
3 CNRS-ULP, UMR 7177, Laboratoire de Dynamique et Structure Moléculaire par Spectrométrie
de Masse, Institut de Chimie, ISIS, 67083 Strasbourg, France
4 Département de sciences biologiques, Université de Montréal, C.P. 6128, succursale Centre-ville,
Montréal, Québec, Canada H3C 3J7
*Corresponding Author : F. Zal, Station Biologique de Roscoff, Place Georges Teissier, BP74,
29682 Roscoff cedex, FRANCE Phone : 0033 (0)298292309 Fax : 0033 (0)298292324 E-mail :
zal@sb-roscoff.fr
Abbreviations : AcNH 4 , ammonium acetate ; ESI-MS, electrospray ionization mass spectrometry ;
FA, formic acid ; Hc, hemocyanin ; MALLS, multi-angle laser-light scattering ; MANOVA, multivariate
analysis of variance ; RDA, canonical redundancy analysis
Keywords : canonical redundancy analysis, crustacean, deep-sea hydrothermal vents, ESI-MS,
hemocyanin, hypoxia, lactate, Segonzacia mesatlantica, urate

182 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
Abstract
Segonzacia mesatlantica individuals were collected at deep-sea hydrothermal vents near the Azores
Triple Junction and exposed to temperature and oxygenation changes in pressurized chambers. Both
factors had a significant effect on hemolymph composition. At high temperature (20°C), magnesium
levels and the hemocyanin hexamer proportion were higher than at low temperature (10°C), but hemocyanin
content was higher at 10°C. Hemocyanin and calcium contents were also higher under high
oxygenation. In all acclimated crabs, urate concentrations were higher compared to control. No lactate
response was observed with an average basal level at 4 mM. Hemocyanin subunit composition was
determined by ESI-MS under each experimental condition ; no evidence for phenotypic plasticity as a
short-term adaptation was found under any of the experimental conditions used. Purified hemocyanin
had a high affinity for O 2 , a strong Bohr effect, a strong L-lactate effect, but was insensitive to urate.
The two former characteristics are typical of hydrothermal vent crustaceans, whereas the latter two
are different from other hydrothermal crabs.

5.4. MANUSCRIT : RESPIRATORY ADAPTATIONS OF S. MESATLANTICA 183
5.4.1 Introduction
Deep-sea hydrothermal vents are hypervariable environments in which the physical and chemical
properties of the water exhibit rapid and large changes. These vents are located on geologically active
zones such as oceanic spreading centers and subduction zones. Dense faunal assemblages live around
hydrothermal vents, in contrast to the usually low biomass of the deep-sea environment. Such ecosystems
rely on chemosynthetic bacteria for their primary production of organic carbon. Hydrothermal
organisms live in the mixing zone between the hot, anoxic, acidic and toxic hydrothermal fluid and
the cold oxygenated surrounding deep-sea water. The chaotic emission of hydrothermal fluid causes
fluctuations of the environmental variables both spatially and temporally, thereby modulating oxygen
availability. Since metabolic levels seem to be comparable between species from this environment and
shallow water species (Childress, 1995), hydrothermal vent animals must cope with these conditions
to maintain an adequate oxygenation of their tissues. Original respiratory adaptations are thus likely
to exist in such environments (Hourdez et Lallier, 2007).
Crustaceans are useful models for comparative physiology since they have colonized a wide range
of environments (marine, freshwater, terrestrial), including deep-sea hydrothermal vents. Segonzacia
mesatlantica is the only known endemic crab living on hydrothermal vents on the Mid-Atlantic Ridge.
Like all other endemic deep-sea hydrothermal brachyuran species described up to now, it belongs to
the Bythograeidae family. In decapod crustaceans, the respiratory pigment responsible for oxygen
transport from the gills to the tissues is the blue copper-protein hemocyanin (Hc). Hc is made of
non-covalent hexamers of 75 kDa subunits and can bind dioxygen reversibly on the two copper
atoms of the active site of each subunit (Markl et Decker, 1992). Different subunit types exist for
each species thus permitting potential combinatory diversity of the complexes. Hc is freely dissolved
in the hemolymph and its functional properties can be modulated by a wide range of effectors (pH,
temperature, divalent cations, L-lactate, urate, thiosulfate) (Bridges, 2001). The phenotypic plasticity
due to the different subunit types can also result in changes in the intrinsic affinity of the pigment for
O 2 (Giomi et Beltramini, 2007). All these regulatory mechanisms of Hc affinity enable crustaceans
to adjust the functional properties of their pigment to a variety of stressful conditions (hypoxia, high
temperature, exercise, terrestrial way of life).
Crustacean Hc affinity usually decreases with decreasing pH (normal Bohr effect) and with in-

184 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
creasing temperature (normal temperature effect). L-lactate, urate and thiosulfate are also well-known
positive modulators of Hc affinity (triggered by anaerobic metabolism, stress, or sulfide detoxification
for thiosulfate). Many crab species harbor Hc with original properties resulting from specific molecular
adaptations to the environmental conditions they live in. For example, one terrestrial crab Hc
has a reverse L-lactate effect (Adamczewska et Morris, 1998) ; Hc from the hydrothermal vent crab
Bythograea thermydron is sensitive to thiosulfate (Sanders et Childress, 1992) whereas shore crab Hc
is insensitive to it (Taylor et al., 1999).
Some specific functional adaptations of Hc are known for hydrothermal crustaceans. The intrinsic
affinity of their Hc is very high (2 to 5 Torr), as observed in others groups (annelids, molluscs) (Hourdez
et Lallier, 2007). The temperature effect is usually negligible or slightly inverse, which is adaptive
near hydrothermal vents since an increase in temperature is usually correlated with a decrease of the
oxygen content of the mixed water due to a higher fraction of anoxic fluid. Such a specific temperature
effect avoids a decrease of Hc affinity when animals are in the mixing zone which would result
in an impaired oxygen loading at the gills in the depleted water. The Bohr effect is also often very
strong for hydrothermal species, enabling an improved unloading of Hc near the active tissues. For the
L-lactate, urate and thiosulfate effects, such general trends cannot be observed and the Hc sensitivity
to each of them is rather species-specific.
A previous study of Segonzacia mesatlantica showed that the affinity of its Hc was high, with a
strong Bohr effect and a slightly reverse temperature effect (Chausson et al., 2004). Its hemolymph
had a large buffer capacity and Hc accounted for approximatively 31 % of the total protein content.
However, no other major protein was observed during Hc purification. Interestingly, structural studies
made on hemolymph pools from crabs exposed to hypoxia and hyperoxia suggested that Hc composition
could vary slightly between conditions (Chausson et al., 2004). This called for further study on
hemolymph samples from single crabs in order to confirm this hypothesis.
In this work, we used pressurized chambers coupled with a chemical regulation system in order
to acclimate Segonzacia mesatlantica individuals to different conditions of temperature and oxygenation.
Hemolymph composition and Hc structure and composition were determined for each condition.
Mass spectrometry was used to determine subunit composition of the Hc complex. Multivariate analyses
of variance were performed to test whether composition reacted to the experimental conditions
experienced by the crabs. The effect of allosteric effectors (L-lactate, urate, Mg 2+ ) on Hc affinity was
also determined.

5.4. MANUSCRIT : RESPIRATORY ADAPTATIONS OF S. MESATLANTICA 185
5.4.2 Materials and methods
Animal collection, acclimation under pressure and hemolymph sampling
Segonzacia mesatlantica individuals were collected during the Momareto 2006 oceanographic
cruise on the Mid-Atlantic Ridge. Animals were captured with a slurp-gun manipulated by the remotely
operated vehicle (ROV) Victor 6000. Collection sites were Lucky Strike (37°13.52’ N, 32°26.18’ W,
1600 m deep) for 58 animals and Rainbow (36°08.44’ N, 34°00.02’ W, 2200 m deep) for 5 animals.
Animals were either used for experiments on the day they were caught or kept at sea-level pressure at
4°C for up to 3 days depending on the availability of the pressurized chambers. In each experiment,
hemolymph from a control set of individuals was sampled at the beginning of acclimation for the
experimental set. Acclimation lasted for approximately 16 h and took place in three 1-liter pressurized
chambers DESEARES (Sarrazin et Sarradin, 2006) for which pressure can be set between 1
and 300 atm. These chambers were provided with surface seawater by the SYRENE system (described
in Chausson et al. (2004)) enabling regulation of the gas content and pH. The chambers were
thermostated by a water-jacket system and the pressure was set to 160-170 atm, corresponding to
the Lucky Strike bottom pressure. The same pressure was used for all crabs to keep the acclimation
results comparable between sites. Two temperatures and two oxygen levels were tested, leading to
four experimental conditions : cool normoxia, hot normoxia, cool hypoxia, hot hypoxia. Temperature
was comprised between 9 and 13°C in the cool conditions and 18 and 22°C in the hot conditions.
These temperature levels are referred to as the 10°C and the 20°C conditions, respectively. O2 content
was approximately 170 µM (range 140-200 µM) for normoxia and 60 µM (range 40-70 µM) for hypoxia.
For control and experimental individuals, hemolymph was withdrawn from the arthropodial
membrane of a walking leg with a syringe and immediately put on ice, then frozen at -80°C. Before
analysis in the lab, samples were thawed on ice and centrifuged for 15 min at 10000 rpm to pellet
coagulated proteins and cells ; the supernatant was kept on ice until analysis. Some samples were
frozen and thawed twice since they were used in another study (oxidative stress).
Hemolymph composition
Protein content - Total protein content was determined using a Biuret assay with BSA standards
(Sigma-Aldrich).
Hemocyanin content - Hc concentration was determined with the method described by Sanders
and Childress (Sanders et Childress, 1992). Briefly, hemolymph is diluted 1 :100 in a 50 mM Tris,
0.05 mM EDTA, pH 8.9 buffer and absorbance is read at 347 nm. The extinction coefficient used for
Hc is 0.269 l.g-1.cm-1.

186 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
Sodium and potassium - Sodium and potassium concentrations are determined using a flame photometer
(Radiometer FLM3, Copenhagen, Denmark).
Calcium and magnesium - calcium and magnesium concentrations were determined using the
colorimetric kits Ca-kit 61041 and Mg-kit 61411 from Biomérieux, France.
L-lactate and urate - L-lactate and urate concentrations were determined using the L-lactic acid
Enzytec fluid kit from Scil Diagnostics GmbH, Germany and the AU PAP 150 kit from Biomérieux,
France.
Hemocyanin purification
Native hemolymph was analyzed by size-exclusion chromatography (SEC) using a Superose-
6 10/300 GL column (Amersham Bioscience) at an elution rate of 0.5 ml/min with a crustacean
physiological saline buffer (500 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgSO4, 20 mM CaCl2, 50 mM
Tris, pH 7.8, modified from Chausson et al. (2004)). Absorbance was recorded at 280 nm and 340 nm
for protein and Hc detection, respectively. Complex proportions were determined using the area under
each Hc elution peak.
For purification, native hemolymph was injected and complexes were separated using the same
method but at an elution rate of 0.25 ml/min. Dodecameric and hexameric fractions were collected
and concentrated on centrifugal filters (10 kDa Microcon - Millipore).
Multi-angle laser-light scattering (MALLS)
Native mass of the Hc complexes was determined using multi-angle laser-light scattering. A
MALLS device (Dawn EOS, Wyatt Technology, USA) was connected at the end of the SEC system
previously described, along with a refractive index (RI) detector (Waters 2414). The dn/dc value
taken for Hc is 0.190 ml/g, typical of non-glycosylated proteins. Masses are determined using the Astra
4.90.08 software (Wyatt Technology, USA) and employing the Zimm fit method. Normalization
of the signals from the MALLS detectors was performed using BSA (Sigma).
Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
Hemocyanin samples were analyzed by ESI-MS in non-covalent (supramolecular ESI-MS) and
in denaturing conditions in order to determine the masses of the complexes and of their constituting
subunits, respectively. Analyses were performed on 25 individuals, for each of which whole hemolymph
was analyzed in non-covalent and denaturing conditions and purified dodecamers and hexamers
were analyzed in denaturing conditions. All samples used for ESI-MS were desalted through
concentration-dilution cycles using 10 kDa Microcon (Millipore) prior to analysis. Typically, 30 µl of

5.4. MANUSCRIT : RESPIRATORY ADAPTATIONS OF S. MESATLANTICA 187
native hemolymph diluted in 470 µl 10 mM ammonium acetate (AcNH 4 ), pH 6.8 or 250 µl of purified
sample (protein concentration about 1-3 µg/µl) were first concentrated to almost dryness and then resuspended
in 400 µl 10 mM AcNH 4 . At least 10 successive similar concentration-dilution steps were
performed in order to ensure that the samples were correctly desalted prior to ESI-MS analysis. The
samples were stored at 4°C in 10 mM AcNH 4 until analysis. The desalting was realized just prior to
MS analysis and desalted samples for non-covalent analysis were not kept more than 2 days at 4°C
because of dissociation occurring upon longer storage.
Mass spectrometry experiments were performed on a MicroTOF instrument (Bruker Daltonics,
Bremen, Germany) equipped with an ESI source.
For non-covalent analysis, desalted samples were diluted in 10 mM AcNH 4 at a final concentration
of approximately 1.5 µM (for 900 kDa dodecamers). The injection rate for the samples was 4 µl/min.
The nebulization voltage was set to 5 kV, nebulization gas (N 2 ) pressure was 1 bar, drying gas flow was
4 l/min, source temperature was 200°C and the capillary exit voltage was set to 400 V. The calibration
was made using 1 mg/ml CsI in water/isopropanol (50 :50 volume). The acquisition range was 500 to
20000 m/z. Spectra were smoothed using a Savitzky-Golay method and baseline subtracted. Complex
masses were estimated using an in-built ruler (Bruker DataAnalysis v3.2 software).
For denaturing analysis, desalted samples were diluted in a water/acetonitrile/formic acid mix
(H 2 O/ACN/FA 50 :50 :1 volume) at a final concentration of approximately 4 µM (for 75 kDa subunits).
The nebulization gas (N 2 ) pressure was 0.3 bar, drying gas flow was 3 l/min, and the capillary
exit voltage was set to 160 V. Calibration was performed using myoglobin (Sigma-Aldrich). Mass
spectra were analyzed using maximum entropy deconvolution (Bruker DataAnalysis v3.2 software).
Determination of O 2 -binding properties of hemocyanin
Oxygen equilibrium curves were recorded with a modified diffusion chamber (Sick et Gersonde,
1969) using the step by step method (Bridges et al., 1979, Lallier et Truchot, 1989)). A 3-5 µl sample
was used for saturation measurements ; gas mixtures (N 2 and O 2 ) were prepared using mass flow
controllers (MKS Instruments) connected to a multi gas controller unit (647B) and the absorbance
of the sample was monitored at 340 nm. Samples were washed in the crustacean physiological saline
buffer described above by at least 7 concentration-dilution steps using centrifugal filters (10 kDa Amicon,
Millipore). For determination of the magnesium effect, samples were washed in an Mg 2+ -free
saline buffer and mixed with physiological saline buffer containing various concentrations of Mg 2+ .
The Mg 2+ experiments were simultaneously led on Carcinus maenas hemocyanin. For determination
of the Bohr effect and of the L-lactate and urate effects, the Hc samples washed in the saline buffer
were mixed with identical buffer containing various concentrations of L-lactate (Sigma) and urate

188 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
(Sigma), or buffered at a different pH with HCl or NaOH solutions. All experiments were performed
at 15°C ; the pH of an identical sample was simultaneously determined using a microelectrode
(Orion, Thermo Corporation). Saturation of the sample for each PO2 step was determined from the
absorbance measurement at 340 nm and the P 50 (P O2 for half-saturation) and n 50 (Hill coefficient)
were determined using the Hill plot log(
S
(1−S) ) = f(log(P O2)) where S is the fractional saturation of
the pigment.
Statistical analyses
Multivariate analysis methods must be used to carry out analyses of the whole data sets of hemolymph
variables and of subunit compositions. Parametric multivariate analysis of variance (MA-
NOVA) could not be used since the number of individuals for each experimental condition or control
set was low (from 3 to 20 individuals). Canonical redundancy analysis (RDA) was used as a form of
MANOVA, as proposed by Legendre and Anderson (Legendre et Anderson, 1999). RDA uses permutation
tests of significance, which remain valid for small samples and non-normally distributed data.
We used RDA to test the significance of the effect of the experimental conditions and obtain biplot
graphs which present interesting representations of the relationships between the response variables
and the experimental conditions. The functions rdaTest and graph.rdaTest, written in the R language
by P. Legendre and S. Durand, were used for our analyses. See :
http ://www.bio.umontreal.ca/legendre/indexEn.html
5.4.3 Results
Hemolymph composition
Segonzacia mesatlantica hemolymph has a high protein content with an average value of 117 µg/µl
± 44 % for all crabs (standard deviation calculated for all crabs). A high variability exists between
crabs and values are comprised between 23 µg/µl and 200 and 282 µg/µl for the crabs with the highest
protein content. Hc is always the main hemolymph protein in all crabs and accounts for approximately
80 % of all proteins in the hemolymph (Figure 5.5a). This result is confirmed when samples are
analyzed by FPLC.
For all measured inorganic ions, concentrations are in the range of those observed for the shallow
water species Carcinus maenas (Robertson, 1960). For monovalent cations, sodium content is quite
stable with an average value of 490 mM ± 7 %. Potassium levels remain low but show a higher
variability than sodium with an average value of 10.7 mM ± 15 % (Figure 5.5b). These low potassium
levels confirm that the cellular integrity of individuals is conserved at the end of the experiments and

5.4. MANUSCRIT : RESPIRATORY ADAPTATIONS OF S. MESATLANTICA 189
FIG. 5.5 – Hemolymph composition for control and acclimated crabs for each experiment. (a) total
protein content and Hc/protein ratio ; (b) monovalent cations concentration ; (c) divalent cations
concentration ; (d) organic ions concentration. Bars are average values ± standard deviations. c,
control crabs, exp, experimental crabs, hypo, hypoxia, normo, normoxia. When present, the horizontal
dotted line represents the average value for Carcinus maenas hemolymph.

190 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
FIG. 5.6 – Hemocyanin complex proportion in Segonzacia mesatlantica hemolymph. (a) example of a
SEC-MALLS profile obtained for a "high-dodecamer" sample ; (b) example of a SEC-MALLS profile
obtained for a "high-hexamer" sample. Full line is the refractive index profile, dots are the calculated
masses from the MALLS data. 18, 12, 6, octadecamer, dodecamer and hexamer peaks, respectively.
(c) dodecamer and hexamer proportions under the different experimental conditions. Bars are average
values ± standard deviations. c, control crabs, exp, experimental crabs, hypo, hypoxia, normo,
normoxia.
that the crabs are globally in good health (Tentori et Lockwood, 1990). For divalent cations, average
calcium level is 13 mM ± 8 % and average magnesium level is 23 mM ± 18 % for all measured
crabs (Figure 5.5c). These levels are thus relatively stable with a higher inter-individual variability for
magnesium. Divalent cations are known to be potential modulators for Hc (Truchot, 1975).
Lactate and urate are crucial Hc modulators in numerous crustacean species and are typical of
an environmental and/or metabolic stress (Bridges, 2001). Lactate levels are high in all groups for
Segonzacia mesatlantica, with values ranging from 1.85 to 11.9 mM and an average value of 4.21 mM
± 33 %. The variability between individuals is very high for two groups (normoxia 10°C control and
hypoxia 20°C experimental groups) and relatively low in the other groups (Figure 5.5d). Urate levels
exhibit a very strong interindividual variability, with values ranging from 34.5 to 601 µM and an
average value of 191 µM ± 61 %. This variability is particularly high in hypoxia experimental groups
(Figure 5.5d). In general, urate levels tend to be higher in the experimental groups (see later in the text
for statistical analysis). The highest values observed for Segonzacia mesatlantica urate levels are very
high compared to Carcinus maenas (maximum value for C. maenas 221 µM, observed in temperature
and oxygenation stress experiments (Lallier, 1988)).
Dodecamer and hexamer abundances were also determined by FPLC. A higher proportion of

5.4. MANUSCRIT : RESPIRATORY ADAPTATIONS OF S. MESATLANTICA 191
hexamer is visible in all samples compared to shallow water brachyurans (average hexamer proportion
of 54 % for S. mesatlantica). This proportion varies from one crab to another, with values ranging from
33 to 66 % of Hc content. For Carcinus maenas fresh hemolymph, hexamer content is typically 5 to
20 % (personal observation). Figure 5.6 shows an example of a "high-hexamer" and a "low-hexamer"
sample analyzed by FPLC.
Canonical redundancy analysis of experimental effects
The effect of experimental conditions was tested using RDA, a non-parametric method enabling
to test if the multivariate response data from different experimental groups are significantly different,
without a priori assumptions about normality. It also permits to produce graphical representations of
the relationships between the response variables (in our case, 11 hemolymph variables) and the explanatory
variables representing the experimental conditions (Legendre et Legendre, 1998, Legendre
et Anderson, 1999).
The analysis was performed on the table of 11 measured response variables for 44 crabs for which
information without missing values was available (total protein, Hc, sodium, potassium, calcium, magnesium,
L-lactate and urate concentrations, dodecamer, hexamer and 18-mer proportions). For each
crab, the explanatory variables are the collection site, sex, size, number of thawings (some hemolymph
samples were thawed once before analysis for another study on oxidative stress), experimental
groups (one group for each of the 4 experiments ; in each group, the control crabs were dissected prior
to acclimating the others), and experimental conditions (control or acclimated crab, temperature and
oxygen levels if the crab was acclimated).
The interaction between oxygen and temperature effects must be tested first. If it is significant,
the main factors cannot be tested in a 2-way anova ; factor 1 has to be tested separately in each of
the classes of factor 2 and conversely. If the interaction is not significant, we do not have to take it
into account as a covariable in the tests involving the environmental variables. Coding variables were
created to represent the oxygen and temperature treatments and control/acclimated status of each
crab. A variable Control with mean 0 separated the 18 control crabs (coding value = 1/18) from the
26 acclimated animals (coding value = -1/26) ; a variable Oxygenation with mean 0 represented the
17 crabs submitted to hypoxia (coding value = -1/17), the 18 control crabs (coding value = 0), and
the 9 animals subjected to normoxia (coding value = 1/9) ; and a variable Temperature with mean 0
represented the 10 crabs subjected to 10°C (coding value = -1/10), the 18 control crabs (coding value
= 0), and the 16 animals subjected to 20°C (coding value = 1/16). An Interaction variable was created
by multiplying the corresponding values of the oxygen and temperature treatment variables. Control
was orthogonal (correlation r = 0) to the two variables representing the main factors, but because of

192 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
TAB. 5.2 – Summary of the forward selection results for the choice of covariables. Exp4 , Exp2 and
Exp3 are the experimental groups ; Site is the collection site. Since the power of the forward selection
is reduced for the small number of control crabs (18), variables with a p-value up to 0.10 were chosen
as covariables.
Variables R 2 Cumulative R 2 Cumulative adjusted R 2 p-value
Exp4 0.1625 0.1625 0.1102 0.0048
Size 0.1447 0.3073 0.2149 .0114
Site 0.0909 0.3982 0.2693 0.0674
Exp2 0.0457 0.4440 0.2729 0.3638
Exp3 0.0333 0.4773 0.2595 0.5637
Sex 0.0369 0.5142 0.2493 0.4845
the imbalance of the experimental design, it was not quite orthogonal to Interaction (correlation r =
0.06). For the same reason, Oxygenation was not quite orthogonal to Temperature (r = -0.09), and the
Interaction variable was not quite orthogonal to the main factors (r(Oxygenation, Interaction) = -0.06,
r(Temperature, Interaction) = 0.04). Lack of orthogonality means that the test of significance of the
Interaction term will be based upon type III sums-of-squares, which will result in slightly reduced
power for the test, due to a small interference from the two main factors whose sums-of-squares will
be taken into account in the analysis before computing that of the interaction.
The following variables represent conditions that may affect the physiological response of the
crabs to the experimental conditions : hydrothermal field of origin of the animals (site, binary variable
: Lucky Strike or Rainbow), sex (binary variable : male or female), width of the cephalothorax
(quantitative variable : size in mm), and whether or not the hemolymph had been unfrozen prior to
our measurement of the response variables for study on oxydative stress (binary variable : unfrozen).
The four experimental groups (exp1 to exp4) may also explain part of the variation in the response
variables. Forward selection of these variables against the 11 hemolymph response variables showed
that the variables site, size, and exp4 explained significant amounts of the variation in the table of
response variables (Table 5.2). These three variables were used as covariables (matrix W) during the
tests of the interaction and main factors.
The interaction was tested by performing an RDA on the 11 hemolymph response variables (Y),
with the interaction term as the explanatory variable (X) and temperature and oxygen added to the
other covariables (W). The interaction was found to be significant (R2=0.04, p-value=0.027) ; so, the
effect of each factor had to be tested separately in each of the classes of the other factor.
Both factors had very significant effects in both classes of the other factor. Oxygenation had an
effect at low (R2=0.12, p-value=0.028) and high (R2=0.12, p-value=0.005) temperature, and temperature
had an effect at low (R2=0.12, p-value=0.003) and high (R2=0.16, p-value=0.008) oxygenation

5.4. MANUSCRIT : RESPIRATORY ADAPTATIONS OF S. MESATLANTICA 193
FIG. 5.7 – Biplot graphs of the canonical redundancy analyses (RDA) performed between hemolymph
composition (descriptive variables Y) and acclimation conditions (explanatory variables X) along the
two first canonical axis. See the text for details on statistical analyses. Graphs were produced from an
RDA performed without covariable in order to avoid distortion of the explanatory variables by the covariables.
Dotted arrows, explanatory variables ; full lines, response variables. The analysis was made
for each factor separately in each class of the other factor since the interaction term was significant. (a)
Oxygenation effect under low temperature, (b) oxygenation effect under high temperature, (c) temperature
effect under low oxygenation, (d) temperature effect under high oxygenation, (e) example
graph. See the text for an interpretation of the example graph.

194 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
levels. The observed R2 values for the main factors are small but a large part of the variance was explained
by the covariables used (cumulative R2 for the three covariables : 0.40) ; so, the R2 values
of 0.12 to 0.16 for the main factors represent 20 to 26 % of the remaining unexplained variance.
The four resulting biplot graphs are depicted in Figure 5.7 ; for these representations, analyses were
rerun without the covariables in order to produce clear graphs, without distortion of the explanatory
variables by the covariables. Each graph has four explanatory arrows : the control or acclimated status
of the crabs, and the two states of the tested factor for acclimated crabs. The relationships between the
response variables and the explanatory factors can be described considering three main orientations,
as shown in Figure 5.7e : the α variable increases in acclimated crabs in condition "a", the β variable
increases in acclimated crabs in condition "b" and the γ variable decreases in all acclimated crabs.
The opposite directions correspond to a decrease in condition "a", in condition "b", and an increase in
acclimated crabs in both conditions, respectively.
Some general trends can be observed in all graphs : urate and sodium contents tend to increase
in all acclimated crabs regardless of the experimental conditions, and lactate content only slightly
correlates with the explanatory factors. It is also clear on the graphs that the dodecamer proportion
increases at 10°C and decreases at 20°C, independently of oxygenation (Figure 5.7a,b). Sodium is
more correlated with high temperature. Magnesium content decreases at low temperature and increases
at high temperature ; under high temperature it is more correlated with hypoxia. Calcium
content increases under high oxygenation, whatever the temperature is. Potassium content increases
under simultaneous high oxygenation and high temperature. Hemocyanin content increases under low
temperature and under high oxygenation.
Hemocyanin structure
Segonzacia mesatlantica Hc presents the classical dodecameric and hexameric assemblies, along
with a small amount of 18-meric complexes (Figure 5.6a,b). As already pointed out above, hexamer
proportion is high for a brachyuran crab, with a mean value of 54 % compared to typical values of
5-20 % for the shore crab Carcinus maenas (personal observation). Statistical analysis of the effect of
experimental conditions on complex proportions is presented above. The MALLS estimated masses
fit well with the expected masses of 1350 kDa, 900 kDa and 450 kDa for the 18-meric, dodecameric
and hexameric fractions, respectively. Native hemolymph samples were analyzed in supramolecular
ESI-MS (non-covalent conditions) (Figure 5.8). Hexamer and dodecamer are also the main complexes
detected by this method ; a lower amount of 18-mer and monomer are detected. Masses obtained by
supramolecular ESI-MS also fit unambiguously with the estimated masses of the complexes.
ESI-MS analysis in denaturing conditions gives access to the subunit composition of the Hc com-

5.4. MANUSCRIT : RESPIRATORY ADAPTATIONS OF S. MESATLANTICA 195
FIG. 5.8 – Examples of supramolecular ESI-MS spectra of Segonzacia mesatlantica native Hc. Whole
hemolymph was desalted in 10 mM AcNH 4 and analyzed in non-covalent conditions. (a) example of
a dodecamer-rich sample (9 % 18-mer, 48 % dodecamer, 43 % hexamer, proportions in mass as
measured by SEC), (b) example of an hexamer-rich sample.

196 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
FIG. 5.9 – Examples of ESI-MS deconvoluted mass spectra in denaturing conditions for purified
dodecamers (top) and purified hexamers (bottom) from the same individual. Desalted samples were
analyzed in a H 2 O/ACN/FA (50 :50 :1 volume) mix. Spectra were deconvoluted using maximum entropy
(Bruker DataAnalysis v3.2 software). Asterisks indicate the dodecamer-specific subunits which
were never detected in any hexamer sample. The masses for the 8 more abundant subunits on average
are indicated.

5.4. MANUSCRIT : RESPIRATORY ADAPTATIONS OF S. MESATLANTICA 197
FIG. 5.10 – Relative abundances of the 16 subunits in Segonzacia mesatlantica whole hemolymph
samples and purified complexes. Bars are average values ± standard deviation. Asterisks mark the
dodecamer specific subunits.
plexes. Purified dodecamers and hexamers from 24 crabs were analyzed and for 23 of these crabs
whole hemolymph samples were also analyzed. A very high subunit diversity exists for Segonzacia
mesatlantica, with 16 subunits identified (Figure 5.9). This diversity is higher than previously described
(Chausson et al., 2004). Two subunits were detected in dodecamer samples but never in hexamer
samples and are thus dodecamer-specific (75 749 Da and 75 870 Da, Figure 5.9). It was not determined
whether each detected subunit corresponds to a different polypeptide chain or if some subunits
are identical polypeptide chains with different post-translational modifications.
Relative abundances of the subunits were determined by measuring peak heights in the deconvoluted
spectra and by normalizing them with respect to the highest peak height. These values do not
reflect with certainty the abundances in solution since different subunits can be ionized with different
efficiencies in the ESI source. However, these values can be used for relative comparisons between
samples ; their use for statistical analysis is thus relevant. There was a very high inter-individual variability
in subunit abundances (Figure 5.10).
The 23 observations on whole hemolymph were used to test the effect of oxygenation and temperature
on subunit composition. The canonical analyses (RDA) were conducted as described above for
the effect of acclimation conditions on hemolymph composition. The 16 different subunits were used
for the analysis as response variables (Y). A forward selection was performed to determine which
explanatory variables among size, sex, site, and experimental groups were to be used as covariables.

198 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
Since the number of thawings could have had an effect on complex proportions or lactate and urate
contents but not on the subunit composition, this variable was not used for the forward selection. Only
sex and exp3 explained significant amounts of variance of the response variables (p-values lower than
0.1 ; 0.09 for both) and were kept as covariables in the following analyses. Experimental conditions
were described with the same method as above : a variable Control with mean 0 separated the 13
control crabs (coding value = 1/13) from the 10 acclimated animals (coding value = -1/10) ; a variable
Oxygenation with mean 0 represented the 6 crabs submitted to hypoxia (coding value = -1/6), the
13 control crabs (coding value = 0), and the 4 animals subjected to normoxia (coding value = 1/4) ;
and a variable Temperature with mean 0 represented the 3 crabs subjected to 10°C (coding value =
-1/3), the 13 control crabs (coding value = 0), and the 7 animals subjected to 20°C (coding value =
1/7). The Interaction variable was created by multiplying the corresponding values of the oxygen and
temperature treatment variables. There was also a small lack of orthogonality because of the imbalance
of the experimental design (r(Oxygen, Interaction) = 0.04, r(Temperature, Interaction) = -0.08,
r(Oxygenation, Temperature) = 0.09).
The interaction was tested by performing an RDA with the 16 subunit abundances as response
variables (Y), the Interaction term as the explanatory variable (X) and sex, exp3, Oxygenation and
Temperature as covariables (W). No significant interaction was found (R2=0.03, p-value=0.53). The
oxygenation and temperature effects were tested separately, with Oxygenation and Control or Temperature
and Control as explanatory variables and sex and exp3 as covariables. No significant effect
of either factor on subunit abundances in the native samples was found (R2=0.11, p-value=0.19 for
oxygenation ; R2=0.12, p-value=0.09 for temperature). Results were not significant either when only
the 8 more abundant subunits were considered.
The next step was to determine whether the subunit composition was different between hexamers
and dodecamers, in addition to the two dodecamer-specific subunits. For this, the 24 experiments on
purified complexes were associated into a single data set with 48 observations (24 rows for dodecamer
and 24 rows for hexamer composition) and a dummy binary variable accounting for the type of complex
analyzed was created (Dodecamer = 1 for dodecamer or 0 for hexamer). Using the 16 subunits in
a univariate permutation test against the complex type, without covariables, gave a significant p-value
of 0.003. For clarity, the analysis was rerun with only the 8 more abundant subunits and gave a p-value

5.4. MANUSCRIT : RESPIRATORY ADAPTATIONS OF S. MESATLANTICA 199
FIG. 5.11 – Biplot graph of the canonical redundancy analysis (RDA) of the repartition of main subunits
between Hc dodecamers and hexamers. Dotted arrows, explanatory variables ; full lines, response
variables. Since only one canonical axis is present (the two explanatory variables "dodecamer" and
"hexamer" are colinear), the second axis used for the graphical representation is the first PCA axis of
the residuals.
proportions and the explanatory variables (X) were the subunit relative abundances. The test was not
significant (R2=0.57, p-value=0.959) and no change was observed when only the 8 more abundant
subunits were taken into account (R2=0.28, p-value=0.811).
Finally, a last analysis was led to determine whether the other hemolymph variables had a significant
effect on complexes proportions. The canonical analysis (RDA) was performed with the 3 complexes
proportions as response variables (Y) and the 8 hemolymph variables (protein, Hc, L-lactate,
urate, and inorganic ions contents) as the explanatory variables (X). No covariable was considered
since we examined the relationships between hemolymph composition and complex proportions in
all conditions. The effect of hemolymph composition on complex proportions is significant (R2=0.27,
p-value=0.001). The biplot graph shows that high dodecamer proportion and low hexamer proportion
are correlated with high protein (Hc) content and lower sodium concentrations, while 18-mer proportion
is positively correlated with calcium content and negatively with lactate, urate, magnesium and
potassium contents (Figure 5.12).
Hemocyanin properties
Hemocyanin washed in crustacean physiological saline buffer was used to study the effect of pH,
L-lactate, urate and Mg 2+ on its oxygen affinity. Segonzacia mesatlantica Hc has a very strong affinity
for oxygen (P 50 =1.1-1.4 Torr at 15°C, pH 7.61). The Bohr effect is very pronounced (-1.4 to -2.7)
compared to Carcinus maenas (-0.66 at pH 7.6 (Lallier, 1988)). S. mesatlantica Hc is also sensitive

200 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
FIG. 5.12 – Biplot graph of the canonical redundancy analysis (RDA) of the hemolymph composition
effect on complex proportions along the two first canonical axis. Dotted arrows, explanatory
variables ; full lines, response variables.
to L-lactate. Lactate curves were calculated with the assumption that lactate did not modify the Bohr
effect, even if lactate can alter the Bohr effect in some species. A second order polynomial was used
to fit P 50 values vs pH without lactate (log(P 50 ) = 0.9088pH 2 − 15.781pH + 67.625, r2=0.9847) and
the second and first order coefficients were kept for fitting with the data points with lactate, resulting
in a change in the third constant only. From these curves a L-lactate effect was calculated ( ∆log(P 50)
∆log[lactate] )
and had a value of -0.276 and -0.174 in another experiment (average = 0.225), compared to -0.095
for C. maenas (Figure 5.13). The cooperativity of S. mesatlantica Hc is quite low (1.28-2.58), which
could be due to the freezing and storage at -80°C (Morris, 1988).
When the urate effect was studied, no effect could be observed up to 333 µM urate (Figure 5.14).
The Bohr effect was not affected either. This is in contrast with the data for C. maenas ( ∆log(P 50)
∆log[urate] =-
0.22, (Lallier et Truchot, 1989)).
The magnesium effect was tested simultaneously on S. mesatlantica and C. maenas Hc. For both
species, affinity increased with increasing concentrations of Mg 2+ ; however the magnesium effect
was more pronounced for S. mesatlantica than for C. maenas ( ∆log(P 50)
=-0.24 vs -0.14, respectively)
(Figure 5.15). It was also clear during these experiments that C. maenas Hc had a much
∆log[Mg 2+ ]
higher
cooperativity than S. mesatlantica Hc (4.74-5.54 vs 1.83-2.06, respectively).

5.4. MANUSCRIT : RESPIRATORY ADAPTATIONS OF S. MESATLANTICA 201
FIG. 5.13 – L-lactate and pH effect on Segonzacia mesatlantica Hc affinity. Functional parameters
P 50 and n 50 were measured at different pH and with several L-lactate concentrations. Experiments
were performed at 15°C on physiological saline buffer washed hemocyanin from a single individual.
For comparison, data for Hc from the shore crab Carcinus maenas is also presented on the graph
(Truchot, 1980). For S. mesatlantica Hc, a second order polynomial was fitted to the P 50 values with
0 mM L-lactate. For fitting to the values in presence of L-lactate, the same equation was used and the
value of the constant term was adjusted to minimize the difference with the experimental points. This
is valid under the hypothesis that the Bohr effect is not affected by L-lactate, which is false for some
species. The value for the L-lactate effect is then calculated from the P 50 values at different L-lactate
concentrations interpolated at the same pH.

202 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
FIG. 5.14 – Urate effect on Segonzacia mesatlantica Hc affinity. Functional parameters P 50 and n 50
were measured with several urate concentrations. Experiments were performed at 15°C on physiological
saline buffer washed hemocyanin from a single individual. Given the smaller pH range and
number of points compared to the L-lactate experiment, simple linear regression was used to fit the
data. For comparison, data for Hc from the shore crab Carcinus maenas is also presented on the graph
(Lallier et Truchot, 1989).

5.4. MANUSCRIT : RESPIRATORY ADAPTATIONS OF S. MESATLANTICA 203
FIG. 5.15 – Magnesium effect on Segonzacia mesatlantica and Carcinus maenas Hc affinity. Functional
parameters P 50 and n 50 were measured with several magnesium concentrations for each species.
Experiments were performed at 15°C on physiological buffer washed hemocyanin from a single individual.
Data were fitted using simple linear regression. The magnesium effect is quantified by the
slope ∆log(P 50)
∆log[Mg 2+ ] .

204 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
TAB. 5.3 – Comparison of composition of sea water, hydrothermal fluid and hemolymph from various
decapod species. Values are mean ± s.d.
Species Group Location Na+ (mM) K+ (mM) Ca 2+ (mM) Mg 2+ (mM)
S. mesatlantica a Brachyura Hydroth. vent 491 ± 33 10.7 ± 1.6 13 ± 1.1 23 ± 4
C. praedator a Brachyura Hydroth. vent 479.6 ± 43.7 8.7 ± 2.2 14.9 ± 6.2 21.6 ± 9.3
B. thermydron a Brachyura Hydroth. vent 431.6 ± 73.4 6.9 ± 1.7 9.3 ± 4.5 19 ± 9.6
R. exoculata a Caridea Hydroth. vent 403.4 ± 37.4 5.4 ± 1.1 4.6 ± 1.5 14.2 ± 6.4
C. chacei a Caridea Hydroth. vent 451.8 ± 1.2 9.6 ± 0.8 4.8 ± 1 6.2 ± 0.7
M. fortunata a Caridea Hydroth. vent 518 10.8 17.9 11
C. affinis a Brachyura Deep sea 504.8 ± 19.2 8.8 ± 0.7 14.8 ± 4.6 19.5 ± 2.1
C. maenas Brachyura Shallow water 506.8 ± 16.9 b 9.07 ±0.83 b 26 c 16.2-21.5 d -40 c
Hydrothermal fluid (Lucky Strike) e 390 23.4 35.6 0
Standard deep-sea water e 468 10.2 10.3 52.9
Mix (10 % fluid for a 27°C mix) f 460.2 11.52 12.83 47.61
a Chausson (2001)
b personal data
c Truchot (1975)
d Tentori et Lockwood (1990)
e Charlou et al. (2000)
f Chausson et al. (2004)
5.4.4 Discussion
Hemolymph composition
The measured inorganic ions concentrations show that S. mesatlantica hemolymph is almost isotonic
to the surrounding sea water, except for Mg 2+ for which it is hypotonic. No particular difference
is observed compared to other hydrothermal and deep-sea species and to shallow water crab species,
except for the magnesium content which is generally lower in hydrothermal brachyurans compared
to shallow water ones (Table 5.3). For Bythograea thermydron, a strong hyporegulation of Mg 2+ was
observed over a large range of salinities (Martinez et al., 2001). Mg 2+ is an inhibitor of the neuromuscular
activity in crustaceans (Katz, 1936) and a negative correlation between general level of activity
and hemolymph Mg 2+ concentration has been observed in brachyuran crustaceans (Robertson, 1953).
The lower Mg 2+ level in hydrothermal vent crustaceans is close to the level in the more active crabs
such as C. maenas and P. marmoratus (Martinez et al., 2001) and is interpretable as a way to perform
faster and more important locomotive activity in an environment in which rapid fluctuations can occur
and force animals to move rapidly in response to a sudden stress (Chausson, 2001, Thiberge, 2006).
Thus, the proximity to the vent source does not induce marked modification of hemolymph inorganic
ion composition and hypo-regulation of Mg 2+ can be associated with the necessity for rapid locomotory
responses. The animals experience rapid fluctuations of salinities when foraging in the mixing

5.4. MANUSCRIT : RESPIRATORY ADAPTATIONS OF S. MESATLANTICA 205
zone and the average experienced ionic concentrations must be quite close to those of deep-sea water
on the whole.
Measured organic ions levels are high compared to shallow water species. The observed range for
L-lactate concentration is similar to those for other decapods, but a high basal level is evidenced by the
average value of 4 mM even in normoxia acclimations. This indicates that a basal level of anaerobic
metabolism may be triggered at all times in S. mesatlantica. Values of 5.57 ± 1.07 mM lactate were
recorded for freshly caught B. thermydron and 3.47 ± 0.5 mM in 24-48h maintained individuals (Sanders
et Childress, 1992), showing that high basal levels of lactate are found also for this hydrothermal
vent crab. The maximum observed value of 12 mM for S. mesatlantica is inferior to the 31.1 mM
found in hypoxic B. thermydron (Chausson, 2001), but this could be due to a hypoxia not severe enough
in our study. Higher levels could possibly be detected in tougher conditions. For urate levels, a
very high variability was observed between individuals. Urate levels measured in hydrothermal vent
crustaceans are generally high. The highest values measured here are well above those observed for
shallow water species and were always found in acclimated crabs, whatever the condition was. Urate
is a typical modulator present under stress in decapods (Bridges, 2001) ; the urate response to acclimation
indicates that the repressurization process in itself can be a stress, maybe due to the rapid rise
of pressure. This calls for control experiments with progressive increase of the pressure.
The hemolymph protein content is high for S. mesatlantica, as observed for other hydrothermal
crustacean species. This results in a higher oxyphoric capacity of the blood since hemocyanin is the
main protein present, as in other brachyurans/decapods. For an average value of 117 µg/µl Hc for S.
mesatlantica, the oxyphoric capacity is 1.56 mM O 2 compared to 0.97 mM O 2 for Carcinus maenas
(average value of 73 µg/µl Hc for 32 individuals, personal observation). A very high variabwility was
observed between individuals as in other species. The hemocyanin content is in contradiction with
previous results from Chausson (Chausson et al., 2004). In this study, a high protein concentration was
also observed but only 30 % of protein was identified as hemocyanin. Our results are in accordance
with the protein content but not on the hemocyanin content. Since the authors could not detect other
protein by FPLC, we hypothesize that the difference comes from the determination of hemocyanin
content in the previous study.
Hemocyanin structure
As previously described by Chausson and Sanglier (Sanglier et al., 2003, Chausson et al., 2004),
S. mesatlantica presents a typical decapod hemocyanin structure comprised mainly of dodecamers
and hexamers of ˜75 kDa subunits. The subunit diversity observed here is higher than previously described
with 8 major subunits and 8 minor subunits detected by denaturing ESI-MS. Only 4 subunits

206 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
were found previously, all of which are also observed in our study. Since the crabs came from different
sites (Menez Gwen for the previous study, Lucky Strike and Rainbow here), these differences
could be due to the existence of two separated population or to long term adaptations to different
conditions of pressure or of hydrothermal fluid composition. ESI-MS is the method of choice for
identifying such a high diversity among proteins so close in molecular mass. A high diversity was
also observed for Cyanagraea praedator with at least 8 different subunits (Chausson et al., 2001).
The observed hexamer proportion was always very high in S. mesatlantica, which is different from
what is generally observed for shallow water brachyuran species. Dodecamer is usually the main complex
in brachyurans, lobsters, crayfishes, hermit crabs species, and hexamer in isopods, krill, shrimps,
prawns, spiny lobsters (Markl, 1986, Markl et Decker, 1992, Terwilliger, 1998). This hexamer abundance
is also generally found in the other hydrothermal vent species, such as Bythograea thermydron
(26.8 % dodecamer) and Cyanagraea praedator (46.5 % dodecamer) (Lallier et al., 1998, Chausson,
2001). It is also the case for the terrestrial crab Ocypode quadrata (44 % dodecamer) (Johnson, 1987)
and two crabs from Amazon River (Dilocarcinus pagei cristatus, mainly hexamer, and Sylviocarcinus
pardalinus, 30 % dodecamer) (Bonaventura et al., 1979). For Segonzacia mesatlantica Hc complexes
are formed by non-covalent interactions since no covalently bound dimer of 75 kDa subunits was
ever detected. Two subunits were found to be dodecamer-specific and were never found in hexamer.
For some individuals (7/24), only one of the two subunit was detected from purified dodecamer, and
for one individual amongst 24 none of them was detected, suggesting that these subunits promotes
dodecamer assembly but the two of them are not compulsory. The canonical redundancy analysis
showed a consistent strong correlation between the occurrence of these subunits and the type of complex
analyzed, whereas the other subunits were non-specific of the complex type. Two subunits were
also dodecamer-specific in Cyanagraea praedator (Chausson et al., 2001). In numerous crustacean
species, dodecamer assembly is dependent on one or several specific subunits (Stöcker et al., 1988).
Response to acclimation to different conditions
In the hydrothermal zone, temperature and low oxygenation are correlated since a rise in temperature
indicates a higher fraction of the anoxic hydrothermal fluid in the mix. Hence, it is of interest
to know if crabs have a physiological response to high temperature, low oxygen, or both, if the same
response is triggered for high temperature when associated with normoxia rather than hypoxia, and reciprocally,
and what are the specific effects of these factors. The use of canonical redundancy analysis
provided a global view of how the response variables changed over the 4 experimental conditions.
The first observation is that both temperature and oxygenation had a significant effect, and that
their effect was different depending on the state of the other factor (significant interaction). One could

5.4. MANUSCRIT : RESPIRATORY ADAPTATIONS OF S. MESATLANTICA 207
have hypothesized that in an environment in which two stresses (high temperature and low oxygen)
are correlated, the physiological responses to them could have evolved to be triggered by only one of
the factors. Here both temperature and oxygenation had a separate, uncorrelated effect.
Mg 2+ levels increased at high temperature, particularly under low oxygenation, and decreased at
low temperature (average values are 25.1 mM at high temp, 19.2 mM at low temp and 22.8 mM in
control crabs). Mg 2+ is known to act as an anesthesiant that inhibits neuromuscular activity (Katz,
1936) and is often correlated with lower activity in Reptantia (Robertson, 1953). High Mg 2+ causes
relaxation in crustacean (Frederich et al., 2000) and is correlated with a lower heart activity (Walters et
Uglow, 1981). The same pattern was observed for the oxygenation effect at high temperature (average
values 25.75 mM for low O 2 , 23.2 mM at high O 2 ). Thus Mg 2+ increase was general in respiratory
stressful conditions. It has been shown that lower Mg 2+ level correlates with a higher heart rate and
a lower O2 consumption in polar species (Frederich et al., 2001). In S. mesatlantica it may act at
high temperature or low oxygenation by decreasing the metabolism of the crab and thus decreasing
its O 2 consumption. It has been showed for B. thermydron that high temperature induces an increase
of heart rate (Mickel et Childress, 1982a). Mg 2+ could limit the increase in heart rate due to the high
temperature in S. mesatlantica.
Both low temperature and high oxygenation conditions induced a strong production of hemocyanin.
This results in an improved oxyphoric capacity that would rather be expected and adaptive at
high temperature or at low oxygenation. A possible explanation for this is that whereas hemocyanin
biosynthesis was reactivated under pressure at low temperature or high oxygenation, it was not at high
temperature or low oxygenation because of the excessive metabolic cost.
No clear lactate response to acclimation was observed. On the contrary, urate levels increased in all
experimental crabs. This shows that a non-specific urate response to repressurization exists and thus
repressurization itself could be considered as a stress. This has also been observed for Paralvinella
grasslei for which higher levels of DNA damage were observed after 18 h in worms reacclimated
under pressure compared to worms kept at sea surface pressure (Dixon et al., 2002) ; in this precise
case oxidative stress can have been the cause since worms were acclimated with surface water with
higher O 2 contents than their natural environment. Note that the experimental hypoxia was moderate
and that crabs can undergo more severe hypoxia in their natural environment. The Pacific hydrothermal
vent crab Bythograea thermydron was found to be able to survive up to 12 h without O 2 (Mickel
et Childress, 1982b). Thus, it is possible that more severe hypoxia could have induced a lactate response,
but this was not tested since specimens were rare and precious and those available were not
exposed to conditions that could have been lethal to them and would have prevented using them for
physiological studies.
Na + levels were higher in acclimated crabs compared to the controls. The average values were

208 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
471.6 mM for control crabs and 503.8 mM for acclimated crabs. This reflects a change in ionic
regulation with Na+ being hyper-regulated after repressurization compared to the sea water salinity.
The cause and the role of this change are unclear. High calcium and potassium levels were correlated
with normoxia but no clear physiological interpretation can be made.
In most crustaceans, hypoxia, high temperature or stress usually induce a lactate and/or urate
response (Bridges, 2001). For hydrothermal vent crustaceans, a strong lactate response was observed
in Bythograea thermydron under severe hypoxia (31.1 mM lactate in 5 % O 2 ) and up to 20.4 mM
lactate was measured in Cyanagraea praedator after a 4h30 stabulation at atmospheric pressure.
Thus the absence of lactate response in S. mesatlantica is original. An absence of lactate response
was also observed in the buried isopod Saduria entomon which has only about 3 mM lactate after
144 h exposure to severe hypoxia (Hagerman et Szaniawska, 1988).
Response in term of phenotypic plasticity / Hc structure
Phenotypic plasticity has been observed in several species during development (Cancer magister)
(Terwilliger et Terwilliger, 1982, Terwilliger et Dumler, 2001) or in response to environmental
changes (Callinectes sapidus, Panulirus elephas, Panulirus mauritanicus) (Bellelli et al., 1988, Condó
et al., 1991, Mangum, 1994). In our study, no effect of acclimation condition was found on the subunit
composition for S. mesatlantica. Thus phenotypic plasticity at the subunit level is not involved
in the physiological response to respiratory stresses under the conditions tested here. The short term
adaptation in our crabs must be rather hemolymphatic than phenotypic. It can be interpreted in term
of metabolic cost : the cost of protein synthesis for short time adaptation (16 h) must be higher than
a hemolymphatic response such as urate production or a local acidification near metabolizing tissues
coupled with a strong Bohr effect.
A strong response in complex proportions was observed, with a higher proportion of hexamer in
high temperature acclimated crab and a higher proportion of dodecamer in low temperature acclimated
crabs. A similar difference in complex proportions under temperature adaptation was observed
for Astacus leptodactylus and was associated with a higher affinity of the hexamer (Decker et Foll,
2000). In our case, functional properties of purified complexes from a single individual could not
be investigated due to the low quantity of available material for each crab. The potential physiological
advantages for oxygen transport of this proportion adjustment are unclear. Previous studies have
shown similar properties for both complexes (Ocypode quadrata (Johnson, 1987)), a higher affinity
for the hexamer (Astacus leptodactylus, Callinectes sapidus (Mangum et al., 1991), Carcinus aestuarii
(Dainese et al., 1998)) or the dodecamer (Penaeus monodon (Beltramini et al., 2005), Litopenaeus
vannamei (y. Pan et al., 2008), Calappa granulata at high pH (Olianas et al., 2006)) depending on

5.4. MANUSCRIT : RESPIRATORY ADAPTATIONS OF S. MESATLANTICA 209
the species. Different thermal stability is not involved since it was shown that no dissociation occurs
upon incubation at 35°C (Chausson, 2001). In S. mesatlantica we observed a correlation between high
dodecamer proportion and high protein content : this enables to decrease blood viscosity and osmotic
pressure at the very high protein contents observed in some crabs (up to 200 µg/µl and 282 µg/µl),
compared to what it would be with the same protein quantity under the hexameric form. It must also
be noted that freezing can cause partial dissociation of dodecamers, as observed for several decapod
species Morris (1988). The correlation between sodium and protein concentration and the dodecamer
proportion can possibly reflect stabilizing effect of one complex or the other during freezing. The ideal
control experiment would be to perform SEC experiments on board on freshly sampled hemolymph.
An interesting alternative explanation is that hydrostatic pressure could have an effect on oligomerization.
Elevated hydrostatic pressure can modify chemical equilibria and rate constants depending
on the specific volumes and activation volumes of reactions and has an effect on ionic interactions,
hydrogen bonds and hydrophobic cores. Pressure can stabilize or destabilize protein conformation
depending on the type of interaction involved in the tertiary structure. Dissociation of oligomeric
proteins is usually promoted by high pressures (Gross et Jaenicke, 1994, Boonyaratanakornkit et al.,
2002). Glossoscolex paulistus giant hemoglobin is dissociated at pressures above 1 kbar (equivalent
to 10 000 m depth) (Silva et al., 1989). Lactate dehydrogenase apoenzyme is progressively dissociated/inactivated
at pressures comprised between 0 and 80 MPa (0 and 800 bar, equivalent to 8 000 m
depth) (Gross et Jaenicke, 1994). To our knowledge, all deep-sea crabs studied to date have higher
hexamer proportions than shallow-water crabs (including for a bathyal species non-endemic from
hydrothermal vents, Chaceon affinis (Chausson, 2001)). These proportions could reflect a specific
molecular adaptation of the oligomeric complexes to deep-sea pressure.
Functional properties
S. mesatlantica Hc had a very high affinity for O 2 and exhibited a strong Bohr effect. Along with
no or inverse temperature effect on affinity, this is a common feature of hydrothermal-vent crustacean
Hc and is adaptive in hypoxic environments for efficient loading at the gills and unloading near the
metabolizing tissues (Hourdez et Lallier, 2007).
The strong lactate effect observed and the absence of urate effect for S. mesatlantica is not typical
of hydrothermal species. Cyanagraea praedator Hc is insensitive to lactate (Chausson, 2001) whereas
lactate sensitivity is small for Bythograea thermydron Hc ( ∆log(P 50)
∆log[lactate]
=-0.06 (Sanders et Childress,
1992)), moderate for Rimicaris exoculata Hc (-0.12 (Lallier et Truchot, 1997)) and Chorocaris chacei
(-0.16 (Lallier et al., 1998)). From our data, L-lactate is not a physiological modulator of Hc for S.
mesatlantica given the occurrence of a strong lactate effect, a high basal lactate level and no lactate

210 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
response during acclimation. Interestingly, urate does not have a physiological effect on Hc affinity
either since Hc was insensitive to urate even if a strong urate response to acclimation was observed.
These two organic ions which are classic modulators in decapod crustaceans do not have a marked
role in the respiratory response in S. mesatlantica according to our data. This is in accordance with
some results from Cyanagraea praedator and Bythograea thermydron for which a lactate response
occurs but no or a very small lactate effect on Hc affinity is observed (Chausson, 2001).
A stronger effect of Mg 2+ on Hc affinity was observed for S. mesatlantica than for C. maenas.
Mg 2+ content increased in stressful conditions but the calculated effect for a change from 20 mM
to 25 mM Mg 2+ is -0.023 for log(P 50 ), while an increase from the average value of 4.2 mM to
5.6 mM lactate (1.4 mM being the standard deviation in our measures) results in a change of -0.027
for log(P 50 ) and of -0.1 for a 11.9 mM final lactate concentration (the maximum value observed). Thus
the intensity of the Mg 2+ is not negligible compared to the lactate effect for example, and provides
another interpretation for the increase in magnesium content observed at high temperature and in
hypoxia which would increase Hc affinity for oxygen and improve loading at the gills in the stressful
conditions.
Acclimation to our conditions did not result in a significant modulation of Hc affinity by the usual
organic modulators : Hc affinity is always high. Another effector is the hemolymph pH which could
not be measured on board during the cruise ; an acid-base response of the hemolymph of Segonzacia
mesatlantica during environmental stresses is not known yet but is likely to occur during hyperventilation
or exercise (avoidance of hydrothermal fluid). The high affinity without organic modulation is
adaptive for hypoxic media. Such a high affinity results in a 95 % saturation of the pigment even at an
oxygen arterial partial pressure of 3.9 Torr (without lactate at 15°C, pH 7.8) or 2.6 Torr (with 4mM
lactate at 15°C, pH 7.8), which in a very efficient pigment for O 2 extraction even in severe hypoxia.
Thus the main issue when exposed to stressful conditions may not be to improve extraction but to be
able to unload the bound O 2 near the active tissues, which can be facilitated by a strong Bohr effect.
The potential effect of pressure also has to be considered ; pressure can modify chemical equilibria
depending on the reaction volumes (Gross et Jaenicke, 1994). Structural studies of oxygenated and
deoxygenated Hc subunits from Limulus polyphemus have suggested the rotation of one of its three
domain by 8° upon oxygenation (Magnus et al., 1994). Work on complexes have led to "turning
wheel" and camera iris aperture models for describing the movement of the two trimer layer in Hc
hexamer upon oxygenation (Haas et al., 1993, Decker et al., 1996) ; Hc from the spider Eurypelma
californicum is less compact in the oxygenated form (Decker et al., 1996) and the distance between
the two oxygenated hexamers in a dodecamer of Homarus americanus Hc is shortened in the presence
of L-lactate (Hartmann et al., 2001). Based on these data, pressure could result in a decrease of Hc
affinity (the deoxygenated form being the more compact for Eurypelma californicum) and an increase

5.4. MANUSCRIT : RESPIRATORY ADAPTATIONS OF S. MESATLANTICA 211
of the lactate sensitivity (the lactate-bearing form being more compact for Homarus americanus)
compared to data collected at sea-surface pressure.
5.4.5 Conclusion
Segonzacia mesatlantica Hc has some common features present in hydrothermal crustacean Hc :
an intrinsic high affinity for O 2 , a strong Bohr effect and a high hemolymphatic concentration resulting
in a high capacitance. No phenotypic plasticity at the subunit level was involved in the respiratory
response to the conditions tested here but complex proportions varied according to temperature, with
an increased hexamer proportion at high temperature. The specific properties of each complex remain
to be determined to physiologically interpret this observation. Hemolymph composition responses
included a dramatic increase in urate levels in repressurized crabs, regardless of the experienced
conditions, a higher Hc level at low temperature and at high oxygenation, and higher magnesium
levels at high temperature and in moderate hypoxia. No lactate response was observed. Magnesium
can act at the metabolic level by decreasing the activity of the crab but also increases Hc affinity for
O 2 . Interestingly, S. mesatlantica Hc was sensitive to lactate but not to urate. This results in a physiological
uncoupling between the usual organic effectors of Hc and Hc properties since no effector
exhibits simultaneously a concentration response to stress and an effect on Hc affinity. This is also
the case in other hydrothermal crustaceans for lactate at least. The common adaptive strategies for
hydrothermal crustaceans can be summarized as 1) a constant high affinity of Hc for O 2 , but not or
weakly modulated by organic cofactors and temperature, for efficient loading at the gills in the whole
range of conditions they experience and 2) a strong Bohr effect to facilitate the unloading near the
metabolizing tissues. The absence of an excessively strong increase of affinity by L-lactate or urate in
hypoxia is adaptive since it permits to keep unloading O 2 at the tissues. Changes in complex proportions
and thiosulfate levels are also potential functional modulators for which further investigations
are needed. To reach an integrated understanding of the respiratory response in S. mesatlantica and
in other hydrothermal crustaceans, it would be of interest to measure physiological variables such as
ventilation, cardiac frequency and output, arterial and venous pH and oxygen partial pressure, and
oxygen consumption under various conditions including severe hypoxia and in the presence of sulphides.
These experiments should be made under pressure and the physiological rest status of the
individuals should be checked before applying the stress, since the urate data in our study suggest that
repressurization itself can act as a stressor.
Acknowledgments :
P. Legendre got involved in this research as recipient of a CNRS Associate Research Director-

212 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA
ship in Unité Mixte de Recherche #7144, Station Biologique de Roscoff, April to August 2008.
M.Bruneaux was funded by a MRT grant, n°18213-2005. The authors would like to thank the crews
of the N/O Pourquoi Pas ? and the ROV Victor 6000 and all the participants to the MoMARETO 2006
cruise. The MoMARETO 2006 cruise was part of the Exocet/D project.

5.5. BILAN ET PERSPECTIVES 213
5.5 Bilan et perspectives
La réponse de Segonzacia mesatlantica aux conditions testées indique que les adaptations pour
le transport par l’Hc ont lieu principalement au niveau de la composition de l’hémolymphe et que la
plasticité phénotypique n’est pas mise en jeu. Cependant, il existe une grande variabilité des profils
de composition en sous-unités, à l’image de ce qui est observé chez Carcinus maenas.
Il semble exister un découplage fonctionnel entre la réponse aux variations du milieu et l’effet
des modulateurs organiques sur les propriétés du pigment. Cette caractéristique est différente de ce
qui est observé en milieu intertidal et pourrait permettre d’éviter une trop forte affinité du pigment
en conditions d’hypoxie environnementale, qui empêcherait un relargage correct aux tissus. Le principal
effecteur hémolymphatique serait donc plutôt le pH grâce au fort effet Bohr caractéristique des
espèces hydrothermales.
Afin d’obtenir une vue globale et intégrée des réponses respiratoires de S. mesatlantica, il serait intéressant
de pouvoir disposer de l’ensemble des variables respiratoires dans les différents conditions :
consommation d’oxygène, fréquences et débits ventilatoires et cardiaques, pH artériel et veineux. Il
est également à noter que, même en reproduisant la pression du fond, les conditions imposées différent
toujours des conditions réelles et représentent la meilleure approximation possible à cet instant de
ces conditions. Le développement d’appareils à mettre en oeuvre au fond serait un outil appréciable
(cage de respirométrie par exemple). Chez certaines espèces possédant des cuticules transparentes, il
est possible de visualiser les battements des scaphognathites sur les vidéos prises au fond et de les
corréler avec l’emplacement des individus au moment de la prise de vue (près d’une zone de diffusion
ou plus éloigné) (crevettes Alvinocaris sp., Decelle (2007)).

214 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRATOIRES DE S. MESATLANTICA

Chapitre 6
Conclusion et perspectives
215

216 CHAPITRE 6. CONCLUSION ET PERSPECTIVES
6.1 Conclusion générale
Les travaux réalisés pendant cette thèse avaient pour objectif de répondre à plusieurs questions
concernant les adaptations respiratoires à court terme et au niveau moléculaire des Crustacés Décapodes,
à travers l’étude de l’hémocyanine. La première question concernait l’aspect structural et
biochimique : quelles sont les modalités de l’interaction entre l’Hc et ses effecteurs allostériques ? La
deuxième question concernait l’aspect physiologique : quelles sont les réponses adaptatives à court
terme chez Carcinus maenas et Segonzacia mesatlantica face à des conditions environnementales
difficiles ? En particulier, la plasticité phénotypique des Hc est-elle impliquée dans l’adaptation aux
milieux hypervariables ?
6.1.1 Interactions entre l’Hc et ses effecteurs
A travers les études réalisées en ESI-MS chez Carcinus maenas, plusieurs caractéristiques structurales
de l’Hc ont été déterminées. Les résultats obtenus mettent en évidence des rôles différents de
chacune des sous-unités impliquées dans la formation des complexes d’Hc.
Une sous-unité spécifique est impliquée dans la formation du dodécamère chez C. maenas. Cette
sous-unité est nécessaire pour former les dodécamères et n’est pas présente dans les hexamères. De
même, deux sous-unités spécifiques du dodécamère ont été observées chez Segonzacia mesatlantica.
Deux autres sous-unités légères interagissent spécifiquement avec le L-lactate chezC. maenas. Le site
de fixation du L-lactate est formé par l’assemblage des sous-unités en complexe : le L-lactate ne peut
pas se fixer sur une sous-unité isolée. L’analyse des masses des hexamères révèle que les sous-unités
lourdes sont préférentiellement incorporées dans l’hexamère chez C. maenas.
Les cations divalents jouent un rôle important dans l’assemblage des sous-unités en complexes.
La formation de dodécamère est plus dépendante de ces ions que celle d’hexamère, soit à cause
d’une affinité moindre des sites de fixation de ces cations entre deux hexamères, soit à cause d’une
incorporation diminuée de la sous-unité spécifique du dodécamère dans les structures hexamériques
pour de faibles concentrations de cations divalents. L’interaction entre le L-lactate et les sous-unités
légères est peu dépendante de la concentration en cations divalents.
La diversité des sous-unités existantes dans les Hcs semble donc liée à l’existence de propriétés
différentes d’une sous-unité à l’autre. Les données disponibles chez d’autres Crustacés ont également
montré l’existence d’une spécificité pour la sensibilité au lactate, l’incorporation dans le dodécamère

6.1. CONCLUSION GÉNÉRALE 217
ou des affinités différentes pour l’oxygène. Le maintien de cette diversité de sous-unité au cours de
l’évolution peut être dû à la sélection d’un système souple et plastique dont les propriétés globales
(celles du complexe) peuvent être modifiées par ajustement de la composition en sous-unités, comme
cela a été observé chez Callinectes sapidus ou chez Cancer magister pendant le développement par
exemple.
Les études structurales nous ont permis de mettre en évidence la diversité de fonction des sousunités
chez Carcinus maenas. Pour comprendre la physiologie respiratoire de cette espèce, ces résultats
biochimiques doivent être intégrés au niveau de la réponse globale lors d’un stress environnemental
afin de faire ressortir leur signification adaptative.
6.1.2 Adaptations respiratoires à court terme et plasticité phénotypique chez
Carcinus maenas
Les expériences réalisées montrent que la proportion des complexes d’Hc chez C. maenas n’est
pas modifiée à court ou à plus long terme lors d’une réponse à des changements de salinité ou à une
hypoxie. La plasticité phénotypique au niveau des sous-unités n’est pas non-plus impliquée dans la
réponse à des variations de salinité ou à une oxygénation variable. En revanche, la plasticité phénotypique
intervient lors d’une acclimatation à plus long terme à l’hypoxie (quelques jours) et se traduit
par une augmentation de l’abondance relative d’une sous-unité légère, les proportions des complexes
restant inchangées. Les données biochimiques acquises dans la première partie indiquent que cette
sous-unité interagit avec le L-lactate. Ce changement de composition peut ainsi avoir un effet physiologique
à l’échelle du transport de l’oxygène dans l’organisme en rendant l’Hc plus sensible au
L-lactate en hypoxie longue. L’interprétation complète et fine au niveau physiologique nécessitera de
déterminer les propriétés de fixation de l’oxygène pour ces complexes enrichis en sous-unités légères.
Le schéma global qui se dégage pour Carcinus maenas est donc plutôt une réponse aux stress
respiratoires à court terme par un ajustement ventilatoire, circulatoire, métabolique et au niveau du
pigment par une modulation par des effecteurs hémolymphatiques. La plasticité phénotypique ne
serait mise en route qu’à partir d’une certaine durée du stress, de l’ordre de quelques jours.
Les mécanismes observés pour Carcinus maenas correspondent à des adaptations sélectionnées
dans un environnement hypervariable côtier. L’approche comparée avec Segonzacia mesatlantica permet
de déterminer si ces mécanismes sont aussi mis en jeu dans un environnement hypervariable
hydrothermal.

218 CHAPITRE 6. CONCLUSION ET PERSPECTIVES
6.1.3 Adaptation respiratoire à court terme et plasticité phénotypique chez
Segonzacia mesatlantica
Les expériences réalisées en acclimatation avec Segonzacia mesatlantica ont permis de mettre en
évidence des caractéristiques originales de son Hc et de ses réponses aux stress respiratoires. Certaines
sont communes aux espèces hydrothermales : forte affinité du pigment pour l’oxygène et fort effet
Bohr par exemple, ainsi qu’une forte proportion d’hexamère d’Hc chez les Crustacés Décapodes
hydrothermaux. D’autres sont plus spécifiques : Segonzacia mesatlantica présente ainsi une forte
réponse en urate à l’acclimatation alors que son Hc y est insensible, et une absence de réponse en L-
lactate avec un niveau basal déjà élevé alors que son Hc y est très sensible. Ces résultats, associés à des
observations chez d’autres espèces de crabes hydrothermaux, suggèrent l’existence d’un découplage
fonctionnel entre les modulateurs organiques et les propriétés de l’Hc dû à l’absence de réponse en
concentration de modulateur ou à l’absence de sensibilité de l’Hc au modulateur. Ce phénomène
est différent de ce qui est observé chez de nombreuses espèces littorales où les stress respiratoires
induisent une réponse en concentration des modulateurs organiques qui ont eux-mêmes un effet sur
l’affinité du pigment.
Dans les conditions testées (16 h), aucune plasticité phénotypique au niveau des sous-unités n’a
pu être mise en évidence chez Segonzacia mesatlantica. Ces résultats rejoignent ceux concernant
Carcinus maenas pour la réponse à court terme. En revanche, il semblerait que les proportions des
complexes soient affectées par les conditions d’acclimatation. Afin de vérifier la pertinence physiologique
de cette observation, il serait nécessaire de purifier suffisamment de complexes à partir d’un
individu pour pouvoir caractériser leurs propriétés de liaison à l’oxygène.
Les mécanismes mis en jeu chez Segonzacia mesatlantica sont donc pratiquement indépendants
des effecteurs organiques et la plasticité au niveau des sous-unités n’est pas impliquée. Son Hc présente
constitutivement une affinité forte et principalement modifiée par le pH et la température, ainsi
que par un effet éventuel des proportions des complexes.
6.1.4 Comparaison entre les milieux hypervariables : le côtier face à l’hydrothermal
Les deux environnements étudiés sont tous deux hypervariables ; les conditions physiques et chimiques
déterminant la disponibilité de l’oxygène pour les animaux qui y vivent varient dans une
gamme très large et rapidement. Les mécanismes d’adaptation à court terme dans les deux espèces
modèles étudiées ne font pas intervenir la plasticité phénotypique au niveau des sous-unités. Chez
C. maenas, la réponse à court terme est donc essentiellement hémolymphatique. Chez Segonzacia me-

6.1. CONCLUSION GÉNÉRALE 219
satlantica, de manière étonnante, le découplage fonctionnel observé entre les effecteurs organiques
et l’Hc suggèrent que la réponse hémolymphatique joue un rôle faible. Les deux espèces modèles
différent beaucoup par cet aspect. Quelle peut être la raison de cette différence ?
Les deux milieux étudiés sont hypervariables mais présentent des caractéristiques différentes :
en milieu intertidal, les périodes d’immersion à marée haute correspondent à des périodes de repos
respiratoire dans la mesure où l’eau est tamponnée en température, en salinité et en oxygénation.
C. maenas rencontre donc des périodes sans stress respiratoire lié à son environnement. De plus, si
les périodes d’émersion peuvent présenter des variations apériodiques et imprévisibles des conditions
rencontrées (pluie, vent, soleil), les périodes régulières d’immersion permettent un retour à des conditions
stables. Dans le milieu hydrothermal, il n’existe pas de période récurrente similaire de trêve
respiratoire pour les individus ; ils peuvent éventuellement s’éloigner des zones d’émission pour aller
vers l’eau de mer du fond mais leurs activités de nourrissage nécessitent une présence fréquente dans
la zone de mélange. Les observations au fond révèlent également que les crabes sont présents le plus
souvent au niveau de cette zone. Le temps effectif passé dans des conditions de stress respiratoire doit
donc être plus important pour S. mesatlantica. L’affinité intrinsèque plus forte de l’Hc et le niveau
basal élevé de L-lactate observé confortent cette hypothèse.
C. maenas présente donc plutôt une stratégie lui permettant de s’adapter périodiquement, de manière
rapide, à des épisodes de stress respiratoire. Les propriétés de l’Hc peuvent être modulées sur
une large gamme par différents effecteurs et une grande plasticité fonctionnelle existe. S. mesatlantica
présenterait plutôt une stratégie de réponse permanente à un stress respiratoire de l’environnement.
L’Hc est très affine mais la plasticité fonctionnelle est moindre ; dans ce cas, il semble y avoir désactivation
de certains mécanismes augmentant l’affinité de l’Hc en conditions difficiles (réponse lactate,
effet urate) ce qui permettrait d’éviter d’empêcher le relargage au niveau des tissus. Le fort effet Bohr
est alors important pour favoriser le chargement aux branchies et le déchargement aux tissus.
On peut schématiser ces adaptations en distinguant trois niveaux successifs dans les contraintes
imposées par le milieu : le premier niveau est un milieu parfaitement tamponné et oxygéné, dans
lequel l’affinité du pigment reste relativement faible en raison de l’absence d’épisode hypoxique.
C’est le cas des espèces vivant dans la zone infralittorale par exemple. Le deuxième niveau est un
milieu hypervariable avec des périodes régulières de "sauvetage" par l’eau libre, dans lequel l’affinité
du pigment est régulée sur une large gamme de P 50 par des mécanismes rapides. C’est le cas de C.
maenas et des espèces intertidales en général. Le troisième niveau est un milieu hypervariable sans
période régulière de "sauvetage" et présentant des gammes de conditions physiques et chimiques
très contraignantes, dans lequel l’affinité du pigment est constitutivement haute et serait peu régulée
face aux variations du milieu sauf à l’échelle des organes grâce à un fort effet Bohr. C’est le cas de
Segonzacia mesatlantica.

220 CHAPITRE 6. CONCLUSION ET PERSPECTIVES
D’après nos données, la plasticité phénotypique au niveau de la composition en sous-unités n’est
donc pas impliquée dans les réponses à court terme que ce soit chez C. maenas ou S. mesatlantica.
Cependant un stimulus plus long (saison) pourrait avoir un effet chez C. maenas dans l’environnement
naturel.
6.1.5 Evolution de la fonction de transport de l’oxygène chez les pigments respiratoires
Les Hcs d’Arthropode présentent, à partir de structures de base identiques (l’hexamère), une
grande variété de structures quaternaires et de propriétés fonctionnelles. Les différences entre les
structures observées chez les Chélicérates et chez les Crustacés illustrent la souplesse et la plasticité
du système. A travers l’étude des Hcs des Crustacés de différents milieux, la diversification des propriétés
de la forme dodécamérique montre une adaptation des propriétés aux contraintes de chaque
milieu. L’Hc d’Arthropode est une protéine dont les propriétés possèdent un large spectre potentiel
de P 50 et de sensibilité à différents effecteurs allostériques. Ce spectre peut être maintenu large pour
certaines espèces comme chez C. maenas, ou décalé et centré sur une gamme précise (haute affinité
par exemple) comme c’est le cas chez S. mesatlantica. Les Hcs des différentes espèces occupent en
quelque sorte des niches fonctionnelles différentes liées aux conditions du milieu de vie des espèces.
Les autres types de pigments respiratoires présentent également des gammes de P 50 et des propriétés
très différentes. Par exemple, l’affinité de la chlorocruorine est de l’ordre de plusieurs dizaines
de Torr chez Eudistylia vancouverii et celles de l’HBL-Hb est de l’ordre de quelques dixièmes de
Torr chez les Annélides hydrothermaux. D’un point de vue structural, le repliement de type globine
a pu évoluer en des pigments respiratoires très diversifiés (hémoglobines mono et multidomaines,
monomères et complexes).
La diversité actuelle des pigments respiratoires montre ainsi qu’à partir d’éléments de départ différents
(protéine héminique, site CuA de liaison du cuivre) des histoires évolutives indépendantes
peuvent avoir lieu en parallèle et présenter des convergences (haute affinité dans les milieux hydrothermaux).
La présence de groupes possédant des types de pigments différents dans les écosystèmes
extrêmes (Annélides, Crustacés, Mollusques) illustre qu’un même problème physiologique peut avoir
plusieurs solutions aussi performantes les unes que les autres et que la contingence joue un grand rôle
dans l’établissement de tels systèmes biologiques et le "choix" des solutions.
Il est également important de noter que les protéines désignées sous l’appellation de pigments
respiratoires peuvent avoir d’autres fonctions (e.g. détoxification des métaux ou des sulfures, réactions
de défense immunitaire) qui dépassent le cadre de la physiologie respiratoire et qui peuvent elles-aussi
être soumises à sélection. Il est donc important de ne pas perdre de vue dans les études sur les pigments

6.2. PERSPECTIVES 221
respiratoires que d’autres fonctions physiologiques peuvent aussi entrer en jeu et être régulées par ces
protéines.
6.2 Perspectives
6.2.1 Mécanismes moléculaires de la modulation de l’affinité
Afin de caractériser plus précisément les mécanismes moléculaires modifiant l’affinité de l’Hc, des
expériences de reconstruction tridimensionnelle en cryomicroscopie (cryoEM) du dodécamère d’Hc
dans différentes conditions (pH différents, avec et sans lactate) ont été entreprises en collaboration
avec Patrick Bron et l’équipe SDM dirigée par Daniel Thomas (UMR6026, CNRS Rennes I). Un
premier objectif est de déterminer s’il est techniquement possible de reconstituer un volume à partir
de préparations très salines (tampons physiologiques) au lieu des tampons peu salins habituellement
utilisés en cryoEM. Les premières analyses ont montré qu’il était possible de réaliser des images,
d’extraire des particules et de corriger correctement le signal malgré le bruit de fond dû aux sels. Des
reconstructions sont actuellement en cours pour répondre à la question biologique et des clichés ont
été réalisés pour 3 conditions : pH 7,8 sans lactate, pH 7,8 avec lactate, pH 8,2 sans lactate à 15°C.
6.2.2 Pourquoi une telle diversité de sous-unités ?
La plasticité phénotypique ne semble pas avoir de rôle à court terme dans les milieux hypervariables
; pourtant une grande diversité des sous-unités existe. Pour quelle raison cette diversité est-elle
maintenue au cours de l’évolution ?
Les études structurales de la première partie et celles réalisées chez d’autres espèces ont montré
que les sous-unités ne sont pas interchangeables et ont des propriétés différentes. La diversité permet
donc de maintenir un ensemble de propriétés qui ne sont pas présentes chez une seule sous-unité.
Cette diversité permet également des réponses par plasticité phénotypique sur le long terme (saison).
Le maintien de cette diversité permet a posteriori aux espèces de coloniser d’autres milieux et de
présenter une plus large gamme de sous-unités à la sélection. Pour tester l’hypothèse d’une sélection
d’un système plastique par la nécessité d’ajuster les propriétés du pigment, il serait intéressant de
comparer la diversité des sous-unités entre espèces vivant dans des milieux très tamponnés (espèces
abyssales) et celles vivant dans des milieux variables. Il n’existe pas de corrélation entre le profil de
sous-unités et les taxa des espèces ; peut-être existe-il une corrélation entre la complexité des profils
et la variabilité des environnements ?
Les expériences de type dissociation / purification des sous-unités et réassociation en complexes
homogènes permettent également de caractériser fonctionnellement les sous-unités et de préciser les

222 CHAPITRE 6. CONCLUSION ET PERSPECTIVES
avantages adaptatifs lors qu’un changement de composition du complexe en réponse à une acclimatation
à de nouvelles conditions.
6.2.3 Le passage du court terme au long terme
Les adaptations à court terme sont plutôt de type hémolymphatiques alors que celles sur le long
terme peuvent faire intervenir la plasticité phénotypique. D’un point de vue métabolique, ce changement
de stratégie peut correspondre à un équilibre entre un investissement (le changement de composition
en sous-unités) et les bénéfices (une affinité plus adaptée sans modification de la composition
de l’hémolymphe). Il serait intéressant de faire des expériences d’acclimatation à long terme avec
des prélévements quotidiens afin de déterminer précisément le rapport entre les réponses hémolymphatiques
et protéiques au cours du temps. Pour ce genre d’approche, les analyses en ESI-MS pour
caractériser les sous-unités ainsi que des analyses multivariées intégrant les données chimiques (composition
de l’hémolymphe), structurales et fonctionnelles permettrait de faire ressortir les tendances
fortes.
Pour confirmer l’implication de la plasticité phénotypique dans les adaptations à long terme chez
C. maenas, un suivi saisonnier d’une population naturelle de la zone intertidale serait pertinent. De
même, le suivi des profils d’expression des sous-unités au cours du développement (de la larve mégalope
à l’adulte) permettrait de déterminer s’il existe une régulation liée à l’ontogenèse comme cela
est le cas chez Cancer magister.
6.2.4 Le découplage entre effecteurs organiques et propriétés de l’Hc
Les données actuellement disponibles et qui suggèrent un découplage fonctionnel entre les effecteurs
organiques et les propriétés de l’Hc pour certains crabes hydrothermaux pourraient être complétées
par des études d’acclimatation sur d’autres espèces de Crustacés hydrothermaux (notamment crevettes)
et par des comparaison avec des espèces vivant dans d’autres milieux mais avec des contraintes
proches (boues anoxiques par exemple).
Il serait également nécessaire de vérifier pour Segonzacia mesatlantica si des conditions d’hypoxie
plus sévères que celles testées dans notre étude peuvent induire une réponse en L-lactate.
6.3 Vue intégrée des adaptations respiratoires
Pour des raisons pratiques, la plupart des études physiologiques s’intéressent à une étape en particulier
du transport de l’oxygène (ici, le transport par l’Hc). Afin d’obtenir une vue intégrée de la
fonction respiratoire, il est nécessaire de connaître d’autres variables et de pouvoir les intégrer dans

6.3. VUE INTÉGRÉE DES ADAPTATIONS RESPIRATOIRES 223
une perspectives globale : consommation d’O 2 , ventilation, circulation, pH artériel et veineux, P O2
artérielle et veineuse. La physiologie respiratoire ne peut être appréhendée et comprise que si toutes
les étapes du transport, du milieu aux mitochondries, ainsi que la régulation du métabolisme sont
connus. Il est également nécessaire de garder à l’esprit que l’organisme vit dans un environnement
donné, et de s’attacher à déterminer les réponses dans des gammes de conditions rencontrées dans la
nature.
Cette étude s’est basée sur une approche d’écophysiologie comparée pour essayer de mettre en
évidence les adaptations spécifiques à des milieux différents chez deux espèces du même groupe. Au
fur et à mesure que des données sont accumulées sur les adaptations chez différentes espèces et à
différents niveaux du transport de l’oxygène, il est important de toujours revenir à ce type d’approche
comparée afin de comprendre l’histoire évolutive de ces adaptations et quels sont les facteurs les
plus significatifs (contingence, contrainte du milieu) pour expliquer la sélection de ces mécanismes
physiologiques.

224 CHAPITRE 6. CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Annexes
225

Annexe A
Détermination des masses de deux complexes
éluant simultanément par SEC-MALLS
227

228 ANNEXE A. MASSES DE DEUX COMPLEXES CO-ÉLUANT PAR SEC-MALLS
1 Présentation des calculs
Pour les crabes estuariens prélevés dans l’estuaire de la Penzé, les données disponibles en SEC-
MALLS pour chaque échantillon sont les proportions en dodécamères et en hexamères déterminées
à 280 nm et à 337 nm (d 280 , h 280 , d 337 et h 337 ) et les masses estimées en malls (M d et M h ). On
a : d 280 + h 280 = 1 et d 337 + h 337 = 1. On note M f et M n f les masses des hexamères fonctionnel et
non-fonctionnel.
D’après l’hypothèse que le pic de dodécamère est constitué uniquement de dodécamère fonctionnel
alors que le pic d’hexamère est constitué à la fois d’hexamère fonctionnel f et d’hexamère
non-fonctionnel n f , on a : h 280 = h f + h n f et h 337 = h f où h f et h n f sont les proportions d’hexamère
fonctionnel et non-fonctionnel dans l’échantillon. On a donc : d 280 +h f +h n f = 1. On note M f et M n f
les masses des hexamères fonctionnel et non-fonctionnel.
La masse mesurée à chaque instant pour la fraction hexamèrique est M h = h f .M f +h n f .M n f
h f +h n f
. On a :
(h f + h n f ).M h = h f .M f + h n f .M n f
h f + h n f
.M h = h f
.M f + M n f
h n f h n f
h 280
h 337
.M h = .M f + M n f
h 280 − h 337 h 280 − h 337
h 280
h 337
En représentant
h 280 −h 337
.M h = f(
h 280 −h 337
), on obtient une représentation linéaire dont la pente
est la masse de l’hexamère fonctionnel M f et l’ordonnée à l’origine la masse de l’hexamère nonfonctionnel
M n f .
2 Application aux échantillons estuariens
h
Les données utilisées sont uniquement celles pour lesquelles 280
h 280 −h 337
.M h est positif. Il existe des
échantillons pour lesquels h 280 < h 337 en raison de l’imprécision sur la détermination de h 280 et h 337 .
Les valeurs de h 280 et h 337 dépendent des aires sélectionnées sous les profils d’absorbance et assignées
au pic "dodécamère" et au pic "hexamère" ; dans le pic "dodécamère" est inclus un épaulement à
gauche du pic correspondant à des agrégats qui peut varier entre les échantillons et qui influence
également la valeur h. Ces points aberrants sont éliminés de la régression linéaire. Il est cependant

229
10000
h280
.M h)
h280−h337
8000
6000
4000
2000
M f = 442kDa
(
0
-2000
M n f = 518,4kDa
-4000
-10 -5 0 5 10 15 20 25
(
h 337
h 280 −h 337
)
FIG. A.1 – Représentation linéaire pour la détermination des masses des hexamères. Les cercles pleins
sont utilisés pour la régression et les cercles ouverts sont exclus. L’ordonnée à l’origine correspond à
M n f et la pente à M f .

230 ANNEXE A. MASSES DE DEUX COMPLEXES CO-ÉLUANT PAR SEC-MALLS
inattendu de constater qu’ils correspondent bien avec la courbe de régression. Un échantillon pour
lequel la masse estimée de la fraction hexamérique est anormalement basse (370 kDa) a également
été exclu.
Les masses obtenues sont de 444 kDa et 518,2 kDa pour l’hexamère fonctionnel et le nonfonctionnel,
respectivement (R 2 =0,998) (figure A.1). Ces masses correspondent relativement bien aux
masses obtenues en spectrométrie de masse supramoléculaire pour un échantillon présentant deux distributions
de pics donnant des masses de 449 809 Da et 486 572 Da (cf partie xxx).
3 Généralisation et amélioration de la méthode
Il a été possible de déterminer la masse de deux composés éluant simultanément à partir de la
masse moyenne estimée en MALLS grâce à la connaissance de leurs proportions respectives dans
différents spectres. Le procédé peut être utilisé à partir d’un seul spectre présentant des zones de
mélange entre les différentes espèces en réalisant une déconvolution en pics gaussiens puis en appliquant
le même type de représentation, les différents points du graphique ne correspondant plus à
des échantillons différents mais à des acquisitions successives d’un même spectre pour lesquelles les
proportions des espèces sont connues grâce aux pics gaussiens et la masse moyenne est estimée par
le MALLS.
Dans notre exemple, les deux pics coéluent exactement en même temps mais la déconvolution
pourrait quand même être utilisée pour estimer plus précisément les proportions des hexamères.

Annexe B
Détermination des distributions de masse des
hexamères d’Hc de Carcinus maenas
231

232 ANNEXE B. DISTRIBUTIONS DE MASSE DES HEXAMÈRES
1 Principe
La distribution des masses des hexamères d’Hc à partir des données de spectrométrie de masse
peut être établie avec le modèle suivant : un hexamère est formé de l’assemblage de 6 sous-unités
prises au hasard dans un ensemble de 4 types de sous-unités principales, dont les masses sont 73922,
74043, 75073 et 75187 Da. On peut déterminer l’ensemble des masses possibles des complexes en
établissant la somme des masses de toutes les combinaisons possibles de sous-unités ; si on considère
que toutes les sous-unités ont la même probabilité d’être intégrées dans un hexamère, la probabilité
d’avoir un hexamère d’une masse donnée est le rapport entre le nombre de combinaisons de sousunités
donnant cette masse et le nombre total de combinaisons possibles. On peut établir des modèles
différents en imposant par exemple la présence d’une ou plusieurs sous-unités dans l’hexamère (imposer
la présence de sous-unités lourdes ou légères par exemple).
2 Implémentation dans le langage R
La distribution des masses selon les différents modèles a été déterminée en utilisant le langage R
pour calculer les masses de chaque combinaison.
Modèle 1 : 6 sous-unités aléatoires
masses_hexa=function() { ### 6 su aléatoires
liste_masses_hexa=NULL
masses_su=c(73922,74043,75073,75184)
for (i in 1:4) {
for (j in 1:4) {
for (k in 1:4) {
for (r in 1:4) {
for (s in 1:4) {
for (q in 1:4) {
liste_masses_hexa=append(liste_masses_hexa,masses_su[i]
+masses_su[j]+masses_su[k]+masses_su[r]
+masses_su[s]+masses_su[q])}}}}}}
return(liste_masses_hexa)}
masses_hexa1=sort(masses_hexa())

233
Modèle 2 : 2 sous-unités légères imposées
masses_hexa=function() { ### 4 su aléatoires, 2 légères imposées
liste_masses_hexa=NULL
masses_su=c(73922,74043,75073,75184)
for (i in 1:2) {
for (j in 1:2) {
for (k in 1:4) {
for (r in 1:4) {
for (s in 1:4) {
for (q in 1:4) {
liste_masses_hexa=append(liste_masses_hexa,masses_su[i]
+masses_su[j]+masses_su[k]+masses_su[r]
+masses_su[s]+masses_su[q])}}}}}}
return(liste_masses_hexa)}
masses_hexa2=sort(masses_hexa())
Modèle 3 : 2 sous-unités lourdes imposées
masses_hexa=function() { ### 4 su aléatoires, 2 lourdes imposées
liste_masses_hexa=NULL
masses_su=c(73922,74043,75073,75184)
for (i in 3:4) {
for (j in 3:4) {
for (k in 1:4) {
for (r in 1:4) {
for (s in 1:4) {
for (q in 1:4) {
liste_masses_hexa=append(liste_masses_hexa,masses_su[i]
+masses_su[j]+masses_su[k]+masses_su[r]
+masses_su[s]+masses_su[q])}}}}}}
return(liste_masses_hexa)}
masses_hexa3=sort(masses_hexa())
Modèle 4 : 3 sous-unités lourdes imposées
masses_hexa=function() { ### 3 su aléatoires, 3 lourdes imposées
liste_masses_hexa=NULL
masses_su=c(73922,74043,75073,75184)
for (i in 3:4) {
for (j in 3:4) {
for (k in 3:4) {
for (r in 1:4) {

234 ANNEXE B. DISTRIBUTIONS DE MASSE DES HEXAMÈRES
for (s in 1:4) {
for (q in 1:4) {
liste_masses_hexa=append(liste_masses_hexa,masses_su[i]
+masses_su[j]+masses_su[k]+masses_su[r]
+masses_su[s]+masses_su[q])}}}}}}
return(liste_masses_hexa)}
masses_hexa4=sort(masses_hexa())
Modèle 5 : 4 sous-unités lourdes imposées
masses_hexa=function() { ### 2 su aléatoires, 4 lourdes imposées
liste_masses_hexa=NULL
masses_su=c(73922,74043,75073,75184)
for (i in 3:4) {
for (j in 3:4) {
for (k in 3:4) {
for (r in 3:4) {
for (s in 1:4) {
for (q in 1:4) {
liste_masses_hexa=append(liste_masses_hexa,masses_su[i]
+masses_su[j]+masses_su[k]+masses_su[r]
+masses_su[s]+masses_su[q])}}}}}}
return(liste_masses_hexa)}
masses_hexa5=sort(masses_hexa())
3 Résultats obtenus
Les distributions de masses obtenues peuvent être représentées sous la forme d’une probabilité
cumulée en fonction de la masse des complexes (figure B.1). Selon le modèle utilisé, les masses
présentant les plus fortes probabilités sont différentes.
Alors qu’avec un modèle avec 6 sous-unités aléatoires la masse la plus probable est 447334 Da
et les deux masses les plus probables ensuite sont 446187 Da et 448479 Da, pour un modèle avec 3
sous-unités lourdes imposées les deux masses les plus probables sont 448479 Da et 449625 Da (à peu
près équiprobables) et pour un modèle à 4 sous-unités lourdes imposées la masse de 449625 Da est
plus probable.
En ESI-MS supramoléculaire, les masses les plus souvent observées pour les hexamères sont
448641 Da ± 85 et 449632 Da ± 210.

235
1
0.9
0.8
6 s-u aléatoires
2 s-u légères imposées
2 s-u lourdes imposées
3 s-u lourdes imposées
4 s-u lourdes imposées
Probabilité cumulée
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
442000 444000 446000 448000 450000 452000
Masses des complexes Da
FIG. B.1 – Distribution de masses des hexamères d’Hc de Carcinus maenas à partir des données
d’ESI-MS

236 ANNEXE B. DISTRIBUTIONS DE MASSE DES HEXAMÈRES
4 Conclusion
Le bon accord entre les masses théoriques les plus probables et les masses observées en ESI-
MS supramoléculaire suggère que 3 sous-unités lourdes sont préférentiellement incorporées dans les
hexamères d’Hc de Carcinus maenas. D’un point de vue quantitatif, cela suggère que ces sous-unités
seraient plus abondantes que les autres dans les fractions hexamèriques. Il est intéressant de noter
que pour les échantillons d’hexamères purifiés analysés en ESI-MS en conditions dénaturantes, les
sous-unités légères ont une abondance relative moyenne de 0,196 ± 0,048 et 0,195 ± 0,104 (sousunités
de 73922 Da et 74043 Da) et les sous-unités lourdes une abondance relative moyenne de 0,249
± 0,072 et 0,244 ± 0,13 (sous-unités de 75073 Da et 75187 Da). Même s’il n’est pas rigoureux de
comparer les abondances relatives de sous-unités différentes tant qu’il n’a pas été vérifié qu’elles
étaient ionisées de la même manière, ces proportions vont dans le sens de sous-unités lourdes plus
abondantes. Une séparation et un dosage des sous-unités par chromatographie d’affinité par exemple
permettrait de vérifier cette hypothèse.

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Liste des figures
1.1 Cycle des marées et émersion des côtes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2 Diagramme de Hjulström . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3 Evolution des paramètres physiques et chimiques dans des cuvettes intertidales . . . 9
1.4 Influence du mode sur l’étagement en milieu rocheux . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.5 Localisation des principaux sites hydrothermaux profonds actuellement connus . . . 12
1.6 Fonctionnement d’un site hydrothermal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.7 Schéma de la zone de mélange hydrothermale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.8 Fluctuations des conditions physiques et chimiques près d’un diffuseur hydrothermal 18
1.9 Voies de fixation du carbone chez les autotrophes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.10 Spécimens de Carcinus maenas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.11 Aire de répartition de Carcinus maenas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
1.12 Spécimens de Segonzacia mesatlantica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.13 Schéma du transport des gaz respiratoires entre les compartiments d’un organisme . . 25
1.14 Effet d’un pigment respiratoire sur la capacité oxyphorique et la capacitance . . . . . 30
1.15 Structure de la myoglobine de Cachalot et de l’hémoglobine de Lombric . . . . . . . 34
1.16 Monomère et octamère d’hémérythrine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
1.17 Structure de l’hémocyanine de Mollusque . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
1.18 Effet de l’affinité et de la coopérativité sur le chargement de l’oxygène . . . . . . . . 40
1.19 Représentation de Hill . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
1.20 Représentation de Hill du modèle Monod-Wyman-Changeux . . . . . . . . . . . . . 43
1.21 Structure cristallographique de l’hémocyanine de Panulirus interruptus . . . . . . . 46
1.22 Site actif de l’hémocyanine de Panulirus interruptus . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
1.23 Différentes structures quaternaires des Hcs d’Arthropodes . . . . . . . . . . . . . . 48
1.24 Hémocyanine de Carcinus maenas vue en microscopie électronique . . . . . . . . . 49
2.1 Principe d’un spectromètre de masse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
2.2 Principe de l’ESI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
253

254 LISTE DES FIGURES
2.3 Principe des analyseurs quadripôle (Q) et temps de vol (TOF) . . . . . . . . . . . . . 60
2.4 ESI-MS supramoléculaire et dénaturante appliquées à l’Hc de Crustacé . . . . . . . 64
2.5 Induction d’un dipôle oscillant sous l’effet d’un laser . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
2.6 Diffusion de lumière d’un dimère . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
2.7 Schéma d’un système SEC-MALLS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
2.8 Profil SEC-MALLS typique de l’hémolymphe de Carcinus maenas . . . . . . . . . . 68
3.1 Structure du L-lactate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
3.2 Différentes modalités hypothétiques de fixation du L-lactate à l’Hc . . . . . . . . . . 106
3.3 Mass spectrum of Carcinus maenas native hemolymph analysed in non-covalent conditions
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
3.4 Alkaline dissociation of Carcinus maenas hemocyanin by TEA . . . . . . . . . . . . 118
3.5 Acidic reassociation of Carcinus maenas hemocyanin by formic acid . . . . . . . . . 120
3.6 Acidic reassociation of Carcinus maenas hemocyanin by lactic acid . . . . . . . . . 122
3.7 Alkaline dissociation and formic acid reassociation of purified Carcinus maenas hemocyanin
dodecamers and hexamers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
3.8 Alkaline dissociation and acidic reassociation of Carcinus maenas hemocyanin coupled
with chelation of divalent cations by EDTA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
4.1 Spectres FPLC d’hémolymphe de crabes acclimatés à une hypo ou une hypersalinité 142
4.2 Détermination des pics gaussiens d’un échantillon hyposalin . . . . . . . . . . . . . 143
4.3 Biplot de l’effet de la salinité sur l’abondances des différents complexes . . . . . . . 144
4.4 PAGE natif sur hémolymphe de crabes acclimatés à différentes salinités . . . . . . . 144
4.5 Conditions d’acclimatation en laboratoire pour C. maenas . . . . . . . . . . . . . . . 146
4.6 PAGE natif des échantillons acclimatés à différentes salinités . . . . . . . . . . . . . 148
4.7 Spectre ESI-MS des complexes natifs d’Hc de Carcinus maenas . . . . . . . . . . . 150
4.8 Spectre ESI-MS des complexes natifs d’Hc présentant un hexamère particulier . . . . 151
4.9 Spectre ESI-MS en conditions dénaturantes d’hexamère de Carcinus maenas . . . . 152
4.10 Spectre ESI-MS en conditions dénaturantes de dodécamère de Carcinus maenas . . . 153
4.11 Abondance des sous-unités en normoxie et en oxygénation variable . . . . . . . . . 154
4.12 Abondances relatives des sous-unités en acclimatation couplée à l’hypoxie et à différentes
salinités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
4.13 Effet de l’acclimatation en hypoxie sur la composition en sous-unités . . . . . . . . . 158
4.14 Sites de prélévement des populations estuariennes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160
4.15 Profil SEC-MALLS de l’hémolymphe d’un crabe du Pont Eon . . . . . . . . . . . . 162
4.16 Profil SEC-MALLS de l’hémolymphe d’un crabe du Pont de la Corde . . . . . . . . 163

LISTE DES FIGURES 255
4.17 Profils PAGE dénaturant et natif de crabes estuariens . . . . . . . . . . . . . . . . . 165
4.18 Profils PAGE dénaturant et natif de complexes purifiés après stabulation . . . . . . . 166
5.1 Segonzacia mesatlantica dans l’environnement hydrothermal . . . . . . . . . . . . . 174
5.2 Carte des sites hydrothermaux de la MAR situés près du point triple des Açores . . . 176
5.3 Equipements de la campagne MoMARETO 2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177
5.4 Systèmes DESEARES et SYRENE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
5.5 Hemolymph composition for control and acclimated crabs for each experiment . . . 189
5.6 Hemocyanin complex proportion in Segonzacia mesatlantica hemolymph . . . . . . 190
5.7 Biplot graphs of the RDA performed between hemolymph composition and acclimation
conditions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193
5.8 Examples of supramolecular ESI-MS spectra of Segonzacia mesatlantica native Hc . 195
5.9 Examples of ESI-MS deconvoluted mass spectra in denaturing conditions for purified
dodecamers and hexamers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196
5.10 Relative abundances of the 16 subunits in Segonzacia mesatlantica whole hemolymph
samples and purified complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
5.11 Biplot graph of the RDA of the repartition of main subunits between Hc dodecamers
and hexamers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
5.12 Biplot graph of the RDA of the hemolymph composition effect on complex proportions200
5.13 L-lactate and pH effect on Segonzacia mesatlantica Hc affinity . . . . . . . . . . . . 201
5.14 Urate effect on Segonzacia mesatlantica Hc affinity . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202
5.15 Magnesium effect on Segonzacia mesatlantica and Carcinus maenas Hc affinity . . . 203
A.1 Représentation linéaire pour la détermination des masses des hexamères . . . . . . . 229
B.1 Distribution de masses des hexamères d’Hc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235

Liste des tableaux
1.1 Paramètres physiques et chimiques de cuvettes intertidales à Roscoff et à Cumbrae
(journée) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2 Paramètres physiques et chimiques de cuvettes intertidales à Cumbrae (saison) . . . . 8
1.3 Composition de fluides hydrothermaux profonds (Atlantique et Pacifique) . . . . . . 16
1.4 Oxydation aérobie et anaérobie du glucose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.5 Différences physico-chimiques entre l’air et l’eau pour l’O 2 et le CO 2 . . . . . . . . 27
1.6 Equations de transport des gaz respiratoires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
1.7 Différents types de pigments respiratoires chez les métazoaires . . . . . . . . . . . . 31
3.1 Subunit masses for Carcinus maenas hemocyanin obtained by ESI-MS . . . . . . . . 116
3.2 Association constants and number of sites for calcium binding with hemocyanin . . . 128
4.1 Données obtenues à différentes salinités chez C. maenas . . . . . . . . . . . . . . . 147
4.2 Données obtenues à différentes oxygénations chez C. maenas . . . . . . . . . . . . . 149
4.3 Données obtenues à différentes oxygénations et salinités chez C. maenas . . . . . . . 155
4.4 Bilan des masses des complexes d’Hc obtenues en ESI-MS supramoléculaire . . . . 158
4.5 Changements protéiques avant et après stabulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164
5.1 Caractéristiques des micro-environnements rencontrés par S. mesatlantica . . . . . . 173
5.2 Summary of the foward selection results for the choice of covariables . . . . . . . . 192
5.3 Comparison of composition of sea water, hydrothermal fluid and hemolymph from
various decapod species . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
257

Table des matières
Résumé
Sommaire
i
ii
1 Introduction 1
1.1 Milieux et modèles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.1.1 La zone intertidale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.1.2 Les sources hydrothermales profondes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.1.3 Modèles biologiques : les Crustacés Décapodes Brachyoures . . . . . . . . . 21
1.2 Physiologie respiratoire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.2.1 Généralités sur la respiration cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.2.2 Transport des gaz respiratoires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.3 Pigments respiratoires - présentation générale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
1.3.1 Propriétés générales des pigments respiratoires . . . . . . . . . . . . . . . . 29
1.3.2 Les différents types de pigments respiratoires . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
1.3.3 Le transport de l’oxygène par les pigments respiratoires . . . . . . . . . . . 37
1.4 L’hémocyanine des Crustacés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
1.4.1 Structure des hémocyanines de Crustacés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
1.4.2 Caractéristiques et modulation des propriétés fonctionnelles des hémocyanines
de Crustacés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
1.5 Questions biologiques et objectifs de la thèse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
2 La spectrométrie de masse et la diffusion de lumière appliquées à l’étude des pigments
respiratoires : article de revue 55
2.1 L’ESI-MS et les pigments respiratoires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.1.1 Principe et historique de la spectrométrie de masse . . . . . . . . . . . . . . 56
2.1.2 L’ESI-MS en biologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
2.1.3 Application de l’ESI-MS à l’étude des pigments respiratoires . . . . . . . . . 64
259

260 TABLE DES MATIÈRES
2.2 Le MALLS et les pigments respiratoires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
2.2.1 Principe de la diffusion de lumière . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
2.2.2 Utilisation du MALLS pour l’étude de complexes non-covalents . . . . . . . 67
2.2.3 Autres possibilités du MALLS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
2.2.4 Application du MALLS à l’étude des pigments respiratoires . . . . . . . . . 69
2.3 Article de revue ESI-MS et MALLS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
2.4 Conclusion : intérêt de la spectrométrie de masse et de la diffusion de lumière pour
l’étude de l’Hc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
3 Interaction de l’hémocyanine de Carcinus maenas avec le L-lactate et les cations divalents
: étude par spectrométrie de masse 103
3.1 Problématique et objectifs de l’étude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
3.1.1 Liaison et effet du L-lactate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
3.1.2 Rôle structural et effet des cations divalents . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
3.1.3 Problématique et approche expérimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
3.2 Manuscrit : Structural study of Carcinus maenas hemocyanin by supramolecular ESI-
MS : interaction with L-lactate and divalent cations . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
3.2.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
3.2.2 Experimental procedures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
3.2.3 Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
3.2.4 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
3.2.5 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
3.3 Bilan et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
4 Etude de la plasticité phénotypique de l’Hc de Carcinus maenas 133
4.1 Introduction : la plasticité phénotypique des Hc de Crustacés . . . . . . . . . . . . . 134
4.1.1 La plasticité interspécifique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
4.1.2 La plasticité intraspécifique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
4.1.3 Bilan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
4.2 Objectifs de l’étude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
4.3 Matériels et méthodes communs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
4.3.1 Prélévement d’hémolymphe sur les crabes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
4.3.2 Dosage de protéine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
4.3.3 Chromatographie et MALLS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
4.3.4 Electrophorèse sur gel d’acrylamide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

TABLE DES MATIÈRES 261
4.3.5 Spectrométrie de masse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
4.3.6 Analyses statistiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
4.4 Etude n°1 : Expérience préliminaire d’acclimatation à différentes salinités . . . . . . 140
4.4.1 Démarche expérimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
4.4.2 Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
4.4.3 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
4.5 Etude n°2 : Acclimatation à différentes salinités et oxygénation en laboratoire . . . . 145
4.5.1 Démarche expérimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
4.5.2 Résultats expérience a : effet de la salinité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
4.5.3 Résultats expérience b : effet de l’oxygénation . . . . . . . . . . . . . . . . 148
4.5.4 Résultats expérience c : couplage salinité/hypoxie . . . . . . . . . . . . . . . 155
4.5.5 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
4.6 Etude n°3 : Plasticité phénotypique d’une population naturelle dans un estuaire (rivière
Penzé) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159
4.6.1 Démarche expérimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159
4.6.2 Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
4.6.3 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167
4.6.4 Conclusion et perspective . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
4.7 Bilan général et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
5 Adaptations respiratoires du crabe hydrothermal Segonzacia mesatlantica 171
5.1 Segonzacia mesatlantica et le contexte hydrothermal . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
5.1.1 Micro-environnement de Segonzacia mesatlantica . . . . . . . . . . . . . . 172
5.1.2 Adaptations respiratoires dans les environnements hydrothermaux profonds . 173
5.2 Matériels et méthodes utilisés pour l’étude d’une espèce hydrothermale . . . . . . . 176
5.2.1 Collecte des individus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176
5.2.2 Acclimatation à bord . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
5.3 Problématique et objectifs de l’étude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179
5.4 Manuscrit : Respiratory adaptations of the deep-sea hydrothermal vent crab Segonzacia
mesatlantica in response to hypoxia and temperature changes . . . . . . . . . 179
5.4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183
5.4.2 Materials and methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
5.4.3 Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188
5.4.4 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
5.4.5 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211

262 TABLE DES MATIÈRES
5.5 Bilan et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213
6 Conclusion et perspectives 215
6.1 Conclusion générale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
6.1.1 Interactions entre l’Hc et ses effecteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
6.1.2 Adaptations respiratoires à court terme et plasticité phénotypique chez Carcinus
maenas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217
6.1.3 Adaptation respiratoire à court terme et plasticité phénotypique chez Segonzacia
mesatlantica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 218
6.1.4 Comparaison entre les milieux hypervariables : le côtier face à l’hydrothermal 218
6.1.5 Evolution de la fonction de transport de l’oxygène chez les pigments respiratoires
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220
6.2 Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
6.2.1 Mécanismes moléculaires de la modulation de l’affinité . . . . . . . . . . . . 221
6.2.2 Pourquoi une telle diversité de sous-unités ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
6.2.3 Le passage du court terme au long terme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222
6.2.4 Le découplage entre effecteurs organiques et propriétés de l’Hc . . . . . . . 222
6.3 Vue intégrée des adaptations respiratoires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222
Annexes 225
A Détermination des masses de deux complexes éluant simultanément par SEC-MALLS 227
1 Présentation des calculs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228
2 Application aux échantillons estuariens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228
3 Généralisation et amélioration de la méthode . . . . . . . . . . . . . . . . . 230
B Détermination des distributions de masse des hexamères d’Hc de Carcinus maenas 231
1 Principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232
2 Implémentation dans le langage R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232
3 Résultats obtenus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234
4 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 236
Bibliographie 237
Liste des figures 252
Liste des tableaux 256

TABLE DES MATIÈRES 263
Table des matières 258

Résumé / Abstract
Réponse adaptative à court terme et plasticité phénotypique des hémocyanines de Crustacés
Décapodes : l’exemple de Carcinus maenas et Segonzacia mesatlantica
Les hémocyanines (Hcs) des Crustacés Décapodes sont des pigments respiratoires formés de 6 ou 12 sousunités
de 75 kDa. L’existence de différents types de sous-unités et d’effecteurs allostériques permet une grande
plasticité structurale et fonctionnelle des Hcs face aux changements de conditions du milieu. L’objectif de cette
thèse était de caractériser les adaptations respiratoires à court terme au niveau de l’Hc chez deux crabes vivant
dans des milieux hypervariables, Carcinus maenas (en zone intertidale) et Segonzacia mesatlantica (près des
sources hydrothermales profondes).
L’interaction de l’Hc de C. maenas avec certains effecteurs physiologiques (L-lactate, cations divalents) a
été caractérisée par spectrométrie de masse supramoléculaire. Des sous-unités spécifiques interagissent avec le
L-lactate et toutes les sous-unités ne jouent pas le même rôle dans l’assemblage du complexe d’Hc.
Chez C. maenas, la plasticité phénotypique de l’Hc n’est pas impliquée dans les adaptations à un changement
de salinité ou à l’hypoxie à court terme. En revanche, les sous-unités interagissant avec le L-lactate sont
plus abondantes après une hypoxie longue (quelques jours).
Chez S. mesatlantica, l’Hc est intrinsèquement très affine pour l’oxygène et présente un fort effet Bohr,
mais le L-lactate et l’urate ne modulent que faiblement l’affinité de l’Hc. La plasticité phénotypique n’est pas
impliquée dans la réponse à nos conditions d’acclimatation.
Les résultats obtenus suggèrent que les adaptations respiratoires à court terme ne sont pas les mêmes dans
les deux milieux hypervariables étudiés : l’affinité de l’Hc est modulée par des effecteurs hémolymphatiques
chez C. maenas alors qu’elle est constitutivement très forte et peu modulée chez S. mesatlantica.
Mots-clés : Carcinus maenas, hémocyanine, milieu hydrothermal, physiologie respiratoire, pigment respiratoire,
plasticité phénotypique, Segonzacia mesatlantica, zone intertidale
Short-term adaptive response and phenotypic plasticity of decapod crustacean hemocyanins : the
example of Carcinus maenas and Segonzacia mesatlantica
Decapod crustacean hemocyanins (Hcs) are respiratory pigments made of 6 or 12 subunits of 75 kDa
each. Several subunit types and allosteric effectors exist, thus permitting a very high structural and functional
plasticity in order to cope with changes in environmental conditions. Our aim was to characterize short-term
respiratory adaptations at the Hc level in two crab species living in hypervariable environment : Carcinus
maenas (intertidal zone) and Segonzacia mesatlantica (deep-sea hydrothermal vents).
The interaction between C. maenas Hc and some of its physiological effectors (L-lactate and divalents
cations) was studied by supramolecular ESI-MS. Specific subunits interact with L-lactate and subunits have
different roles in the complex association.
For C. maenas, phenotypic plasticity of Hc is not involved in the response to changes in salinity or to shortterm
hypoxia. However, L-lactate sensitive subunits were more abundant after several days under hypoxia.
For S. mesatlantica, Hc affinity for oxygen is very high with a strong Bohr effect but only a low modulation
by L-lactate and urate. Phenotypic plasticity response was not observed under our acclimation conditions.
These results suggest that short-term adaptations are different in the two studied hypervariable environments
: Hc affinity is modulated by hemolymphatic effectors for C. maenas whereas it is constitutively very
high and only slightly modulated for S. mesatlantica.
Keywords : Carcinus maenas, deep-sea hydrothermal vents, hemocyanin, intertidal zone, Segonzacia mesatlantica,
respiratory physiology, respiratory pigment, phenotypic plasticity