Méthodes expérimentales en immunologie

2014
Méthodes expérimentales en immunologie
1‐ Techniques de phénotypage
2‐ Analyse fonctionnelle in vitro
3‐ Modèles de souris
Marie‐Alix Poul
Institut de recherche en cancérologie, Montpellier
marie‐alix.poul‐pearson@univ‐montp2.fr
FMBS215

Informations données par la cytométrie en flux sur une
cellule
taille relative (Forward Scatter ‐ FSC)
granularité relative ou complexité interne (Side
Scatter ‐ SSC)
intensité relative de fluorescence
(FL1, FL2, FL3 et FL4 voire FL5, FL6, .et plus
encore): marquage anticorps (ou sonde
biochimique)

Exemple d’analyse: sang humain hémolysé:
Diagramme en 2 dimensions ou dotblot: 1 cellule = 1 point
Side Scatter
(gran nularit té)
600 800 1000
0 20 00 400
Neutrophiles
Monocytes
Lymphocytes
0 200 400 600 800 1000
Right Angle Light Detector
--> fonction de la complexité cellulaire
Forward Light Scatter
(taille)
Lumière
Incidente
Forward Light Detector
--> fonction de la taille de la
cellule

Analyse cytométrie en flux
• DotBlot (graphe en 2 dimensions)
• Histogramme (1 seul marquage représenté, MFI:
intensité moyenne de fluorescence)
• Multimarquages
• Marquage intracellulaire
(perméabilisation/fixation des cellules)
• Technique des
« tétramères »

Détection de T spécifiques:
Principe des tétramères‐MHC peptide
•Production de molécule MHC classe I ou 2
biotinylée chez E. coli
•Dénaturation
•Renaturation en présence de peptide
•Tétramérisation par ajout de streptavidine
(couplée à un fluorochrome) => forte affinité
« fonctionnelle »
Ex: Mise en éid évidence d’une réponse T CD8
spécifique du cytomégalovirus chez des
souris infectées
Préparation des splénocytes
Co‐marquage anticorps anti‐CD8/tétramère
de molécule HLA‐A2‐peptide pp CMV) de
splénocytes de souris infectées

tétramère de CD1d / α‐Galactosyl‐Ceramide
Détection/purification des iNKT
tétramère de CD1d / α‐GalCer
iNKT
autres
T conventionnels

2 stratégies de tri
• Cytomètre associé à un système de tri
Long mais souvent indispensable pour des séparations sur de multiples
paramètres
• Séparation par phase solide
(fond en plastique des boîtes de Pétri ou de culture cellulaire, billes de taille et de nature diverse )
– Les cellules sont retenues soit par adhérence spontanée, soit par
l’intermédiaire d’Ac ou de lectine.
– « sélection positive » : population p d’intérêt retenue par la phase solide
– « sélection négative » : population non retenue ( séparation plus «neutre»
fonctionnellement)
Plus simple, moins couteux, pas toujours applicable

Technique MACS (« Magnetic activated cell sorting »)
Billes d’oxyde de fer et de polysaccharide, diamètre de 50 nm
couplées à des anticorps
Colonne de séparation magnétique placée dans un aimant de
très forte puissance.
Le tri est simple, rapide, pureté > 95%, rendement > 90%,
sélection jusqu’à 10 9 cellules compatible avec la cytométrie de
flux.
Ex: Tri négatif: élimination des cellules T dans le cadre des
allogreffes de moelle (sur colonne couplée à un anticorps
monoclonal pan T.

Stratégies de tri des Tregs pour amplification ex vivo
Tri magnétique des CD4 puis Tri par cytométrie
CD4+, CD127‐, CD25+
CD4
CD127 CD127
CD4+, CD45RA‐, CD25+

1‐3 Histochimie: Tissue micro‐array‐TAM
• Tissue micro array TMA: immunohistochimie à haut débit; fragments
(carottage) de tissus d’environ 0,6 mm de diamètre obtenus de tissus
inclus en paraffine, disposition dans un bloc de paraffine en espacement
réguliers
• Coupes/microtome, montage sur lame pour analyse

Analyse des répertoires
Extraction ARN
Amplification PCR
- amorce V spécifique/amorce C spécifique
- précurseurs nucléotidiques fluorescents
Electrophorèse capillaire
Profil gaussien;
répertoire
poyclonal
Amplification d’un
p
clone

Répertoire anti‐Flu1
... we expand CD4+ T cells from the influenza‐specific memory pool of two HLA‐DR1+
donors (known responders to peptide HA305−320). Ten‐day cultures of 10 6 peripheral
blood mononuclear cells (PBMCs) with the peptides Flu1 gave ≥5×10 4 CD4+ HLA‐
DR1/HA305−320 tetramer‐positive cells (data not shown). We investigated TCR usage by
the amplified populations p (FLu1) to establish the repertoire deployed against Flu1
peptide....
Numbers indicate the % of T cellswith ihTRBV
usage

Fluorescent CllB Cell Bar coding
Code barre fluorescent
‐ Marquage et analyse dans un même
tube de plusieurs populations:
‐Comparaison normalisée des intensités
de signaux de signaux
‐Simplicité, ité rapidité
Nature Methods 3, 361 ‐ 368 (2006)

Fluorescent CllB Cell Bar coding
Analyse dans un même tube de plusieurs populations (marquées avec un code barre
d’intensité variable selon e traitement)
Comparaison des intensités ité de signaux de signaux de phospho‐STAT1 h et phospho‐STAT6
h Nature Methods 3, 361 ‐ 368 (2006)

production de cytokines
• Dosage de cytokines dans un surnageant de culture:
– ELISA
– Cytometric Beads Array (dosage de plusieurs cytokines
possible: analyse multiple)
• Mesure du nombre de cellules produisant un type de
cytokines
– ELISPOT
– Marquage intracellulaire de cytokines/FACS (possibilité de
détecter plusieurs cytokines à la fois

Cytometric Beads Array Immunoassay
Lecture possible de 100 analytes à la fois

Technique ELISPOT:« Enzyme‐linked immunospot »
1983, à l’origine, utilisée pour l’activation des cellules B, en 1996, adaptée
pour l’analyse de l’activation des lymphocytes T (sécrétion des Ig)
Détecter et dénombrer les cellules T activés chez un patient, en détectant la
sécrétion de cytokines (l’INFγ notamment).

Caractérisation fonctionnelle d’épitopes T: ELISPOT
Recherche d’une réponse T anti-Ep-CAM:
PBL d'un patient colo-carcinome HLA*0201
+ peptides issus d’Ep-CAM dEp-CAM
Ep-184
(ILYENNVIT)
4
Ep-184b
(ILYENNVITI)
80
Milieu
0
PHA

Proliferation/division i i cellulaire/mort l cellulaire
l (apoptose)
• Cytometrie de flux:
iodure de propidium (cellules mortes, répatition dans les phases du cycle)
BrdU, EdU: cellules en phase S
CFSE; carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester: colorant fluorescent
permettant t de suivre la division i i des cellules l (diminution i des intensités ité de
fluorescence selon les divisions)
Annexin‐V: apoptose
• Imagerie: DAPI
• Thymidine tritiée: quantification de l’incorporation dans l’ADN au cours de
la pahse S

Fonctions effectrices
• Cytotoxicité (NK, CTL, NKT): mesure de la
radioactivité ité présente dans le surnageant de
cellules préalablement chargées en 51 Cr
• Méthodes cytométriques équivalentes
• Réponse anticorps: ELISA

Souris immunodéficientes
• Souris nude; sans thymus: pas de LT thymodépendants
• Souris SCID (severe combined immunodeficiency, prkdc‐/‐): pas de B et de T
matures, mais des NK
• Souris NOD: diabète, anomalie IFN, anomalie activité NK
• Souris NOD‐SCID: : absence de B, T et anomalie activité NK.
• Souris beige (bg): anomalie des macrophages et neutrophiles, anomalie NK et
CTL
• Souris RAG‐/‐: (recombinaisons activating genes) absence de T et B matures
• Souris NSG: NOD‐SCID‐IL2R‐/‐(2004) IL2R absence de B, T et NK.
• Souris BRG: BALB/C, RAGR2‐/‐,IL2R‐/‐ (2005):absence de B, T et NK.

Différences homme/souris
Mestas J. et al. 2005

Différences homme/souris
Mestas J. et al. 2005

Modèles de souris humanisées

Démarche expérimentale et analyse d’article
Marie‐Alix Poul
Institut de recherche en cancérologie, Montpellier
marie‐alix.poul‐pearson@univ‐montp2.fr
FMBS215

Démarche expérimentale canonique
Question dans un contexte:
Est‐ce que l’interaction de la protéine A avec B est impliquée
dans le processus P?
Synthèse des conclusions
Questions ciblées:
Est‐ce que A interagit avec B?
Est‐ce que A est impliquée dans le processus P?
Est‐ce que B est impliquée dans le processus P?
Est‐ce que le processus P est affecté si on abolit l’interaction
entre A et B?
Pour chaque question ciblée:
Choix d’une stratégie expérimentale permettant de répondre:
Ex: Est‐ce que A interagit avec B?
Interaction de 2 protéines recombinantes in vitro?
Interaction in vivo (co‐immunoprécipitation, double hybride...)?
Est‐ce que des mutations dans le gène A peuvent compenser
des mutations dans le gène B?
Conclusions pour chaque
question ciblée
Pour chaque expérience:
1) réalisation, 2) description
3) interprétation

Le choix de l’article
Site PubMEd: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
nlm nih Titre
Auteurs et nom du(des) laboratoire(s)
Mots clés (keywords)
Résumé (abstract)
Introduction
Résultats Tableaux (tables) et figures
Discussion
Matériel et Méthodes
Autres items variables
Données supplémentaires disponibles en ligne (supplementary information ou supplemental data)

Le facteur d’impact dun d’un article
Il rend compte de l’impact dans la communauté scientifique d’un revue (et (t
attention, en aucun cas d’un article).
Calcul :
Soit IFn(R) le coefficient d’impact d’une revue « R » (ou « impact factor ») de l’année n.
IF année n d’une revue:
Nombre de citations année n‐2+ année n‐1
Nombre d’articles publiés année n‐2 + année n‐1
d d b d l él é l l
correspond donc un nombre moyen de citations court terme. Plus est élevé, plus les
articles publiés par la revue considérée sont cités (à court terme).

50%
des journaux
d’immunologie ont
un facteur d’impact
supérieur à 3

Etape de l’analyse d’article
1) Compréhension
nécessité d’informations complémentaires
2) Analyse critique
3) Restitution

1‐Phase de compréhension de l’article
Comprendre la démarche et le point de vue des auteurs
Comprendre la problématique
Comprendre la démarche expérimentale
Comprendre les résultats de chaque expérience
Comprendre les interprétations ti des auteurs
Faire une synthèse

1‐Phase de compréhension de l’article
1‐1‐ Comprendre la problématique :
Les objectifs :
‐ identifier la (les) question(s) posée(s)
‐ connaître le contexte : qu’est‐ce qui est connu sur le sujet au moment de
la publication ?
‐ identifier les principales conclusions
Les sources d’information :
dans l’article : Titre, résumé, introduction, parfois le début de la discussion
Chercher h un article de revue
Chercher un autre article de recherche
Choisir un autre article si la question
q
posée ne vous paraît pas intéressante
ou pertinente

1‐Phase de compréhension de l’article
1‐2‐ Comprendre la démarche expérimentale :
Les objectifs :
pour chaque méthode employée,
connaître le principe (c.a.d. les grandes étapes du protocole),
comprendre sa finalité, si possible, s’interroger sur ses limites
Les sources d’information :
dans l’article : Matériel et méthodes, résultats
vos cours
certains ouvrages
articles de recherche cités
articles de la série des Methods in…

1‐Phase de compréhension de l’article
1‐3‐ Comprendre les résultats de chaque expérience :
Les objectifs : pour chaque figure ou tableau de résultat présenté
‐ identifier les « témoins » et analyser les résultats leur
correspondant,
‐ identifier les « essais » et analyser les résultats leur correspondant,
‐ comprendre les conclusions tirées de l’expérience par les auteurs.
Les sources d’information :
dans l’article uniquement : Matériel Méthodes, Résultats

1‐Phase de compréhension de l’article
1‐4‐ Comprendre les interprétations formulées par les auteurs :
L’objectif: expérience par expérience, comprendre les interprétations proposées par les
auteurs.
Les sources d’information :
Dans l’article uniquement : partie Résultats.
1‐5‐ Effectuer une synthèse :
L’objectif :
Recenser les différentes conclusions, et s’efforcer de les rassembler
Hiérarchiser les conclusions.
Les sources d’information :
dans l’article uniquement : Résultats, Discussion, Titre, Résumé

2‐Phase d’analyse critique
« procéder à une analyse critique » signifie « s’interroger »
1 Questionnement méthodologique
Pour chaque expérience décrite dans l’article :
‐La stratégie expérimentale utilisée permet‐elle de bien répondre à
la question posée ?
‐ Les témoins sont‐ils selon vous suffisants ?
‐Les témoins donnent‐ils bien les résultats attendus ?
2‐ Questionnement sur l’analyse des résultats par les auteurs
Pour chaque expérience décrite dans l’article :
‐Les résultats obtenus vous paraissent‐ils convaincants ?
‐Êtes‐vous convaincu par les interprétations proposées ?

2‐Phase d’analyse critique
3‐ Questionnement sur les conclusions formulées par les auteurs
‐Les différentes expériences vous paraissent‐elles cohérentes ou
voyez‐vous vous des contradictions
‐ Les conclusions tirées sont‐elles cohérentes avec les données de la
littérature t dont vous avez connaissance ?
4‐Questionnement sur les perspectives ouvertes par l’article
‐ Quelle stratégie expérimentale pourriez‐vous proposer pour
confirmer ou infirmer les conclusions importantes de l’article ?
‐ Quelle « nouvelle » question suscitent les conclusions de l’article ?

3‐ Restitution (présentation orale)
1‐ Situer la problématique (5 min max)
‐ Donner les connaissances (contemporaines de la publication) essentielles la
compréhension (il faut être concis) ;
‐ Formuler de manière explicite la(les) question(s) posée(s) par l’article.
2‐ Présenter et interpréter des résultats choisis
Faut‐il présenter tous les résultats? Ce n’est nest pas obligatoire, et cest c’est rarement
possible dans le temps qui vous est imparti. Cela implique :
‐ de choisir judicieusement les expériences que vous allez présenter ;
‐ d’être néanmoins capable de répondre à des questions concernant
les expériences que vous n’avez pas présentées.
Faut‐il présenter les résultats dans l’ordre de l’article ? Ce n’est pas
obligatoire, il est parfois plus facile de présenter les données dans un
ordre différent de celui de la publication.

Comment présenter une expérience (et donc d’une
figure)
1‐ Indiquer précisément la question posée.
2‐ Présenter la méthode expérimentale utilisée pour répondre à la question. Si
nécessaire, élaborer un schéma présentant son principe.
3‐ Projeter le résultat de l’expérience (tableau ou figure) ; il doit être accompagné :
‐ d’un titre (qui ne doit pas donner la conclusion de l’expérience) mais faire référence à la
stratégie té expérimentale éi tl utilisée ;
‐ d’une légende. Si la légende de l’article est trop sommaire ou difficile à comprendre sur
la publication, ne pas hésiter à refaire une légende didactique.
4‐ Décrire les résultats obtenus sans les interpréter.
5‐ Commenter les résultats obtenus pour les témoins.
6‐ Présenter les interprétations des auteurs.
7‐ Effectuer une analyse critique des résultats et de leurs interprétations.

Exemple 1:

Exemple 2:
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