Dossier technique - Ogm

Ministère de l’Agriculture, de l’Agroalimentaire et de la Forêt 

D.G.A.L. 

251, Rue de Vaugirard 

75015 PARIS 

Demande d’autorisation 

auprès du 

Ministère de l’Agriculture, de l’Agroalimentaire et de la Forêt 

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Dossier technique 

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Taillis à très courte rotation de peupliers génétiquement modifiés pour les 

propriétés du bois - Evaluations agronomique et environnementale - Evaluation 

du bois pour la production de bioénergie 

(Demande pluriannuelle) 

Nota : ce dossier constitue une demande d’extension de la décision d’autorisations # 07/015 du 

21 Septembre 2007 

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I.N.R.A. - 147, Rue de l’Université – 75338 PARIS CEDEX 07 

Etablissement public à caractère scientifique et technologique 

Centre de Recherche d’Orléans 

2163 Avenue de la pomme de pin, CS 40001 ARDON 

45075 ORLEANS Cedex 2

Annexe 1 – dossier scientifique et technique 

INTRODUCTION 

Le contexte : Les lignines, indispensables pour l’arbre, indésirables pour l’homme 

Les lignines qui constituent environ le quart de la matière sèche du bois sont 

indispensables au bon développement de l’arbre de par leur rôle dans les fonctions de 

soutien et de conduction du bois : elles imperméabilisent les vaisseaux qui conduisent la 

sève des racines jusqu’au houppier ; elles assurent le rôle de ciment entre les microfibrilles 

de cellulose, responsable des performances mécaniques des fibres de bois, rendant 

possible le développement des arbres sur de grandes hauteurs. 

A l’inverse, les lignines sont indésirables et doivent être éliminées durant le processus 

de fabrication de la pâte à papier afin d’obtenir un papier de qualité, élimination qui requiert 

l’emploi de produits coûteux et polluants. De même, les lignines sont indésirables pour la 

production de biocarburants de seconde génération à partir de biomasse ligno-cellulosique 

(le bois dans le cas des arbres) car elles limitent grandement l’accès des enzymes de 

saccharification aux polysaccharides de la paroi. Cependant, les lignines sont un 

biocombustible prometteur pour produire de l’énergie et de la chaleur ; demain, elles 

pourraient également constituer un produit secondaire à haute valeur ajoutée au titre de 

précurseurs en chimie aromatique. 

Séparer efficacement les lignines des autres composants du bois, essentiellement la 

cellulose et les hémicelluloses, apparaît ainsi particulièrement intéressant. Une telle 

séparation est plus ou moins aisée selon la qualité et la quantité des lignines présentes dans 

le bois. Il s’avère que dans le cas spécifique du peuplier, il est possible, par transformation 

génétique, de modifier de façon ciblée la voie de biosynthèse des lignines et donc la qualité 

et/ou la quantité de ces dernières. Cette possibilité constitue un outil précieux de 

recherche pour analyser l’assemblage des constituants du bois. 

L’expérience de l’INRA sur les essais en champ de peupliers à lignines modifiées 

L’unité AGPF (Amélioration, Génétique et Physiologie Forestières) du centre INRA 

d’Orléans a acquis une expérience de plus de 20 ans sur la question de la modification des 

lignines et ses conséquences, en particulier dans le cadre de plusieurs projets européens de 

recherche. 

Notre objectif est d’acquérir une meilleure compréhension de la biosynthèse et de la 

mise en place des lignines dans les parois des cellules de bois, et d’évaluer l’effet de 

modifications des lignines sur les propriétés du bois. A cette fin, nous avons ciblé quatre 

gènes de la voie de biosynthèse des monolignols : la Caffeic acid O-méthyl transférase 

(COMT), la Cinnamyl alcool déshydrogénase (CAD), la Cinnamoyl coenzymeA réductase 

(CCR), et la Caffeoyl coenzyme A O-méthyl transférase (CCoAOMT). De nombreuses 

lignées de peupliers affectées dans l’expression de l’un ou l’autre de ces quatre gènes et 

modifiées en conséquence au niveau de leurs lignines ont été produites et finement

caractérisées en conditions confinées, c’est-à-dire en serre. Les lignées les plus 

intéressantes ont pu être identifiées, multipliées et plantées en champ dès 1995, ceci afin 

d’évaluer, d’une part, leur comportement agronomique (capacité à croître et se développer 

dans des conditions naturelles de plantation), et, d’autre part, produire une quantité 

suffisante de matériel de façon à pouvoir procéder à une évaluation technologique des bois 

issus de différentes lignées de peupliers à lignines modifiées. 

Les résultats obtenus ont permis d’identifier, et ce pour la première fois, une lignée de 

peupliers à lignines modifiées présentant une croissance normale et simultanément 

produisant un bois pouvant être délignifié avec des quantités moindres de produits 

chimiques relativement au bois des arbres témoins non génétiquement modifiés, permettant 

ainsi d’obtenir un papier de meilleure qualité, avec un emploi réduit de produits chimiques, 

donc à moindre coût (Pilate et al. 2002). 

Le dernier essai en champ de peupliers à lignines modifiées a été installé en 2008 

(autorisation #07.06.01). Il s’agissait cette fois d’évaluer ces mêmes lignées pour leur 

capacité à produire un biocarburant de deuxième génération dans le cadre d’une conduite 

culturale en taillis à très courte rotation (TTCR) sur des sols marginaux ; ces modalités de 

production visaient à réduire au maximum la concurrence entre usages des terres à des fins 

alimentaires versus non alimentaires. Les premiers résultats de cet essai montrent que pour 

deux des quatre lignées testées, la croissance des arbres est réduite dès lors que ceux-ci 

sont conduits en TTCR ; pour deux autres lignées, la croissance s’est avérée 

légèrement supérieure à celle des arbres témoins à lignines non transformées. A 

l’occasion d’un recépage 1 précoce réalisé pour assurer une bonne installation des cépées, 

des analyses réalisées sur des tiges d’une année ont en outre révélé une meilleure 

saccharification pour certaines lignées à lignines modifiées relativement aux témoins 

(vanAcker et al. 2011, et résultats non encore publiés). 

L’ensemble du matériel de la première rotation a été récolté en février 2012 permettant 

de disposer d’échantillons de taille importante (de 100 à 200 kg) et ainsi d’envisager des 

tests technologiques de type préindustriel. Des tests mobilisant ce matériel sont en cours de 

réalisation en collaboration avec des laboratoires anglais, allemands et belges. 

Parallèlement, des recherches ont été menées pour analyser des effets éventuels des 

lignées de peupliers à lignines modifiées sur l’environnement (effets sur les dynamiques 

d’évolution de la matière organique des sols et les flux de carbone et d’azote associés ; 

impacts sur la diversité microbienne ; éventuelles modifications de la tolérance des lignées à 

lignines modifiées aux attaques de pathogènes ; etc.), ceci en collaboration avec des 

équipes possédant les compétences requises pour de telles analyses d’impact. A ce jour, les 

résultats obtenus ne montrent pas d’effets significatifs des modifications des lignines 

des arbres transgéniques sur les comportements environnementaux listés ci-dessus 

(Hopkins et al. 2007 ; Danielsen et al. 2012 ; Danielsen et al. soumis). 

Grâce à une expérience de près de 40 ans de notre laboratoire sur le peuplier, sa 

culture et sa biologie, nous possédons le savoir nous permettant de contrôler efficacement la 

non-dissémination de ce matériel ; ceci est d’autant plus facile dans des essais menés en 

TTCR que les arbres sont trop jeunes pour venir à floraison. 

Qu’avons nous appris après 20 ans d’essais en champ de peupliers à lignines 

modifiées et pourquoi la demande d’une extension temporelle de l’essai de 2008 ? 

1 Le recépage consiste à couper l’arbre près de terre afin d’obtenir de nouvelles pousses.

Ces expérimentations menées en champ, ainsi que celles d’autres équipes de 

recherche de par le monde travaillant sur le même sujet, s’avèrent non seulement 

fructueuses mais également prometteuses. Leur justification ex ante, relativement à des 

conditions confinées, a été confirmée ex post. Les tendances observées sur matériel juvénile 

élevé en serre se retrouvent généralement, mais non de façon systématique, sur les arbres 

plus âgés plantés en champ. Des effets sur la croissance et/ou la saccharification, non 

observés en serre, ont pu être détectés en plein champ, en conditions réelles correspondant 

à des conditions environnementales variables. 

Ces expériences en plein champ ont par ailleurs montré que des modifications trop 

importantes des lignines entraînent une réduction inacceptable de la croissance et du 

développement des arbres (Leplé et al. 2007 ; Pilate et al. 2012). La fenêtre apparaît ainsi 

étroite si on cherche à modifier les lignines de façon intéressante pour une application 

technologique, sans entraîner une altération trop importante de la croissance et du 

développement des arbres ; autrement dit, il convient d’évaluer pour chaque lignée si les 

avantages de la modification des lignines (dans une perspective technologique) n’est pas 

annulée par ses inconvénients potentiels (en termes de croissance et de développement des 

arbres). Dans cette perspective, il apparaît clairement qu’il est préférable d’évaluer un 

nombre maximal de lignées modifiées pour un même gène de façon à optimiser la 

probabilité de trouver le meilleur compromis. 

Les objectifs scientifiques à la base de la demande d’extension temporelle de 

l’essai en champ de peupliers à lignines modifiées présentée dans ce dossier sont : 

- D’approfondir et de compléter les premières analyses et les premiers 

résultats issus de l’essai de 2008. La demande d’extension envisagée est en 

effet dans la droite continuité de la demande de 2007. Comme cela se fait 

conventionnellement pour toutes les cultures menées en TTCR, la demande vise 

en effet à réaliser la seconde et troisième rotation de l’essai déjà en place : il n’y a 

donc pas de sortie de nouveau matériel génétiquement modifié sur le terrain. Ces 

rotations deux et trois, plus productives que la première, devraient révéler le 

potentiel réel des lignées impliquées. Les analyses prévues dans le cadre de cette 

extension permettront alors de conforter, ou non, les résultats déjà obtenus ou en 

cours d’obtention lors de la première rotation. Il ne s’agit toutefois pas d’une simple 

répétition de l’expérimentation précédente : durant la première rotation, les plants 

issus de cultures in vitro ont en effet dû installer leur système racinaire ; cette 

installation étant acquise à compter de la seconde rotation, les arbres pourront 

exprimer tout leur potentiel ce qui devrait permettre l’obtention de meilleurs 

rendements (du fait d’une meilleure exploitation du milieu par un système racinaire 

désormais bien installé). Les différentes lignées pourront ainsi être suivies dans les 

conditions optimales de seconde et troisième rotations pour leurs performances 

agronomiques et technologiques (production en bioéthanol). Elles seront 

également évaluées en termes de stabilité des modifications, notamment lors des 

phénomènes de réjuvénation qui accompagnent le recépage entre chaque rotation. 

L’essai étant réalisé en Sologne sur un sol marginal, nous réaliserons un suivi de la 

composition minérale des sols de l’essai jusqu’à la fin de la troisième rotation. 

- D’améliorer les analyses de capacité de peupliers à lignines modifiées à 

produire du bioéthanol de seconde génération dans le cadre d’un « process » 

technologique optimisé. il est en effet raisonnablement possible d’anticiper que 

d’ici la récolte de la seconde rotation (fin 2014) et de la troisième (fin 2017), le 

« process » de production de bioéthanol sera optimisé, au minimum amélioré, par 

les équipes qui travaillent sur la question de la production de bioéthanol à partir de 

bois, notamment pour ce qui est de l’étape de prétraitement. Cette optimisation

permettra d’affiner l’évaluation de l’effet de la modification des lignines sur la 

capacité de production du bioéthanol à partir du bois. Notre objectif est également 

d’évaluer ce matériel en utilisant des prétraitements doux 1 capables de préserver 

dans une certaine mesure la réactivité des lignines, et les potentialités d‘utiliser 

cette fraction comme sous-produit à haute valeur ajoutée pour utilisation en tant 

que précurseurs en chimie aromatique. 

1 Les procédés existants (Kraft, bisulfite) n’ont pas vocation à protéger l’intégrité des lignines, 

tandis que de nouveaux procédés plus doux (Organosolv, CIMV) favorisent la récupération de lignines 

moins « abimées » chimiquement. 

- De comparer la variabilité générée par modification génétique et la variabilité 

naturelle. Les résultats obtenus à l’issue de cet essai étendu à la seconde et 

troisième rotation seront en effet comparés à ceux qui seront obtenus 

simultanément par les généticiens qui, selon une démarche de génétique 

conventionnelle, explorent la variabilité génétique du peuplier pour des facteurs 

importants pour la production de biomasse à vocation bioénergétique. Cette 

comparaison permettra de trancher entre les alternatives suivantes : 

i) Ou la variabilité créée par génie génétique est équivalente à celle 

naturellement présente dans les ressources génétiques de peuplier, et 

l’approche biotechnologique (plus précisément la production de lignées 

génétiquement modifiées) ne se justifie pas. 

ii) 

Ou les lignées créées par génie génétique présentent un phénotype qui va au 

delà de la variabilité naturelle qui existe chez le peuplier, avec des propriétés 

plus intéressantes que les génotypes issus de la sélection classique, et dans 

ce cas l’essai et son extension auront permis de montrer l’intérêt du génie 

génétique, relativement à des approches classiques de sélection, pour 

l’aptitude à la saccharification et la production de bioéthanol de deuxième 

génération, tout en permettant une croissance au moins équivalente des 

arbres. 

A. INFORMATIONS D’ORDRE GENERAL 

A.1. Nom et adresse du notifiant : 

INRA - 147, Rue de l’Université – 75338 PARIS CEDEX 07 

Etablissement public à caractère scientifique et technologique 

Centre de Recherche de : ORLEANS 

2163 Avenue de la pomme de pin, CS 40001 ARDON, 45075 

ORLEANS Cedex 2 

A.2. Nom, qualifications et expérience des scientifiques responsables. 

Gilles PILATE DR2 UAGPF 

Tel : 02 38 41 78 00, Fax : 02 38 41 78 79

e-mail : Gilles.Pilate@orleans.inra.fr 

Jean-Charles LEPLE CR1 UAGPF 

Tel : 02 38 41 78 00, Fax : 02 38 41 78 79 

e-mail : Jean-Charles.Leple@orleans.inra.fr 

Annabelle DEJARDIN CR1 UAGPF 

Tel : 02 38 41 78 00, Fax : 02 38 41 78 79 

e-mail : Annabelle.Dejardin@orleans.inra.fr 

Les chercheurs responsables ainsi que les techniciens de la pépinière de l’INRA d’Orléans ont 

déjà conduit plusieurs essais en champ de peupliers génétiquement modifiés. Ils possèdent une 

expérience et une expertise dans la mise en place, le suivi et la destruction de ces essais en champ. 

A.3. Titre du projet. 

Taillis à très courte rotation de peupliers génétiquement modifiés pour les 

propriétés du bois - Evaluations agronomique et environnementale - Evaluation du bois 

pour la production de bioénergie 

Nota : ce dossier constitue une demande d’extension de précédentes autorisations de 

dissémination, les demandes initiales # 43 du 17 mai 1995 (dossier initial # B/FR/95.03.05), et 

# 99/023 (Dossier # B/FR/99.02.15) suivies de deux demandes de prolongation : 

- # 03/017 du 28 Juillet 2003 (dossier de prolongation #B/FR/03.06.01) 

- # 07/015 du 21 Septembre 2007 (dossier de prolongation #B/FR/07.06.01) 

A.4. Développements ultérieurs envisagés 

Cet essai a un objectif de démonstration : le but est d’évaluer des peupliers GM à 

lignines modifiées menés en taillis à très courte rotation (TTCR) pour leur aptitude 

agronomique et à produire un biocarburant de seconde génération tel que le bioéthanol à 

partir de leur biomasse ligno-cellulosique, en l’occurrence leur bois. Cette évaluation se fait 

par comparaison avec des peupliers témoins non modifiés génétiquement. L’objet spécifique 

de cette demande d’extension est d’évaluer le matériel lors de la seconde et troisième 

rotation du TTCR. Les objectifs de l’INRA, organisme de recherche public, sont de faire la 

démonstration qu’une telle application est potentiellement envisageable et économiquement 

intéressante ; ils ne sont pas d’assurer un développement commercial. 

B. INFORMATIONS CONCERNANT LES PLANTES (A) RECEPTRICES OU (B) (LE CAS ECHEANT) 

PARENTALES 

B.1. Nom complet 

Nom de la famille : Salicaceae 

Tribu : Saliceae 

Genre : Populus, section Populus 

Espèce : hybride interspécifique Populus tremula x Populus alba 

Sous-espèce :

Cultivar/lignée : INRA #717-1B4 

Noms usuels : peuplier grisard, Populus x canescens 

B.2. Informations concernant la reproduction 

i) Mode(s) de reproduction : 

Le peuplier est une espèce dioïque, c'est-à-dire que chaque individu est soit mâle soit 

femelle : son mode de reproduction est donc allogame. Le génotype utilisé dans l’étude est 

de sexe femelle. Les bourgeons floraux peuvent être différenciés des bourgeons végétatifs 

dès le mois de janvier. Après éclosion, se développent des chatons qui atteignent plusieurs 

centimètres. Ces chatons sont clairement visibles puisque leur développement se produit 

avant la formation des feuilles. 

ii) Facteurs spécifiques affectant la reproduction : 

La pollinisation est anémophile, c'est-à-dire que le pollen est disséminé par le vent. Les 

fleurs du clone femelle INRA #717-1B4 utilisé dans cet essai peuvent donc, potentiellement, 

être fertilisées par le pollen d’autres peupliers de la section Populus. 

iii) Temps de génération. 

Dans les conditions optimales, le temps de génération minimal, c'est-à-dire la première 

floraison, a lieu chez des arbres âgés de quatre à cinq ans. Dans le cas de cette demande, 

les arbres seront recépés tous les 3 ans ; ils ne pourront donc pas fleurir. 

B.3. Compatibilité sexuelle avec d'autres espèces végétales sauvages ou 

cultivées (y compris la répartition en Europe des espèces compatibles). 

Le clone INRA #717-1B4 est compatible sexuellement avec les autres espèces et 

hybrides de peupliers de la section Populus : P. alba, P. tremula et leur hybrides (grisards) P. 

x canescens. Il est également compatible sexuellement avec l’espèce américaine P. 

tremuloides. L’aire de répartition de ces espèces de peupliers et de leurs hybrides s’étend 

sur tout l’Ouest de l’Eurasie et en Afrique de Nord. Il existe donc dans la région d’Orléans 

des peupliers sexuellement compatibles avec le clone INRA #717-1B4. 

B.4. Capacité de survie 

i) Capacité à former des structures de survie ou de dormance : 

Le peuplier est une espèce pérenne dont la durée de vie peut atteindre plusieurs 

dizaines d’années. Les graines, très petites et sans albumen, perdent leur viabilité très 

rapidement dans la nature (2 à 4 semaines). Les peupliers grisards sont particulièrement 

aptes au drageonnage, c'est-à-dire au développement de rejets à partir de méristèmes situés 

sur les racines. 

ii) Le cas échéant, facteurs spécifiques affectant la capacité de survie. 

B.5. Dissémination 

i) Voies et étendue de la dissémination 

La dissémination du pollen et des graines (englobées dans un coton) est anémophile. Le 

peuplier grisard est également capable de se disséminer localement par drageonnage à partir de 

racines superficielles. 

ii) Le cas échéant, facteurs spécifiques affectant la dissémination. 

Chez les peupliers de la section Populus, la régénération par semis est rare car les conditions 

écologiques nécessaires à la germination des graines et au développement des semis sont rarement

éunies : terrain nu, absence totale de concurrence, pleine lumière, humidité constante et sans excès 

(Bouvarel et Lemoine 1957). 

B.6. 

Distribution géographique de la plante. 

L’aire de P. alba s’étend au Sud de l’Europe et en Afrique du Nord, ainsi qu’en Asie, de 

la Turquie à l’Inde. L’aire de P. tremula englobe la majeure partie de l’Europe, sauf 

l’Espagne, et s’étend jusqu’au Nord-Est de l’Asie. L’aire de P. x canescens est commune aux 

deux autres espèces. Pour sa répartition en France, voir : http://inpn.mnhn.fr/espece/ 

cd_nom/115168. 

B.7. Description de l'habitat naturel de la plante (pour les espèces végétales 

qui ne poussent pas habituellement dans l’UE). 

Sans objet 

B.8. Autres interactions potentielles de la plante avec des organismes dans 

l'écosystème habituel 

Le peuplier grisard peut être la cible d’insectes défoliateurs ou xylophages (Delplanque 

1998). Il est également en interaction avec des organismes pathogènes, essentiellement des 

champignons, tels que les rouilles (Laurans et Pilate 1999). 

C. INFORMATIONS CONCERNANT LA MODIFICATION GENETIQUE 

C.1. Description des méthodes utilisées pour la modification génétique. 

Les plants de peuplier faisant l’objet de ce dossier ont été obtenus grâce à la technique 

de transformation génétique utilisant Agrobacterium tumefaciens comme vecteur de transfert 

d’ADN, optimisée sur les entre-noeuds de tige du clone #717-1B4 (Leplé et al. 1992, Leplé et 

al. 1999). 

C.2. Nature et source des vecteurs utilisés. 

Cette demande de prolongation concerne l’insertion de 4 gènes différents codant pour 

différentes enzymes de la voie de biosynthèse des lignines : la Cinnamyl Alcool 

Déshydrogénase (CAD ; EC 1.1.1.195), la Caffeic acid O-Méthyl Transférase (COMT ; EC 

2.1.1.68), la Cinnamoyl Coenzyme A Réductase (CCR ; EC 1.2.1.44) et la Caffeoyl 

Coenzyme A O-Méthyl Transférase (CCoAOMT ; EC 2.1.1.104). Deux types de vecteurs ont 

été utilisés : ce sont tous deux des plasmides binaires dérivés du plasmide pBIN19 (Bevan 

1984). 

Ils possèdent notamment : 

- une origine de réplication nécessaire au maintien et à la multiplication du plasmide 

dans Escherichia coli, 

- une origine de réplication fonctionnelle dans A. tumefaciens et dans E. coli, 

- un gène de résistance à la kanamycine (nptIII) qui ne s’exprime que dans les 

bactéries, 

- un ADN-T limité par les bordures gauche (LB) et droite (RB) et contenant les 

séquences codantes du gène d’intérêt et du gène marqueur.

A 

Figure 1. A : Schéma du vecteur binaire pGSJ780A utilisé pour les transformations ciblées 

sur les gènes CAD et COMT. B : Schéma de l’ADN-T transféré dans le peuplier (cf. dossier 

#B/FR/95.03.05, annexe 2) 

Ces deux vecteurs sont : 

Le plasmide binaire, pGSJ780A (Bowler et al. 1991 ; De Block 1990 ; figure 1). 

Le gène marqueur utilisé est le gène de la néomycine phosphotransférase 

(nptII) fusionné i) au promoteur (pNOS) du gène de la nopaline synthase de 

Tn7 et ii) au terminateur (3’OCS) de l’octopine synthase. La séquence codant 

pour une enzyme de la voie de biosynthèse des lignines (CAD ou COMT, cf. 

§C3) est insérée entre le promoteur (p35S-2) du virus de la mosaïque du choufleur 

et le terminateur du gène 7 de l’ADN-T d’A. tumefaciens (3'g7, aussi 

nommé pAg7). 

B

A 

B 

C 

Figure 2. A : Schéma du vecteur binaire pBibHygro utilisé pour les transformations ciblées 

sur les gènes CCR et CCoAoOMT. B : séquences des ADNc de CCR et CCoAOMT 

présentes sur l’ADN-T transféré dans le peuplier. C : schéma de l’ADN-T transféré dans le 

peuplier (cf. dossier B/FR/99.02.15, annexe 2a & 2b)

Le plasmide binaire pBIBHygro (Becker 1990, figure 2) contient, entre les deux 

frontières de l’ADN-T : le gène (hpt) de l'hygromycine B phosphotransférase 

fusionné avec le promoteur (pNOS) du gène de la nopaline synthase et le 

terminateur du gène 7 de l’ADN-T (pAg7, aussi nommé 3’g7), et un site de 

clonage multiple. La séquence codant pour une enzyme de la voie de 

biosynthèse des lignines (COMT, CAD, CCR ou CCoAOMT, cf. §C3) est 

insérée dans ce site de clonage ; elle est flanquée du promoteur 35S du virus 

de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) avec un enhancer doublé (p70, aussi 

nommé p35-2), et du terminateur du gène 35S du CaMV (pA35S). Chacun des 

vecteurs binaires ainsi construits a été introduit dans la souche d’A. 

tumefaciens C58C1Rif(pMP90) (Koncz and Schell 1986) utilisée pour la 

transformation génétique du peuplier. 

La technique de transformation par A. tumefaciens permet l’intégration de l’ADN-T 

constitué du gène d’intérêt et du gène marqueur de sélection, encadrés par les bordures 

droite (RB) et gauche (LB). 

C.3. Taille, origine (nom) des organismes donneurs et fonction recherchée de 

chaque fragment constitutif de la région envisagée pour l'insertion. 

La séquence à insérer dans le génome de la plante hôte est l’ADN-T encadré par les 

bordures droite (RB) et gauche (LB) du plasmide Ti d’Agrobacterium tumefaciens 

comprenant le gène d’intérêt et le gène marqueur de sélection. 

Les gènes d’intérêt sont des gènes de peuplier codant pour quatre enzymes de la 

biosynthèse des monolignols, unité élémentaire du polymère de lignines, un des composants 

majeurs du bois (figure 3). La séquence de chacun des gènes d’intérêt est insérée en 

position sens ou antisens entre i) le promoteur du virus de la mosaïque du chou-fleur 

(CaMV) simple (p35S) ou doublé (p70, aussi nommé 35S-2) et, ii) une séquence 

terminateur, soit celle du gène T7 de l’ADN-T (3’g7, aussi nommé pAg7) soit celle du gène 

35S du CaMV (pA35S) (cf. §C2). L’insertion en position antisens a pour objectif d’entraîner 

l’extinction de l’expression du gène endogène correspondant. L’ARN messager produit par le 

gène en position antisens interfère avec l’ARN messager endogène et conduit à une forte 

réduction du niveau de la protéine codée par le gène endogène. L’insertion en position sens 

entraîne chez certaines lignées (dont celles faisant partie de la présente demande) un effet 

similaire (c'est-à-dire une réduction de l’activité de l’enzyme ciblée) par un mécanisme 

appelé co-suppression. L’altération du profil d’activité de ces enzymes dans l’espace et dans 

le temps se traduit par des modifications en quantité et en qualité du polymère de lignines et 

en conséquence, des modifications des propriétés du bois. 

Les quatre séquences utilisées, décrites ci-dessous, dérivent de séquences d’ADNc 

isolées, soit d’une banque d’ADNc de feuilles de l’hybride Populus trichocarpa x Populus 

deltoïdes, clone AFOCEL N°064, cv Hunnegen (pour les ADNc de la COMT et de la CAD), 

soit d’une banque d’ADNc de xylème du clone “Trichobel “ de l’espèce pure Populus 

trichocarpa (pour les ADNc de la CCoAOMT et de la CCR) : les séquences de ces quatre 

gènes sont placées en annexe 1.

Figure 3. La voie de biosynthèse des monolignols chez les angiospermes d’après 

Bonawitz and Chapple, 2010. 

1) COMT (Caffeic acid O-méthyl transférase) : fragment d’une taille de 900 pb, de la 

région 3’ de l’ADNc de la COMT (Accession : AAF60951 ; Dumas et al. 1992), inséré en 

orientation antisens uniquement. Le gène chimérique (p35-AS-COMT-p3’T7) est introduit 

dans le vecteur binaire pGSJ780A pour donner le vecteur de transformation pGSJ780A/AS- 

COMT. 

2) CAD (Cinnamyl alcool déshydrogénase) : ADNc pleine longueur d’une longueur de 

1378 pb (accession Z19568 ; van Doorsselaere et al. 1995a) inséré en orientation sens ou 

antisens. Les gènes chimériques (p35-S-CAD-p3’T7 et p35-AS-CAD-p3’T7) sont introduits 

dans le vecteur binaire pGSJ780A pour donner respectivement les vecteurs de 

transformation pGSJ780A/S-CAD & pGSJ780A/AS-CAD. 

3) CCR (Cinnamoyl coenzymeA réductase) : ADNc pleine longueur codant pour CCR 

(accession AJ224986 ; Leplé et al. 1998) inséré en orientation sens ou antisens. Les gènes 

chimériques (p70-S-CCR-pA35S et p70-AS-CCR-pA35S) sont introduits dans le vecteur 

binaire pBIBHygro pour donner, respectivement, les vecteurs de transformation 

pBIBHygro/S-CCR et pBIBHygro/AS-CCR. 

4) CCoAOMT (Caffeoyl coenzyme A O-méthyl transférase) : ADNc pleine longueur 

codant pour la CCoAOMT (accession AJ224894 ; Meyermans et al., 2000) inséré en 

orientation sens ou antisens. Les gènes chimériques (p70-S-CCoAOMT-pA35S et p70-AS- 

CCoAOMT-pA35S) sont introduits dans le vecteur binaire pBIBHygro pour donner, 

respectivement, les vecteurs de transformation pBIBHygro/S-CCoAOMT et pBIBHygro/AS- 

CCoAOMT.

Pour les constructions p70-S-CCoAOMT-pA35S, p70-AS-CCoAOMT-pA35S, p70-S- 

CCR-pA35S et p70-AS-CCR-pA35S : Le gène marqueur utilisé est le gène de l’hygromycine 

B phosphotransférase (hpt) fusionné au promoteur (pNOS) du gène de la nopaline synthase 

de Tn7 et au terminateur du gène 7 de l’ADN-T (pAg7), 

Pour les constructions p35-AS-COMT-p3’T7, p35-S-CAD-p3’T7 et p35-AS-CAD-p3’T7 : 

Le gène marqueur utilisé est le gène de la néomycine phosphotransférase (nptII) fusionné au 

promoteur (pNOS) du gène de la nopaline synthase de Tn7 et au terminateur (3’OCS) de 

l’octopine synthase. 

Les schémas des différentes constructions ont été fournis dans les dossiers de 

demande de dissémination correspondant à la première installation au champ des peupliers 

transgéniques faisant l’objet de cette présente demande de prolongation (cf. Cornu et al. 

1995 (dossier #B/FR/95.03.05, annexe 2) ; Cornu et al. 1999 (Dossier B/FR/99.02.15, 

annexe 2a & 2b)). Ces schémas ont été replacés dans ce dossier (figure 1 et 2). 

D. INFORMATIONS CONCERNANT LA PLANTE SUPERIEURE GENETIQUEMENT MODIFIEE 

D1. Description du ou des caractères et des caractéristiques qui ont été 

introduits ou modifiés 

Les plants de peupliers transgéniques faisant l’objet de cette demande d’autorisation 

d’essais au champ présentent des lignines modifiées suite à l’altération du niveau d’activité 

d’une des quatre enzymes de la lignification décrites plus haut. La réduction de ce niveau 

d’activité s’étale de 60 à 90% environ, le taux des réductions n’est pas nécessairement 

uniforme dans l’ensemble de la plante. En conséquence, les lignines du bois sont modifiées 

en quantité (baisse globale inférieure à 20%) et/ou en qualité. Ces modifications affectent les 

propriétés du bois. Cela se traduit notamment par l’intégration dans le polymère des lignines 

(donc dans le bois) d’unités élémentaires atypiques. La présence de telles unités 

élémentaires, qui sont des composés aromatiques, s’accompagne de l’apparition d’une 

coloration parfois vive dans la zone de bois en formation (à la périphérie du tronc et des 

branches). Ce phénotype coloré, qui varie selon le gène dont l’expression est altérée, est 

très facile à suivre : alors que le bois du clone INRA #717-1B4 non transformé est vert/jaune 

pâle, les lignées CAD ont un xylème fortement coloré en rouge, les lignées COMT et 

CCoAOMT sont plutôt roses, et les zones à faible activité CCR sont orange. Les 

modifications du bois associées aux modifications génétiques peuvent entraîner des 

altérations dans la croissance et le développement de l’arbre, liées aux importantes fonctions 

du bois dans l’arbre (principalement soutien mécanique et conduction de la sève brute) ; d’où 

l’intérêt d’une évaluation agronomique. Ces modifications génétiques peuvent également se 

traduire par des modifications des propriétés du bois importantes pour une utilisation 

technologique (production de papier ou de bioéthanol). Les modifications introduites au 

niveau des lignines ainsi qu’au niveau des propriétés papetières du bois de ces arbres ont 

été décrites dans plusieurs publications, dont certaines portent sur le matériel récolté sur les 

essais au champ faisant l’objet de cette demande d’extension (Baucher et al. 1996 ; van 

Doorsselaere et al. 1995b ; Meyermans et al. 2000 ; Lapierre et al. 1999 ; Pilate et al. 2002 ; 

Lapierre et al. 2004 ; Leplé et al. 2007). L’évaluation de l’aptitude à la production de 

bioéthanol (objet de la précédente demande d’autorisation) est encore en cours d’évaluation, 

les premières analyses ayant d’ores et déjà donné des résultats très encourageants pour 

certaines des lignées testées. 

Les lignées de peupliers ayant intégré l’ADN-T du vecteur de transformation 

pGSJ780A/AS-COMT sont dénommées ASCOMT2B et ASCOMT10B. 


pGSJ780A/AS-CAD sont dénommées ASCAD21 et ASCAD52, tandis que la lignée de 

peupliers ayant intégré le vecteur de transformation pGSJ780A/S-CAD est nommée SCAD1.

La lignée de peupliers ayant intégré l’ADN-T du vecteur de transformation 

pBIBHygro/S-CCR est nommée WT52-3, tandis que la lignée de peupliers ayant intégré le 

vecteur de transformation pBIBHygro/AS-CCR est nommée WT62-13. 


pBIBHygro/S-CCoAOMT sont dénommées 416 & 429, tandis que la lignée de peupliers 

ayant intégré le vecteur de transformation pBIBHygro/AS- CCoAOMT est nommée 101. 

Toutes les lignées de peupliers à lignines modifiées sont également résistantes à la 

kanamycine ou à l’hygromycine B, la résistance à ces antibiotiques ayant uniquement servi à 

sélectionner les plantes génétiquement transformées au cours des étapes de culture in vitro 

(présence des gènes nptII ou hpt sur le vecteur de transformation). 

D2. Informations sur les séquences réellement insérées ou délétées 

i) Taille et structure de l'insert et méthodes utilisées pour sa caractérisation, avec 

indication des parties de vecteur introduites dans la PSGM ou de tout ADN vecteur ou 

étranger restant dans la PSGM 

Les séquences transférées ont été détectées en réalisant des analyses de Southern 

sur l’ADN génomique extrait de plants de peuplier avant leur première installation en champ 

(cf. Cornu et al. 1995 (dossier #B/FR/95.03.05) ; Cornu et al. 1999 (dossier B/FR/99.02.15)). 

Cette caractérisation a démontré l’intégration stable des fragments d’ADN transférés. Des 

analyses par PCR ont permis de caractériser si l’excision des ADN-T avant leur insertion 

dans le génome des plantes transformées s’était bien réalisée au niveau des frontières 

droites et gauches des ADN-T. L’absence d’amplification observée dans la plupart des 

lignées de peupliers transgéniques, en utilisant comme amorces des séquences situées de 

part et d’autre de chacune de ces frontières, indique que les excisions se sont bien produites 

au niveau des bordures de l’ADN-T ; en d’autres termes, seul l’ADN-T a été intégré au 

génome de la plante hôte. Cependant, pour les deux lignées à faible activité CCR, un signal 

positif a été obtenu pour les PCR réalisées avec des amorces amplifiant la bordure gauche 

et les séquences rk2 et aph3 : l’excision au niveau de la bordure gauche n’a donc pas 

fonctionné et un fragment important du vecteur binaire a été intégré en addition à l’ADN-T 

dans le génome de ces deux lignées (les données de PCR fournies dans le dossier 

B/FR/99.02.15 sont jointes à ce dossier en annexe 3). 

iii) 

En cas de délétion, taille et fonction des régions supprimées 

La technique mise en œuvre n’entraîne pas de délétion 

iii) Nombre de copies de l’insert 

Le nombre de sites d’insertion dans le génome a été estimé par analyse de Southern 

(cf. Cornu et Pilate 1995 (dossier #B/FR/95.03.05) ; Cornu et al. 1999 (dossier B/FR/99.02.15)). 

Nous avons réalisé des analyses de Southern dont les résultats sont présentés en annexe 4. 

Le tableau ci-dessous récapitule le nombre d’inserts estimés à partir de ces analyses. 

Nb inserts 

Lignées COMT : ASCOMT10B 2 

ASCOMT2B 2 

Lignées CAD : ASCAD21 2 

ASCAD52 2 

SCAD1 > ou= 4 

Lignées CCR : WT52.3 > ou= 6 

WT62.13 > ou= 4

Lignées CCoAOMT : 101 3 

416 5 

429 2 

iv) localisation de l'insert dans les cellules de la plante (intégré au chromosome, 

aux chloroplastes ou aux mitochondries, ou sous forme non intégrée), et méthodes 

utilisées pour sa détermination. 

Dans les différentes lignées, les inserts ont été intégrés au niveau du génome 

nucléaire comme révélé par analyse de Southern. 

D3. Informations concernant l'expression de l'insert 

i) Informations concernant l'expression évolutive de l'insert durant le cycle de vie 

de la plante et les méthodes utilisées pour sa caractérisation 

Différentes méthodes sont utilisées pour suivre l’expression des inserts dans l’espace 

et le temps : quantité des ARNs (analyse de Northern, RT-PCR semi-quantitative), quantité 

de protéines (analyse par Western blot quand un anticorps spécifique est disponible, mesure 

d’activité enzymatique), modification qualitative et quantitative des lignines (méthode Klason 

et méthode par thioacidolyse), phénotype coloré du bois… 

Les analyses de northern en utilisant des sondes révélant soit l’ARN sens (endogène) 

ou l’ARN antisens (transgène) des différentes séquences cibles (codant les enzymes de la 

lignification) ont été réalisées sur des ARN totaux extraits de feuilles et de xylème. Dans les 

plantes normales, seul le xylème exhibe une forte expression de l’ARN endogène. Les 

lignées SCAD1, ASCAD T21, ASCAD T52, ASCOMT2B et ASCOMT10B présentent une 

forte réduction du niveau d’ARN endogène dans le xylème (Baucher et al. 1996 ; van 

Doorsselaere et al. 1995). Il est à noter que l’expression de l’ARN sens dans la lignée 

SCAD1 se traduit par un phénomène de co-suppression expliquant pourquoi, comme pour 

les autres lignées analysées, nous observons une réduction de l’expression de l’ARN 

endogène correspondant. L’expression des ARN sens (SCAD1) et antisens (ASB2B, 

ASB10B, ASCAD T21 et ASCAD T52) est sous contrôle du promoteur 35S du CAMV 

présentant peu de spécificité tissulaire. Toutefois, les ARN messagers COMT et CAD 

endogène n’étant exprimés que dans certains tissus (vaisseaux et xylème), la réduction de 

l’expression de l’ARN messager par effet antisens/co-suppression n’est observée que dans 

ces tissus. Les tests d’activité enzymatique capable de détecter des activités méthyl 

transférases spécifiques par dosage de la radioactivité de l’acide férulique résultant de la 

transformation de l’acide caféique par la COMT en présence de la S-Adenosyl Methionine 

(SAM) tritiée comme donneur de groupement méthyl ont révélé une forte réduction (>95%) 

de cette activité dans les deux lignées ASCOMT2B et ASCOMT10B. L’activité CAD a était 

réalisée par dosage colorimétrique du NADP+ formé lors de la réaction transformant l’alcool 

cinnamylique en cinnamaldéhyde : les analyses révèlent des activités résiduelles de l’ordre 

de 30 à 40% chez les lignées SCAD1, ASCADT21, ASCADT52. 

Le niveau des transcripts CCR dans le xylème des lignées WT52-3 et WT62-13 a été 

évalué par RT-PCR (Leplé et al. 2007), tandis que la réduction du niveau des CCoAOMT 

dans les lignées 101, 416 et 429 a été évaluée au niveau des protéines par western blot 

grâce à la disponibilité d’un anticorps spécifique dirigé contre cette enzyme (Meyermans et 

al. 2000). 

Les lignées choisies pour cette demande d’extension sont toutes altérées au niveau du 

métabolisme des lignines, ce qui se traduit par l’intégration dans le polymère des lignines 

d’unités élémentaires atypiques ayant pour effet des phénotypes colorés au niveau du 

xylème en développement. Nous avons pu vérifier la persistance de ce phénotype au cours

des années, de 1995 jusqu’à aujourd’hui, pour les lignées à faible activité CAD et COMT et, 

depuis 1999, pour les lignées à faible activité CCoAOMT et CCR. Il faut cependant souligner 

que le phénotype coloré des lignées à faible activité CCR n’est présent que sous forme de 

taches. De plus, l’intensité de ces colorations varie au cours des saisons : par exemple, la 

coloration orange des lignées à faible activité CCR est beaucoup plus visible en fin d’été 

qu’au printemps. Enfin, nos observations tendent à montrer que les effets de l’expression du 

transgène sur le métabolisme des lignines s’affaiblissent légèrement au fur et à mesure que 

l’arbre prend de l’âge. Par contre, après recépage des arbres, les rejets de jeunes tiges 

présentent à nouveau un phénotype comparable à celui observé initialement (figure 4, 

résultats non encore publiés). 

Figure 4. A : Echantillon de l’arbre A11 (ASOMT10B) prélevé le 23 mars 2007 à une hauteur de 

1m30 et orienté Nord/Sud grâce à l’encoche du côté nord. B : Photographie des rejets (de gauche à 

droite : 5 ASOMT2B et 10B (légèrement rosées), 1 tige ASCADT52 (rainurée rouge), 3 SCAD1 

(rouges), 1 ASCADT21 (rouge), puis 5 témoins (rainurés rouges) récoltés le 4 juin 2008. (G. Pilate, 

INRA Orléans) 

ii) Parties de la plante où l'insert est exprimé (par exemple les racines, la tige, le 

pollen, etc.). 

Comme précisé au paragraphe précédent, l’expression des inserts a été vérifiée au 

niveau des transcrits, des protéines ou de leur activité. Cependant, même si l’expression des 

différents inserts (COMT, CAD, CCoAOMT ou CCR) est sous le contrôle du promoteur du 

35S CAMV simple ou doublé ne présentant pas de spécificité tissulaire, les effets de la 

transformation sont effectifs lorsque le transcrit endogène est exprimé, soit au niveau des 

tissus vascularisés de la tige, des branches, des racines et des feuilles. 

D4. Description des différences entre la plante génétiquement modifiée et 

la plante réceptrice : 

i) Mode(s) et/ou vitesse de reproduction 

Au cours des essais précédents impliquant les mêmes lignées de peupliers à lignines 

modifiées, nous n’avons pas observé de différence entre plantes génétiquement modifiées et 

plantes réceptrices en ce qui concerne le mode ou la vitesse de reproduction. Les lignées à 

lignines modifiées ont commencé à fleurir en même temps et semblent autant florifères que 

les plants témoins. A noter que lors de la dernière période d’autorisation, nous n’avons pas 

observé de floraison du fait du mode de culture en taillis à très courte rotation (recépage sur 

des arbres de 3 ans, donc avant la première floraison), ce qui sera également le cas pour la 

demande d’extension de l’essai.

ii) Dissémination 

Dans les précédentes demandes de mise en champ de peupliers génétiquement 

modifiés, nous prévenions toute dissémination par la collecte et la destruction des fleurs. 

Lors de la dernière période d’autorisation, nous n’avons pas observé de floraison du fait du 

mode de culture en taillis à très courte rotation. 

iii) Capacité de survie. 

L’ensemble des arbres de certaines lignées à lignines modifiées de l’essai 

B/FR/99.02.15 n’a pas supporté les conditions hivernales et a été éliminé dès la première 

année. En revanche, les lignées à lignines modifiées faisant l’objet de cette demande de 

prolongation ne paraissent pas affectées dans leur capacité de survie, à l’exception des 

lignées SCAD1 et W62-13 qui présentent une réduction de croissance considérable par 

rapport au témoin, particulièrement en conditions de taillis à très courte rotation (densité de 

l’ordre de 10 000 tiges/ha). Il est très probable que cette moindre capacité de croissance lui 

ferait perdre assez rapidement la compétition pour la lumière, menant ainsi à terme à une 

réduction de sa capacité de survie, voire son élimination dans des conditions de fortes 

compétitions. Les autres lignées ne présentent pas ou seulement de faibles différences de 

croissance avec les arbres témoins. 

D5. Stabilité génétique de l'insert et stabilité phénotypique de la PSGM. 

La stabilité génétique de l’insert n’a pas été testée. Concernant la stabilité 

phénotypique, comme déjà indiqué plus haut, nos observations indiquent que les effets de 

l’expression du transgène sur le métabolisme des lignines s’affaiblissent au fur et à mesure 

que l’arbre prend de l’âge. Au contraire, les rejets de tiges qui poussent après recépage des 

arbres (réalisé par exemple en fin de rotation) présentent à nouveau un phénotype 

comparable à celui observé initialement (figure 4, résultats non publiés). De même, les 

observations concernant les phénotypes colorés du xylème en activité (cf. § D3.i) suggèrent 

une bonne stabilité phénotypique des modifications au cours des années. 

D6. Toute modification de la capacité de la PSGM à transférer du matériel 

génétique dans d'autres organismes. 

Non testé. Il faut noter que nous contrôlons toute dissémination du matériel génétique 

par voie végétative (destruction régulière des drageons) ou par voie florale (puisque les 

rotations sont trop courtes pour que les arbres produisent des fleurs). 

D7. Information concernant les effets toxiques, allergisants ou autres effets 

nocifs résultant de la modification génétique sur la santé humaine. 

A ce jour nous ne disposons d’aucune indication sur une toxicité éventuelle pouvant 

résulter des séquences introduites. La modification génétique confère aux plantes 

transgéniques une résistance à l’hygromycine ou à la kanamycine et des altérations dans le 

polymère de lignines mis en place dans les parois des cellules de bois. Les gènes introduits 

responsables de ces caractères ne présentent, à notre connaissance, aucun risque de 

toxicité particulier. 

D8. Information concernant la sécurité de la PSGM pour la santé des animaux 

notamment en ce qui concerne tout effet toxique, allergisant ou autre effet nocif 

résultant de la modification génétique, lorsque la PSGM est destinée à être utilisée 

dans l'alimentation des animaux. 

Sans objet.

D9. Mécanisme d'interaction entre la plante génétiquement modifiée et les 

organismes cibles (le cas échéant). 

Sans objet. 

D10. Modifications potentielles des interactions de la PSGM avec les 

organismes non-cibles résultant de la modification génétique. 

Aucune interaction particulière n’est attendue avec des organismes non cibles. 

Les lignines sont parfois décrites comme ayant un rôle de barrière contre l’attaque des 

pathogènes. Aucun effet des différentes PSGM sur des organismes non cibles n’a été 

observé au cours d’un essai installé en Angleterre et impliquant ls mêmes lignées 

transgéniques à faible activités CAD ou COMT que dans cette demande de prolongation 

(Halpin et al. 2007). L’effet des modifications du métabolisme des lignines dans les 

différentes lignées génétiquement modifiées sur la microfaune et la microflore associée a été 

évaluée au cours de l’essai précédent : il apparait que les différences dans l’assemblage des 

ectomycchorhizes entre différentes lignées transgèniques sont similaires à celles se 

produisant entre différents génotypes du commerce (Danielsen et al. 2012 ; Danielsen et al. 

in press). 

D11. Interactions potentielles avec l'environnement abiotique. 

L’expression des transgènes introduits est constitutive car sous le contrôle du 

promoteur p70CaMV. Il est cependant possible que sous l’effet de stress abiotique, 

lumineux, hydrique ou thermique l’expression des transgènes soit affectée, sans qu’aucun 

effet négatif n’ait jamais été observé ni anticipé. 

D12. Description des méthodes de détection et d'identification de la plante 

génétiquement modifiée. 

La plupart des lignées génétiquement modifiées peuvent être identifiées pendant la 

période de croissance par le phénotype coloré du xylème en cours de différenciation. Des 

techniques moléculaires permettent également une identification fiable des plantes 

transgéniques, telles que l’analyse de Southern en prenant des sondes spécifiques du gène 

de résistance à l’antibiotique intégré dans les peupliers GM (nptII pour les peupliers CAD et 

COMT, hpt pour les peupliers CCR et CCoAOMT) et absent chez les plantes non 

transformées (Annexe 2 & 4). 

D13. Informations, le cas échéant, sur les précédentes disséminations de la 

plante génétiquement modifiée. 

L’ensemble des différentes PSGM a déjà été l’objet d’une expérimentation en champ. 

Les lignées ASCAD52, ASCAD21, SCAD1, ASCOMT10B et ASCOMT2B ont été l’objet 

d’une autorisation de plantation en champ en 1995 (Dossier B/FR/95.03.05), puis de deux 

demandes de prolongation (Dossiers B/FR/03.06.01 et B/FR/07/06/01). 

Les lignées 101, 416, 429, WT52#3, WT62#13, ASCOMT10B et ASCOMT2B ont 

également fait l’objet d’une autorisation de plantation en champ en 1999 (Dossier 

B/FR/99.02.15), puis ont été inclues dans une demande de prolongation (B/FR/07/06/01). 

E. INFORMATIONS CONCERNANT LE SITE DE DISSEMINATION 

E1. Localisation et étendue des sites de dissémination. 

Tous nos essais impliquant des PSGM sont localisés dans une zone de la pépinière de 

l’unité de recherche AGPF, située sur la commune de Saint-Cyr en Val, dans le Centre de

Recherche INRA d’Orléans (figure 5). Puisque pour cet essai, nous réalisons une seconde 

rotation du matériel déjà installé pour l’essai #B/FR/07.06.01, la plantation sera par 

construction localisée sur les parcelles déjà utilisées lors de la précédente expérimentation, 

soit une première parcelle d’une surface expérimentale de 21 m x 21 m, soit 441 m 2 , et une 

seconde parcelle de 61,5 m x 15 m, soit 922,5 m 2 , pour une surface totale de 1363,5 m 2 . 

Figure 5. Parcelle D de la pépinière de l’Unité expérimentale UE 995 sur le site 

d’Orléans du centre INRA Val de Loire. En bleu clair, les surfaces concernées par la 

présente demande d’extension d’autorisation. 

E2. Description de l'écosystème des sites de dissémination, y compris le 

climat, la flore et la faune. 

Le site est situé sur la première terrasse de Sologne : le sol, très filtrant, est de texture 

sableuse avec silex à tendance battante. Le climat est typique du Val de Loire à caractère 

océanique avec vents d’ouest dominants et des précipitations moyennes annuelles de 600 

mm. 

La flore est de type acidophile et de sols pauvres, à prédominance de chêne, de 

bouleau, de châtaignier, de pins, de callune et de bruyère cendrée. La classification phytosociologique 

correspondante est de l’ordre « Quercetalia robori-petraeae ». 

E3. Présence d'espèces apparentées sauvages sexuellement compatibles ou 

d'espèces végétales cultivées sexuellement compatibles. 

Dans la région, à proximité du Centre de Recherche d’Orléans, il est possible de 

trouver des individus sauvages de P. tremula et de P. x canescens sexuellement 

compatibles. De plus, l’Unité AGPF d’Orléans possède sur sa pépinière des clones de 

différents peupliers de la section Populus.

E4. Proximité des sites de biotopes officiellement reconnus ou de zones 

protégées susceptibles d'être affectées. 

Il n’existe pas à proximité du site d’implantation de l’essai de biotope officiellement 

reconnu ou de zone protégée susceptible d’être affectée. 

F. INFORMATIONS CONCERNANT LA DISSEMINATION 

F1. Objectif de la dissémination 

Comme déjà évoqué dans l’introduction, les lignines sont indispensables au bon 

développement de l’arbre de par leur rôle dans les fonctions de soutien et de conduction du 

bois ; a contrario, elles sont indésirables pour la production de biocarburants de seconde 

génération à partir de bois car elles limitent grandement l’accès des enzymes de 

saccharification aux polysaccharides de la paroi. 

L’élimination des lignines lors de l’étape de prétraitement est fortement dépendante de 

la quantité des lignines présentes dans le bois et de leurs propriétés. Nous avons produit des 

peupliers GM pour lesquels nous avons modifié de façon ciblée la voie de biosynthèse des 

lignines et donc leur qualité et/ou leur qualité. L’objectif de la dissémination est d’étudier des 

lignées de peupliers modifiés pour l’expression de 4 gènes codant pour des enzymes clés de 

la voie de biosynthèse des lignines : CCoAOMT, COMT, CCR et CAD (figure 3). La 

modification de l’expression de ces gènes entraîne des changements importants sur la 

quantité et la qualité des lignines présentes dans le bois des arbres génétiquement modifiés 

par rapport à des arbres de même génotype non modifiés génétiquement. Ces changements 

importants vont déterminer la "solidité" du polymère de lignines et sa résistance aux 

traitements chimiques ou enzymatiques lors d'une utilisation technologique tandis qu’ils 

peuvent affecter également le potentiel de croissance et de développement des arbres GM. 

Nous avons choisi de réaliser cette évaluation sur une plantation menée en taillis à très 

courte rotation (TTCR), cette sylviculture étant une option raisonnable pour mener des 

cultures énergétiques dans l’objectif de maximiser la production de biomasse avec une forte 

densité de plantation (10 000 tiges à l’hectare) et des récoltes tous les deux trois ans 

pouvant être encore réalisées avec du matériel agricole. De plus, l’essai est réalisé dans 

notre pépinière en Sologne sur un sol marginal peu fertile, impropre à toute culture agricole 

rentable. 

Lors de la période précédente, nous avons réalisé le recépage de l’ensemble du 

dispositif en mars 2012, ce qui a constitué la première rotation : de nombreux échantillons 

ont été prélevés et sont en cours d’analyse. Avec cette demande d’extension, nous 

poursuivons un test en grandeur nature de l’effet de modifications quantitatives et/ou 

qualitatives des lignines dans l’élaboration d’une ressource bois à vocation énergétique, et 

cela dans des conditions voisines de celles qui sont envisageables aujourd’hui pour le 

développement futur de ce type de ressources, c'est-à-dire en taillis à très courte rotation et 

sur un sol marginal afin de ne pas entrer en compétition avec les cultures alimentaires pour 

l’utilisation des surfaces cultivables. 

Par ailleurs, une culture en TTCR est recépée tous les 2 à 3 ans, gardant l’arbre dans 

sa phase juvénile avant qu’il ait pu produire des fleurs, permettant de facto un contrôle total 

de la dissémination par graines ou pollen. 

Afin d’évaluer les performances agronomiques des lignées, différentes mesures seront 

réalisées de façon régulière, mesures portant sur des aspects quantitatifs (hauteur et 

diamètre des arbres, nombre de brins principaux) et qualitatifs (attaques de ravageurs, chute 

de cime…).

A la fin des deuxième et troisième rotations, l’essai sera recépé et le bois récolté et 

traité afin d’évaluer le rendement de saccharification qui est un critère clé pour la production 

de bioéthanol. Si des techniques adaptées sont optimisées à ces dates, des prétraitements 

capables de préserver les propriétés des lignines seront appliqués afin d’évaluer les 

différences potentielles entre lignées dans l’optique d’une valorisation des lignines comme 

sous-produit à haute valeur ajoutée. Les résultats agronomiques et technologiques seront 

comparés aux résultats obtenus au cours de la première rotation. 

Enfin, un suivi agronomique des teneurs en élément minéraux (N, S, P, K, Ca, Mg et 

Mn) continuera d’être réalisé tout au long de la durée de l’essai. 

Toutes les expérimentations seront effectuées uniquement à des fins de recherches. 

F2. Date(s) et durée prévues de l'opération. 

Les deux dispositifs ayant été recépés au mois de mars 2012 afin de profiter de la forte 

repousse de printemps, l’opération s’étendra sur les cinq prochaines années, soit jusqu’à la 

fin décembre 2017. 

F3. Méthode de dissémination envisagée. 

Les peupliers grisards ayant la capacité de rejeter des souches, la croissance des 

nouvelles tiges se fera naturellement à partir des souches correspondant aux plants de 

peupliers installés depuis 2008 et 2009. 

F4. Méthode de préparation et gestion du site avant, pendant et après la 

dissémination, y compris les pratiques culturales et les modes de récolte. 

Le site d’expérimentation est inclus dans la pépinière de l’Unité AGPF de l’INRA 

d’Orléans. A ce titre, il est doublement protégé par la clôture générale du Centre et par une 

clôture d’isolement de parcelles de pépinière. Le site est isolé par une zone de protection de 

3 m maintenue constamment propre par un travail superficiel du sol. Dans un périmètre de 

20 m autour de la parcelle expérimentale, toute apparition de drageons (aisément 

identifiables) sera régulièrement contrôlée par traitement herbicide. 

La zone expérimentale est une zone régulièrement entretenue réservée aux 

expérimentations impliquant des peupliers génétiquement modifiés. Le terrain sera entretenu 

selon les méthodes utilisées classiquement pour ce type de culture : hersage, désherbage 

chimique de la zone expérimentale et de la zone de protection, fertilisation manuelle, 

irrigation... 

Le site sera pris en charge pour la partie entretien par l’Unité Expérimentale “GBFOR” 

sous la direction des responsables scientifiques de l’expérimentation. 

Il en va de même pour la récolte des échantillons qui se fera avec les méthodes 

classiques utilisées en routine par les équipes techniques. 

F5. Nombre approximatif de plantes (ou de plantes par mètre carré) 

Chaque lignée de peuplier GM ou témoin a été plantée à 120 exemplaires répartis en 5 

blocs de 24 plants (6 x 4 plants), répartis de façon semi aléatoire sur toute la surface de 

l’essai (figure 6). Le nombre de plants GM s’élève ainsi à 1200 plants, auxquels se rajoutent 

240 plants témoins, soit une densité de 10 000 plants / ha. L’espacement sur la longueur de 

l’essai est de 1 m tandis qu’il est alternativement de 0.6m et de 1.2m sur la largeur, ce qui 

permet le passage aisé d’une débroussailleuse pour l’entretien régulier de la parcelle.

Figure 6. Plan du dispositif expérimental. Chaque lignée est plantée en 5 blocks de 

24 individus, nommés Tbr et Tin pour les témoins non transformés 

Pour les peupliers transgéniques : Li2 101 (pBIBHygro/AS-CCoAOMT) 

Li3 416 (pBIBHygro/S-CCoAOMT) 

Li4 429 (pBIBHygro/S-CCoAOMT) 

Li5 WT52-3 (pBIBHygro/S-CCR) 

Li7 WT62-13 (pBIBHygro/AS-CCR) 

Li9 ASCOMT2B (pGSJ780A/AS-COMT) 

Li11 ASCOMT10B (pGSJ780A/AS-COMT) 

Li18 ASCAD52 (pGSJ780A/AS-CAD) 

Li21 ASCAD21 (pGSJ780A/AS-CAD) 

Li22 SCAD1 (pGSJ780A/S-CAD)

G. INFORMATIONS SUR LES PLANS DE SURVEILLANCE, DE CONTROLE, ET DE TRAITEMENT DU 

SITE ET DES DECHETS APRES DISSEMINATION 

G1. Précautions prises 

i) Distance(s) des autres espèces végétales sexuellement compatibles, espèces 

parentales sauvages et cultivées 

L’Unité AGPF d’Orléans possède sur sa pépinière des clones de différents peupliers 

de la section Populus. 

ii) Mesures visant à minimiser ou à empêcher la dissémination de tout organe 

reproducteur de la PSGM (par exemple pollen, graines, tubercules) 

Dans le cadre de cette demande, les peupliers ne pourront pas atteindre leur âge 

minimal de floraison (4 ans) car ils seront coupés tous les 3 ans. 

Le site de l’essai est isolé par une zone de protection de 3 m maintenue constamment 

propre par un travail superficiel du sol. Ainsi, toute apparition de drageons (aisément 

identifiables) autour de la parcelle expérimentale peut être régulièrement contrôlée par 

traitement herbicide. 

G2. Description des méthodes de traitement du site après dissémination. 

Afin de contrôler toute formation ultérieure de drageons, le sol (zone expérimentale et 

zone de protection) sera traité selon un protocole mis au point et éprouvé par l’Unité 

Expérimentale GBFOR pour l’élimination des peupliers avant replantation. 

A la fin de l’hiver suivant l’arrêt de l’expérimentation, tous les plants seront recépés à 

une hauteur de 20 cm en moyenne. Ensuite, on laissera les rejets de souche repousser 

jusqu’au mois de juin (la repousse a lieu essentiellement sur les réserves). A cette date, un 

traitement herbicide au glyphosate sera appliqué. Les plants seront ensuite arrachés au 

cours de l’automne et détruits par le feu. Ce protocole permet d’épuiser la souche et de 

détruire la totalité des racines, grandes et petites, Nous n’avons jamais observé de 

rémanents. 

G3. Description des méthodes de traitement après dissémination pour le 

matériel issu de plantes génétiquement modifiées, y compris les déchets. 

En fin d’expérimentation, après prélèvement de tous les échantillons nécessaires aux 

différentes analyses moléculaires, biochimiques et technologiques, les plants seront 

dévitalisés, arrachés mécaniquement et brûlés suivant la procédure décrite au précédent 

paragraphe. 

G4. Description des plans et des techniques de surveillance. 

Le site d’expérimentation est situé dans une zone contrôlée (parcelle D) réservée à ce 

type d’expérimentation. 

Une attention particulière sera portée régulièrement à tout phénomène de 

drageonnage. 

Pendant la culture, l’essai sera suivi très régulièrement par le personnel responsable 

de la dissémination, les techniciens et les chercheurs. La conformité de l’expérimentation 

aux conditions décrites dans ce dossier et dans l’autorisation du Ministère de l’Agriculture 

sera contrôlée annuellement par les agents assermentés de la Protection des Végétaux. 

Après la destruction de l’essai, le site sera contrôlé régulièrement pendant les deux 

années suivantes de façon à détecter et éliminer les repousses (la première année), et 

vérifier (la deuxième année) l’absence de repousses.

G5. Description des plans d'urgence 

Au cours des 15 années d’essais au champ de peupliers à lignines modifiées que nous 

avons menés, nous n’avons pas eu d’évènements nécessitant la mise en œuvre d’un plan 

d’urgence. Néanmoins, nous continuerons de réaliser le suivi régulier de l’essai afin d’être 

capable d'identifier de façon précoce tout événement ou développement non souhaitable et 

de réagir par la destruction de l’essai telle que décrite au § G.2. 

G6. Méthodes et procédures de protection du site. 

Aucune méthode et/ou procédure particulière de protection du site ne sera appliquée. 

Cf. ci-dessus pour description générale des procédures de protection. 

H. CONCLUSIONS CONCERNANT LES INCIDENCES POTENTIELLES SUR LA SANTE PUBLIQUE ET 

L'ENVIRONNEMENT DE LA DISSEMINATION DE PLANTES SUPERIEURES GENETIQUEMENT 

MODIFIEES (PSGM) 

H1. Probabilité que les PSGM deviennent plus persistantes que les plantes 

parentales ou réceptrices dans les habitats agricoles ou se propagent plus 

rapidement dans les habitats naturels. 

Les plantes qui font l’objet de cette prolongation sont résistantes à la kanamycine ou à 

l’hygromycine et possèdent moins de lignines ou des lignines modifiées. 

La résistance à un antibiotique, qui n’est pas utilisé en extérieur (ni en agriculture, ni en 

sylviculture) n’a aucune raison de conférer au peuplier qui porte ce caractère, ni une 

meilleure persistance dans les habitats agricoles, ni une meilleure propagation dans les 

habitats naturels. 

Aucun avantage sélectif des peupliers génétiquement modifiés faisant l’objet de cette 

demande, comme aucune incidence écologique sur des organismes non cibles, ne peuvent 

être actuellement identifiés. Il existe une variation certaine de la quantité et de la qualité des 

lignines entre espèces, et à l’intérieur d’une même espèce (Sarkanen et Hergert 1971 ; 

Studer et al. 2011). Cependant, les lignines sont impliquées dans des fonctions vitales pour 

l’arbre (soutien mécanique, conduction de la sève, barrière contre les pathogènes) ; notre 

expérience de plus de 15 ans en ce domaine nous a démontré à plusieurs occasions que les 

modifications apportées aux lignines par génie génétique, tant du point de vue quantitatif que 

qualitatif, devaient faire l’objet de nombreuses mesures sous peine d’altérer rapidement les 

fonctions de conduction et de soutien (Pilate et al. 2004). De plus, il s’est avéré que des 

peupliers à lignines modifiés qui se comportaient relativement bien dans le milieu très 

protégé de la serre se révélaient très diminués (par rapport aux arbres témoins non 

modifiés), voire inaptes à survivre dans le milieu un peu plus contraignant de la pépinière 

(qui est pourtant beaucoup moins contraignant que l’habitat naturel du peuplier grisard). 

D’ailleurs, le plus difficile dans nos travaux sur ce matériel est bien de trouver un compromis 

entre une modification des lignines assez importante pour être potentiellement intéressante 

sur le plan technologique, et simultanément qui ne soit pas trop délétère pour le 

développement de l’arbre. Ceci suggère que les peupliers génétiquement modifiés faisant 

l’objet de cette demande d’extension ont tout au plus une persistance égale aux individus 

non génétiquement modifiés ; il n’y aucune raison de penser que les modifications apportées 

influent sur la rapidité de propagation des peupliers à lignines modifiées dans leur habitat 

naturel. 

H2. Avantages ou inconvénients sélectifs conférés aux PSGM 

Comme nous l’avons déjà écrit dans le paragraphe précédent, notre expérience de 

plus de 15 ans sur l’étude de l’effet des modifications des lignines nous amène à conclure 

que dès lors que ces modifications ont été apportées de façon artificielle, comme c’est le cas

par génie génétique, donc sans que les forces de sélection aient pu agir, il y a toutes les 

chances que ces modifications confèrent un désavantage adaptatif à la plante 

génétiquement modifiée, au mieux un statu quo. 

H3. Possibilité de transfert de gènes aux mêmes espèces ou à d'autres 

espèces végétales sexuellement compatibles dans les conditions de plantation du 

PSGM et avantages ou inconvénients sélectifs conférés à ces espèces végétales 

La possibilité de transfert de gènes aux mêmes espèces ou à d'autres espèces 

végétales sexuellement compatibles dans les conditions de plantation est inexistante, en 

raison de l’absence de floraison. 

H4. Incidences immédiates et/ou différées que les interactions directes ou 

indirectes entre les PSGM et les organismes cibles, tels que prédateurs, 

parasitoïdes et agents pathogènes peuvent avoir sur l'environnement (le cas 

échéant) 

Les plantes faisant l’objet de ce dossier n’ont pas vocation à agir directement sur des 

organismes cibles. 

H5. Incidences immédiates et/ou différées que les interactions directes ou 

indirectes entre le PSGM et des organismes non-cibles (compte tenu également des 

interactions d'organismes avec les organismes cibles), notamment les incidences 

sur les niveaux de population des concurrents, herbivores, symbiotes (le cas 

échéant), parasites et agents pathogènes 

Les lignines sont supposées avoir un rôle de barrière vis-à-vis de l’attaque des 

pathogènes, mais de fait très peu de données existent sur le sujet et il semble bien que la 

biosynthèse des lignines puisse avoir un rôle plus subtil qu’une simple barrière en réponse à 

l’attaque d’herbivores ou de microbes (Quentin et al. 2009). Par ailleurs, depuis que nous 

réalisons des essais avec ces lignées de peupliers à lignines modifiées, nous n’avons jamais 

observé d’effets évidents, par exemple une variation dans la résistance de ce matériel à 

l’attaque de pathogènes.

H6. Effets immédiats et/ou différés éventuels sur la santé humaine résultant 

des interactions directes ou indirectes potentielles entre les PSGM et les personnes 

travaillant ou entrant en contact avec la/les PSGM disséminée(s) ou se trouvant à 

proximité 

Aucune allergie de contact n’a été développée par les personnels de laboratoire qui 

manipulent depuis de nombreuses années des plantes transgéniques exprimant le gène 

de sélection hptI. Les études menées dans le cadre de l’homologation de plantes 

génétiquement modifiées n’ont pas révélé de toxicité particulière associée au gène nptII 

(Fuchs et al., 1993). Un avis émis par l’Agence Française de Sécurité Sanitaire des 

Aliments développe de façon approfondie les raisons de cette absence de toxicité. Il est 

consultable sur le site suivant : 

http://www.afssa.fr/actualites/index.asp?mode=actu&ladate=&id_info=4673&id_the 

me=1086 

Par ailleurs, la stratégie est d’inhibé la biosynthèse d’enzyme de la voie de 

biosynthèse des lignines. Cela se traduit donc seulement par une diminution du niveau de 

la protéine endogène, écartant tout risque d’effet allergisant, 

H7. Effets immédiats et/ou différés éventuels sur la santé des animaux et 

conséquences pour la chaîne alimentaire résultant de la consommation de l'OGM 

ou de tout produit dérivé s'il est destiné à être utilisé en tant qu'aliment pour 

animaux 

Sans objet. 

H8. Incidences immédiates et/ou différées sur les processus biogéochimiques 

résultant des interactions directes et indirectes potentielles de l’OGM et des 

organismes cibles et non-cibles à proximité du/des OGM disséminé(s) 

Des expériences préliminaires ont montré que le bois de certaines lignées de peuplier 

à lignines modifiées se décomposait à court terme plus rapidement que les arbres témoins 

(Pilate et al. 2002). Cependant, des expériences menées sur près de 18 mois ont démontré 

qu’à cette échelle de temps, les différences entre lignées n’étaient pas significatives et que 

les différences dues aux variations environnementales pendant la croissance des arbres en 

champ étaient bien plus importantes que les différences mesurées entre lignées à lignines 

modifiées et arbres témoins (Hopkins et al. 2007). Cela nous amène à la conclusion que les 

incidences sur les processus biogéochimiques des modifications des lignines sont au plus 

mineures. 

H9. Incidences immédiates et/ou différées, directes ou indirectes, que les 

techniques spécifiques de culture, de gestion et de récolte utilisées pour la PSGM 

peuvent avoir sur l'environnement lorsqu'elles sont différentes de celles utilisées 

pour des plantes supérieures non génétiquement modifiées 

Sans objet.

I. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 

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quantitative et qualitative de la lignine, influence sur les caractères papetiers et la 

qualité du bois. 2) Recherche de l’induction de la stérilité chez un clone femelle. 

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Annexe 1 : séquences des gènes CAD, COMT, CCR & CCoAOMT 

CAD 

LOCUS Z19568 1305 bp mRNA linear PLN 18-APR-2005 

DEFINITION P.deltoides encoding cinnamyl alcohol dehydrogenase. 

ACCESSION Z19568 

VERSION Z19568.1 GI:288752 

KEYWORDS cinnamyl alcohol dehydrogenase. 

SOURCE Populus deltoides 

ORGANISM Populus deltoides 

Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; 

Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; core eudicotyledons; 

rosids; fabids; Malpighiales; Salicaceae; Saliceae; Populus. 

REFERENCE 1 (bases 1 to 1304) 

AUTHORS Van Doorsselaere,J., Baucher,M., Feuillet,C., Boudet,A.M., Van 

Montagu,M. and Inze,D. 

TITLE Isolation of cinnamyl alcohol dehydrogenase cDNAs from two 

important economic species: alfalfa and poplar. Demonstration of a 

high homology of the gene within angiosperms 

JOURNAL Plant Physiol. Biochem. 33, 105-109 (1995) 

REFERENCE 2 

AUTHORS Van Doorsselaere,J. 

TITLE Direct Submission 

JOURNAL Submitted (07-JAN-1993) Van Doorsselaere J., Ghent University, Lab. 

of Genetics, Ledeganckstraat 35, Ghent B-9000, Oost Vlaanderen, 

Belgium 

REMARK revised by [3] 


AUTHORS Van Doorsselaere,J. 


JOURNAL Submitted (01-APR-1993) Van Doorsselaere J., Ghent University, Lab. 

of Genetics, Ledeganckstraat 35, Ghent B-9000, Oost Vlaanderen, 

Belgium 

COMMENT On Jun 11, 1993 this sequence version replaced gi:20466. 

FEATURES Location/Qualifiers 

source 1..1305 

/organism="Populus deltoides" 

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CDS 28..1101 

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/translation="MGSLETERKIVGWAATDSTGHLAPYTYSLRDTGPEDVFIKVISC

GVCHTDIHQIKNDLGMSHYPMVPGHEVVGEVVEVGSDVTRFKVGDVVGVGVIVGSCKN 

CHPCKSEIEQYCNKKIWSYNDVYTDGKPTQGGFAESMVVHQKFVVRIPDGMSPEQAAP 

LLCAGLTVYSPLKHFGLKQSGLRGGILGLGGVGHMGVKIAKAMGHHVTVISSSDKKRE 

EAMEHLGADEYLVSSDVESMQKAADQLDYIIDTVPVVHPLEPYLSLLKLDGKLILMGV 

INAPLQFVTPMVMLGRKSITGSFIGSMKETEEMLEFCKEKGVASMIEVIKMDYINTAF 

ERLEKNDVRYRFVVDVAGSKLIH" 

ORIGIN 

1 ctctcttagc ctcattgttt caagaaaatg ggtagccttg aaacagagag aaaaattgta 

61 ggatgggcag caacagactc aactgggcat ctcgctcctt acacctatag tctcagagat 

121 acggggccag aagatgtttt tatcaaggtt atcagttgtg gagtttgcca taccgatatc 

181 caccaaatca aaaatgatct tggcatgtca cactatccta tggtccctgg ccatgaagtg 

241 gttggtgagg ttgttgaggt gggatcagat gtgacaaggt tcaaagttgg agatgttgtc 

301 ggtgttggag tcatcgttgg aagctgcaag aattgtcatc catgcaaatc agagattgag 

361 caatactgca acaagaaaat ctggtcttac aatgatgtct acactgatgg caaacccacc 

421 caaggaggct ttgctgaatc catggttgtg catcaaaagt ttgtggtgag aattcctgat 

481 gggatgtcac cagaacaagc agcgccgcta ttgtgcgctg gattgacagt ttacagccca 

541 cttaaacact ttggactgaa acagagtggg ctaagaggag ggattttagg acttggagga 

601 gtagggcaca tgggggtgaa gatagcaaag gcaatgggac accatgtaac tgtgattagt 

661 tcttctgaca agaagcggga ggaggctatg gaacatcttg gtgctgatga atacttggtc 

721 agctcggatg tggaaagcat gcaaaaagct gctgatcaac ttgattatat catcgatact 

781 gtgcctgtgg ttcaccctct ggagccttac ctttctctgt tgaaacttga tggcaagctg 

841 atcttgatgg gtgttattaa tgccccattg cagtttgtta cgcctatggt tatgcttggg 

901 agaaagtcta tcaccgggag cttcataggg agcatgaagg agacagagga gatgcttgag 

961 ttctgcaagg aaaagggagt ggcctccatg attgaagtga tcaaaatgga ttatatcaac 

1021 acagcattcg agaggcttga gaaaaatgat gtgagatata gattcgttgt cgatgttgct 

1081 ggtagcaagc ttattcactg aacaacaata ctcttcatat tcgaaaaaaa aacgatatac 

1141 attgatacct gtttcagacg tgactttatt tccgagtgat gtgttttgtg gatcaaatgt 

1201 gacagtgtgt ctttgctttt aaaataaaga aaaggttgaa ttgttttttt aaaaaaaaaa 

1261 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 

// 

COMT 

LOCUS POPOME 1375 bp mRNA linear PLN 30-NOV-2000 

DEFINITION Populus x generosa tissue-type leaf O-methyltransferase mRNA, 

complete cds. 

ACCESSION M73431 

VERSION M73431.1 GI:169452 

KEYWORDS . 

SOURCE Populus trichocarpa x Populus deltoides 

ORGANISM Populus trichocarpa x Populus deltoides 





AUTHORS Dumas,B., Van Doorsselaere,J., Legrand,M., Van Montagu,M.M. and 

Inze,D. 

TITLE Molecular analysis of a poplar O-methyltransferase involved in 

lignin biosynthesis 

JOURNAL Unpublished 



/organism="Populus trichocarpa x Populus deltoides" 



/tissue_type="leaf" 

CDS 56..1150 


/product="O-methyltransferase" 

/protein_id="AAF60951.1"

db_xref="GI:7332271" 

/translation="MGSTGETQMTPTQVSDEEAHLFAMQLASASVLPMILKTAIELDL 

LEIMAKAGPGAFLSTSEIASHLPTKNPDAPVMLDRILRLLASYSILTCSLKDHPDGKV 

ERLYGLAPVCKFLTKNEDGVSVSPLCLMNQDKVLMESWYYLKDAILDGGIPFNKAYGM 

TAFEYHGTDPRFNKVFNKGMSDHSTITMKKILETYKGFEGLTSLVDVGGGTGAVVNTI 

VSKYPSIKGINFDLPHVIEDAPSYPGVEHVGGDMFVSVPKADAVFMKWICHDWSDAHC 

LKFLKNCYDALPENGKVILVECILPVAPDTSLATKGVVHIDVIMLAHNPGGKERTEKE 

FEGLAKGAGFQGFEVMCCAFNTHVIELRKN" 

ORIGIN 

1 tttttttcac cttcttcaac cttttgtttc cttaaagaat tcaatcttga tcaagatggg 

61 ttcaacaggt gaaactcaga tgactccaac tcaggtatca gatgaagagg cacacctctt 

121 tgccatgcaa ctagccagtg cttcagttct accaatgatc ctcaaaacag ccattgaact 

181 cgaccttctt gaaatcatgg ctaaagctgg ccctggtgct ttcttgtcca catctgagat 

241 agcttctcac ctccctacca aaaaccctga tgcgcctgtc atgttagacc gtatcttgcg 

301 cctcctggct agctactcca tactgacttg ctctctgaaa gatcatcctg atgggaaagt 

361 tgagagactg tatggccttg ctcctgtttg caaattcttg accaagaacg aggacggtgt 

421 ctctgtcagc cctctctgtc tcatgaacca ggacaaggtc ctcatggaaa gctggtatta 

481 tttgaaagat gcaattcttg atggaggaat tccatttaac aaggcctatg ggatgactgc 

541 atttgaatat catggcacgg atccaagatt caacaaggtc ttcaataagg gaatgtctga 

601 ccactctacc attaccatga agaagattct tgagacctac aaaggctttg aaggcctcac 

661 atccttggtg gatgttggtg gtgggactgg agctgtcgtt aacaccatcg tctctaaata 

721 cccttcaatt aagggcatta actttgattt gccccacgtc attgaggatg ccccatctta 

781 tcccggtgtg gagcatgttg gtggggacat gtttgttagt gtgcccaaag cagatgccgt 

841 tttcatgaag tggatatgcc atgattggag cgacgcacac tgcttaaaat tcttgaagaa 

901 ttgctatgac gccttgccgg aaaacggcaa ggtgatactt gttgagtgca ttcttcccgt 

961 ggctcctgac acaagccttg ccaccaaggg agtcgttcac attgatgtta tcatgctggc 

1021 gcacaacccc ggtgggaaag agaggaccga aaaggaattt gagggcttag ctaagggagc 

1081 tggctttcaa ggttttgaag tgatgtgctg tgcattcaac acacatgtca ttgaactccg 

1141 caagaactaa ggctcaagtc caagctccaa gttacttggg gttttccata caacgttgct 

1201 gctgtctctg cttttgatgt tgtgattgct tttttacatg acgagtagct ttctcttatg 

1261 aaacatgtaa ggttaaggtt gcgttttgta tgcctgattt tctcaaataa cttcactgcc 

1321 tccctcaaaa ttcttaatac atgtgaaaag atttcttaaa aaaaaaaaaa aaaaa 

// 

CCR 

LOCUS AJ224986 1376 bp mRNA linear PLN 10-FEB-1999 

DEFINITION Populus trichocarpa mRNA for cinnamoyl CoA reductase. 

ACCESSION AJ224986 

VERSION AJ224986.1 GI:2960363 

KEYWORDS CCR gene; cinnamoyl CoA reductase. 

SOURCE Populus trichocarpa (Populus balsamifera subsp. trichocarpa) 

ORGANISM Populus trichocarpa 




REFERENCE 1 

AUTHORS Leple,J.C., Grima-Pettenati,J., Montagu,M. and Boerjan,W. 

TITLE A cDNA encoding cinnamoyl-CoA reductase from Populus trichocarpa 

(accession no. AJ224986). (PGR98-121) 

JOURNAL Plant Physiol. 117, 1126-1126 (1998) 


AUTHORS Leple,J.C., Grima-Pettenati,J., Van Montagu,M. and Boerjan,W. 


JOURNAL Submitted (09-MAR-1998) Laboratorium voor Genetica, Vlaams 

Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie, Universiteit Gent, 

Ledeganckstraat 35, Gent 9000, BELGIUM 



/organism="Populus trichocarpa"

mol_type="mRNA" 

/cultivar="Trichobel" 


/clone="popCCR2.1" 

/tissue_type="xylem" 

/clone_lib="Lambda ZAP II cDNA library from 

differentiating xylem" 

gene 1..1376 

/gene="CCR" 

CDS 99..1115 

/gene="CCR" 

/EC_number="1.2.1.44" 


/product="cinnamoyl CoA reductase" 


/db_xref="GI:2960364" 

/db_xref="GOA:O65880" 



/db_xref="UniProtKB/TrEMBL:O65880" 

/translation="MPVDASSLSGQGQTICVTGGGGFIASWMVKLLLDKGYTVRGTAR 

NPADPKNSHLRELEGAEERLTLCKADLLDYESLKEGIQGCDGVFHTASPVTDDPEEMV 

EPAVNGTKNVIIAAAEAKVRRVVFTSSIGAVYMDPNKGPDVVIDESCWSDLEFCKNTK 

NWYCYGKAVAEQAAWDMAKEKGVDLVVVNPVLVLGPLLQPTVNASITHILKYLTGSAK 

TYANSVQAYVHVRDVALAHILVFETPSASGRYLCSESVLHRGEVVEILAKFFPEYPIP 

TKCSDEKNPRKQPYKFSNQKLRDLGFEFTPVKQCLYETVKSLQEKGHLPIPKQAAEES 

LKIQ" 

ORIGIN 

1 gaaaacacac ctcctctctt ctttgtctct gtctgttctc cactttccca gtcaccaaac 

61 tcgtatgcat ataattacat ttatctaaat ataacaacat gcctgttgat gcttcatcac 

121 tttcaggcca aggccaaact atctgtgtca ccgggggtgg tggtttcatt gcttcttgga 

181 tggttaaact tcttttagat aaaggttaca ctgttagagg aactgcgagg aacccagctg 

241 atcccaagaa ttctcatttg agggagcttg aaggagctga agaaagatta actttatgca 

301 aagctgatct tcttgattat gagtctctta aagagggtat tcaagggtgt gatggtgttt 

361 tccacactgc ttctcctgtc acagatgatc cggaagaaat ggtggagcca gcagtgaacg 

421 ggaccaaaaa tgtgataatt gcggcggctg aggccaaagt ccgacgagtg gtgttcacgt 

481 catcaattgg cgctgtgtac atggatccca ataagggccc agatgttgtc attgatgagt 

541 cttgctggag tgatcttgaa ttctgcaaga acaccaagaa ttggtattgc tatggaaagg 

601 ctgtggcaga acaagctgca tgggatatgg ctaaggagaa aggggtggac ctagtggtgg 

661 ttaacccagt gctggtgctt ggaccattgt tgcagcccac tgtcaatgct agcatcactc 

721 acatcctcaa gtacctcacc ggctcagcca agacatatgc taactctgtt caagcttatg 

781 tgcatgttag ggatgtggca ctagcccaca ttttagtctt tgagacgcct tccgcctccg 

841 gccgttacct ttgctctgag agcgttctcc accgtggaga ggtggtggaa atccttgcaa 

901 agttcttccc tgagtacccc atccctacca agtgctcaga tgagaagaac ccaagaaaac 

961 aaccttacaa gttctcaaac cagaagctaa gggatctggg tttcgaattc accccagtaa 

1021 agcagtgtct gtatgaaact gttaagagtt tgcaggaaaa gggtcacctt ccaatcccaa 

1081 aacaagctgc agaagagtct ttgaaaattc aataaggcct cttggaacta tttattagga 

1141 ttgttccata ccccaagttt ggatcgcaaa tgctagggaa aggagcatat taaagaatgc 

1201 caatgtgcag gtgttttagt attttacatg aagaactctg attatccttg tgcttataat 

1261 aatttttttc aagtgagtgt cttcaaatgt tcaacttgta tttgtggttg tctaacttta 

1321 tccagtttca atataaaaga ggaacgattc tatgtcttaa aaaaaaaaaa aaaaaa 

// 

CCoAOMT 

LOCUS AJ224894 1025 bp mRNA linear PLN 29-NOV-2000 

DEFINITION Populus balsamifera subsp. trichocarpa mRNA for caffeoyl-CoA 

3-O-methyltransferase, clone PtCCoAOMT1b. 

ACCESSION AJ224894 

VERSION AJ224894.1 GI:2960355

KEYWORDS caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase. 

SOURCE Populus trichocarpa (Populus balsamifera subsp. trichocarpa) 

ORGANISM Populus trichocarpa 




REFERENCE 1 

AUTHORS Meyermans,H., Morreel,K., Lapierre,C., Pollet,B., De Bruyn,A., 

Busson,R., Herdewijn,P., Devreese,B., Van Beeumen,J., Marita,J.M., 

Ralph,J., Chen,C., Burggraeve,B., Van Montagu,M., Messens,E. and 

Boerjan,W. 

TITLE Modifications in lignin and accumulation of phenolic glucosides in 

poplar xylem upon down-regulation of caffeoyl-coenzyme A 

O-methyltransferase, an enzyme involved in lignin biosynthesis 

JOURNAL J. Biol. Chem. 275 (47), 36899-36909 (2000) 

PUBMED 10934215 


AUTHORS Meyermans,H. 


JOURNAL Submitted (10-MAR-1998) Meyermans H., University of Gent, 

Laboratory of Genetics, Ledeganckstraat 35, Gent, B9000, BELGIUM 



/organism="Populus trichocarpa" 


/cultivar="Trichobel" 


/clone="PtCCoAOMT1b" 

/tissue_type="stem xylem" 

CDS 63..806 

/EC_number="2.1.1.104" 

/function="methylates lignin precursors" 


/product="caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase" 


/db_xref="GI:2960356" 

/db_xref="GOA:O65862" 


/db_xref="UniProtKB/Swiss-Prot:O65862" 

/translation="MATNGEEQQSQAGRHQEVGHKSLLQSDALYQYILETSVYPREPE 

CMKELREVTAKHPWNIMTTSADEGQFLNMLLKLVNAKNTMEIGVYTGYSLLATALAIP 

EDGKILAMDINRENYELGLPVIQKAGVAHKIDFKEGPALPVLDQMIEDGKCHGSFDFI 

FVDADKDNYINYHKRLIELVKVGGLIGYDNTLWNGSVVAPPDAPMRKYVRYYRDFVLE 

LNKALAADPRIEICMLPVGDGITLCRRIQ" 

ORIGIN 

1 aaaaaaaaaa aattccaagg ccaagaaaga gatcgtagtt taattagaag atatacacaa 

61 taatggccac caacggagag gaacagcaaa gccaggcagg aaggcaccag gaagttggcc 

121 acaagagcct tttgcaaagt gatgctcttt accagtatat tctcgagact agtgtgtatc 

181 caagagagcc tgaatgcatg aaggagctca gggaggtgac tgccaagcat ccttggaaca 

241 tcatgaccac atctgctgat gaagggcaat tcttgaatat gcttttgaag cttgtcaatg 

301 ccaaaaacac catggagatc ggtgtttaca ctggctattc tctcttggcc actgccctgg 

361 ctatccctga ggatggcaag atcttggcta tggacatcaa cagagaaaac tatgaattgg 

421 gtctcccagt aattcagaaa gctggtgttg cgcacaagat tgatttcaag gaaggccctg 

481 ctctaccagt tcttgatcaa atgattgaag atgggaagtg ccatggaagt tttgatttca 

541 tctttgtgga tgctgacaag gacaattata taaattatca caagaggttg attgagcttg 

601 taaaagttgg tgggctgatt gggtacgaca acactctgtg gaatggatct gtggtggctc 

661 cacctgatgc accaatgagg aagtatgtga ggtactacag ggactttgtt ttggagctca 

721 acaaggcact tgctgctgac cccaggattg aaatttgcat gcttcctgtt ggtgatggca 

781 tcactctctg ccgtcggatc caatgaggga cctgccagta ttgttatctg atgttgacca 

841 ttgaaatggt cacttacaaa aacaagggag atgtaatagt tgtttttacc cactttgtat

901 ttcaatggct tataatttgt gtacttgaac agaatggtgt ctgattgaga aattcctctc 

961 ttaaatttct gtaagtggat tttttatgca cttaatcaat attgttcggt ggcaaaaaaa 

1021 aaaaa 

Annexe 2 

Séquence du gène hpt conférant la résistance à l’hygromycine 

Les amorces utilisées pour la réaction de détection en PCR sont en couleur jaune pour 

la séquence « forward » et rouge pour la séquence « reverse » permettant d’amplifier un 

fragment de 165bp dont la séquence est soulignée. La séquence « reverse » effectivement 

utilisée est bien sur complémentaire de celle indiquée en rouge, soit 

TCTCGCTAAACTCCCCAATG 

>hpt 

ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGT 

TCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAG 

CTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTC 

TACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGT 

GCTTGACATTGGGGAGTTTAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAG 

GGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTACAACCGGTCG 

CGGAGGCTATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCC 

CATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATT 

GCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCG 

TCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGC 

ACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAAC 

AGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAAC 

ATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGC 

GGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCACGACTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGG 

TCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGC 

AGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAA 

TCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATA 

GTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGAAATAG

Séquence du gène nptII conférant la résistance à la kanamycine 

Les amorces utilisées pour la réaction de détection en PCR sont en couleur jaune pour 

la séquence « forward » et rouge pour la séquence « reverse » permettant d’amplifier un 

fragment de 477bp dont la séquence est soulignée. La séquence « reverse » effectivement 

utilisée est bien sur complémentaire de celle indiquée en rouge, soit 

TCGGCAAGCAGGCATCGCCA 

>nptII 

GATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCT 

ATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGG 

CTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGA 

ATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTT 

GCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCG 

AAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATC 

ATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACC 

ACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGA 

TCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAG 

GCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTG 

CTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGC 

TGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGA 

GCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGAT 

TCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGA

Annexe 3 

Analyse par PCR du fonctionnement des bordures de l’ADN-T dans les différentes lignées de 

peupliers à lignines modifiées (données fournies dans le dossier B/FR/99.02.15)

Annexe 3 (suite et fin)

Annexe 4 

Analyse par Southern blot des peupliers modifés pour les gènes CCR et 

CCoAOMT 

L’ADN génomique a été digéré par l’enzyme XbaI et hybridé avec une sonde hpt (cf. 

annexe 2). L’enzyme ne coupant pas dans la séquence correspondant à la sonde, le nombre de 

bande donne une estimation du nombre d’insertion.

Analyse par Southern blot des peupliers modifés pour les gènes CAD et COMT 

L’ADN génomique a été digéré par l’enzyme XbaI et hybridé avec une sonde nptII (cf 

annexe 2). L’enzyme ne coupant pas dans la séquence correspondant à la sonde, le nombre de 

bande donne une estimation du nombre d’insertion.

Dossier technique - Ogm

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