REGENERATION IN VITRO DE CINQ VARIETES DE CAFEIERS ...

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO
FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT
DE
BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE
MEMOIRE DE DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIES
DE
BIOCHIMIE
Option: BIOTECHNOLOGIE-MICROBIOLOGIE
REGENERATION IN VITRO DE CINQ VARIETES DE
CAFEIERS
(C.arabica bourbon, C. perrieri, C. racemosa, Var. AM2, Var. 344 ATo)
EXTRACTION D'ADN GENOMIQUE
DE
C. arabica bourbon, C. racemosa, C. perrieri
Présenté par
RAZAFIMAHARO Christian Benjamin
Maître-ès-sciences
Soutenu le 21 juillet 2003 devant les membres du jury compose de
Président du jury : Madame RALAMBORANTO Laurance, Professeur titulaire
Rapporteur : Monsieur Daniel RAMAMONJISOA, Maître de conférences
Examinateurs : Monsieur RAHERIMANDIMBY Marson, Professeur
Madame RAKOTO Doll Aurore, Docteur.

Ho an’I DADA sy MAMA,
Niaritra ny mafy tokoa ianareo nandritra ireo taona maro tamin’ny fanampiana sy
fanohanana. Nody ventiny tokoa izao ny rano natsakaina, ka indro atolotro “ity” ho
fankasitrahana anareo.
Ho anareo Zoky sy Zandry,
Atolotro anareo ity asa ity ho mariky ny maha iray antsika sy ny fifankatiavantsika. Tsy
tanteraka izao raha tsy ny fanampiana avy aminareo.

REMECIEMENT
Je tiens tout particulièrement à remercier le Chef du Département de Recherches Agronomiques
(DRA) à Ambatobe de nous avoir accueilli au sein de son équipe et de nous avoir fait confiance tout au
long de notre séjour au FOFIFA.
Nous tenons à exprimer toute notre reconnaissance envers les Chefs des deux Département DRFP
et DRT du FOFIFA pour toutes les peines qu`ils se sont données pour nous procurer les matériels et les
produits dont nous avions besoin.
Je remercie vivement Monsieur RAKOTOMALALA Jean Jacques pour les documents et l`appareil
photographique qui nous a permis de réaliser les belles photos illustrants ce travail.
J`ai une dette particulière envers RAMAMONJISOA Daniel, maître de conférences à la faculté des
sciences d`Antananarivo. Ce travail a pu être mené à bien, pour une grande part, grâce à son aide et à
ses qualités scientifiques et humaines. Je lui exprime ma profonde gratitude.
Nos remerciements vont aussi :
- au Professeur JEANNODA Victor, chef du département de Biochimie Fondamentale et Appliquée
et responsable de la formation en troisième cycle, de nous avoir prodigué des conseils tout au long de
notre formation.
- au Professeur titulaire RALAMBORANTO Laurence, qui nous a fait le grand honneur de
présider cette commission d`examen.
- au Professeur RAHERIMANDIMBY Marson et au Docteur RAKOTO Doll Aurore d`avoir bien
voulu accepter de juger ce travail.
A tous ceux qui, de prés ou de loin, ont contribué à la réalisation de ce travail, notamment
- les chercheurs et les techniciens du laboratoire de la phytopathologie du DRA
d`Ambatobe
- les ami(e)s qui m’ont soutenu moralement et surtout spirituellement durant ces années
d`études.
Merci !
Christian

Liste des abréviations
ADN : Acide désoxyribonucléique
AM : Arabica x Mascarocoffea
EDTA : Ethylène diamine tétracétique
BET : Bromure d’éthydium
DMSO : Diméthylsulfoxyde
DRA : Département de Recherches Agronomiques du FOFIFA
FOFIFA : Foibem-pirenena momba ny Fikarohana Ampiharina amin’ny Fampandrosoana ny
Ambanivohitra
GCA : Eugenoide x canephora x arabica
GD6 : Milieu de GREYSSHOF et DOY avec 60 g/l de saccharose
IRAM : Institut de Recherches Agronomiques de Madagascar
IRCC : Institut de Recherche du Café, du Cacao et autres plantes stimulantes
Kb : Kilobases ou kilo paire de bases
MS4 : Milieu de MURASHIGE et SKOOG avec 40 g/l de saccharose
Na 2 EDTA : Ethylène Diamine Tétra Acétique Disodique
RNase : Ribonucléase
Tris : Tris- (hydroxyméthyl) aminoéthane
UV : Ultraviolet

GLOSSAIRE
Cals : Amas de cellules indifférenciées résultant de la totipotence des tissus végétaux
Crossette : Fragment de tige attaché à la feuille
Caulogènese : Régénération de tige à partir de culture de microbouture ou de cals embryogènes.
Eucoffea : Section de caféiers cultivés, appartenant au genre Coffea
Mascarocoffea : Section de caféiers spontanés de Madagascar et des îles Mascareignes appartenant au
genre Coffea
Microboutures axéniques : nœuds exemptes de tout micro-organisme depuis leur naissance en les
cultivant dans des isolateurs assurant les conditions de stérilité absolue.
Orthotrope : Ramification primaire portant les branches fructifères
Photopériode : Alternance de période d’illumination et de période sombre dans le cycle journalier d’une
plante
Plagiotrope : Branche fructifère
Protoplaste : Cellule somatique débarrassée de sa membrane cellulosique
Rameaux semi-aoutés : Rameaux de l’année semi-lignifiés
Séquence palindromique : Séquence d'ADN pouvant se lire de la même façon sur les deux brins
complémentaires, dans des directions opposées

LISTE DES TABLEAUX
TABLEAU 1 : Structure botanique de la tribu des caféiers.
TABLEAU 2 : Types de désinfections utilisées.
TABLEAU 3 : Les différents milieux de cultures utilisés.
TABLEAU 4 : Résultats de la désinfection des microboutures.
TABLEAU 5 : Résultats des microbouturages.
TABLEAU 6 : Résultats d'initiation de la racine.
TABLEAU 7 : Résultats de l'embryogenèse somatique indirecte.
TABLEAU 8 : Résultats de la maturation des cals.

Listes des figures
Figure 1 : Structures des auxines
Figure 2 : Structure des cytokinines utilisés

Listes des photo
Photo 1a : C. perrieri
Photo 1b : C. perrieri. Rameaux.
Photo 2a : C. racemosa.
Photo 2b : C. racemosa. Rameaux.
Photo 3a : C. arabica bourbon.
Photo 3b : C. arabica bourbon. Rameaux.
Photo 4 : Feuilles de la variété 344 ATO sur GD6 + AIA 8 mg/l + 6 mg/l kinétine après 1 semaine de
culture.
Photo 5: Feuilles de la variété 344 AT 0 sur GD6 + 8mg/l AIA + 6mg/l kinétine après 1 mois de culture
Photo 6 : Feuilles de la variété 344 ATO sur GD6 + BAP 6 mg/l + 2,4-D 8 mg/l après 1 mois et demi de
culture.
Photo 7 : Microbouture de C. arabica var. bourbon après 8 jours de culture sur milieu D (MS4 + 6mg/l
BAP)
Photo 8 : Microbouture de C. arabica var. bourbon après 8 jours de culture sur milieu D (MS4 + 6mg/l
BAP)
Photo 9 : Microbouture de la variété AM2 sur milieu D (MS4 + 6 mg/l BAP) après 2 mois et demi de
culture
Photo 10 : Microbouture de la variété AM2 sur milieu C (MS4 + 6mg/l kinétine) après 1 mois et demi de
culture
Photo 11 : Microbouture de la variété AM2 sur milieu F (MS4 + 6mg/l kinétine + 0,6 mg/l AIB) après 2
mois de culture

Photo 12 : Microbouture de la variété AM2 sur milieu D (MS4 + 6mg/l BAP) après 1 mois de culture
Photo 13 : Microbouture de C. arabica var bourbon sur milieu C (MS4 + 6mg/l kinétine) après 2 mois de
culture
Photo 14 : microboutures de la variété AM2 après 1 mois de culture sur milieu D (MS4 + 6mg/l de BAP)
Photo 15 : Electrophorégramme sur gel d'agarose
Photo 16 : Electrophorégramme sur gel d'agarose après digestion
Photo 17 : Ectrophorégramme sur gel d'agarose après reconcentration

SOMMAIRE
INTRODUCTION…………………………………………………………….1-2
PREMIERE PARTIE : GENERALITES
I- DONNEES SUR LES CAFEIERS
I-1- Systématique des caféiers………………………………………………3-5
I-2- Description des espèces utilisées
I-2-1- Coffea arabica variété bourbon…………………………………5
I-2-2- Coffea racemosa………………………………………………..6
I-2-3- Coffea perrieri (A-5)…………………………………………...6
I-2-4-Variété hybride AM2……………………………………………6
I-2-5-Variété hybride 344 AT 0 (ET6-18 x GC1T 0 )……………………6
II- PROPAGATION VEGETATIVE DES CAFEIERS : le bouturage
II-1- Transport des bois de bouture…………………………………………7
II-2- Préparation des bacs de bouturage…………………………………….7
II-3- Préparation des boutures
II-3-1 Découpage en bouture feuillue à un nœud………………………8
II-3-2 L'éclairement et aptitude au bouturage………………………….8
III-CULTURE IN-VITRO
III-1- Historique…………………………………………………………..9
III-2 –Réaction des explants mis en culture………………………………10
III-3- Méthodes de régénération in-vitro appliquées au caféier
III-3-1- Culture de méristème………………………………………..10
III-3-2- Microbouturage……………………………………………...10
III-3-3- Embryogenèse somatique……………………………………11
- A partir de microboutures…………………………………………11
- A partir de fragments de feuille…………………………………...11
- Embryogenèse sur ovule de caféier……………………………….11
- Par culture d’anthères……………………………………………..11
- Par fusion de protoplastes……………………………………….12

DEUXIEME PARTIE : MULTIPLICATION IN VITRO DES ESPECES UTILISEES
I- MATERIELS
I-1- Le matériel végétal……………………………………………………16
I-2- Les milieux de culture…………………………………………………16
I-3- Préparation des milieux de culture…………………………………….16
I-4- Les régulateurs de croissance
I-4-1- Les auxines
A/ Les auxines naturelles…………………………………………17
B/ Les auxines de synthèse……………………………………….18
I-4-2- Les cytokinines…………………………………………………19
I-5- Préparation des régulateurs de croissance……………………………19
II- METHODES DE CULTURE
II-1-Multiplication par microbouturage
II-1-1- Stérilisation des explants………………………………………20
II-1-2-Mise en culture des nœuds……………………………………..21
II-2- Embryogenèse somatique……………………………………………21
II-2-1 Embryogenèse somatique indirecte sur fragments de feuille…...22
III- RESULTATS ET DISCUSSION
III-1- Désinfection des microboutures…………………………………….23-24
III-2- Résultats des microbouturages……………………………………...25-27
III-3- Rhizogenèse…………………………………………………………28-29
III-4- Embryogenèse somatique indirecte………………………………….30-31
III-5- Evolution des cals des variétés AM2 et 344 ATo…………………...32
TROISIEME PARTIE : EXTRACTION D’ADN GENOMIQUE
I- EXTRACTION D'ADN GENOMIQUE DE CAFEIER
I-1 Le matériel végétal………………………………………………37
I-2 Méthodes
I-2-1 Préparation de la solution d’extraction ..……………………….37

I-2-2 Broyage et purification des noyaux…………………………38
I-2-3 Extraction de l'ADN…………………………………………38
I-2-4 Séparation de fragments d’ ADN par électrophorèse en gel d'agarose…39
II- ANALYSE DE L'ADN GENOMIQUE PAR DIGESTION A L'AIDE DES ENZYMES
RESTRICTION…………………………………………………………………39-40
III- RESULTATS ET DISCUSSION……………………………………………….41-42
CONCLUSION ET PERSPECTIVES.……………………………………………..46-47
DE

INTRODUCTION
La filière café à Madagascar rencontre aujourd'hui des graves problèmes sur le plan national et
international. Il y a quelques années, Madagascar était encore l'un des plus importants producteurs de café
Robusta. Mais depuis la régression de la qualité de son café, Madagascar a été devancé par le Brésil,
Vietnam, l'Indonésie et la Cote d'Ivoire (CITE et GRET, 1998) .
La production caféière malgache est dominé par C. canephora, variété robusta et kouillou,
représentant 90% de la production nationale (RABEMIAFARA et al., 1997) . C. canephora est renommé
pour sa robustesse agronomique (d'où son nom commun de Robusta) et sa richesse en caféine. Il est
largement répandu dans les zones Est et Nord du pays (C.I.D.S.T. et al, 1989; CITE et GRET, 1998) . C.
arabica est plus aromatique et est surtout cultivé dans le Centre-Nord du pays. Il ne représente que les 5%
de la production caféière totale (CITE et GRET, 1998) .
Sur le marché mondial la détermination du prix du café est basée sur arabica et la demande va
vers un café de qualité sure, doté d'un goût neutre à la tasse. Ce café standard a une teneur en caféine
faible, voire nulle, mais garde une saveur agréable. La consommation mondiale s'oriente, ainsi, vers une
plus grande demande en arabica, 90% de la demande contre 10% pour robusta.
Aujourd'hui, les espoirs malgaches reposent sur les recherches effectuées par le FOFIFA (Foibempirenena
momba ny Fikarohana ampiharina amin'ny Fampandrosoana ny Ambanivohitra ou Centre
National de la Recherche Appliquée au Développement Rural) . Ces recherches concernent
principalement les hybrides interspécifiques, entre caféiers cultivés et caféiers sauvages malgaches et
africains introduits, qui seraient susceptibles de remplacer les anciens (C.I.D.S.T. et al., 1989) .
La recherche caféière à Madagascar a véritablement débuté en 1957, à la station d'Ilaka-Est de
l'Institut de Recherches Agronomiques de Madagascar (IRAM) dont la gestion était assurée par
l'ORSTOM. C'est en 1974 que le gouvernement confie au FOFIFA la charge des recherches sur le caféier.
Ces recherches sont basées sur les variétés cultivées, les Mascarocoffea et des hybrides interspécifiques.
Parmi ces derniers, le peuplement de GCA montre des individus agronomiquement intéressants :
- une bonne adaptation aux basses altitudes,
- une tolérance remarquable vis à vis de la rouille et divers scolytes,
- un port trapu fortement ramifié,
- une haute productivité et une pulpe réduite.
1

GCA se rapproche d’arabica, considéré comme un café de qualité. AM (arabica x Mascarocoffea) et MC
(Mascarocoffea x canephora) sont des hybrides interspécifiques respectivement hexaploïdes et diploïdes.
Traditionnellement, les variétés sélectionnées aux champs ou nouvellement créées par hybridation
sont multipliées par bouturage direct. Cette méthode exige une grande surface de terrain pour sa mise en
oeuvre et demande beaucoup de temps. Les difficultés rencontrées dans cette opération sont d'importances
inégales. Les nouvelles techniques de culture in-vitro et de biologie moléculaire permettent de surmonter
certaines d'entre elles. La multiplication végétative in-vitro pallie la très faible efficacité des techniques
horticoles de bouturage. L'embryogenèse somatique in-vitro constitue, dans certains cas, une réponse
élégante à la difficulté de reproduire une combinaison génétique par voie sexuée (INRA, 1991) .
Ce travail comporte trois parties :
la première partie traite des généralités sur la culture in-vitro et les caféiers,
la deuxième présente les matériels et méthodes mis en œuvre ainsi que les résultats et discussions,
la troisième partie concerne l'extraction d'ADN génomique de trois espèces de caféier (C. arabica var.
bourbon, C. racemosa et C. perrieri), les résultats ainsi qu’une discussion.
Enfin, une conclusion générale et des perspectives sont présentées.
2

GENERALITES
I - DONNEE SUR LES CAFEIERS
I 1- SYSTEMATIQUE DES CAFEIERS
Le genre Coffea, créé par DE JUSSIEU (MOWAN, 1978), appartient à la grande famille des
Rubiaceae. Cette famille comporte plus de 10400 espèces, essentiellement ligneuses (MARBERLEY,
1987) , regroupées en 630 genres (BREMER et JANSEN, 1981) . Les caféiers sensu lato constituent la
tribu des Coffeae (BRIDSON et VERDCOURT, 1988) .
Les espèces groupées dans cette tribu sont des arbres et arbustes à fleurs blanches, de type 4-5
jusqu’à 12, groupées en glomérules d’inflorescence racémique à l’aisselle des feuilles. Les ovaires
possèdent 2 loges contenant chacune un ovule. Les graines présentent un sillon ventral plus ou moins
invaginé, signe distinctif de leur placentation originale, dite «cofféene» (LEROY, 1980) .
La tribu des Coffeae est subdivisée en deux genres (tableau 1) : le genre Coffea et le genre
Psilanthus (BRIDSON, 1987) . Chacun des 2 genres est subdivisé en sous-genres inégalement riches en
espèces. Les espèces du genre Coffea sont classées en deux sous-genres : Coffea et Baracoffea. Les
espèces appartenant au genre Psilanthus sont regroupées en deux sous-genres : Psilanthus et Afrocoffea
(BRIDSON et VERDCOURT, 1988 ; BRIDSON, 1994) .
3

GENERALITES
Tableau 1 : Structure botanique de la tribu des caféiers
Classification des espèces de caféiers (tribu des Coffeae) d’après LEROY (1980) et
BRIDSON (1987).
SOUS GENRE
GENRE
COFFEA PSILANTHUS
Coffea
Psilanthus
(>80 taxons)
(1 taxon)
Baracoffea
Afrocoffea
(7 taxons)
(20 taxons)
Anthères et stigmates Anthères et stigmates
exertes
insertes
Style long
Style court
Fleurs axillaires,
développement
monopodial
Fleurs terminales et
développement
sympodial
prédominant
Subdivision taxonomique du sous-genre Coffea.
Le sous-genre a une répartition limitée au continent africain et à la région malgache. Il se divise en deux
sections : les Eucoffea et Mascarocoffea.
Les Eucoffea
Cette section de caféiers spontanés, inféodés à l’Afrique orientale, centrale et occidentale, renferme
les espèces cultivées, Elle est subdivisée par CHEVALIER (1947) , à partir de divers critères comme :
- la coloration des fruits à maturité :
rouge : Erythrocoffea, comprenant les deux principales espèces commerciales (C. arabica, C.
canephora) .
noire : mélanocoffea.
4

GENERALITES
- La taille des arbres adultes :
très développée : Pachycoffea.
peu développée : Nanocoffea.
- L’origine géographique :
Afrique orientale : Mozambicoffea.
Les Mascarocoffea (CHEVALIER, 1938)
Cette section de caféiers spontanés de Madagascar, des îles Mascareignes et de l’archipel des
Comores est caractérisée par une impressionnante diversité de formes et de caractères morphologiques.
L’analyse simultanée de la variabilité de leur comportement phénologique, de leurs caractères
morphologiques, agronomiques, technologiques et chimiques, et des inter-croisements, ont conduit
CHARRIER (1975) à regrouper les Mascarocoffea en six séries :
- série Verae.
- série Multiflorae.
- série Mauritianae-Humblotianae.
- série Garcinioïdes.
- série Subterminales.
Les hybrides interspécifiques (RAKOTOMALALA, 1992 ; RABEMIAFARA et al, 1998)
Les hybrides diploïdes entre Mascarocoffea et C. canephora
Les hybrides hexaploïdes entre C. arabica et Mascarocoffea
Les hybrides tétraploïdes trois voies (GCA ou Ratelo) entre C. eugenoïdes x C. canephora) x C. arabica
I-2 DESCRIPTION DES ESPECES UTILISEES
Cinq variétés de caféiers sont utilisées
I-2-1- Coffea arabica var. bourbon (photo 1a et 1b)
D’après CHEVALIER, cette variété serait dérivée de C. arabica L., variété abyssinica. Fixée par
sélection, elle se rencontre à l’état spontané en Abyssinie. Cette variété est considérée comme un mutant
récessif originaire de l'île de la Réunion.
5

GENERALITES
Elle est cultivée dans tous les pays tropicaux et subtropicaux sous des noms divers : «nacional» au
Brésil ; «java» en Malaisie; «bourbon» à la Réunion. Sa caractéristique est d'être d'une forme réduite mais
d'une végétation dense, conséquence du développement très fourni de ramifications aux nœuds
rapprochés. Les grains sont plus petits que ceux de l'espèce type. Cette variété est appréciée pour sa
productivité et sa qualité.
I-2-2- Coffea racemosa (photo 2a et 2b)
Variété de caféier venant d’Afrique orientale, Coffea racemosa est compris dans la subdivision des
Mozambicoffea (CHEVALIER, 1947) . Ce sont des arbustes, souvent de petite taille, à feuilles caduques,
petites à très petites, à fruits très petits, ovoïdes et à graines petites ou très petites.
I-2-3- Coffea perrieri (photo 3a et 3b) : Série des Multiflorae (CHARRIER, 1978)
Il est caractérisé par :
- des feuilles coriaces assez grandes (10-15 cm de longueur) ,
- des inflorescences en position axillaire sur le bois âgé, constituées de fascicules nombreux ou de
courtes cymes très florifères,
- Des fleurs de 8 à 12 mm de long, à tube court évasé,
- Des fruits ovoïdes allongés.
I-2-4- Hybride AM2
Les AM sont des hybrides issus du croisement de C. arabica géniteur femelle, tétraploïde et de
Mascarocoffea géniteur mâle, diploïde.
AM2 hybride issu de C. arabica (R 23) x C. perrieri (A 12)
I-2-5- Hybride 344 AT 0 (FOFIFA, 1987)
Le clone 344 AT 0 est un hybride interspécifique. C’est un Arabusta obtenu par combinaison de C.
canephora (ou autres hybrides) avec C. arabica.
344 AT 0 est obtenu par combinaison d’ET 6 –18 x GCI T 0.
ET 6 –18 est originaire d’Ethiopie.
GC1 T 0 est issu de la polyploïdisation des hybrides F1 (2n = 2x = 22) GC1 de type C. canephora x C.
eugenioïdes.
6

GENERALITES
II- PROPAGATION VEGETATIVE DES CAFEIERS : LE BOUTURAGE
La technique de bouturage du caféier est étudiée depuis plus d’une vingtaine d’année. Elle est
maintenant bien au point.
Des caféiers hybrides provenant d’Ilaka-Est ont été bouturés au FOFIFA Ambatobe.
II-1 TRANSPORT DES BOIS DE BOUTURE
Les bois de bouture proviennent de pieds cultivés à Ilaka-Est. Ce sont des rameaux orthotropes
semi-aoûtés. Seules les pousses orthotropes sont utilisées pour constituer un arbuste de port normal. Les
boutures de rameaux plagiotropes donnent des caféiers anormaux, au port buissonnant.
La diffusion des bois de bouture sur de longs trajets se fait par envoi de tiges entières ou des
sections de tiges enveloppées de mousse humide sous matière plastique (SNOECK, 1968) . Après 12 à 14
jours de conservation, le taux de reprise des boutures est supérieur à 90%. Le trempage dans des solutions
de produits anti-transpirants ne paraît pas être indispensable.
II-2 PREPARATION DES BACS DE BOUTURAGE
Les bacs sont de cuves en maçonnerie, remplies de terre (1/3) et de sable de rivière (2/3) . Le
mélange «terre-sable» est stérilisé par du Formol (5 ml dans 10 l d’eau) avant de le mettre dans les bacs 48
heures après. Les bacs sont ombragés par un lattis de pailles, situé à 0,5 mètre de hauteur. Les bacs
peuvent recevoir entre 250 et 400 boutures au mètre-carré . La charge est surtout fonction de la superficie
des demi-feuilles. Un mètre carré de bac bien employé est susceptible de fournir 1500 à 2000 boutures
racinées par an.
7

GENERALITES
II-3 PREPARATION DES BOUTURES
Les premiers essais de bouturage ont été effectués avec des boutures d’une longueur de deux à
quatre nœuds. L’avantage de faire des boutures courtes (1 nœud) est apparu par la suite.
II-3-1 Découpage en bouture feuillue à un nœud.
Les boutures, provenant de rameaux semi-aoûtés, sont à un nœud. Le limbe des feuilles est amputé
de la moitié de sa surface pour limiter l’encombrement des bacs et réduire l’évapotranspiration (SNOECK,
1968) . Les boutures sont disposées côte à côte les unes des autres. Les limbes des feuilles sont posés sur
la surface du sable ou se chevauchent. Le talon est enterré presque verticalement jusqu’au ras du pétiole.
II-3-2 Eclairement et aptitude au bouturage
Le taux d’éclairement est un facteur très important. Il doit être réglé en fonction de l’intensité de
l’éclairement régional saisonnier.
L’aptitude au bouturage varie avec les espèces et même les variétés. C. Canephora se bouture très
facilement, avec un taux de réussite variant, suivant les clones, de 70% à près de 100%. Le bouturage de
C. arabica exige plus de soins. La variété hybride 344 AT 0 est facile à bouturer.
III- CULTURE IN-VITRO
La multiplication in-vitro des plantes, communément appelée «micropropagation», consiste à
reproduire un type parental donné, à partir d’un fragment plus ou moins grand de ce végétal. Comme dans
le cas de la multiplication végétative classique, appliquée depuis des siècles en horticulture, cette
reproduction ne s’effectue que par divisions mitotiques des cellules des tissus concernés (AUGE et al,
1989) .
Aujourd’hui, le terme «multiplication in-vitro» recouvre, le plus souvent, la seule multiplication
conforme d’individus performants. Celle-ci se réalise essentiellement par une prolifération abondante,
mais contrôlée, de bourgeons préexistants. Dans la pratique, plus de 90% des plantes produites in-vitro
relèvent de ce type de multiplication. Le restant de la production est issu de bourgeons néoformés, issus de
tissus, de cals ou de cellules mis en culture (BOXUS, 1989)
La multiplication in-vitro, aujourd’hui en pleine expansion, constitue déjà une des belles
applications de la biotechnologie au niveau industriel.
8

GENERALITES
III-1- HISTORIQUE
Les premiers cas de culture in-vitro proprement dite sont dus à HABERLANDT (1902) . Il a
obtenu, sur un milieu de KNOP amélioré, la survie durant plusieurs mois, de petits amas cellulaires (poils
staminaux ou glanduleux ou des fragments d’épiderme) mais sans multiplication cellulaire. En 1912,
CARREL a réussi la culture indéfinie de cellules issues de cœur d’embryon de poulet par repiquages
successifs.
Il faut attendre 1922 pour que de nouveaux espoirs apparaissent pour la culture de tissus végétaux.
En 1922, ROBLINS aux Etats-Unis et KOTT en Allemagne, ont réussi à maintenir des pointes de
racine en survie près de six mois et à obtenir des fragments qui sont passés de quelques millimètres à 5 ou
6 centimètres de long. Par la suite, ces tissus ont cessé de croître et les cultures ont été perdues.
WHITE (1932) a obtenu, pour la première fois, la culture indéfinie d’extrémités de racines de
tomate en milieu liquide contenant des sels minéraux, un extrait de levure et du sucre.
Ce succès est sans doute à l’origine du regain d’effort pour la culture de tissus végétaux. Dès 1934,
GAUTHERET a obtenu, à partir de prélèvements de tissus cambiaux d’arbre (tissus méristématiques), des
proliférations de tissus qui, malheureusement, n’ont pas dépassé huit mois. En 1939, il publie ses premiers
résultats sur la culture indéfinie de tissus de carotte. NOBECOURT sur le même matériel, et WHITE aux
Etats-Unis sur des tissus tumoraux de tabac, publient, la même année des résultats analogues. La culture
in-vitro de tissu végétal a vraiment vu le jour à partir de ce moment.
Une autre étape historique est la guérison de plantes, atteintes de maladie à virus, par culture in-vitro de
méristèmes. En 1949, LIMASSET et CORNET publient leurs observations sur l’absence de virus dans des
méristèmes de tabacs virosés. MOREL et MARTIN (1952) mettent à profit ces observations et
entreprennent de mettre en culture in-vitro des méristèmes de dahlia et de pomme de terre atteints de
maladie à virus. Ils obtiennent, des plantes entières qui, remises en culture normale, se révèlent saines au
contrôle.
C’est ainsi qu’est née cette technique universellement employée pour assainir toutes sortes de plantes
virosées.
9

GENERALITES
III-2- REACTION DES EXPLANTS MIS EN CULTURE
Le premier problème à résoudre (en dehors des problèmes d’asepsie) lors de la mise en culture
consiste à maintenir l’explant en vie. On assiste souvent, après la préparation de l’échantillon, à un
brunissement des cellules lésées. Ce phénomène est dû à l’oxydation de substances de nature phénolique
qui ont un effet toxique. De plus, les cellules mortes peuvent diminuer ou annuler les échanges entre
l’explant et le milieu. Ce problème est partiellement résolu par l’adjonction au milieu de culture de
substances adsorbantes et détoxifiantes comme le charbon activé (1 à 4 g/l) ou le polyvinylpyrolidone (5 à
10 g/l) .
III-3- METHODE DE REGENERATION IN VITRO APPLIQUEES AU CAFEIER
III-3-1 – Culture de méristème : KARTHA et LONDONO (1971)
La culture de méristème est possible chez Coffea. Toutefois, sa mise œuvre est malaisée du fait de
la présence d’exsudats cireux autour des bourgeons terminaux et d’oxydations phénoliques polluant le
milieu de culture. De plus, son rendement est faible et son pouvoir multiplicateur insuffisant.
III-3-2 – Microbouturage :
Développé par DUBLIN (1980 ; 1984) et CUSTERS (1981) , le principe est de favoriser la
caulogenèse. Le microbouturage a pour finalité l’induction in-vitro de bourgeons axillaires des nœuds
orthotropes, leur développement et leur multiplication en série.
La technique de microbouturage comprend trois phases :
- l’installation du matériel végétal in-vitro et l’obtention de microtiges orthotropes,
- la multiplication en série des vitroplants,
- l’enracinement et l’acclimatation des vitroplants.
Le microbouturage peut être effectué à partir :
- de bourgeons préexistants sur les nœuds des tiges (à l'aisselle des feuilles),
- de bourgeons néoformés sur des nœuds de tiges orthotropes,
- de la réversion de la plagiotropie pour l'obtention de tigelles orthotropes .
10

GENERALITES
III-3-3 – Embryogenèse somatique
Des recherches effectuées au cours des trente dernières années ont permis de conclure que
l'embryogenèse somatique peut être induite à partir d'explants d'origines variées :
- A partir de microboutures
Les premiers travaux d’embryogenèse somatique sur le caféier ont été publiés par STARISKY
(1970) . Cet auteur a obtenu le développement de cals vigoureux à partir d’explants de tiges de C. arabica,
C. canephora, et de C. liberica. Toutefois seul, les cals de C. canephora se sont différenciés en embryons
somatiques et plantules.
L’embryogenèse à partir de microboutures de jeunes rameaux plagiotropes exige la combinaison de prétraitements
de juvénilisation et de séquences d’embryogenèses somatiques.
DUBLIN (1980), STARISKY et VAN HASSELT (1980) ont publié des résultats sur l’embryogenèse
somatique à partir de tige.
- A partir de fragments de feuille
Ce procédé a été mis en évidence par HERMAN et HASS (1975) , SONDAL et SHARP (1977) ,
puis YASUDA et col (1985) . Il présente l’avantage de pouvoir être réalisé à partir d’un matériel
disponible en abondance.
- Embryogenèse sur ovules de caféier (LANAUD, 1981)
Ce procédé offre l’avantage de donner des explants facilement accessibles, un taux d’infection nul
et un pouvoir multiplicateur élevé.
- Par culture d’anthères ASCANIO et ARCIA (1987)
Cette méthode permet la création d’haploïdes.
11

GENERALITES
- Par fusion de protoplastes (SPIRAL et PETIARD, 1991 ; ACUNA et PENA, 1991)
Cette méthode permet l’incorporation de gènes naturellement très éloignés et la possibilité de
manipulations génétiques plus audacieuses par l’intermédiaire de plasmides ou de tissus tumoraux.
12

GENERALITES
Fig 1a : C. racemosa
Fig 1b : C. racemosa. Rameaux
Fig 2a : C. arabica bourbon
Fig 2b : C. arabica bourbon.
Rameaux
13

GENERALITES
Fig 3a : C. perrieri
Fig 3b : C. perrieri. Rameaux.
14

La culture in-vitro de tissus végétaux, sur milieux de culture artificiels, offre de
nouveaux moyens de propagation végétative des caféiers, avec un fort pouvoir
multiplicateur. Le principe de cette méthode est relativement simple mais sa mise en
pratique nécessite des tâtonnements expérimentaux avant d'aboutir à une maîtrise
complète.
I- MATERIELS
I-1- LE MATERIEL VEGETAL
Les microboutures axéniques de C. Arabica var. bourbon, C. racemosa, C. perrieri
et de la variété AM2 sont préparées à partir des nœuds prélevés sur des tiges orthotropes
aoûtés. Pour la variété AM2, les nœuds proviennent d’un pied cultivé sous serre tandis que
les trois autres variétés sont issues des pieds cultivées hors serre au DRA/FOFIFA
Ambatobe.
Les fragments de feuilles proviennent de la variété AM2 et variété 344 AT 0
cultivées sous serre.
I-2- LES MILIEUX DE CULTURE
La culture des nœuds est pratiquée dans des tubes à essai et l’embryogenèse
somatique est suivie dans des boites de Pétri.
Les nœuds sont cultivés sur le milieu de base de MURASHIGE et SKOOG (1962)
supplémenté de saccharose, d’hormones végétales et gélifié par de l’agar.
Le milieu de GRESSHOFF ET DOY (1974) est utilisé pour la culture des
fragments de feuilles.
I-3 PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE (AUGE,1984 ;
RAKOTOMAMONJY, 1993)
La solution mère de macro éléments est concentrée 10 fois et celle de microéléments
1000 fois.
Pour éviter les précipitations, CaCl 2 , 2H 2 O et Ca(NO 3 ) 2 , 4H 2 O, concentrées 10
fois, sont ajoutés extemporanément.
Le fer, sous forme chélatée Fe-EDTA, est additionné extemporanément pour cette
même raison. FeSO 4 , 7H 2 O (5,56 g) et Na 2 -EDTA (7,44 g) sont dissous séparément dans
500 ml d’eau distillée puis, par chauffage léger du mélange, on obtient 1000 ml de
solution de Fe-EDTA à 20mM.
16

Le complexe vitaminique de GRESSHOFF et DOY (1974) est concentré 10 fois.
Le pH des micro et macro éléments (milieux de base) , additionnés de saccharose
et d’agar (10 g/l) , est ajusté entre 5,7 et 5,8. Ces milieux de base et les verreries sont
stérilisées par autoclavage à 125 °C pendant 15 min sous une pression de 1 bar.
Les solutions mères peuvent être conservées plusieurs semaines soit dans un
réfrigérateur, soit dans un placard selon la nature des produits. Ainsi, les régulateurs de
croissance, le fer chélaté, les vitamines sont conservées à basse température.
I-4 LES REGULATEURS DE CROISSANCE (CHAUSSAT, 1983)
Deux régulateurs de croissance sont utilisés : les auxines et les cytokinines.
I-4-1 Les auxines
On appelle auxines un groupe de substances naturelles ou de synthèse, comprenant
l’acide indolyl acétique (AIA) et des composés chimiquement apparentés présentant dans
leur formule un noyau saturé et une chaîne latérale. Ce sont des hormones responsables de
la croissance chez les végétaux. Elles stimulent le développement cellulaire au niveau des
méristèmes et induisent, en général, une croissance basipète. Il existe deux types
d’auxines : les auxines naturelles et auxines de synthèses
A/ Auxines naturelles
AIA
L’acide ß-indole acétique, rencontré aussi bien chez les bactéries et les
champignons que chez les végétaux supérieurs, est considéré comme la principale auxine
naturelle.
17

B/ Auxines de synthèse
Trois conditions sont nécessaires à leur activité :
a/ la présence d’un cycle non saturé (noyau indole, benzène, naphtalène)
b/ la présence d’une chaîne latérale présentant les deux caractéristiques suivantes :
- nombre pair de carbones
- groupement carboxylique à l’extrémité de la chaîne
c/ la position et la nature des substances sur le noyau déterminent l’activité. Un H libre en
position α sur le noyau est considéré comme indispensable,
Trois types d’auxines de synthèses ont été utilisés : AIB, ANA, 2,4-D
Acide indole-butyrique (AIB )
Ce produit est un excellent stimulateur de la rhizogenèse. Son activité auxinique est
faible mais est très lentement détruite.
LES AUXINE
CH2-CH2-CH2-COOH
CH2--COOH
N
H
AIB
N
H
AIA
CH2--COOH
O-CH2-COOH
Cl
Cl
ANA
2,4-D
Acide naphtalène acétique (ANA)
Cette substance est du plus haut intérêt. Son spectre d’action est plus large que celui de
l’AIB.
Acide 2,4 dichlorophénoxyacétique (2,4-D)
A forte dose, cette substance est utilisée comme herbicide
18

I-4-2 Les cytokinines
Ce sont des substances chimiquement proches de l’adénine. Elles permettent ou
favorisent la division cellulaire des tissus différenciés mis en culture.
Généralement, les cytokinines induisent la croissance acropète en culture in-vitro.
Deux cytokinines de synthèse sont utilisés :
- Le Benzyl aminopurine (BAP)) , le plus utilisé en culture in-vitro
- La kinétine (6-furfuryl aminopurine)
LES CYTOKININES
HC -- HC
N
N
HN-CH2-HC
N
H
N
HC
O
N
HN – CH2
N
N
H
N
KINETINE
BAP
Figure 2 : Structures des Cytokinines
I-5-PREPARATION DES REGULATEURS DE CROISSANCE
Les phytohormones sont préalablement dissoutes dans de l’alcool 90° pour l’ANA
et le BAP, et dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) pour le 2,4-D. Ces phytohormones sont
concentrées cent fois sous forme de solutions mères. Leur stérilisation se fait à l’aide de
microfiltres de 0,22 µm de taille de mailles. Elles sont ajoutées au milieu de culture au
moment du coulage dans les tubes à essai ou les boîtes de pétri (45 à 50 °C) et leur
conservation se fait à –20 °C.
II- METHODES DE CULTURE
En culture in-vitro, l’asepsie du milieu de travail est primordiale. La température
optimale de culture est de 27 °C et le photopériodisme de 12 heures.
19

II-1- MULTIPLICATION PAR MICROBOUTURAGE
II-1-1 Stérilisation des explants
Après un lavage de 10 minutes des nœuds avec de l’eau de robinet, 10 explants
sont stérilisés par divers désinfectants (3 répétitions par traitement)
Tableau 2 : Désinfections des explants
Type de désinfectant
Hypochlorite de calcium 5% (Ca(ClO) 2 )
+ 3 gouttes de Tween 80 (10 min)
(I)
Hypochlorite de calcium 5% (Ca(ClO) 2 )
+ 3 gouttes de Tween 80 (10 min)
+ Alcool 70° (1min)
(II)
Hypochlorite de calcium 5% (Ca(ClO) 2 )
+ 3 gouttes de Tween 80 (10 min)
+ HgCl 2 1‰ (1 min)
(III)
Benlate 5% (pendant 10 min) + Hypochlorite
de calcium 5% (Ca(ClO) 2 ) + 3 gouttes de
Tween 80 (10 min) + HgCl 2 1‰ (1min)
(IV)
Hypochlorite de sodium 10% + 3 gouttes de
Tween 80) (10 min)
+ HgCl 2 1‰ (1 min) + Cryptonol 4‰ (1min)
(V)
Nombre d’explants
30
30
30
30
30
Après passage dans chaque substance chimique, les explants sont rincés 3 fois 5
minutes à l’eau distillée stérile.
.
20

II-1-2 Mise en culture des nœuds de C. perrieri, AM2, C. arabica bourbon, C. racemosa
Après désinfection, les explants sont mis en culture dans des tubes de verre. Le
milieu utilisé est celui de MURASHIGE et SKOOG (1962) supplémenté de 40 g/l de
saccharose (MS4) et de différents types et concentrations d’hormones.
Tableau 3 : Les différents milieux de cultures utilisés
Milieux
A
B
C
D
E
F
MS + 40 g/l de saccharose (MS4)
Sans hormone
1 mg/l kinétine
6 mg/l Kinétine
6 mg/l BAP
1 mg/l AIB
6 mg/l Kinétine + 0,6 mg/l AIB
Les cultures sont ensuite incubées à 27 °C dans un incubateur avec une
photopériode de 12 heures
II-2 EMBRYOGENESE SOMATIQUE
Les embryons somatiques s’obtiennent selon 2 stratégies :
- en une seule phase, par culture des explants sur un milieu unique. Dans ce cas le
milieu peut contenir soit une cytokinine seule (DUBLIN,1981 ; YASUDA et al, 1985)
, soit une auxine et une cytokinine en association (DUBLIN, 1980 ; PIERSON et al,
1983)
- en deux phases, par culture d'explants sur un premier milieu afin d'initier une
prolifération de cals, puis sur un second milieu afin de développer des cellules
embryogènes (SONDAHL et SHARP, 1977 ; DUBLIN, 1984)
21

II-2-1 Embryogenèse somatique indirecte sur fragments de feuille
Après stérilisation des feuilles des deux variétés hybrides AM2 et 344 AT 0
(l’hypochlorite de sodium 10° + 3 gouttes de Tween 80) , les feuilles sont fragmentées en
morceaux d’environ 1 cm 2 et déposées, la face inférieure en contact avec le milieu. Les
cultures sont scellées, à l’aide de film alimentaire, pour éviter les contaminations et une
trop grande évaporation. L’incubation s’effectue à 25 °C, sous une photopériode de 12
heures (DESBRUNAIS, 1991 ; RAKOTOMAMONJY, 1993)
22

I- RESULTATS ET DISCUSSION
III-1- DESINFECTION DES MICROBOUTURES
L’étude de la désinfection a été effectuée avec la variété hybride AM2.
Tableau 4 : Résultats de la désinfection des microboutures
Traitement
Nombre d’explants non Nombre d’explants
contaminés
contaminés
I 0 30
II 0 30
III 2 28
IV 4 26
V 8 22
Traitement I : Hypochlorite de calcium 5%
Traitement II : Hypochlorite de calcium 5% + Alcool 70°
Traitement III : Hypochlorite de calcium 5% + HgCl 2 1‰
Traitement IV : Hypochlorite de calcium 5% + Benlate 5% + HgCl 2 1‰
Traitement V : Hypochlorite de sodium 10% + HgCl 2 1‰ + Cryptonol 4‰
La stérilisation effectuée au cours de la première série de désinfection montre que
toutes les microboutures sont contaminées après 2 jours de mise en culture.
L'augmentation du temps d'immersion supérieur à 15 min dans l'hypochlorite de calcium
5% provoque des brûlures des explants. L'utilisation d'alcool 70° après l'hypochlorite de
calcium n'est pas suffisante pour remédier à la prolifération des contaminants.
Selon AUGE et al. (1984), la stérilisation à l'hypochlorite de calcium est préférable
à l'hypochlorite de sodium. Dans notre cas l'utilisation de l'une ou de l'autre ne donne pas
de résultats significatifs.
L’utilisation d’HgCl 2 1‰ en plus de l’hypochlorite de calcium 5% (Traitement III)
, permet d’obtenir des explants utilisables pour la suite de la manipulation. Sur les 30
explants désinfectés, 2 explants seulement sont non contaminés.
23

HgCl 2 est un agent stérilisant très efficace mais rarement utilisé en culture in-vitro
par le fait de sa toxicité pour les plantes. En plus de son pouvoir à la fois bactéricide et
fongicide, il est utilisé pour la stérilisation en surface au cours des études de
phytopathologie à une concentration de 1‰. A plus forte concentration, il entraîne la mort
des explants. L’utilisation combinée des deux solutions permet de réduire le taux de
contamination par action successive de leur principe actif. L’augmentation du temps
d’immersion à plus de 1 min dans le HgCl 2 provoque des brûlures sur les explants. La
contamination des cultures apparaît à partir du cinquième jour.
Pour le traitement IV, le nombre d’explants non contaminés augmente par
utilisation de benlate en plus de HgCl 2 et CaClO. Les contaminants n’apparaissent qu’au
bout du cinquième jour.
Le benlate est un fongicide, insoluble dans l’eau et dans les huiles, dont le principe
actif est le bénomyl. Il est utilisé pour le traitement des sols et des semences. Son
efficacité s’étend à un grand nombre de champignons pathogènes (Botrytis, Oïdium …)
mais pas la fumagine.
La substitution du benlate par le cryptonol permet d’augmenter le nombre
d’explants sains et les contaminations ne s’observent qu’à partir du cinquième jour.
Le cryptonol (sulfate neutre d’orthooxyquinoléine, (C 6 H 7 ONH 2 )SO 4 ), non
phytotoxique, possède des propriétés antiseptiques et bactériologiques. Il est soluble dans
l’eau et est doté d’une action endothérapique.
L’utilisation d’antibiotiques ne permet pas d’éliminer totalement les
contaminations primaires, principalement les bactéries (DUHEM et al, 1988) . Dans ce
cas, il faut fixer le matériel par bouture ou greffe et le maintenir pendant quelques mois en
serre, en condition très sèche, sans jamais mouiller feuillage et bourgeons (DEBERGH et
MAENE, 1981)
24

25
III-2- RESULTAT DES MICROBOUTURAGES
Les résultats sont consignés dans le tableau 5.
Tableau 5 : résultats des essais de microbouturage
Variété
Milieu
C. perrieri AM2 C. arabica bourbon C. racemosa
A
Pas d’évolution Pas d’évolution Pas d’évolution des Pas d’évolution
des bourgeons des bourgeons bourgeons des bourgeons
Développement Développement des Développement
B
Pas d’évolution des bourgeons bourgeons après 10 des bourgeons
des bourgeons après 9 jours de jours de mise en après 12jours de
mise en culture culture mise en culture
Développement Développement des Développement
C
Pas d’évolution des bourgeons bourgeons après 9 des bourgeons
des bourgeons après 8 jours de jours de mise en après 9 jours de
mise en culture culture mise en culture
Développement Développement des Développement
D
Pas d’évolution des bourgeons bourgeons après 9 des bourgeons
des bourgeons après 8 jours de jours de mise en après 9 jours de
mise en culture culture mise en culture
E
Pas d’évolution Pas d’évolution Pas d’évolution des Pas d’évolution
des bourgeons des bourgeons bourgeons des bourgeons
F
Développement des
Développement
bourgeons après 15
des bourgeons
Pas d’évolution
jours de mise en
avec hypertrophie
des bourgeons
culture avec
de la partie
hypertrophie de la
inférieure
partie inférieure
Milieu A : MS4 sans hormone
Milieu B : MS4 + 1 mg/l de Kinétine
Milieu C : MS4 + 6 mg/l de Kinétine
Milieu D : MS4 + 6 mg/l de BAP
Milieu E : MS4 + 1 mg/ d'AIB
Milieu F : MS4 + 6 mg/l de Kinétine + 0,6mg/l d'AIB

Le milieu A (sans auxine et cytokinine) ne permet pas le développement des explants. L’addition
de kinétine (1 mg/l ou 6 mg/l) ou du BAP (6 mg/l) dans le milieu de culture, 8 jours après la mise en
culture des explants, favorise l'élongation des bourgeons pour les variétés AM2, C. arabica var. bourbon
et C. racemosa. La prolifération de bourgeons axillaires peut être donc régulée par la présence de
cytokinines dans les milieux de culture.
Dans le milieu B (MS4 + 1 mg/l kinétine), les bourgeons se développent et, après 1 mois de
culture, ils atteignent 0,3 cm à 0,5 cm de longueur. Les trois variétés s’allongent de 1 à 1,5 cm dans le
milieu C après la même période de mise en culture. La durée de la réponse de chaque explant varie de 9 à
12 jours dans le milieu B et de 8 à 9 jours dans le milieu C.
Ainsi, l’élongation des explants est favorisée par une augmentation de la concentration en kinétine.
Sur les quatre variétés utilisées, seule la variété AM2 présente un développement bourgeonnaire
après 8 jours de culture dans les milieux C et D (photos 4 et 5), tandis que les autres variétés ne se
développent qu’à partir du neuvième jour.
L’addition de BAP (milieu D) est beaucoup plus significatif pour le développement des bourgeons
des 3 variétés (AM2, C. arabica var. bourbon et C. racemosa). En effet, après 1 mois de culture
l’élongation des bourgeons est de 2,5 cm à 3 cm (photo 6 ) .
La kinétine et le BAP induisent donc la néoformation de bourgeons chez C.arabica var. bourbon,
C. racemosa et la variété AM2. Toutefois, à concentration égale, l'action du BAP sur les explants est plus
favorable que celle de la kinétine. Les photos 7 et 8 montrent cette différence. Dans le milieu C, la variété
AM2 présente des grandes feuilles par contre celui cultivés dans le milieu D se développe avec des
feuilles normales résultant d’une élongation bourgeonnaire très marqué.
Après 2 mois de culture, le second nœud apparaît, présentant des feuilles développés (photos 9 et
10)
L’essai effectué sur le milieu E, ne contenant que de l’AIB 1 mg/l, ne provoque pas de
développement des bourgeons. L’AIB, à une concentration inférieure à 2 mg/l induit la formation des
racines chez les caféiers.
Dans le milieu F contenant 6 mg/l de kinétine et 0,6 mg/l d'AIB, les bourgeons de C. arabica var.
bourbon, C. racemosa et AM2 développent de grandes feuilles et la partie inférieure de la tige
s’hypertrophie (photo 11) . Ceci pourrait être dû à l'addition d'AIB car les auxines stimulent le
développement cellulaire au niveau des méristèmes et induisent, en général une croissance basipète.
Chez d’autres espèces végétales, comme le Pin maritime (DAVID, 1977), l’addition d’auxine au
milieu de culture stimule la prolifération des tissus prélevés sur le tronc.
26

Les études faites sur les caféiers ont montré qu’en multiplication végétative in-vitro le BAP est très
performant, après la Zeatine, pour développer les bourgeons (COSTE, 1989) .
Pour le microbouturage de C.racemosa, C. arabica var. bourbon et la variété AM2, dans la suite
des travaux, nous avons donc utilisé le milieu de MURASHIGE et SOOG contenant 40 g/l de saccharose
(MS4) supplémenté de BAP (suivant exigence) . Pour C. perrieri (Mascarocoffea), son microbouturage
demande encore des études plus approfondies, car même en bouturage sur terrain il se développe très mal.
27

III-3 RESULTATS DE LA RHIZOGENESE
Les explants obtenus lors de la caulogenèse sont transférés sur un milieu d’enracinement. Le
tableau 6 montre les résultats obtenus au cours de la rhizogenèse.
Tableau 6 : résultats de racines sur différents milieux.
VARIETE
ORIGINE DES
EXPLANTS
MILIEU
RESULTAT
Pas d’apparition de
AM2
Obtenu sur milieu D
(6 mg/l BAP)
MS4 sans hormone
racines.
Dépérissement des
explants après 1 mois
MS4 + 1,5 mg/l ANA
Pas de formation de
racines
Pas d’apparition de
racines.
C. arabica var.
bourbon
Obtenu sur milieu D
(6 mg/l BAP)
MS4 sans hormone
Dépérissement des
explants après 23
jours
MS4 + 1,5 mg/l ANA
Pas de formation de
racines
Pas d’apparition de
racines.
C. racemosa
Obtenu sur milieu D
(6 mg/l BAP)
MS4 sans hormone
Dépérissement des
explants après 20
jours
MS4 + 1,5 mg/l ANA
Pas de formation de
racines
28

Dans le milieu MS4 sans hormone, les explants ne forment pas de racines et dépérissent après 1
mois de culture.
L’addition d’ANA (1 mg/l) dans le milieu de culture ne provoque pas l'apparition de racines.
D’après RANCILLAC et al (1982) et MARGARA (1984), l’induction de la rhizogenèse se révèle difficile
sans apport de facteurs stimulants. Les auxines, comme l’acide naphtalène acétique (ANA) sont les
principaux régulateurs utilisés en ces cas.
L'examen histologique des boutures cultivés in-vitro chez la vigne montre que leurs formations
secondaires sont à peine developpées ou inexistantes. Elles s'enracinent plus tardivement que celles qui
ont déjà manifesté un début du fonctionnement cambial (FAVRE, 1970).
Le comportement des boutures se trouve donc, au moins pour une part, lié à la structure
anatomique qu'elles présentent au moment de leur préparation.
In-vitro, la rhizogenèse est conditionnée par l’équilibre hormonal présent dans le milieu de culture
(BEKKAOUI et al, 1984). Les études faites sur C. arabica montre que la phase d’enracinement des
tigelles, obtenues à l’issue du processus de la caulogenèse, est bien codifiée : il procède essentiellement de
leur repiquage sur un milieu solide à faible concentration en éléments minéraux et additionné d’AIB (1 à 2
mg/l) (DUBLIN, 1971) .
Selon DRUART (1987), la qualité de l’enracinement de beaucoup de ligneux dépend de la
présence simultanée d’auxines (1 ou 2 mg/l) mais aussi de proline (10-100 mg/l) pour augmenter le
nombre de racines, et de riboflavine (1 mg/l) pour prévenir ou diminuer la présence de cals.
29

III-4 RESULTAT DE L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE INDIRECTE
Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau ci-après.
Tableau 7 : Embryogenèse somatique indirecte pour 344 AT 0 et AM2
Variété Nombres Milieu Résultats
30% des explants
GD6 + 2,4-D 8 mg/l
30
+ 6 mg/l kinétine
GD6 + AIA 8 mg/l +
35
6 mg/l kinétine
344 AT 0
GD6 + AIA 8 mg/l +
30
BAP 6 mg/l
MS2 + 2,4-D 8 mg/l
30
+ 6 mg/l kinétine
GD6 + 2,4-D 8 mg/l
35
+ kinétine 6 mg/l
AM2
GD6 + 2,4-D 8 mg/l
35
+ BAP 6 mg/l
présentent une
callogenèse faible et
deviennent jaune
- Pas de formation
de cal
- Explants
dépérissent
80% des explants
présentent une
callogenèse moyenne
Pas de formation de
cal et les explants
meurent
Jaunissement des
explants avec
callogenèse faible
(25%)
Jaunissement des
explants avec forte
callogenèse (85%)
La variété 344 AT 0 présente une meilleure réponse sur GD6 que sur MS2 avec les mêmes apports
hormonaux (8 mg/l 2,4-D et 6 mg/l kinétine). Des explants (30%) produisent des cals sur GD6 tandis que
ceux sur MS2 dépérissent sans production de cals. Le milieu GD6 est un milieu riche en sels minéraux et
en saccharose qui favoriseraient la callogenèse.
30

Cultivés sur GD6 en présence de 2,4-D à 8mg/l et 6 mg/l kinétine, 30% des explants présentent
une callogenèse faible. Par contre, l’observation des cultures après une semaine de mis en culture sur
milieu GD6 avec AIA 8 mg/l et 6 mg/l kinétine, montre que les fragments de feuille présentent des débuts
de nécrosés sur la surface foliaire (photo 12). Les explants meurent sans produire de cal après 1 mois de
culture (photo 13).
Le 2,4-D serait donc plus callogène que l'AIA.
Dans le milieu où le BAP est remplacé par la kinétine, tous les explants de la variété 344 AT 0
fournissent des cals qui sont observées au niveau des nervures des fragments de feuille (photo 14). Le
BAP et la Zéatine sont les plus actives pour stimuler la néoformation des bourgeons.
Pour la variété AM, 25% des explants cultivés initient des cals sur le milieu GD6 avec 8 mg/l de
2,4-D et 6 mg/l de kinétine. Par contre, sur GD6, contenant 8 mg/l de 2,4-D et 6 mg/l de BAP 85% des
explants forment des cals.
Le milieu GD6 est donc favorable pour l'initiation de la callogenèse chez les deux variétés
hybrides AM2 et 344 AT 0 . Le même résultat a été obtenu sur 3 Mascarocoffea : C.perrieri, C.bertrandi,
C. dolychophylla (RANDRIA., 2000).
Chez Prunus persica et Prunus avium (SEIRILIS et al, 1979), l’association 2,4-D/BAP a donné de
meilleurs résultats pour la callogenèse à partir d’anthères. Selon VERDEIL et BUFFARD-MOREL
(1995), le 2,4-D est une hormone a forte activité auxinique et serait nécessaire à l’activation et à la
division des cellules indifférenciées (méristématiques) à l’origine des cals. Les études faites sur
l’enracinement de Sequoiadendron, néoformé à partir de section d’hypocotyles, a également donné un
effet favorable en associant les cytokinines (BAP) avec des auxines (YILMATZ-LENTZ, 1984).
31

III-4- EVOLUTION DES CALS DES DEUX VARIETES HYBRIDES AM2 ET 344 AT 0
Le tableau ci-dessous présente les résultats obtenus.
Tableau 8 : Evolution des cals des deux hybrides AM2 et 344 AT 0
VARIETE
AM2
ORIGINE DES
EXPLANTS
Cals obtenus sur GD6
+ 8 mg/l 2,4-D +
BAP 6 mg/l
344 AT 0
Cals obtenus sur GD6
+ 8 mg/l AIA + 6
mg/l BAP
MILIEU
GD6 sans hormone
MS4 + 1 mg/l BAP
GD6 sans hormone
MS4 + 1 mg/l BAP
RESULTATS
Pas d’évolution des
cals
Les explants meurent
après 1 mois de
culture
Pas d’évolution des
cals
Les explants meurent
après 1 mois de
culture
Les cals, provenant de ces deux variétés hybrides et transférés sur les milieux de maturation,
dépérissent. Sur MS4 + 1 mg/l de BAP les explants meurent après 1 mois de culture. En 1998, VERDEIL
et coll. ont obtenu la maturation de cals de Cocos nucifera sur un milieu contenant de la cytokinine mais
sans auxine.
L'évolution des cals est généralement effectuée sur milieu liquide agité. Là, les cals se scindent en
cellules qui donnent un développement embryonnaire (BOXUS, 1989).
32

Photo 4 : Microbouture de C. arabica
var. bourbon après 8 jours de culture
sur milieu D (MS4 + 6mg/l BAP)
Photo 5 : Microbouture de C.
arabica var. bourbon après 8
jours de culture sur milieu D
(MS4 + 6mg/l BAP)
Photo 6 : microboutures de la variété AM2 après 1 mois
de culture sur milieu D (MS4+ 6mg/l de BAP)
33

Photo 7 : Microbouture de la
variété AM2 sur milieu C (MS4
+ 6mg/l kinétine) après 1 mois
et demi de culture
Photo 8 : Microbouture de la
variété AM2 sur milieu D
(MS4 + 6mg/l BAP) après 1
mois de culture
Photo 9 : Microbouture de C. racemosa
sur milieu C (MS4 + 6mg/l kinétine)
après 2 mois
34
de culture

Photo 10 : Microbouture de la variété AM2 sur
milieu D (MS4 + 6 mg/l BAP) après 2 mois et
demi de culture
Photo 11 : Microbouture de la
variété AM2 sur milieu 35 F (MS4
+ 6mg/l kinétine + 0,6 mg/l AIB)
après 2 mois de culture

Photo 12: Feuilles de la variété 344
AT 0 sur GD6 + 8mg/l AIA + 6mg/l
kinétine après une semaine de
culture
Photo 13: Feuilles de la variété 344
AT 0 sur GD6 + 8mg/l AIA + 6mg/l
kinétine après 1 mois de culture
Photo 14 : Feuilles de la variété 344 AT 0 sur
GD6 + 6 mg/l BAP + 8 mg/l 2,4 - D après 1
mois et demi de culture
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Trois génomes coexistent dans la cellule végétale. Ils sont compartimentés respectivement dans le
noyau, les mitochondries et les chloroplastes. Dans le noyau, la taille varie suivant les espèces. L'ADN
mitochondrial a une taille très variable avec un minimum de 100 kb et l'ADN chloroplastique a une taille
d'environ 140 kb. Ce sont ces molécules qui sont rencontrés in-vitro au cours des clonages, les
préparations de banques d'ADN génomiques ou d'ADN complémentaire aux ARN messagers. Par contre,
dans la cellule, les acides nucléiques sont compartimentés et/ou font partie de structures beaucoup plus
complexes dont il convient de tenir compte pour les opérations d'extraction et de purification. En effet,
l'obtention d'acides nucléiques intègres et purs est un préalable essentiel au succès de toute manipulation
in-vitro [SINGER et BERG (1991) ; LEWIN (1994) ]
L'isolement d'ADN de plante est très difficile par l'existence des formations complexes qui
s'associent aux acides nucléiques. Ainsi, plusieurs méthodes ont été combinées pour effectuer cette
extraction. La méthode que nous avons retenue permet l'isolement d'ADN à partir de petites quantités de
matériel végétal (0,5 à 1 g). L'ADN obtenu est ensuite analysé par digestion avec des enzymes de
restriction pour déterminer les profils de chaque variété
I- EXTRACTION D'ADN GENOMIQUE DE CAFEIER
I-1 MATERIEL VEGETAL
Le matériel végétal utilisé pour les extractions d’ADN est constitué de jeunes feuilles et de
bourgeons apicaux prélevés sur des pieds de C. arabica var bourbon (940 mg), C. racemosa (890 mg) et
C. perrieri (1 g), cultivé à la station du FOFIFA Ambatobe.
I-2 METHODES
I-2-1 Préparation de la solution d’extraction (SAMBROOK et al, 1989)
Avant usage, le phénol est équilibré à un pH supérieur à 7,8 puisque l'ADN est dans la phase
organique à pH acide.
37

Le phénol cristallisé est fondu à 60 °C. De l' hydroxyquinoléine, à une concentration finale de
0.1%, est ajouté au phénol. Ce composé est un anti-oxydant, un inhibiteur partiel de ARNases et un agent
chélatant faible d'ions métalliques. De plus, sa couleur jaune permet, d'identifier facilement la phase
organique.
Un volume égal de Tris-HCl 0.5 M, pH 8, est ajouté en agitant vigoureusement pendant 15 min. Après
décantation, la phase aqueuse est retirée en l'aspirant avec une pipette connectée à une trompe à vide. Un
volume de Tris-HCl 0.1 M, pH 8, à est ajouté. Cette dernière étape est répétée jusqu'à ce que le pH soit
égal à 7,8. Lorsque le phénol est équilibré, et que la phase aqueuse est retirée, un volume de TE x 1 est
ajouté. Le phénol ainsi équilibré peut être conserver à 4 °C.
I-2-2 Broyage et purification des noyaux
Les jeunes feuilles et les bourgeons apicaux sont broyés dans un mortier contenant 10 ml de
tampon d'extraction (voir annexe). Le broyat est filtré à travers 4 couches de gaze. Après 10 min de
centrifugation à 3.000 rpm, le surnageant est éliminé et le culot est remis en suspension dans 5ml de
tampon d'extraction. Cette étape (lavage) est répétée jusqu'à l'obtention d'un culot blanc.
I-2-3 Extraction de l'ADN
Le culot est repris dans 1,5 ml de tampon d'extraction auxquels sont ajoutés 15 l de protéinase K
(10mg/ml) et 150 l de SDS (20%) (sodium dodécyl sulfate). Le mélange est homogénéisé doucement
avant de l'incubé à 50 ºC pendant 2 heures.
Deux extractions phénol/chloroforme sont effectuées jusqu'à l'obtention d'une interphase propre
pour éliminer les protéines contaminantes. La phase aqueuse est additionnée de 2,5 volumes d'éthanol
froid et de 0,04 volumes de NaCl 5 M pour précipiter l'ADN à -20ºC pendant une nuit. Le culot obtenu,
après centrifugation à 10.000 rpm, est lavé avec de l'éthanol 70º puis séché à l'air après élimination de
l'alcool 70º par centrifugation. L'ADN est repris dans de l'eau distillée.
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I-2-4 Séparation des fragments par électrophorèse en gel d'agarose
La séparation de fragments d'ADN est effectuée par électrophorèse horizontale en gel d'agarose
dans du tampon TAE (voir annexe) . L'agarose est dissous à chaud dans de l'eau distillée stérile. Après
refroidissement (environ 50 ºC) et addition de bromure d’éthydium (BET) à raison de 0,5 g/ml, le gel est
coulé. Les molécules de BET ont la particularité de pouvoir s’intercaler entre les bases des nucléotides et
y rester piégées pendant la migration. Du tampon de charge (0,2 volume) est mélangé aux échantillons
d'ADN avant de les déposer sur gel. L'électrophorèse s’effectue sous une tension allant de 50 volts à 120
volts suivant la taille du gel. A pH 8, seuls les phosphates sont chargés négativement. Les acides
nucléiques, dans ces conditions, vont migrer de la cathode vers l'anode, essentiellement suivant leur taille.
De l'ADN marqueur de tailles (1Kb ladder), allant de 75 à 12214 paires de bases est également déposé sur
le gel. Les fragments d'ADN sont visualisés sous éclairage UV grâce aux propriétés de fluorescence du
BET.
II- ANALYSE DE L'ADN GENOMIQUE PAR DIGESTION A L'AIDE DES ENZYMES DE
RESTRICTION
Les enzymes de restriction ont été découvertes dans diverses espèces bactériennes. Elles servent à
dégrader tout ADN étranger qui aurait pénétré dans la cellule. Ces enzymes coupent les molécules d'ADN
bicatenaires au niveau de séquences nucléotidiques spécifiques caractérisées par une symétrie et une
complémentarité. Lors de notre étude, nous avons utilisé les enzymes de restriction suivantes: Eco RI,
Bam H1 et Pvu II. Les séquences palindromiques reconnues par ces enzymes sont les suivantes:
G
CTTAA
AATTC
G
Eco R1
G
CCTAG
GATCC
G
Bam HI
CAG
GTC
CTG
GAC
Pvu II
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L'activité optimale de ces enzymes est en particulier fonction de la force ionique, de la température
d'incubation et du pH
L'incubation du mélange réactionnel suivant se fait pendant 3 heures à 37ºC:
- 2l de tampon B/E/H (voir annexe)
- 2l d'enzyme de restriction Pvu II/Eco RI/BamHI
- 6l d'eau distillée stérile
-10l d'ADN (qsp)
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IV- RESULTATS ET DISCUSSIONS
IV-1- Analyse de la qualité de l'ADN
Le résultat de la migration sur gel d'agarose (Figure 12) montre que les ADN sont restés dans les
puits de dépôts. Ces non-migrations sont dues au haut poids moléculaire des ADN génomiques.
La concentration de 0,5% en agarose du gel ne permet pas de bien séparer les fragments d'ADN
car son domaine de résolution optimal est compris entre 1 à 40 kb (kilobases) de molécules d'ADN
linéaires. Cette migration permet d'observer la qualité des ADN obtenus.
L'isolement d'ADN des plantes est très difficile par l'existence des composés secondaires tels que
les polysaccharides, les polyphenols qui s'associent aux acides nucléiques en formant une matrice
gélatineuse et provocant une coloration marron due à l'oxydation phénolique. L'utilisation du tampon
d'extraction (Maréchal-Drouard , Guillemaut ; 1994) par l`intermédiaire de la cystéine a résolu ces deux
problèmes lors de la manipulation. Le pH 5,5 du tampon d'extraction bloque l'ionisation et l'apparition
d'oxydation phénolique durant l'extraction et précipites une grande quantité de matériels indésirables.
IV-2 Résultat de la digestion de l'ADN
L'observation du résultat de la migration des ADN digérés (Figure 13) montre la présence de
traînées et les ADN sont restés dans les puits et ne migrent pas.
En général, après digestion par des enzymes de restriction l'électrophorégramme doit présenter des
bandes séparées de poids moléculaires différents. Or, le résultat ne reflète pas ceci.
La photo 17 permet d'expliquer ce résultat car la migration sur gel d'agarose des extraits d'ADN
non digérés montre sur cette figure que des traînées sont présentes. Ces traînés sont dus à des coupures au
niveau des molécules d'ADN survenues au cours de la reconcentration des extraits bruts. Donc les
enzymes de restriction ne peuvent pas couper au niveau de leurs sites de restriction par le fait de la
destruction des molécules d'ADN.
Les non-migration des ADN pourraient s’expliquer aussi par la qualité des enzymes de restriction.
En effet, la mauvaise conservation de ces enzymes provoque la destruction de leur fonction.
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CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Depuis la dissolution de l`OCPG (Opération Café-Poivre-Girofle) en 1980, les paysans n`ont plus
reçu de subvention pour la culture de caféier. Le volume des exportations de café de Madagascar
n`occupe même pas 0,5% du volume mondial en 2002. Pour essayer de trouver une solution pour le
redressement de la filière café de Madagascar, le CNCC (Comité National de Commercialisation du Café
de Madagascar) a décidé de mettre en œuvre sur la côte Est de la Grande Ile des projets pilotes de relance
de la filière.
Pour la variété robusta, les interventions du CNCC ont pour objectifs, de maintenir le potentiel
productif des régions et préparer un regain d`activités se rapportant à la filière.
Malgré l`inexistence des moyens, le FOFIFA a continue son action dans la recherche caféière pour
la production d'hybrides à faible taux de caféine. Des travaux de sélection et de développement sont
encore nécessaires avant la vulgarisation dans le milieu rural de nouvelles progénies stables ou de
descendances hybrides d'exploitation rentable
Dans ce cas, toutes souches nouvellement créés pourront bénéficier d'un mode de conservation et
d'un système rapide de multiplication quasiment indéfinie grâce aux techniques de culture de tissus.
Par le biais de la culture in-vitro, des tests de sélection précoce qu'elle autorise et des procèdés
informatiques, de grandes économies de temps et d'espace seront enfin disponibles pour mener à bien des
essais comparatifs variétaux les plus complets possibles.
Notre étude réside donc dans la maîtrise des méthodes adaptés en culture in vitro et aussi à
l`extraction et l’analyse d`ADN génomique des caféiers. Ainsi :
- Les hybrides interspécifiques, le C. arabica var. bourbon, C. racemosa et la variété AM2 se
développent rapidement dans un milieu MS4 additionné de BAP que de la kinétine
- La production de cals semble le plus favorable sur GD6, supplémenté de 6mg/l BAP et 8mg/l de 2,4-
D
- Les résultats obtenus au cours de l`extraction d`ADN génomique de caféier nous ont permis de
tirer deux hypothèses sur les non-migrations des fragments d’ADN. La première c’est la destruction des
molecules d’ADN survenue au cours de la reconcentration et la deuxième serait la mauvaise conservation
des enzymes de restriction qui provoqueraient la destruction de leur fonction.
46

Pour la suite, nous proposons de poursuivre l'étude sur :
- la recherche de méthode d’initiation des racines,
- les manipulations de gènes, non seulement pour la plupart des critères héréditaires dont
l'ensemble caractérise une espèce, un clone…
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Nom :
Prénoms :
RAZAFIMAHARO
Christian Benjamin
Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée
Mémoire de Diplôme d'Etudes Approfondies de Biochimie
Option : BIOTECHNOLOGIE - MICROBIOLOGIE
Titre : REGENERATION IN VITRO DE CINQ VARIETES DE CAFEIERS
(C. arabica bourbon, C. perrieri, C. racemosa, Var. AM2, Var. 344 ATo)
EXTRACTION D'ADN GENOMIQUE DE C. arabica bourbon, C. racemosa, C. perrieri.
Résumé :
La filière café à Madagascar ne cesse de rencontrer des problèmes aussi bien sur le plan
national qu'international. Dernièrement les paysans et les exportateurs ne trouvent plus de preneurs pour
C. canephora par le fait que sur le marché mondial, les prix et les demandes sont en faveur du C. arabica.
Pour espérer retrouver notre place, les nouveaux clones créés doivent être diffusés rapidement auprès des
paysans. La propagation par graines et par bouturages classiques demande beaucoup de temps et de gros
investissements. D’autre part, C. canephora est fortement allogame. Ainsi les biotechnologies présentent
des avantages pour la création et la propagation in-vitro des clones créés. Le comportement du caféier à la
régénération in-vitro fait donc l'objet de notre étude et permettra d'adopter une technique fiable pour
l'extraction, l’analyse et les manipulations de son ADN.
Les variétés arabica bourbon, racemosa et perrieri se développent donc dans un milieu renfermant 6
mg/l de BAP après 8 jours de mise en culture et l'apparition des cals est favorisée par utilisation du milieu
de Greysshof et Doy supplémenté de 60 g/l de saccharose et des hormones de croissances ( 2,4-D 8 mg/l
et BAP 6 mg/l) au cours de l'étude de l'embryogenèse somatique. Une méthode d'extraction de l'ADN
génomique des caféiers a été adoptée. Toutefois, elle demande à être affinée.
Mots clés : Caféier, Hybrides interspécifiques, Embryogenèse somatique, ADN