Biocontrôle de Staphylococcus aureus dans les produits laitiers.

Lynn El Haddad et Nour Ben Abdallah

o Staphylococcus aureus et ses phages dans le laito Hypothèses de travailo Objectif 1: Souches de S. aureuso Objectif 2: Phages de S. aureuso Objectif 3: Résistance des phageso Objectif 4: Test du cocktail de phageso Conclusions2

Staphylococcus aureuso Gram-positifo Mésophileo Anaérobie facultativeo Tolère 20% de NaClSource: Wikipediao Bactérie commensaleo Bactérie pathogèneo Dotée de pouvoirs invasifs et toxiques3

o Intoxications alimentaireso Transmission par mauvaisemanipulationo Ingestion d’un aliment contenant> 100 ng d’entérotoxinesstaphylococciqueso Symptômes bénins jusqu’àdangereuxo Lots de lait cru rejetés4

o Solution envisagée pour contrôler la présence etla concentration de S. aureus dans l’alimento Utilisation de phages comme additifsalimentairesPhages de ferments lactiquesSpécifiques aux souches defermentsPetit spectre lytiqueResponsable de rejets de lotsde lait et de fromagePhages de S. aureusSpécifiques auxstaphylocoquesPolyvalentPeuvent réduire le nombre derejets (?)5

o Utilisation de phages comme additifsalimentaires:oNe changent pas les propriétésorganoleptiques des produitsooReconnus comme sécuritairespour le contrôle de Listeriamonocytogenes (FDA, 2007)AgriPhage-CMM anti-Clavibactermichiganensis (Santé Canada, 2012)http://www.listex-p100.com/6

o Conditions d’utilisation des phages commeadditifs alimentaires:o Phage lytiqueo Absence de facteurs de virulenceo Spectre lytique largeo Efficacité dans la matricealimentaireo Cocktail de phages7

Trois familles de Caudovirales, ADN dbMyoviridaeSiphoviridae3 morphotypesPodoviridae2 morphotypesPyophage, Team1,Team2, phi812, K3A, M SA , LH1, LH1-MUTP68, 44AHJD8

Les phages présents dans les laits du Québec sontplus adaptés à la réduction de S. aureus dans lesfromages d’iciL’activité des phages staphylocoques a lieu durantla fabrication et la maturation fromagère9

1. Sélection et identification de souches de S.aureus isolées du milieu laitier2. Collection, isolement et caractérisation desphages de S. aureus3. Test de la résistance des phages à deuxétapes de la fabrication de fromage Cheddar4. Test de l’efficacité de cocktail contreS. aureus durant une fabrication de fromageCheddar10

ooQuarante souches de S. aureus isolées de lamammite envoyées par le RCRMBooToutes les provinces canadiennesDifférents types d’échantillonso Score de mammite entre 0 et 3Une souche de S. aureus isolée de fromage aulait cru québécois.12

Trois familles de Caudovirales, ADN dbMyoviridaeSiphoviridae3 morphotypesPodoviridae2 morphotypesPyophage, Team1,Team2, phi812, K3A, M SA , LH1, LH1-MUTP68, 44AHJD15

Échantillons de lait cru:o Centrifugation5 ml d’échantillon de lait5 ml de TSB 2X contenantune culture bactérienne deS. aureus37 ºC16

Phage LH1o Siphoviridae de groupe B2o Phage infectieuxo Souche hôte: S. aureus 01o Solution turbide après amplification17

Mutant naturel de LH1, LH1-MUTLysat clairEl Haddad, L., and S. Moineau. 2013. Appl. Environ. Microbiol. 79(8):2828-283218

Traitementthermique73 ºC pour 20 secAffinage1 mois à 4 ºC21

oTempérature/durée du traitement thermique:o73 ºC pendant 20 secondesoMilieu:oLait pasteurisé ultrafiltré à 2% de M.G.oPhages:Myoviridae Podoviridae Siphoviridae CocktailsTeam1 P68 LH1-MUT phi812/K/LH1-MUTphi812 44AHJD phi2 phi812/P68/LH1-MUTK3AM SA 22

Réduction de la concentration phagique (unités de log)après 73ºC pour 20 secondesSiphoviridaeLH1-MUT1,4 ±0,5phi20,6 ±0,1M SA2,9 ±0,43A4,2 ±0,2MyoviridaeTeam14,0 ±1,0phi8122,6 ±0,5K3,5 ±0,2PodoviridaeP682,7 ±0,144AHJD3,6 ±0,7Cocktailsphi812/K/LH1-MUT2,2 ±0,7phi812/P68/LH1-MUT2,8 ±0,323

Réduction de la concentration phagique (unités de log)après 73ºC pour 20 secondesSiphoviridaeLH1-MUT1,4 ±0,5phi20,6 ±0,1M SA2,9 ±0,43A4,2 ±0,2MyoviridaeTeam14,0 ±1,0phi8122,6 ±0,5K3,5 ±0,2PodoviridaeP682,7 ±0,144AHJD3,6 ±0,7Cocktailsphi812/K/LH1-MUT2,2 ±0,7phi812/P68/LH1-MUT2,8 ±0,324

Traitementthermique73 ºC pour 20 seco Résistance des phagesLH1-MUT et phi2, isolésdu lait cruAffinage1 mois à 4 ºC25

o Conditions du caillé modèle :o 1,77% de selo 39% d’humiditéo Cheddar lyophiliséo Réduction du pH à 5,5 avec de l’eau acidifiée(Adapté de Lessard et al. 2012. Appl. Environ. Microbiol.)o Phage à une concentration de 10 7 ufp/mlMyoviridae Podoviridae Siphoviridae Cocktails de phagesTeam1KP6844AHJDLH1-MUT3Aphi2T1/P68/LH1-MUTK/44AHJD/phi2o Temps d’échantillonnage: 0, 4, 7, 14 et 28 jours26

+10 grammesCaillé modèleEauacidifiéeEaupeptonée95% de videTSA 90 ml decitrate desodium à45ºC4ºC27

Log 10 concentration phagique (ufp/ml)Résistance des phages dans du caillé modèle, pH 5,5 à 4ºC98765430 JOUR4 JOURS7 JOURS14 JOURS28 JOURS210LH1-MUT 3A P68 44AHJD K TEAM1 PHI2 COCKT1 COCKT2(T1-P68-MUT) (K-44AHJD-2)28

Traitementthermique73 ºC pour 20 seco Résistance des phagesLH1-MUT et phi2, isolésdu lait cruAffinage1 mois à 4 ºCo Résistance de tous lesphages29

o En présence de S. aureus :o Production d’entérotoxines staphylococciquesen présence/absence de phageso Efficacité de cocktails de phagesstaphylococciques durant la fabrication et lamaturation de fromage Cheddar30

Phages de ferments lactiquesSpécifiques aux souches defermentsPetit spectre lytiqueResponsable de rejets de lotsde lait et de fromagePhages de S. aureusSpécifiques auxstaphylocoquesPolyvalentsPeuvent réduire le nombre derejets (?)o Phages polyvalentso Au-delà de l’espèceo Ferment alimentaire GRAS, S. xylosuso Reproduction du phage sur une souche nonpathogène31

o Phage Team1 amplifié avec S. aureus/ S. xylosus:o Pas de différences sur 140Kb séquencés etanalysés32

o Isolement d’agents de biocontrôle plus stables etrésistants à l’étape de chauffageo Utilisation de souches isolées du milieu laitiero Stratégie de sélection de phages polyvalentso Les phages amplifiés sur S. aureus et S. xylosus sontgénétiquement identiques33

o Hypothèseo Objectifso Sélectiono Paramètreso Types de laito Inoculation initialeo Agitationo Moment d’ajout du phageo Fromage Cheddaro Conclusiono Perspectives

L’activité des phages anti-staphylocoquesdépend de différents paramètres liés au typede lait et au processus de la fabricationfromagère

1. Sélection d’un phage stable dans le laitcru à partir d’une collection de phages2. Détermination des paramètres favorisantl’action lytique du phage dans le lait3. Suivie de l’action phagique durant unemini-fabrication fromagère de typeCheddar

%Lait moyennementcontaminéStaphylocoques totaux= 10 2 UFC/mL350300250200150100KTeam 2Φ812PyophageLait plus contaminéStaphylocoques totaux =10 4 UFC/mL50Team 100 5 10 15 20 25temps (h)Suivi des titres phagiques dans un lait cru

%10090807060504030201000 1 2 3 4 5temps (h)KTeam 2Φ812PyophageTeam 1Suivi des titres phagiques dans le temps

Étapes du test de Pearce(Pearce L.E., 1969. J. Dairy Technol.)

o Staphylocoque à coagulase négative (SCN)o Ferment pour la fabrication des saucissonso Microflore de surface pour les viandes séchées etles fromages (Munster)

Suivi du titre phagique du Phage K dans différentstypes de lait

Croissance de S. xylosus dans du TSB avec des contaminationsinitiales différentes en présence du phage K• CI3 = 10 3 UFC/mL• CI5 = 10 5 UFC/mL• CI6 = 10 6 UFC/mL• Phage K à une MOI = 100

Croissance de S. xylosus dans du TSB en présence duphage K• Contamination initiale = 10 5 UFC/mL• Phage K à une MOI = 100

Croissance de S. xylosus dans du TSB en présence duphage K• Contamination initiale =10 6 UFC/mL• Phage K à une MOI = 10

o Lait pasteuriséo Contamination initiale = 10 5 , 10 6 UFC/mLo L’ajout du phage : au début de la fabricationo Garder une légère agitation en continue

Bilan de S. xylosus et du phage K en % durant la fabricationde CheddarS. xylosusPhage KLait Caillé Lactosérum

o L’activité lytique des phages anti-staphylocoques estoptimale dans le lait pasteuriséo L’activité dépend de la contamination initiale enstaphylocoques (contamination minimale de10 5 UFC/mL)o Une faible agitation en continue est nécessaire pourfavoriser le contact entre le phage et sa cellule hôteo Durant la fabrication, les phages semblent être retenusdans le cailléo Dans une matrice solide leur action semble être inhibé

o Utilisation d’un cocktail de phageso Production de fromages Cheddar à partir de laitcontaminé avec une souche de S. aureus en présenced’un cocktail de phageso Efficacité des phages dans d’autres types deproduction fromagère

o Diminution des risques de contaminationalimentaires par S. aureuso Amélioration de l’innocuité des aliments50

Laboratoire du Prof. Sylvain MoineauLaboratoire du Dr Daniel St-GelaisoooProf. Steve LabrieDr Claude ChampagneOrganismes subventionnaires:AAC, MAPAQ, Novalait etFRQNT