Bordetella pertussis & parapertussis - Diagenode Diagnostics
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PAGE 1Réf.: Dia-Bor-050.Vs1 (30.07.2012)<strong>Bordetella</strong><strong>pertussis</strong> & para<strong>pertussis</strong>PCR en temps réelManuel d’utilisationDisponible sur:• ABI® 7000 / 7300 / 7500 / 7900HT• Roche LightCycler® 480 / Lc 2.0• Biorad iCycler® / IQ5 / CFX96• Qiagen Rotor-Gene 6000• Stratagene MX3000P/3005PEn combinaison avec:• DIA-EIC/DNA(DR)-050• DIA-EIC/DNA(Cy5)-050• DIA-EIC/DNA(RD)-050www.diagenodediagnostics.com
PAGE 3SommaireInformation générale .......................................................................................................................................... 4Information sur l’agent pathogène ................................................................................................................... 4Description du produit ....................................................................................................................................... 4Stockage .............................................................................................................................................................. 5Avertissements et précautions ......................................................................................................................... 5Matériel requis, non fourni................................................................................................................................. 6Utilisation d'échantillons humains / Champ d'application de la trousse ..................................................... 7Prélèvement, stockage et transport d'échantillons humains ........................................................................ 71. Prélèvement d'échantillons ....................................................................................................................... 72. Stockage des échantillons ........................................................................................................................ 73. Transport des échantillons ........................................................................................................................ 7Protocole ............................................................................................................................................................. 8A. Procédures à suivreA.1. Procédure d’extraction ........................................................................................................................... 8A.2. Procédure de la PCR ............................................................................................................................ 8A.3. Amplification et procédures des systèmes en temps réel ..................................................................... 9A.4. Interprétation des résultats .................................................................................................................. 10B. Annexes de la procédureB.1. Contrôle d’extraction d’ADN & d’inhibition (facultatif).......................................................................... 11B.2. Extraction d’échantillons / Isolation d’ADN .......................................................................................... 12B.3. Préparation de la réaction PCR ........................................................................................................... 13B.4. Programme de PCR ............................................................................................................................ 15B.5. Sélection des fluorophores appropriés ................................................................................................ 16ABI ® 7000-7300-7500-7900HT .......................................................................................................... 16Roche LightCycler ® 480 – Lc2.0 .......................................................................................................... 16Biorad iCycler ® -IQ5-CFX96................................................................................................................. 16Stratagene MX3000P-3005P .............................................................................................................. 17Qiagen Rotor-Gene ............................................................................................................................. 17Cepheid SmartCycler II ....................................................................................................................... 17B.6. Interprétation des résultats .................................................................................................................. 18Guide de résolution des problèmes .............................................................................................................. 19Évaluation des performances ......................................................................................................................... 20Sensibilité analytique ............................................................................................................................. 20Spécificité analytique ............................................................................................................................. 20Investigation clinique.............................................................................................................................. 20Restrictions concernant l'utilisation du produit ............................................................................................ 21Contrôle qualité ................................................................................................................................................ 21Références ........................................................................................................................................................ 21Explication des symboles ................................................................................................................................ 22Avis à l'acheteur ............................................................................................................................................... 23www.diagenodediagnostics.com
DIAGENODE <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> | <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> PCR en temps reel MANUEL D'UTILISATIONInformation généraleLa trousse de PCR de <strong>Bordetella</strong> (<strong>pertussis</strong>/ para<strong>pertussis</strong>) en temps réel de <strong>Diagenode</strong> est unetrousse dédiée au diagnostic in vitro. Elle doit être utilisée par les laboratoires cliniques et par lestechniciens de laboratoire qualifiés.La trousse de PCR en temps réel du <strong>Bordetella</strong> (<strong>pertussis</strong>/ para<strong>pertussis</strong>) de <strong>Diagenode</strong> estvalidée sur :• ABI ® (7000 /7300 /7500 /7900HT)• Roche ® Lc 2.0/ Lc 480• Biorad ® (iCycler/ IQ5/CFX96)• Qiagen Rotor-Gene (3000/6000)• Stratagene (MX3000P-3005P)• Cepheid SmartCycer II (en fonction du programme)Information sur l’agent pathogèneLa coqueluche est une maladie respiratoire très contagieuse provoquée par la bactérie à Gramnégatif<strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> (Cherry, 2004). Des 9 types de <strong>Bordetella</strong> identifiés à ce jour, seul 3ont été associés à des infections respiratoires chez l’homme et les autres mammifères (B.para<strong>pertussis</strong>, B. holmesii, B. bronchiseptica) (Cotter, 2001 ; Mattoo et al., 2001).Description du produitLe produit contient des amorces, des sondes et un contrôle positif. Le mastermix n’est pas inclus.La trousse de PCR du <strong>Bordetella</strong> (<strong>pertussis</strong>/para<strong>pertussis</strong>) en temps réel est prévue pour 50 PCR(volume 50 μl) et se compose de 2 pochettes.I. Pochette d’amorces et sondes :1. Amorces & sonde d'hydrolyse du <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> et <strong>Bordetella</strong>para<strong>pertussis</strong> (Bord. <strong>pertussis</strong>, FAM, émission 520 nm & Bord. para<strong>pertussis</strong>,Yellow Dye, émission 553 nm) : 250 μl, tube rouge.2. H 2 O (PCR grade): 1500 μl, tube bleu foncé.II. Pochette du contrôle positif:1. Contrôle positif <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> & <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> : 250 μl,tube vert.La trousse de PCR du <strong>Bordetella</strong> (<strong>pertussis</strong>/para<strong>pertussis</strong>) en temps reel (DIA-Bor-050) est utiliséeen combinaison avec le contrôle d’extraction d’ADN et d’inhibition en temps réel (DIA-EIC/DNA-050).Europe <strong>Diagenode</strong> sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com
PAGE 5Contrôle d’extraction d’ADN & d’inhibition de PCR en temps reel: 50 PCR (volume PCR: 50 µl),1 boite.I. Amorces & sonde d’hydrolyse (ADN viral):Orange Dye (DIA-EIC/DNA(DR)-050), 575 nm: 250 μl, tube bleu.Ou Cy5 (DIA-EIC/DNA(Cy5)-050), 662 nm: 250 μl, tube bleu foncé.Ou Red Dye (DIA-EIC/DNA(RD)-050, 669 nm : 250 µl, tube violet.II.Culture d’ADN viral: 500 µl, tube jaune.StockageLa trousse de PCR du <strong>Bordetella</strong> (<strong>pertussis</strong>/ para<strong>pertussis</strong>) en temps réel doit être stockée à- 20°C, avant et après ouverture.NB:Si vous utilisez le DIA-EIC/DNA-050, la trousse et la culture d’ADN viral doivent être stockés à-20°C.Veuillez vérifier la date d'expiration mentionnée sur les étiquettes de la pochette et des tubes. Lapochette a une durée de conservation de 24 mois (à partir de la date de production) à -20°C. Aprèsouverture, les trousses sont stables pendant 12 mois à -20°C.NB :Veuillez effectuer un fractionnement des solutions afin d’éviter les cycles de congélation/décongélation. Pendant l’utilisation, tous les composants de la trousse doivent être conservés surde la glace.STOCKAGE À L’ABRI DE LA LUMIÈRE.Avertissements et précautionsVérifier, dès réception, que l'emballage de la trousse n’est pas abîmé et que le produitn'est pas dégelé. N'hésitez pas à contacter le département logistique en cas deproblème.logistics@diagenode.com / +32 4 364 20 52Recommandations générales• Veuillez lire toutes les instructions avant de réaliser le test.• Après utilisation, les déchets et les réactifs doivent être manipulés comme potentiellementinfectieux et doivent être éliminés dans une poubelle spécifique prévue pour lessubstances biologiques.• Ne remplacez pas les réactifs de la trousse par d’autres provenant d’un numéro de lot oud’un fabricant différent.Extraction/PCR• Les trousses de PCR en temps réel de <strong>Diagenode</strong> doivent être utilisées par desscientifiques/des techniciens de laboratoire possédant un grand savoir-faire en biologiemoléculaire et, en particulier, en matière de plateforme PCR en temps réel.• Pour obtenir des résultats optimaux, <strong>Diagenode</strong> suggère quelques méthodes d’extractionadaptées afin d’éviter les inhibiteurs de PCR. (Cf. point B.2. Extractiond’échantillons/isolation d’ADN).• Le contrôle d’extraction d’ADN et d’inhibition doit être utilisé pour chaque réaction de PCR.AttentionSi les résultats obtenus pour le contrôle d'extraction d’ADN et d'inhibition ne sont passatisfaisants, il est de la responsabilité de l'utilisateur d'optimiser les méthodes d'extractionafin d'obtenir des résultats concluants.www.diagenodediagnostics.com
DIAGENODE <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> | <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> PCR en temps reel MANUEL D'UTILISATION• Le contrôle d’extraction viral doit être manipulé sous une hotte à flux laminaire dans le casd’une procédure d’extraction manuelle ou dans une zone délimitée dans le cas d’uneprocédure d’extraction automatisée, comme le suggère le fabricant.Contamination• Veuillez réaliser l'extraction d’acide nucléique, l’isolation et l’amplification en temps réeldans des locaux séparés.• Gardez tous les tubes et les ampoules fermés lorsque vous ne les utilisez pas.• Le laboratoire de PCR (hotte stérile, plateforme d’extraction ADN/ARN, tablier delaboratoire, etc.) doit être nettoyé après chaque test PCR avec les produits appropriés.• Les trousses contaminées doivent être jetées dans une poubelle spécifique pour lessubstances biologiques.• La trousse ne doit pas être utilisée par une personne présentant des symptômes similairesà la maladie recherchée.• Les contrôles PCR positifs et négatifs doivent être réalisés à chaque réaction PCR.• Il est obligatoire de porter des gants.• Il faut utiliser des tips à filtre pour tous les mélanges PCR.• Avant ouverture, tous les tubes doivent être centrifugés.• Ne jamais pipetter les solutions avec la bouche. Ne pas fumer, ni manger, ni boire dansles zones où l’on manipule les échantillons ou les réactifs de la trousse.• Les tests ne doivent pas être réalisés par une femme enceinte en raison des risquespossibles pour le fœtus.ATTENTIONStocker la trousse à température ambiante peut engendrer une dégradation des amorces/ sondes/contrôle positif, ce qui diminuera la sensibilité. Dans ce cas, nous recommanderions vivementd’utiliser une nouvelle trousse.Matériel requis (non fourni)• Pipettes• Embouts de pipette stériles avec filtre exempt d’ARNase/ADNase• Gants non poudrés• Vortex• Centrifugeuse de table• Tubes de microcentrifugeuse exempts de ARNase / ADNase (1,5 et/ou 2 ml)• Eau exempte d’ARNase/ADNase• Trousse d’isolation d’ADN (cf. point B .2. Extraction d’échantillons/isolation d’ADN)• Consommables et accessoires (tubes, microcentrifugeuse, plaques, bande adhésive) pourles systèmes ABI/ Roche/ Biorad/ Qiagen/ Stratagene ou Cepheid.• Mastermix (cf. point B .3. Préparation à la réaction de PCR)• Machine de PCR en temps réel : ABI/ Roche/ Biorad/ Qiagen/ Stratagene ou Cepheid.Europe <strong>Diagenode</strong> sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com
DIAGENODE <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> | <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> PCR en temps reel MANUEL D'UTILISATIONProtocoleA. Procédures à suivreA.1. Procédure d’extraction (cf. point B.2. Extraction d’échantillons/isolation d’ADN)Veuillez réaliser cette procédure dans une zone de confinement adaptée.Suivez les étapes suivantes:• Placez le ou les échantillons à température ambiante.NB :Il est recommandé de manipuler les échantillons potentiellement infectés sous une hotte à fluxlaminaire.• Choisissez une méthode d’extraction adaptée à votre échantillon. <strong>Diagenode</strong> a sélectionnédes méthodes d’extraction (cf. point B.2 Extraction d’échantillons / Isolation d’ADN).Suivez les instructions du fabricant pour la réalisation de la procédure d’extraction.• (Facultatif) Si vous utilisez le contrôle d'extraction d’ADN et d'inhibition en temps réel,ajoutez 10 μl de la culture d’ADN viral dans le volume à extraire (tube du virus à ADN) (cf.point B.1. Extraction d’ADN & contrôle d’inhibition et B.2. Extractiond’échantillon/Isolation d’ADN).NB :Le contrôle d’extraction d’ADN et d’inhibition de <strong>Diagenode</strong> sont fournis séparément, réf. : DIA-EIC/DNA-50.Vous pouvez choisir le fluorophore approprié à votre PCR en temps réel (cf. point B.5. Sélectiondes fluorophores appropriés).• Lorsque la procédure d’extraction est terminée, placez l’ADN sur de la glace avant del’utiliser (ou à - 20°C pour un stockage de plus de 24h).• Placez le tube du contrôle positif <strong>Bordetella</strong> pertussi & <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> sur de laglace (pour un stockage de plus longue durée).NB :Si les échantillons extraits restent à température ambiante pour une longue période, l’ADN peutse dégrader. Si l’ADN est dégradé, la sensibilité de la PCR sera amoindrie!Si le tube de contrôle positif du <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> & <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> est àtempérature ambiante pendant une longue période (> 24 heures), le contrôle positif peutêtre dégradé et influencer les résultats obtenus!A.2. Procédure de la PCRVeuillez réaliser cette procédure dans une zone de confinement adaptée.Mastermix suggéré : Quantifast Multiplex + R kit (réf. : 204756), Qiagen (non fourni) (cf. point B.3.Préparation de la réaction PCR)NB :Rotor-Gene Multiplex PCR Kit (Qiagen) (non founi) pour Qiagen Rotor-GeneLightCycler ® TaqMan ® Master (Roche) (non fourni) pour LightCycler 2.0 (Lc2.0)Europe <strong>Diagenode</strong> sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com
PAGE 9Suivez les étapes suivantes:• Placez la trousse de PCR en temps réel du <strong>Bordetella</strong> (<strong>pertussis</strong>/para<strong>pertussis</strong>) àtempérature ambiante: le tube rouge (amorces & sonde d'hydrolyse du <strong>Bordetella</strong><strong>pertussis</strong> et <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong>), le tube bleu foncé (H 2 O PCR grade) de lapochette des amorces/sondes.• Si vous utilisez une PCR en temps réel sur un contrôle d’extraction d’ADN & d’inhibition,placez le tube avec les amorces et les sondes d’hydrolyse à température ambiante.• Placez le Mastermix sur de la glace.NB :Centrifugez brièvement toutes les solutions lorsqu’elles sont dégelées et homogénéisez cesdernières à l'aide d'une pipette.NB :• Sélectionnez le protocole approprié en fonction du système PCR en temps réel utilisé(Cf.point B.3. Préparation de la réaction PCR) et préparez les mélanges sansl’échantillon et/ou le contrôle positif <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> & <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong>.Préparer le même mélange pour tous les échantillons.Pour valider le test, vous devez réaliser une PCR sur un contrôle négatif (H 2 O PCR grade) et unePCR sur le contrôle positif <strong>Diagenode</strong>.Si DIA-EIC/DNA-050 n’est pas utilisé, remplacez les amorces et les sondes d’hydrolyse du contrôled’extraction d’ADN & d’inhibition PCR par H 2 0 (PCR grade).• Distribuez les mélanges préparés dans les tubes/capillaires appropriés ou sur une plaque96 puits.• Ajoutez-y les échantillons, le contrôle positif de <strong>Diagenode</strong> (même volume que leséchantillons).• Fermez les tubes/capillaires ou la plaque.NB :Si les tubes (rouges) d’amorces et de sondes d’hydrolyse <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> et <strong>Bordetella</strong>para<strong>pertussis</strong> sont à température ambiante pendant une longue période (plus de 24h), les amorceset les sondes peuvent être dégradées et influencer les résultats obtenus!A.3. Amplification et procédures des systèmes en temps réelVeuillez réaliser cette procédure dans une zone de confinement adaptée.<strong>Diagenode</strong> conçoit et valide des trousses adaptées aux systèmes PCR en temps réel ABI / Roche/Biorad/ Qiagen/ Stratagene/ Cepheid.Suivez les instructions du fabricant avant d’utiliser les systèmes de PCR en temps réel.Suivez les étapes suivantes:• Placez les tubes/capillaires ou la plaque fermés dans le système en temps réel.• Sélectionnez le cycle PCR (cf. point B.4. Cycle PCR).• Sélectionnez les fluorophores adaptés au système en temps réel (cf. point B.5. Sélectiondes fluorophores appropriés)• Entrez le nom et la position des échantillons dans le logiciel.• Démarrez le test.www.diagenodediagnostics.com
DIAGENODE <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> | <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> PCR en temps reel MANUEL D'UTILISATIONA.4. Interprétation des résultats (cf. point B.6. Interprétation des résultats)Suivez les instructions du fabricant pour analyser les résultats.Suivez les étapes suivantes:• Analysez le fluorophore FAM (<strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong>), le fluorophore Yellow (<strong>Bordetella</strong>para<strong>pertussis</strong>) et le fluorophore Orange/ Cy5/ Red (Contrôle d'extraction d’ADN et d’inhibition(DIA-EIC/DNA-050) séparément (cf. point B .6. Interprétation des résultats):- Contrôle négatif: les signaux FAM et Yellow ne doivent pas apparaître.- Contrôle positif: les signaux FAM et Yellow doivent apparaître, valeur Ct/Cp de ± 30 (pour<strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> et <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> en fonction du système en temps réelutilisé).- Pour les échantillons inconnus:• L’apparition du signal FAM indique que l’échantillon est positif au <strong>Bordetella</strong><strong>pertussis</strong>.• L’absence du signal FAM indique que l’échantillon est négatif au <strong>Bordetella</strong><strong>pertussis</strong>.• L’apparition du signal Yellow indique que l’échantillon est positif au <strong>Bordetella</strong>para<strong>pertussis</strong>.• L’absence du signal Yellow indique que l’échantillon est négatif au <strong>Bordetella</strong>para<strong>pertussis</strong>.En cas d’absence des signaux FAM et Yellow:N.B.• Un signal Orange/ Cy5 ou Red Dye au-dessus du seuil (Threshold), 27 ≤ valeur ≤ 36, doitêtre considéré comme positif pour le contrôle d'extraction d’ADN et d’inhibition PCR (DIA-EIC/DNA-050). L’échantillon est valide.• Un signal Orange/ Cy5/ Red dye en-dessous du seuil (Threshold) doit être considérécomme négatif pour le contrôle d'extraction d’ADN et d’inhibition PCR (DIA-EIC/DNA-050).L’échantillon n’est pas valide. Recommencez la procédure d’extraction d’ADN et/ou laprocédure PCR.Si la valeur Ct/Cp du contrôle d’extraction d’ADN & d’inhibition (DIA-EIC/DNA-050) se situe ≥ 36:I. Premièrement, nous suggérons fortement de réaliser à nouveau la PCR en diluantl’échantillon 10x afin d’exclure au maximum les facteurs inhibiteurs.II.Deuxièmement, si l’erreur persiste, nous recommandons vivement de réaliser ànouveau la procédure d’extraction et/ou de réaliser une autre procédure d’extractionplus appropriée.III.Sélectionnez le document de rapport pour obtenir un résumé des résultats Ct/Cp et descourbes.Europe <strong>Diagenode</strong> sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com
PAGE 11B. Annexes de la procédure:B.1. Contrôle d'extraction d’ADN & d’inhibition (facultatif)Le contrôle d'extraction d’ADN & d’inhibition de <strong>Diagenode</strong> est une culture virale contenant unecharge virale de 1.000 TCID50/ml.Le contrôle d’extraction d’ADN & d’inhibition est un virus complet, gardant son pouvoirinfectieux. Ce virus est répertorié dans la classe Ea1* établie par l’EFB (EuropeanFederation of Biotechnologies).Ce virus n’est pas considéré comme dangereux pour l’homme, mais doit être manipulésous une hotte à flux laminaire.*(plus de détails à la fin de ce manuel)Les résultats suivants ont été obtenus avec le système Nuclisens easyMAG ® (Biomerieux)Procédure:• 10 μl de chaque dilution à extraire dans500 μl d’eau.• Système Nuclisens easyMAG ® (extraction"on board").• Élution dans 60 μl.• 5 μl utilisés pour la PCR.• TaqMan ® Universal PCR Mastermix(Applied Biosystems).• Tests réalisés sur ABI Prism ® 7000(Applied Biosystems).La valeur Ct pour 1.000 TCID50/ml est de ± 28,5. La figure ci-dessus montre également lesrésultats d’autres dilutions (100 TCID50/ml à ± 31,5 et 10 TCID50/ml à ± 35).Pour l’extraction d’échantillons/l’isolation d’ADN, ajoutez 10µl de culture virale d’ADN ducontrôle d'extraction (IC) dans l’échantillon avant de lancer la procédure d’extraction.(La concentration peut être modifiée afin d’adapter la PCR multiplexe à la méthode d’extractionutilisée.)www.diagenodediagnostics.com
DIAGENODE <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> | <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> PCR en temps reel MANUEL D'UTILISATIONB.2. Extraction d’échantillons/Isolation d’ADN<strong>Diagenode</strong> suggère les méthodes d’extraction suivantes:• Nuclisens EASYMAG ® System (Biomerieux)Echantillons cliniques : échantillons de lavage broncho-alvéolaire, de prélèvement nasopharyngé.Suivez les instructions du fabricant qui suivent :Volume de l’échantillon humain à extraire : 200 µl (+ 10 μl de DIA-EIC/DNA-050, si vousutilisez le contrôle d’extraction d’ADN & d’inhibition)Volume d’isolation de l’ADN : 60 µl• MagNa pure LC system, Roche : MagNa pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit(réf. : 03038505001)Echantillons cliniques : échantillons de lavage broncho-alvéolaire, de prélèvement nasopharyngé.Suivez les instructions du fabricant qui suivent :Volume de l’échantillon humain à extraire : 200 µl (+ 10 μl de DIA-EIC/DNA-050, si vousutilisez le contrôle d’extraction d’ADN & d’inhibition)Volume d’isolation de l’ADN : 60 µl• QIAamp DNA mini Ki t (50) (Blood and Body Fluid Spin Protocol) (Qiagen Ref. 51304)Echantillons cliniques : échantillons de lavage broncho-alvéolaire, de prélèvement nasopharyngé.Suivez les instructions du fabricant qui suivent :Volume d’échantillon humain à extraire : 200 µl (+ 10 μl de DIA-EIC/DNA-050, si vous utilisezle contrôle d’extraction d’ADN & d’inhibition)Volume d’isolation de l’ADN : 60 µlInformation générale concernant l’extraction:Si vous réalisez la PCR le même jour, l’ADN extrait peut être conservé sur de la glace. Pourune période de conservation plus longue, l’ADN doit être stocké à -20°C.Europe <strong>Diagenode</strong> sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com
PAGE 13B.3. Préparation de la réaction PCR(ABI 7000-7300-7500-7900HT/ Roche Lc480-Lc2.0/ Biorad iCycler-IQ5-CFX96/ StratageneMX3000P-3005P/ Qiagen Rotor-Gene/ Cepheid SmartCycler II (sur demande))Avec: Qantifast Multiplex + R kit (réf. : 204756), Qiagen (non fourni)NB :Pour le Qiagen Rotor-Gene, nous recommandons la trousse PCR Rotor-Gene Multiplex, Qiagen(non fourni) (réf. : 204774)Pour le LightCycler2.0 (Lc2.0), nous recommandons tout particulièrement LightCycler ® TaqMan ®Master, Roche (non fourni) (réf. : 04535286001).• PCR 50 μl(ABI 7000-7300-7500-7900HT/ Roche Lc480 / Biorad iCycler-IQ5/ Stratagene MX3000P-3005P/Qiagen Rotor-Gene)25 µl …………………………………. 2X mastermix5 µl …………………………………… Amorces et sondes d’hydrolyse <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong>et <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> de <strong>Diagenode</strong>5 µl……………………………………. Amorces et sondes d’hydrolyse de contrôled’extraction d’ADN et d’inhibition PCR de<strong>Diagenode</strong>10 µl …………………………………. Echantillon humain (ou contrôle positif de <strong>Bordetella</strong><strong>pertussis</strong> & <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong>)5 µl …………………………………… H 2 O (PCR grade)50 µl …………………………………. Volume finalNB :Avec le système ABI, vous pouvez ajouter 1 μl de solution ROX (Qiagen).• PCR 25 μl(ABI 7000-7300-7500-7900HT / Roche Lc480 / Biorad iCycler-IQ5-CFX96/ Stratagene MX3000P-3005P/ Qiagen Rotor-Gene)12,5 µ...………………………………. 2X mastermix2,5 µl ………………………………… Amorces et sondes d’hydrolyse <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong>et <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> de <strong>Diagenode</strong>2,5 µl…………………………………. Amorces et sondes d’hydrolyse de contrôled’extraction d’ADN et d’inhibition PCR de<strong>Diagenode</strong>5 µl …………………………………….Echantillon humain (ou contrôle positif de <strong>Bordetella</strong><strong>pertussis</strong> & <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong>)2,5 µl ………………………………… H 2 O (PCR grade)25 µl …………………………………. Volume finalwww.diagenodediagnostics.com
DIAGENODE <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> | <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> PCR en temps reel MANUEL D'UTILISATIONCepheid SmartCycler II (sur demande)5 μl 5X MM GMO-DAMMDU5-1002.5 μl. ................ Pathogens double-dye probes & primers2.5 μl ................ DNA extraction & PCR inhibition control double-dye probe & prime5 μl... ................ Human sample* (or positive control)0.5 μl ................ MGCl25 μl... ................ <strong>Diagenode</strong> Buffer4.5 μl... ................ <strong>Diagenode</strong> H2O (maximum)25 μl ................ Final volume• PCR 20 μl(Roche Lc2.0)NB :Pour le LightCycler2.0 (Lc2.0), nous recommandons tout particulièrement LightCycler ® TaqMan ®Master, Roche (non fourni) (réf. : 04535286001).4 µl …………………………………… 5X mastermix2 µl …………………………………… Amorces et sondes d’hydrolyse <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong>et <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> de <strong>Diagenode</strong>2 µl……………………………………. Amorces et sondes d’hydrolyse de contrôled’extraction d’ADN et d’inhibition PCR de<strong>Diagenode</strong>10 µl …………………………………. Echantillon humain (ou contrôle positif de <strong>Bordetella</strong><strong>pertussis</strong> et <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong>)2 µl …………………………………… H 2 O (PCR grade)20 µl …………………………………. Volume finalNB :Avec le système Roche LC2.0, les amorces et les sondes d’hydrolyse du contrôle d’extractiond’ADN et d’inhibition PCR de <strong>Diagenode</strong> (fluorophore Yellow) ne peuvent pas être utilisées dans lemême capillaire. Vous aurez besoin d’un deuxième capillaire.AttentionIl faut préparer un nouveau mélange pour chaque nouveau test PCR. Le Mastermix (non fourni) etles amorces/sondes fournies dans la trousse doivent être placées sur de la glace pendant toutel’étape de préparation de la PCR.Europe <strong>Diagenode</strong> sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com
PAGE 15B.4. Programme PCR‣ ABI 7000-7300-7500-7900HT/ Roche Lc480/ Biorad iCycler-IQ5- CFX96/ StratageneMX3000P-3005P/ Qiagen Rotor-Gene/ Cepheid SmartCycler II (sur demande)NiveauDescription1 2 minutes à 50°C (1 cycle)2 10 minutes à 95°C (1 cycle)3 Programme du cycle (45 cycles)- Étape 1 : 15 secondes à 95°C- Étape 2 : 60 secondes à 60°CNB :Lors de la deuxième étape du niveau 3, il est fortement recommandé de diminuer la vitesse dechangement de température (°C/s) de 50%.‣ Roche Lc2.0NiveauDescription1 10 minutes à 95°C (1 cycle)2 Programme du cycle (45 cycles)Étape 1 : 10 secondes à 95°CÉtape 2 : 40 secondes à 60°CÉtape 3 : 1 seconde à 72°C3 30 secondes à 40°C (1 cycle)• Cepheid Smart Cycler IIStage Description1 2 minutes at 50°C (1 cycle)2 10 minutes at 95°C (1 cycle)3 Cycle program (45 cycles)Step 1: 15 seconds at 95°CStep 2: 30 seconds at 60°CStep3: 30 seconds at 68°c + fluorescence read outwww.diagenodediagnostics.com
DIAGENODE <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> | <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> PCR en temps reel MANUEL D'UTILISATIONB.5. Sélection des fluorophores appropriés• ABI 7000-7300-7500-7900HTNom du détecteur Émetteur Absorbeur<strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> FAM FAM (aucun)<strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> Yellow Dye Vic (aucun)DIA-EIC/DNA(DR)-050 Orange dye NED (aucun)(*)DIA-EIC/DNA(Cy5)-050 Cy5 Cy5 (aucun)Sélectionnez la référence passive : ROX (si vous utilisez un Mastermix avec ROX)Sélectionnez la référence passive: néant (si vous utilisez un Mastermix sans ROX).DIA-EIC/DNA(DR)-050: ABI 7000 ou 7300 ou 7900DIA-EIC/DNA(Cy5)-050 : ABI 7500(*) DIA-EIC/DNA(Cy5)-050 peut être remplacé par DIA-EIC/DNA(RD)-050• Roche Lc480-Lc2.0Nom du détecteurÉmetteurAbsorbeur<strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> FAM FAM (aucun)<strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> Yellow dye Vic/Hex (aucun)(*) DIA-EIC/DNA(Cy5)-050 Cy5 Cy5 (aucun)N.BAvant d’utiliser notre trousse PCR en temps réel sur le système Roche LightCycler 2.0 ou 480,vous devez créer un fichier de compensation pour les fluorophores spécifiques à l’application.(1) Pour Lc2.0, DIA-EIC/DNA(YD)-050 doit être utilisé dans un second capillaire.(*) DIA-EIC/DNA(Cy5)-050 peut être remplacé par DIA-EIC/DNA(RD)-050• Biorad iCycler-IQ5-CFX96Nom du détecteur Émetteur Absorbeur<strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> FAM FAM (aucun)<strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> Yellow dye Vic/Hex (aucun)DIA-EIC/DNA(Cy5)-050 Cy5 Cy5 (aucun)DIA-EIC/DNA(Cy5)-050 : iCycler ou IQ5 ou CFX96(*) DIA-EIC/DNA(Cy5)-050 peut être remplacé par DIA-EIC/DNA(RD)-050Europe <strong>Diagenode</strong> sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com
PAGE 19Guide de résolution des problèmes• Isolation de l’acide nucléiqueRéférez-vous à la mention du fabricant concernant le produit.N.BRéalisez l’entretien des postes de travail pour l’extraction automatisée (en fonction desrecommandations du fabricant). Vérifiez la date d’expiration et les conditions de stockage dessolutions fournies.• PCRLe signal détecté pour le contrôle positif du <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> & <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong>, lecontrôle d'extraction d’ADN & d'inhibition (DIA-EIC/DNA-050) sont négatifs ou faibles.Les conditions de la PCR ne sont pas conformes au protocole.1. Vérifiez la procédure d’extraction.Il est important de sélectionner la procédure d’extraction appropriée. La procédure d’extractiondoit être validée et limiter la présence de facteurs inhibiteurs.2. Vérifiez la préparation de la réaction PCR.Pour obtenir une haute sensibilité, vous devez respecter les volumes décrits et les Mastermixsuggérés.NB :Vérifiez l’étalonnage des pipettes utilisées (en fonction des recommandations du fabricant).Vérifiez la date d’expiration et les conditions de stockage des mastermix suggérés.3. Vérifiez le cycle de PCR.Pour obtenir une haute sensibilité, suivez le protocole adapté à la machine PCR en temps réelutilisée.4. Vérifiez les fluorophores sélectionnés.Vérifiez et sélectionnez les fluorophores adaptés à chaque plate-forme PCR en temps réel.5. Interprétation des résultats.Vérifiez le tableau et sélectionnez le canal approprié.Remarque importante:Vérifiez les conditions de stockage (pendant et après l’expérience) et la date d’expiration.Ces deux conditions influencent fortement les résultats obtenus.• Système de PCR en temps réelRéférez-vous à la mention du fabricant concernant le produit.NB :Réalisez l’entretien de la plateforme PCR en temps réel (en fonction des recommandations dufabricant).Pour tout problème/question, veuillez nous contacter:Tél. : +32 4 364 20 50 / info@diagenodediagnostics .comwww.diagenodediagnostics.com
DIAGENODE <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> | <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> PCR en temps reel MANUEL D'UTILISATIONÉvaluation des performances1. Sensibilié analytiqueL’ADN a été extrait (QIAamp DNA mini kit, Qiagen (réf : 51504) : cf. B.2. Extraction d’échantillon/Isolation d’ADN) à partir d’une série de dilutions de <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> et a été amplifié par PCR.Une dilution a été jugée positive si le fluorophore correspondant dépassait le seuil comme établipar le programme de détection Biorad iCycler. La sensibilité des tests PCR a été évaluée à 1 à 19CFU/ml (Templeton et al., 2003)L’ADN, estimation externe de la qualité de détection moléculaire du <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> dans deslaboratoires européens (Muyldermans et al., 2005), a été extrait avec le « Amplicor respiratoryspecimen preparation kit » (RSP Prep, Roche) (cf. B.2. Extraction d’échantillon/ Isolation d’ADN) eta été amplifié par PCR. Une dilution a été jugée positive si le fluorophore correspondant dépassaitle seuil comme établi par le programme de détection Biorad iCycler. Les résultats suivants ont étéobtenus :Organisme<strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong><strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong>Limite de la détection1 CFU/ml10 CFU/ml2. Spécificité analytiqueLes amorces et les sondes spécifiques ont été sélectionnées à partir de la littérature (Templetonet al., 2003). Elles ont également été vérifiées par rapport aux homologies possibles avec d’autresséquences connues par analyse de comparaison des séquences. Les amorces et les sondes sontutilisées quotidiennement dans des laboratoires de diagnostic clinique sur des échantillonshumains de lavage broncho-alvéolaire (BAL), d’expectoration et de prélèvements.La séquence de contrôle interne a également été contrôlée par analyse de séquence.Des tests de réactions croisées ont également été effectués avec les bactéries suivantes :<strong>Bordetella</strong> pertussi Legionella pneumophila Staphylococcus aureus<strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> Mycoplasma pneumoniae Moraxella catarrhalis<strong>Bordetella</strong> bronchiseptica * ChlamydophilaNeisseria meningitidispneumoniae<strong>Bordetella</strong> holmesii * StreptococcusPseudomonas aeruginosapneumoniae<strong>Bordetella</strong> hinzii Klebsiella pneumoniae Enterobacter aerogenes<strong>Bordetella</strong> avium Streptococcus pyogenes Haemophilus influenzae<strong>Bordetella</strong> trematum Enterococcus faecalis Escherichia coli*Cf. Restrictions concernant l’utilisation du produit3. Investigation cliniqueUne étude rétrospective a été réalisée avec la PCR en temps réel <strong>Bordetella</strong> de <strong>Diagenode</strong> sur168 échantillons cliniques (expectoration et prélèvement nasopharyngé). Les résultats obtenusont été comparé avec des cultures bactériennes précédentes et des résultats de PCR interneconventionnelle. Les PCR en temps réel ont été jugées positives si le fluorophore correspondantdépassait le seuil comme établi par le programme de détection Biorad iCycler.Les résultats suivants ont été obtenus :Europe <strong>Diagenode</strong> sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com
PAGE 21Echantillon Bord. Pertussis Bord. Para<strong>pertussis</strong> Bord. homesiiCultures8,9% 0,6% -bactériennesPCR interne 12,5% 0,6% -<strong>Diagenode</strong> 11,9% 0,6% -Restrictions concernant l’utilisation du produit• Tous les réactifs doivent servir exclusivement au diagnostic in vitro.• Le respect strict du manuel d’utilisation est nécessaire pour obtenir des résultats optimaux.• La fiabilité des résultats dépend du prélèvement, du transport, du stockage et desprocédures de traitement adéquates des échantillons.• Ce test a été validé pour utilisation avec des échantillons de lavage broncho-alvéolaire,l’expectoration et les prélèvements nasopharyngés.• Le test a été validé avec le système PCR en temps réel Lc480.• Réactions croissées entre la PCR en temps réel <strong>Bordetella</strong> de <strong>Diagenode</strong> et <strong>Bordetella</strong>holmesii et bronchiseptica.- Les amorces et sondes de détection du Bortedella <strong>pertussis</strong> interagissent aussi avec<strong>Bordetella</strong> holmesii et <strong>Bordetella</strong> bronchiseptica.- Les amorces et sondes de détection du Bortedella para<strong>pertussis</strong> interagissent aussiavec <strong>Bordetella</strong> holmesii.Contrôle qualité<strong>Diagenode</strong> a obtenu les certifications ISO 9001 et ISO 13485 pour la conception, la production etla vente des trousses de diagnostic clinique basées sur la technologie PCR en temps réel.La PCR en temps réel du <strong>Bordetella</strong> (<strong>pertussis</strong>/para<strong>pertussis</strong>) est testée en fonction despécifications prédéterminées pour assurer la qualité du produit.Références(1) Cherry, J. D., and U.Heininger. (2004).Pertussis and other <strong>Bordetella</strong> infections. InR.D.Feigin, J.D.Cherry, G.J.Demmler, and S.Kaplan (ed.), Textbook of pediatric infectiousdiseases, 1588-1608.(2) Cotter, P. A., and J.F.Miller. (2001). <strong>Bordetella</strong>. In E.A.Groisman (ed), Principles of bacterialpathogenesis. Academic Ltd., London, United Kingdom.Press, 619-674.(3) Mattoo, S., Foreman-Wykert, A. K., Cotter, P. A., and Miller, J. F. (2001). Mechanisms of<strong>Bordetella</strong> pathogenesis. Front Biosci 6, E168-86.(4) Muyldermans, G., Soetens, O., Antoine, M., Bruisten, S., Vincart, B., Doucet-Populaire, F.,Fry, N. K., Olcen, P., Scheftel, J. M., Senterre, J. M. et al. (2005). External qualityassessment for molecular detection of <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> in European laboratories. J ClinMicrobiol 43, 30-5.(5) Templeton, K. E., Scheltinga, S. A., van der Zee, A., Diederen, B. M., van Kruijssen, A. M.,Goossens, H., Kuijper, E., and Claas, E. C. (2003). Evaluation of real-time PCR fordetection of and discrimination between <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong>, <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong>, and<strong>Bordetella</strong> holmesii for clinical diagnosis. J Clin Microbiol 41, 4121-6.www.diagenodediagnostics.com
DIAGENODE <strong>Bordetella</strong> <strong>pertussis</strong> | <strong>Bordetella</strong> para<strong>pertussis</strong> PCR en temps reel MANUEL D'UTILISATIONExplication des symbolesRéférenceNuméro de lotNombre d'expériencesTempérature de conservationyyyy-mmDate d'expirationDispositif médical de diagnostic In vitroSe référer au manuel d'utilisation RisquebiologiqueContrôleContrôle négatifContrôle positifÀ protéger de la lumièreFabriquantEurope <strong>Diagenode</strong> sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com
PAGE 23Avis à l’acheteurCe produit est optimisé dans le cadre d’un usage dans la réaction en chaine par polymérase (PCR)couverte par les licences de Roche Molecular Systems, Inc. et F. Hoffmann-La Roche ltd. (Roche).Aucune autorisation relative à ces licences pour l’usage du procédé de PCR ne peut être transféréeexpressément ou par implication de l’acheteur suite à l’achat de ce produit. L’autorisation d’utiliser leprocédé de PCR dans certaines recherches et activités de développement implique l’achat de certainsréactifs chez les fournisseurs agréés, lorsqu’ils sont utilisés en combinaison avec un thermocycleuragréé et sont disponibles chez Applied Biosystems. Pour plus d’informations concernant l’achat deslicences autorisant le procédé de PCR, contactez le responsable des licences chez AppliedBiosystems, 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404 ou chez Roche Molecular Systems,Inc, 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California 94501.• ABI (Applied Biosystems) Prism 7000 ou 7300 ou 7500 ou 7900HT sont des marquescommerciales de Applera Corporation.• Roche LightCycler 480 et 2.0 est une marque commerciale de Roche.• Biorad iCycler ou IQ5 ou CFX96 sont des marques commerciales de Biorad.• Stratagene MX3000P ou 3500P sont des marques commerciales de Stratagene.• Qiagen Rotor-Gene est une marque commerciale de Qiagen.• Cepheid SmartCycler II est une marque commerciale de Cepheid.• Nuclisens EASYMAG System est une marque commerciale de Biomerieux.• MagNa pure LC est une marque commerciale de Roche.• QIamp DNA Mini Kit est une marque commerciale de Qiagen.. • Quantifast TM Multiplex + R kit est une marque commerciale de Qiagen.* Classe Ea1: virus pouvant provoquer des maladies chez les animaux et présentantles caractéristiques suivantes (à des degrés divers): importance géographique limitée,transmissibilité interespèce faible, vecteur ou porteur inexistant.Il ne nécessitegénéralement aucune mesure de confinement particulière. Il existe habituellement uneprophylaxie et/ou un traitement efficace.MA-Bor-050-FR-Vs1_30_07_12www.diagenodediagnostics.com
<strong>Diagenode</strong> saCHU, Tour GIGA, 3e étageAvenue de l’hôpital, 14000 Liège – BELGIUMTel. +32 4 364 20 50info@diagenodediagnostics.comwww.diagenodediagnostics.com