Contrôle d'extraction d'ADN et d'inhibition - Diagenode Diagnostics
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PAGE 7Matériel requis (non fourni)• Pip<strong>et</strong>tes• Embouts de pip<strong>et</strong>te stériles avec filtre exempt d’ARNase/ADNase• Gants non poudrés• Vortex• Centrifugeuse de table• Tubes de microcentrifugeuse exempts de ARNase / ADNase (1,5 <strong>et</strong>/ou 2 ml)• Tubes/capillaires ou plaque 96 puits• Tablier de laboratoire• Eau exempte d’ARNase/ADNase• Trousse d’isolation d’ADN (cf. point B .2. Extraction d’échantillons/isolation d’ADN)• Consommables <strong>et</strong> accessoires (tubes, microcentrifugeuse, plaques, bande adhésive)pour les systèmes ABI / Roche/ Biorad /Qiagen / Stratagene ou Cepheid system• Mastermix (cf. point B.3. Préparation à la réaction de PCR)• Machine de PCR en temps réel: ABI / Roche/ Biorad / Qiagen / Agilent Stratageneou Cepheid• Hotte à flux laminaire (Mix/DNA)Prélèvement, stockage <strong>et</strong> transport d’échantillonshumains1. Prélèvement d’échantillons• Échantillons respiratoires humains : des échantillons respiratoires humains tels, lavagebroncho-alvéolaire, expectorations, écouvillage/lavage du nasopharynx doivent êtreprélevés.• Échantillons de sang : des échantillons de sang humains tels que du sang ou du plasmadoivent être prélevés.• Échantillons d’urine.• Échantillons de selles : des échantillons de selle doivent être prélevés.2. Stockage des échantillonsLes échantillons humains peuvent être stockés à 4°C pour une durée maximale de 24 heures.Pour une durée plus longue, ils doivent être congelés à -20°C ou à -80°C (en fonction du typed’échantillon).Les échantillons humains doivent être stockés dans des tubes en polypropylène exemptsd’ADNase / ARNase. La sensibilité de la PCR peut être compromise si les échantillons humainssont congelés <strong>et</strong> décongelés de façon répétée. Nous recommandons d'éviter les cycles decongélation/décongélation.3. Transport des échantillonsLes échantillons humains (sang, plasma, urine, selle, échantillon respiratoire) doivent êtr<strong>et</strong>ransportés dans des containers adaptés. Le transport d'échantillons pathogènes doit se faire dansle respect des normes locales <strong>et</strong> nationales.Les échantillons humains doivent être transportés à une température de -20°C.www.diagenodediagnostics.com
PAGE 93. Préparation de la réaction PCRMastermix suggéré:2x: Lc 480 Probe Master, Roche (réf.: 4707494001)5x: Optima DU Mastermix 5X DNA, <strong>Diagenode</strong> (GMO-DAMMDU5-100)Taqman Probe Lc 2.0 pour LightCycler 2.0, Roche (réf.: 4535286001)Autres Mastermix validés:2x: QuantiFast Multiplex + R kit (2000) , Qiagen (réf.: 204756)QuantiFast TM Probe PCR + ROX viral kit, Qiagen (réf.: 204354)Rotor-Gene Multiplex PCR kit pour Qiagen Rotor-Gene (réf.: 204774)Exemples de protocoles :• PCR 50 μl25 µl …………………………………. 2X mastermix5 µl …………………………………… Amorces <strong>et</strong> sonde d’hydrolyse pour le contrôled’extraction d’ADN <strong>et</strong> d’inhibition5 µl……………………………………. Amorces <strong>et</strong> sondes d’hydrolyse pour l’agentpathogène humain recherché10 µl …………………………………. Échantillon (ou contrôle positif /négatif)5 µl …………………………………… H2O (PCR grade)50 µl …………………………………. Volume final10 µl …………………………………. 5X mastermix5 µl …………………………………… Amorces <strong>et</strong> sonde d’hydrolyse pour le contrôled’extraction d’ADN <strong>et</strong> d’inhibition5 µl……………………………………. Amorces <strong>et</strong> sondes d’hydrolyse pour l’agentpathogène humain recherché10 µl …………………………………. Échantillon (ou contrôle positif/négatif)20 µl …………………….…………… H2O (PCR grade)50 µl …………………………………. Volume final• PCR 25 μl12.5 µl …………………………………. 2X mastermix2.5 µl …………………………………… Amorces <strong>et</strong> sondes d’hydrolyse pour le contrôled’extraction d’ADN <strong>et</strong> d’inhibition2.5 µl……………………………………. Amorces <strong>et</strong> sonde d’hydrolyse pour l’agentpathogène humain recherché5 µl …………………………………..…. Échantillon (ou contrôle positif/négatif)2.5 µl …………………………………… H2O (PCR grade)25 µl ……………………………………. Volume final5 µl …………………………………. 5X mastermix2.5 µl …… ………………………… Amorces <strong>et</strong> sondes d’hydrolyse pour le contrôled’extraction d’ADN <strong>et</strong> d’inhibition2.5 µl………………..………………. Amorces <strong>et</strong> sonde d’hydrolyse pour l’agentpathogène humain recherché5 µl …………………………………. Echantillon (ou contrôle positif/négatif)10 µl …………………..….………… H2O (PCR grade)25 µl …………………..……………. Volume finalwww.diagenodediagnostics.com
PAGE 10DIAGENODE CONTRÖLE D’EXTRACTION D’ADN & D’INHIBITION MANUEL D'UTILISATION• PCR 20 μl10 µl ……………………… .…………. 2X mastermix2 µl …………………………………… Amorces <strong>et</strong> sonde d’hydrolyse pour le contrôled’extraction d’ADN <strong>et</strong> d’inhibition2 µl……………………………………. Amorces <strong>et</strong> sonde d’hydrolyse pour l’agentpathogène humain recherché5 µl …………………… .……………. Échantillon (ou contrôle positif/négatif)1 µl …………………………………… H2O (PCR grade)20 µl …………………………………. Volume final4 µl ……………………… .…………. 5X mastermix2 µl …………………………………… Amorces <strong>et</strong> sonde d’hydrolyse pour le contrôled’extraction d’ADN <strong>et</strong> d’inhibition2 µl……………………………………. Amorces <strong>et</strong> sonde d’hydrolyse pour l’agentpathogène humain recherché5 µl …………………… .……………. Échantillon (ou contrôle positif/négatif)7 µl …………………………………… H2O (PCR grade)20 µl …………………………………. Volume finalAttentionIl faut préparer un nouveau mélange pour chaque nouveau test PCR. Le Mastermix (nonfourni) <strong>et</strong> les amorces/sondes fournies dans la trousse doivent être placées à 4°C pendanttoute l’étape de préparation de la PCR.4. Programme de PCR• ABI 7000-7300-7500-7900HT-StepOnePlus TM / Roche LightCycler ® 480 / Biorad iCycler-IQ5-CFX96/ Agilent Stratagene MX3000P-3005P/ Qiagen Rotor-Gene ® 3000-6000 /Cepheid SmartCycler ® IINiveau Description1 2 minutes à 50°C (1 cycle)2 10 minutes à 95°C (1 cycle)3 Programme du cycle (45 cycles)Étape 1 : 15 secondes à 95°CÉtape 2 : 60 secondes à 60°CNB :Lors de la deuxième étape du niveau 3, il est fortement recommandé de diminuer la vitesse dechangement de température (°C/s) de 50%.Europe <strong>Diagenode</strong> sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com
PAGE 11• Roche Lc2.0NiveauDescription1 10 minutes à 95°C (1 cycle)2 Programme du cycle (45 cycles)Étape 1 : 10 secondes à 95°CÉtape 2 : 40 secondes à 60°CÉtape 3 : 1 seconde à 72°C3 30 secondes à 40°Cwww.diagenodediagnostics.com
PAGE 12DIAGENODE CONTRÖLE D’EXTRACTION D’ADN & D’INHIBITION MANUEL D'UTILISATION5. Sélection des fluorophores appropriés*ABI : Comme « absorbeur », sélectionnez « (aucun) »Sélectionnez la référence passe : ROX (si vous utilisez un Mastermix avec ROX)Sélectionnez la référence passive: néant (si vous utilisez un Mastermix sans ROX).**Roche : Avant d’utiliser notre trousse PCR en temps réel sur le système Roche LightCycler 480ou 2.0, il est conseillé de créer un fichier de compensation pour les fluorophores spécifiques àl’application.***Stratagene : Dans le menu « Filter S<strong>et</strong> Gain S<strong>et</strong>tings », sélectionnez pour FAM: x8Yellow dye : x2Cy5 : x4Europe <strong>Diagenode</strong> sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com
PAGE 14DIAGENODE CONTRÖLE D’EXTRACTION D’ADN & D’INHIBITION MANUEL D'UTILISATIONPerformance du contrôle interneLa performance du contrôle d’extraction d’ADN & d’inhibition a été évaluée sur 137 spécimenscliniques (lavage broncho-alvéolaire, expectoration <strong>et</strong> écouvillon/lavage nasopharyngé):• Les échantillons cliniques ont été extraits sur le système Nuclisens EASYMAG(Biomerieux). (Voir 2. Extraction d’échantillons/Isolation d’ADN)• Protocole PCR. (Voir 3. Préparation de la réaction PCR (ABI 7000, ICycler Biorad))• Système PCR en temps réel ABI 7000.Le contrôle ADN d’Extraction & d’Inhibition a été ajouté à chaque échantillon avant l’extraction(Voir 1. <strong>Contrôle</strong> d’extraction d’AND & d’Inhibition) Les résultats suivants ont été obtenus:N (échantillons) = 93CtMoyenne des résultats 32,24Déviation standard 1,54Minimum 27Maximum 35Des résultats équivalents ont été obtenus avec la procédure d’extraction Qiagen DNA bloodMiniprep Kit.(Voir 2. Extraction d’échantillons/Isolation d’ADN.)Europe <strong>Diagenode</strong> sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com
PAGE 15Guide de résolution des problèmes• Isolation de l’acide nucléiqueRéférez-vous à la mention du fabricant concernant le produit.N.BRéalisez l’entr<strong>et</strong>ien des postes de travail pour l’extraction automatisée (en fonction desrecommandations du fabricant). Vérifiez la date d’expiration <strong>et</strong> les conditions de stockage dessolutions fournies.• PCRLe signal détecté pour contrôle <strong>d'extraction</strong> d’ADN & <strong>d'inhibition</strong> de la PCR est négatif ou faible.Les conditions de la PCR ne sont pas conformes au protocole.1. Vérifiez la procédure d’extraction.Il est important de sélectionner la procédure d’extraction appropriée. La procédure d’extractiondoit être validée <strong>et</strong> limiter la présence de facteurs inhibiteurs.2. Vérifiez la préparation de la réaction PCR.Pour obtenir une haute sensibilité, vous devez respecter les volumes décrits <strong>et</strong> les Mastermixsuggérés.NB :Vérifiez l’étalonnage des pip<strong>et</strong>tes utilisées (en fonction des recommandations du fabricant).Vérifiez la date d’expiration <strong>et</strong> les conditions de stockage des mastermix suggérés.3. Vérifiez le cycle de PCR.Pour obtenir une haute sensibilité, suivez le protocole adapté à la machine PCR en temps réelutilisée.4. Vérifiez les fluorophores sélectionnés.Vérifiez <strong>et</strong> sélectionnez les fluorophores adaptés à chaque plate-forme PCR en temps réel.5. Interprétation des résultats.Vérifiez le tableau <strong>et</strong> sélectionnez le canal approprié.Remarque importante:Vérifiez les conditions de stockage (pendant <strong>et</strong> après l’expérience) <strong>et</strong> la date d’expiration.Ces deux conditions influencent fortement les résultats obtenus.• Système de PCR en temps réelRéférez-vous à la mention du fabricant concernant le produit.NB :Réalisez l’entr<strong>et</strong>ien de la plateforme PCR en temps réel (en fonction des recommandations dufabricant).Pour tout problème/question, veuillez contacter notre service de support technique:Tél. : +32 4 364 20 50 / info@diagenodediagnostics .comwww.diagenodediagnostics.com
PAGE 16DIAGENODE CONTRÖLE D’EXTRACTION D’ADN & D’INHIBITION MANUEL D'UTILISATIONÉvaluation des performancesI. Sensibilité analytiqueCf. Performance du contrôle interneII.Spécificité analytiqueLes amorces <strong>et</strong> les sondes spécifiques ont été sélectionnées dans la littérature. Nous les avonségalement vérifiées par rapport aux homologies possibles avec d’autres séquences connues paranalyse de comparaison des séquences.Les tests de réaction croisée ont été réalisés avec les espèces bactériennes suivantes:Neisseria meningitidis Legionella pneumophila Listeria monocytogenesNeisseria Gonoridae Mycoplasma pneumoniae BartonellaStreptococcus pneumoniae Bord<strong>et</strong>ella Borrelia burgdorferiStreptococcus B Chlamydia pneumoniae Treponema pallidumHaemophilus influenzaeStaphylococcus aureusLes tests de réaction croisée ont été réalisés avec les virus suivants:Adénovirus HBV CMVVaricelle-zona Herpes ParvovirusLes tests de réaction croisée ont été réalisés avec les espèces fongiques suivantes:AspergillusCandida(s)Les tests de réaction croisée ont été réalisés avec le parasite suivant:Toxoplasma gondiiIII.Investigation cliniqueCf. Performance du contrôle interneRestrictions concernant l’utilisation du produit• Tous les réactifs doivent servir exclusivement au diagnostic in vitro.• Le respect strict du manuel d’utilisation est nécessaire pour obtenir des résultats optimaux.• La fiabilité des résultats dépend du prélèvement, du transport, du stockage <strong>et</strong> desprocédures de traitement adéquates des échantillons.• Ce test a été validé pour utilisation avec des échantillons respiratoires, de selles, de sang<strong>et</strong> d’urine.• Le test a été validé avec les systèmes PCR en temps réel ABI /Roche / Biorad / AgilentStratagene / Qiagen / CepheidRemarque importante :La PCR en temps réel du contrôle d’extraction d’ADN & d’inhibition de <strong>Diagenode</strong> peut égalementêtre utilisé avec les systèmes PCR en temps reel ABI 7500, Corb<strong>et</strong>t Research Rotor-Gene 3000 TM ,Stratagene Mx3000P TM QPCR, Roche LightCycler ® 2.0 ou 480.(Veuillez demander pour les paramètres).Europe <strong>Diagenode</strong> sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com
PAGE 17<strong>Contrôle</strong> qualité<strong>Diagenode</strong> a obtenu les certifications ISO 9001 <strong>et</strong> ISO 13485 pour la conception, la production <strong>et</strong>la vente des trousses de diagnostic clinique basées sur la technologie PCR en temps réel.La PCR en temps réel de contrôle d’extraction d’ADN & d’inhibition est testée en fonction despécifications prédéterminées pour assurer la qualité du produit.Références(1) Templ<strong>et</strong>on KE, Scheltinga SA, vander ZEE A., Diederen BM, van Krijssen AM,Goossens H, Kuiper E., Claas EC (2003)Evaluation of real-time PCR for d<strong>et</strong>ection of and discrimination b<strong>et</strong>ween Bord<strong>et</strong>ellapertussis, Bord<strong>et</strong>ella parapertussis and Bord<strong>et</strong>ella holmesii for clinical diagnosis. Journal ofClinical Microbiology, 41(9):4121-4126(2) Eric C. J. Claas, Marco W. Schilham, Caroline S. de Brouwer, P<strong>et</strong>r Hubacek, MarcelaEchavarria, Arjan C. Lankester, Maarten J. D. van Tol, <strong>et</strong> Aloys C. M. Kroes (2005)Internally Controlled Real-Time PCR Monitoring of Adenovirus DNA Load in Serum orPlasma of Transplant Recipients. Journal of Clinical Microbiology, 43(4):1738-1744.www.diagenodediagnostics.com
PAGE 18DIAGENODE CONTRÖLE D’EXTRACTION D’ADN & D’INHIBITION MANUEL D'UTILISATIONExplication des symbolesRéférenceNuméro de lotNombre d'expériencesTempérature de conservationyyyy-mmDate d'expirationDispositif médical de diagnostic In vitroSe référer au manuel d'utilisationRisque biologique<strong>Contrôle</strong><strong>Contrôle</strong> négatif<strong>Contrôle</strong> positifÀ protéger de la lumièreFabriquantEurope <strong>Diagenode</strong> sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com
PAGE 19Avis à l’ach<strong>et</strong>eurCe produit est optimisé dans le cadre d’un usage dans la réaction en chaine par polymérase (PCR)couverte par les licences de Roche Molecular Systems, Inc. <strong>et</strong> F. Hoffmann-La Roche ltd. (Roche).Aucune autorisation relative à ces licences pour l’usage du procédé de PCR ne peut être transféréeexpressément ou par implication de l’ach<strong>et</strong>eur suite à l’achat de ce produit. L’autorisation d’utiliser leprocédé de PCR dans certaines recherches <strong>et</strong> activités de développement implique l’achat de certainsréactifs chez les fournisseurs agréés, lorsqu’ils sont utilisés en combinaison avec un thermocycleuragréé <strong>et</strong> sont disponibles chez Applied Biosystems. Pour plus d’informations concernant l’achat deslicences autorisant le procédé de PCR, contactez le responsable des licences chez AppliedBiosystems, 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404 ou chez Roche Molecular Systems,Inc, 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California 94501.• ABI (Applied Biosystems) Prism 7000 ou 7300 ou 7500 ou 7900HT ou StepOnePlus TM sontdes marques commerciales de Applera Corporation.• Biorad iCycler ou IQ5 ou CFX96 sont des marques commerciales de Biorad.• Qiagen Rotor-Gene est une marque commerciale de Qiagen.• LightCycler ® 2.0 ou 480 sont des marques commerciales de Roche.• Cepheid SmartCycler II est une marque commerciale de Cepheid.• Stratagene MX3000P TM QPCR est une marque commerciale de Stratagene.• Nuclisens EASYMAG System est une marque commerciale de Biomerieux.• MagNa pure LC ® system est une marque commerciale de Roche.• QIASymphony ® est une marque commerciale de Qiagen.• QIAamp ® DNA Blood mini Kit est une marque commerciale de Qiagen.• QIAamp ® DNA micro Kit est une marque commerciale de Qiagen.• QIAamp ® DNA stool mini Kit est une marque commerciale de Qiagen.• QIAamp ® DNA mini Kit est une marque commerciale de Qiagen.• Maxwell 16 Blood DNA Purification Kit est une marque commerciale de Promega.• Lc 480 Probe Master est une marque commerciale de Roche.• Optima DU Master Mic 5X DNA est une marque commerciale de <strong>Diagenode</strong>.. • Taqman Probe Lc 2.0 est une marque commerciale de Roche.. • Quantifast TM Multiplex PCR +R kit est une marque commerciale de Qiagen.. • Quantifast TM Probe PCR +ROX vial kit est une marque commerciale de Qiagen.. • Rotor-Gene Multiplex PCR kit est une marque commerciale de Qiagen.* Classe Ea1: virus pouvant provoquer des maladies chez les animaux <strong>et</strong> présentantles caractéristiques suivantes (à des degrés divers): importance géographique limitée,transmissibilité interespèce faible, vecteur ou porteur inexistant.Il ne nécessitegénéralement aucune mesure de confinement particulière. Il existe habituellement uneprophylaxie <strong>et</strong>/ou un traitement efficace.www.diagenodediagnostics.com
<strong>Diagenode</strong> saCHU, Tour GIGA, 3 e étageAvenue de l’hôpital, 14000 Liège – BELGIUMTel. +32 4 364 20 50info@diagenodediagnostics.comwww.diagenodediagnostics.com