Mycoplasma pneumoniae Chlamydophila pneumoniae - Diagenode ...

diagenodediagnostics.com

Mycoplasma pneumoniae Chlamydophila pneumoniae - Diagenode ...

PAGE 1Réf.: Dia-MCpn-050.Vs1 20.11.2012Mycoplasma pneumoniaeChlamydophila pneumoniaePCR en temps réelManuel d’utilisationDisponible sur:• ABI® 7000 / 7300 / 7500 / 7900HT• Roche LightCycler® 480 / 2.0• Biorad iCycler® / IQ5 / CFX96• Qiagen Rotor-Gene 6000• Stratagen MX3000P / 3005P• Cepheid SmartCycler IIEn combinaison avec:• DIA-EIC/DNA(DR)-050• DIA-EIC/DNA(TR)-050• DIA-EIC/DNA(Cy5)-050www.diagenodediagnostics.com


PAGE 3SommaireInformation générale .......................................................................................................................................... 4Information sur l’agent pathogène ................................................................................................................... 4Description du produit ....................................................................................................................................... 4Stockage .............................................................................................................................................................. 5Avertissements et précautions ......................................................................................................................... 5Matériel requis, non fourni................................................................................................................................. 6Utilisation d'échantillons humains / Champ d'application de la trousse ..................................................... 7Prélèvement, stockage et transport d'échantillons humains ........................................................................ 71. Prélèvement d'échantillons ....................................................................................................................... 72. Stockage des échantillons ........................................................................................................................ 73. Transport des échantillons ........................................................................................................................ 7Protocole ............................................................................................................................................................. 8A. Procédures à suivreA.1. Procédure d’extraction .......................................................................................................................... 8A.2. Procédure de la PCR ............................................................................................................................ 8A.3. Amplification et procédures des systèmes en temps réel ..................................................................... 9A.4. Interprétation des résultats .................................................................................................................. 10B. Annexes de la procédureB.1. Contrôle d’extraction d’ADN & d’inhibition (facultatif).......................................................................... 11B.2. Extraction d’échantillons / Isolation d’ADN .......................................................................................... 12B.3. Préparation de la réaction PCR ........................................................................................................... 14B.4. Programme de PCR ............................................................................................................................ 16B.5. Sélection des fluorophores appropriés ................................................................................................ 17ABI ® 7000-7300-7500-7900HT .......................................................................................................... 17Roche LightCycler ® 480-Lc2.0 ............................................................................................................ 17Biorad iCycler ® -IQ5-CFX96................................................................................................................. 17Stratagene MX3000P-3005P .............................................................................................................. 17Qiagen Rotor-Gene ............................................................................................................................. 18Cepheid SmartCycler II ....................................................................................................................... 18B.6. Interprétation des résultats .................................................................................................................. 18Guide de résolution des problèmes .............................................................................................................. 19Évaluation des performances ......................................................................................................................... 20Sensibilité analytique ............................................................................................................................. 20Spécificité analytique ............................................................................................................................. 20Restrictions concernant l'utilisation du produit ............................................................................................ 21Contrôle qualité ................................................................................................................................................ 21Références ........................................................................................................................................................ 21Explication des symboles ................................................................................................................................ 22Avis à l'acheteur ............................................................................................................................................... 23www.diagenodediagnostics.com


DIAGENODE Mycoplasma/ Chlamydophila pneumoniae PCR EN TEMPS REEL MANUEL D'UTILISATIONInformation généraleLa trousse de PCR de Mycoplasma/Chlamydophila pneumoniae en temps réel de Diagenode estdédiée au diagnostic in vitro. Cette trousse doit être utilisée par les laboratoires cliniques et par lestechniciens de laboratoire qualifiés.La trousse de PCR en temps réel du Mycoplasma/Chlamydophila pneumoniae de Diagenode estvalidée pour:• ABI ® (7000 /7300 /7500 /7900HT)• Roche® (Lc2.0/LcC480)• Biorad® (iCycler/ IQ5/CFX96)• Qiagen Rotor-Gene (3000 / 6000)• Stratagene (MX3000P / 3005P)• Cepheid (SmartCycler II)Information sur l’agent pathogèneMycoplasma pneumoniae & Chlamydophila pneumoniae sont responsables dans la plupart descas de pneumonie atypique chez les enfants.La pneumonie atypique causée par cette bactérie entraine généralement des formes plus légèresde pneumonies. Elles sont caractérisées par une apparition plus lente des symptômes,contrairement aux autres formes de pneumonies qui arrivent de façon plus soudaine avec dessymptômes sévères dès le départ.Mycoplasma pneumoniae peut occasionner une infection légère des voies respiratoiressupérieures et être responsable de bronchite, bronchiolite et bronchopneumonie. La maladiedébute habituellement avec des symptômes similaires à ceux de la grippe. Les symptômesprincipaux sont de la fièvre, des maux de tête, des sensations de démangeaisons dans la gorge etde la toux.Description du produitLe produit contient des amorces, des sondes et un contrôle positif. Le mastermix n’est pas inclus.La trousse de PCR du Mycoplasma/Chlamydophila pneumoniae en temps réel prévue pour 50PCR (volume 50 μl) se compose de 2 pochettes.I. Pochette d’amorces et sondes :1. Amorces & sonde d'hydrolyse du Mycoplasma/Chlamydophila pneumoniae(Mycoplasma pneumoniae, FAM, émission 520 nm & Chlamydophilapneumoniae, Yellow Dye, émission 548 nm) : 250 μl, tube mauve.2. H 2 O PCR grade : 1000 μl, tube bleu foncé.3. Contrôle negatif : 500 µl, tube rouge.II. Pochette du contrôle positif:1. Contrôle positif Mycoplasma/Chlamydophila pneumoniae : 500 μl, tube vert.La trousse de PCR du Mycoplasma/Chlamydophila pneumoniae en temps reel (DIA-MCpn-050)est utilisée en combinaison avec le contrôle d’extraction d’ADN et d’inhibition en temps réel (DIA-EIC/DNA-050).Europe Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com


PAGE 5Contrôle d’extraction d’ADN & d’inhibition de PCR en temps reel: 50 PCR (volume PCR: 50 µl),1 boite.I. Amorces & sonde d’hydrolyse du contrôle d’extraction d’ADN et d’inhibition:Orange Dye (DIA-EIC/DNA(DR)-050), 575 nm: 250 μl, tube bleu.Texas Red (Dia-EIC/DNA(TR)-050), 603 nm: 250 μl, tube rouge.Cy5 (DIA-EIC/DNA(Cy5)-050), 662 nm: 250 μl, tube bleu foncé.II.StockageCulture de virus à ADN: 500 µl, tube jaune.La trousse de PCR du Mycoplasma/Chlamydophila pneumonia en temps réel doit être stockée à -20°C, avant et après ouverture.NB:Si vous utilisez le DIA-EIC/DNA-050, la trousse et la culture de virus à ADN doivent être stockés à-20°C.Veuillez vérifier la date d'expiration mentionnée sur les étiquettes de la pochette et des tubes. Lestrousses ont une durée de conservation de 24 mois à -20°C à partir de la date de production.Après leur ouverture, les trousses sont stables pendant 12 mois à -20°C.NB :Veuillez effectuer un fractionnement des solutions afin d’éviter les cycles de congélation/décongélation. Pendant l’utilisation, tous les composants de la trousse doivent être conservés surde la glace.STOCKAGE À L’ABRI DE LA LUMIÈRE.Avertissements et précautionsVérifier, dès réception, que l'emballage de la trousse n’est pas abîmé et que le produitn'est pas dégelé. N'hésitez pas à contacter le département logistique en cas deproblème.logistics@diagenode.com / +32 4 364 20 52Recommandations générales• Veuillez lire toutes les instructions avant de réaliser le test.• Après utilisation, les déchets et les réactifs doivent être manipulés comme potentiellementinfectieux et doivent être éliminés dans une poubelle spécifique prévue pour lessubstances biologiques.• Ne remplacez pas les réactifs de la trousse par d’autres provenant d’un numéro de lot oud’un fabricant différent.Extraction/PCR• Les trousses de PCR en temps réel de Diagenode doivent être utilisées par desscientifiques/des techniciens de laboratoire possédant un grand savoir-faire en biologiemoléculaire et, en particulier, en matière de plateforme PCR en temps réel.• Pour obtenir des résultats optimaux, Diagenode suggère quelques méthodes d’extractionadaptées afin d’éviter les inhibiteurs de PCR. (Cf. point B.2. Extractiond’échantillons/isolation d’ADN)..• Le contrôle d’extraction d’ADN et d’inhibition doit être utilisé pour chaque réaction de PCR.www.diagenodediagnostics.com


DIAGENODE Mycoplasma/ Chlamydophila pneumoniae PCR EN TEMPS REEL MANUEL D'UTILISATIONAttentionSi les résultats obtenus pour le contrôle d'extraction d’ADN et d'inhibition ne sont passatisfaisants, il est de la responsabilité de l'utilisateur d'optimiser les méthodesd'extraction afin d'obtenir des résultats concluants.• Le contrôle d’extraction viral doit être manipulé sous une hotte à flux laminaire dans lecas d’une procédure d’extraction manuelle ou dans une zone délimitée dans le cas d’uneprocédure d’extraction automatisée, comme le suggère le fabricant.Contamination• Veuillez réaliser l'extraction d’acide nucléique et l’amplification en temps réel dans deslocaux séparés.• Gardez tous les tubes et les ampoules fermés lorsque vous ne les utilisez pas.• Le laboratoire de PCR (hotte stérile, plateforme d’extraction ADN/ARN, tablier delaboratoire, etc.) doit être nettoyé après chaque test PCR avec les produits appropriés.• Les trousses contaminées doivent être jetées dans une poubelle spécifique pour lessubstances biologiques.• La trousse ne doit pas être utilisée par une personne présentant des symptômes similairesà la maladie recherchée.• Les contrôles PCR positifs et négatifs doivent être réalisés à chaque réaction PCR.• Il est obligatoire de porter des gants.• Il faut utiliser des tips à filtre pour tous les mélanges PCR.• Avant ouverture, tous les tubes doivent être centrifugés.• Ne jamais pipetter les solutions avec la bouche. Ne pas fumer, ni manger, ni boire dans leszones où l’on manipule les échantillons ou les réactifs de la trousse.• Les tests ne doivent pas être réalisés par une femme enceinte en raison des risquespossibles pour le fœtus.AttentionLe stockage de la trousse à température ambiante peut entraîner la dégradation desamorces/des sondes/du contrôle positif, ce qui peut provoquer une moins bonnesensibilité. Nous conseillons dès lors l'utilisation d’une nouvelle trousse.Matériel requis (non fourni)• Pipettes• Embouts de pipette stériles avec filtre exempt de ARNase/ADNase• Gants non poudrés• Vortex• Centrifugeuse de table• Tubes de microcentrifugeuse exempts de ARNase / ADNase (1,5 et/ou 2 ml)• Eau exempte d’ARNase/ADNase• Trousse d’isolation d’ADN (cf. point B .2. Extraction d’échantillons/isolation d’ADN)• Consommables et accessoires (tubes, microcentrifugeuse, plaques, bande adhésive)pour les systèmes ABI / Roche/ Biorad/ Qiagen/ Stratagene ou Cepheid.• Mastermix (cf. point B .3. Préparation à la réaction de PCR)• Machine de PCR en temps réel: ABI / Roche/ Biorad/ Qiagen/ Stratagene ou Cepheid.Europe Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com


PAGE 7Utilisation d’échantillons humains/Champ d’applicationde la trousseLa trousse de PCR du Mycoplasma/Chlamydophila pneumoniae en temps réel est destinée à ladétection du Mycoplasma/Chlamydophila pneumoniae dans des lavages broncho-alvéolaires, desexpectorations, des écouvillages/lavages du nasopharynx.La trousse s’utilise sur des échantillons de patients potentiellement infectés par leMycoplasma/Chlamydophila pneumoniae.Prélèvement, stockage et transport d’échantillonshumains1. Prélèvement d’échantillonsDes échantillons respiratoires humains tels que lavage broncho-alvéolaire, expectorations,écouvillage /lavage du nasopharynx doivent être prélevés.2. Stockage des échantillonsLes échantillons humains doivent être stockés à 4°C jusqu’à 24 heures ou congelés à -20°C ou à -80°Cdans le cas de périodes plus longues.Les échantillons humains doivent être stockés dans des tubes en polypropylène exempts d’ADNase /ARNase. La sensibilité de la PCR peut être compromise si les échantillons humains sont congelés etdécongelés de façon répétée.Nous recommandons d'éviter les cycles de congélation/décongélation.3. Transport des échantillonsLes échantillons humains doivent être transportés dans des containers adaptés. Le transportd'échantillons pathogènes doit se faire dans le respect des normes locales et nationales.Les échantillons humains doivent être transportés à -20°C.www.diagenodediagnostics.com


DIAGENODE Mycoplasma/ Chlamydophila pneumoniae PCR EN TEMPS REEL MANUEL D'UTILISATIONProtocoleA. Procédures à suivreA.1. Procédure d’extraction (cf. point B.2. Extraction d’échantillons/isolation d’ADN)Veuillez réaliser cette procédure dans une zone de confinement adaptée.Suivez les étapes suivantes:• Placez le ou les échantillons à température ambiante.NB :Il est recommandé de manipuler les échantillons potentiellement infectés sous une hotte à fluxlaminaire.• Choisissez la méthode d’extraction adaptée à votre échantillon (cf. point B.2 concernantles méthodes validées par Diagenode).Suivez les instructions du fabricant pour la réalisation de la procédure d’extraction.• (Facultatif) Si vous utilisez le contrôle d'extraction d’ADN et d'inhibition en temps réel,ajoutez 10 μl de la culture du virus ADN dans le volume à extraire (tube du virus à ADN)(cf. point B.1. Extraction d’ADN & contrôle d’inhibition et B.2. Extractiond’échantillons/isolation d’ADN).NB :Le contrôle d’extraction d’ADN et d’inhibition de Diagenode sont fournis séparément, réf. : DIA-EIC/DNA-50. Vous pouvez choisir le fluorophore approprié à votre PCR en temps réel (cf. pointB.5. Sélection des fluorophores appropriés).• Lorsque la procédure d’extraction est terminée, placez l’ADN sur de la glace avant del’utiliser (ou à - 20°C pour un stockage de plus de 24h).• Placez le tube du contrôle positif Mycoplasma pneumoniae & Chlamydophila pneumoniae(pour un stockage à long terme) sur de la glace.NB :Si les échantillons extraits restent à température ambiante pour une longue période, l’ADN peutse dégrader. Si l’ADN est dégradé, la sensibilité de la PCR sera amoindrie!Si le tube de contrôle positif du Mycoplasma pneumoniae & Chlamydophila pneumoniaeest à température ambiante pendant une longue période (> 24 heures), le contrôle positifpeut être dégradé et influencer les résultats obtenus!A.2. Procédure de la PCRVeuillez réaliser la procédure dans une zone de confinement adaptée.(cf. point B.3. Préparation de la réaction PCR)Mastermix suggérés :Optima DU Master Mix 5 x DNA (réf :GMO-DAMMDU5-100) (Diagenode) (non fourni)Optima Ro Master Mix 2X DNA (réf: GMO-DAMMRO2-100) (Diagenode) (non fourni)Quantifast Multiplex + R kit (réf. : 204756), Qiagen (non fourni) (cf. point B.3. Préparation de laréaction PCR)Europe Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com


PAGE 9NB :Rotor-Gene Multiplex PCR Kit (Qiagen) (non fourni) pour Qiagen Rotor-GeneLightCycler ® TaqMan ® Master (Roche) (non fourni) pour LightCycler 2.0 (Lc2.0)Suivez les étapes suivantes:• Placez la trousse de PCR en temps réel du Mycoplasma/Chlamydophila pneumoniae àtempérature ambiante: le tube mauve (amorces & sonde d'hydrolyse duMycoplasma/Chlamydophila pneumoniae), le tube bleu foncé (ddH2O) de la pochettedes amorces/sondes.• Placez le Mastermix sur de la glace.NB :Centrifugez brièvement toutes les solutions lorsqu’elles sont dégelées et homogénéisez cesdernières à l'aide d'une pipette.• Sélectionnez le protocole approprié en fonction du système PCR en temps réel utilisé(Cf.point B.3. Préparation de la réaction PCR) et préparez les mélanges sansl’échantillon et/ou le contrôle positif Mycoplasma/Chlamydophila pneumoniae.NB :Préparer le même mélange pour tous les échantillons.Pour valider le test, vous devez réaliser une PCR sur un contrôle négatif (H 2 O PCR grade) et unePCR sur le contrôle positif Diagenode.Si DIA-EIC/DNA-050 n’est pas utilisé, remplacez les amorces et les sondes d’hydrolyse du contrôled’extraction d’ADN & d’inhibition PCR par ddH20.• Distribuez les mélanges préparés dans les tubes/capillaires appropriés ou sur une plaque96• Ajoutez-y les échantillons, le contrôle positif de Diagenode (même volume que leséchantillons).• Fermez les tubes/capillaires ou la plaque.NB :Si les tubes (mauves) d’amorces et de sondes d’hydrolyse Mycoplasma pneumoniae &Chlamydophila pneumoniae sont à température ambiante pendant une longue période, lesamorces et les sondes peuvent être dégradées et influencer les résultats obtenus!A.3. Amplification et procédures des systèmes en temps réelVeuillez réaliser la procédure dans une zone de confinement adaptée.Diagenode conçoit et valide des trousses adaptées aux systèmes PCR en temps réel ABI / Roche/Biorad/ Qiagen/ Stratagene/ Cepheid.Suivez les instructions du fabricant avant d’utiliser les systèmes de PCR en temps réel.Suivez les étapes suivantes:• Placez les tubes/capillaires ou la plaqu,e fermés dans le système en temps réel.• Sélectionnez le cycle PCR (cf. point B.4. Cycle PCR).• Sélectionnez les fluorophores adaptés au système en temps réel (cf. point B.5. Sélectiondes fluorophores appropriés).www.diagenodediagnostics.com


DIAGENODE Mycoplasma/ Chlamydophila pneumoniae PCR EN TEMPS REEL MANUEL D'UTILISATION• Entrez le nom et la position des échantillons dans le logiciel.• Démarrez le test.A.4. Interprétation des résultats (cf. point B.6. Interprétation des résultats)Suivez les instructions du fabricant pour analyser les résultats.Suivez les étapes suivantes:• Analysez le fluorophore FAM (Mycoplasma pneumoniae), fluorophore Yellow (Chlamydophilapneumoniae) et le fluorophore Orange/ Texas red/ Cy5 (Contrôle d'extraction d’ADN etd’inhibition) séparément (cf. point B .6. Interprétation des résultats):- Contrôle négatif: le signal FAM ne doit pas apparaître.- Contrôle positif: les signaux FAM et Yellow doivent apparaître, valeur Ct/Cp ± 30 (enfonction du système en temps réel utilisé pour Mycoplasma pneumoniae et Chlamydophilapneumoniae).- Pour les échantillons inconnus:• L’apparition du signal FAM indique que l’échantillon est positif au Mycoplasmapneumoniae.• L’absence du signal FAM indique que l’échantillon est négatif au Mycoplasmapneumoniae.• L’apparition du signal Yellow indique que l’échantillon est positif au Chlamydophilapneumoniae.• L’absence du signe Yellow indique que l’échantillon est négatif au Chlamydophilapneumoniae.En cas d’absence des signaux FAM et Yellow:N.B.• Un signal Orange/Texas red/Cy5 au-dessus du seuil (Threshold), 27 ≤ valeur ≤ 36, doit êtreconsidéré comme positif pour le contrôle d'extraction d’ADN et d’inhibition PCR.L’échantillon est valide.• Un signal Orange/Texas red/Cy5 en dessous du seuil (Threshold) doit être considérécomme négatif pour le contrôle d'extraction d’ADN et d’inhibition PCR. L’échantillon n’estpas valide. Recommencez la procédure d’extraction d’ADN et/ou la procédure PCR.Si la valeur Ct du contrôle d’extraction d’ADN & d’inhibition PCR (DIA-EIC/DNA-050) se situe ≥ 36:I. Premièrement, nous suggérons fortement de réaliser à nouveau la PCR en diluantl’échantillon 10x afin d’exclure au maximum les facteurs inhibiteurs.II.Deuxièmement, si l’erreur persiste, nous recommandons vivement de réaliser à nouveau laprocédure d’extraction et/ou de réaliser une autre procédure d’extraction plus appropriée.• Sélectionnez le document de rapport pour obtenir un résumé des résultats Ct/Cp et descourbes.Europe Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com


PAGE 11B. Annexes de la procédure (points I-II-III-IV-V-VI) :B.1. Contrôle d'extraction d’ADN & d’inhibition (facultatif)Le contrôle d'extraction d’ADN & d’inhibition de Diagenode est une culture virale contenant unecharge virale de 1.000 TCID50/ml.Procédure:Le contrôle d’extraction d’ADN & d’inhibition est un virus complet, gardant son pouvoirinfectieux. Ce virus est répertorié dans la classe Ea1* établie par l’EFB (EuropeanFederation of Biotechnologies).Ce virus n’est pas considéré comme dangereux pour l’homme, mais doit être manipulésous une hotte à flux laminaire.*(plus de détails à la fin de ce manuel)• 10 μl de chaque dilution à extraire dans500 μl d’eau.• Système Nuclisens easyMAG ® (extraction"on board").• Élution dans 60 μl.• 5 μl utilisés pour la PCR.• TaqMan ® Universal PCR Mastermix(Applied Biosystems).• Tests réalisés sur ABI Prism ® 7000(Applied Biosystems).La valeur Ct pour 1.000 TCID50/ml est de ± 28,5. La figure ci-dessus montre également lesrésultats d’autres dilutions (100 TCID50/ml à ± 31,5 et 10 TCID50/ml à ± 35).Pour l’extraction d’échantillons/l’isolation d’ADN, ajoutez 10µl de culture virale ADN ducontrôle d'extraction (IC) dans l’échantillon avant de lancer la procédure d’extraction.(La concentration peut être modifiée afin d’adapter la PCR multiplexe à la méthode d’extractionutilisée.)www.diagenodediagnostics.com


DIAGENODE Mycoplasma/ Chlamydophila pneumoniae PCR EN TEMPS REEL MANUEL D'UTILISATIONB.2. Extraction d’échantillons/Isolation d’ADNDiagenode suggère les méthodes d’extraction suivantes:o Nuclisens EASYMAG ® System (Biomerieux)Échantillons cliniques Lavages broncho-alvéolaires, expectorations, écouvillonnages du nasopharynx.Suivez les instructions du fabricant qui suivent :Volume de l’échantillon humain à extraire : 250 µl (+ 10 μl de DIA-EIC/DNA-050, si vous utilisezle contrôle d’extraction d’ADN & d’inhibition)Volume d’isolation de l’ADN : 60 µlLa procédure suivante de pré-extraction est recommandée :Lavage broncho-alvéolaire (BAL) :NB :• 250 µl d’expectoration entière• Ajoutez 250 µl de tampon avec de la protéinase K (1mg/ml protéinase K, 0,5% SDS, 20 mMTris – HCl, pH 8.3), vortexProtéinase K (100 mg), Merck, réf : 1.24568.0100• Faites incuber pendant 60 minutes à 55°C• Utilisez l’expectoration totale de 500 µl pour la procédure d’extraction (Nuclisens Lysis Buffer)o MagNa pue LC system, Roche : MagNa pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (Réf :03038505001)Échantillons cliniques: lavages broncho-alvéolaires, expectorations, écouvillonnages du nasopharynx.Suivez les instructions du fabricant qui suivent :Volume de l’échantillon humain à extraire : 200 µl (+ 10 μl de DIA-EIC/DNA-050, si vous utilisezle contrôle d’extraction d’ADN & d’inhibition)Volume d’élution d’ADN : 100 µlLa procédure suivante de pré-extraction est recommandée :Lavage broncho-alvéolaire (BAL) :NB :• Ajoutez 3 volumes de sputolysin (1 :10) avec 1 volume d’échantillon BAL, vortex.Sputolysin, Calbiochem, réf. : 560000Avant d’utiliser sputolysin, la solution doit être diluée 10X avec le d’eau exempte d’ADN/ARNase.• Faites incuber pendant 15 minutes à température ambiante• Centrifugez 5 minutes à 1500 rpm• Retirez complètement et débarrassez-vous du liquide surnageant• Le pellet est complètement en suspension avec 200 µl de substance tampon stérile TEEurope Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com


PAGE 13oQIAamp DNA mini Ki t(50) (Blood and Body Fluid Spin Protocol)(Qiagen Ref. 511304)Échantillons cliniques: lavages broncho-alvéolaires, expectorations, écouvillonnages du nasopharynx.Suivez les instructions du fabricant qui suivent :Volume d’échantillon humain à extraire : 200 µl (+ 10 μl de DIA-EIC/DNA-050, si vous utilisez lecontrôle d’extraction d’ADN & d’inhibition)Volume d’isolation de l’ADN : 60 µlInformation générale concernant l’extraction:Si vous réalisez la PCR le même jour, l’ADN extrait peut être conservé sur de la glace. Pour unepériode de conservation plus longue, l’ADN doit être stocké à -20°C.www.diagenodediagnostics.com


DIAGENODE Mycoplasma/ Chlamydophila pneumoniae PCR EN TEMPS REEL MANUEL D'UTILISATIONB.3. Préparation de la réaction PCR(ABI 7000-7300-7500-7900HT/ Roche Lc480-Lc2.0/ Biorad iCycler-IQ5-CFX96/ StratageneMC3000P-3500P/ Qiagen Rotor-Gene/ Cepheid SmartCycler IIAvec: Quantifast Multiplex + R kit (réf. : 204756), Qiagen (non fourni)Optima DU Master Mix 5 x DNA (réf :GMO-DAMMDU5-100) (Diagenode) (non fourni)Optima Ro Master Mix 2X DNA (réf: GMO-DAMMRO2-100) (Diagenode) (non fourni)NB :Pour le Qiagen Rotor-Gene, nous recommandons la pochette PCR de Rotor-Gene Multiplex, Qiagen(non fourni) (réf. : 204774)Pour le LightCycler2.0 (Lc2.0), nous recommandons tout particulièrement LightCycler ® TaqMan ®Master, Roche (non fourni) (réf. : 04535286001).Pour Cepheid SmartCycler II, nous recommandons le GMO-DAMMDU5-100 et du tampon(Diagenode), MgCl 2 0,5 µl (non fourni)• PCR 50 μl25 µl …………………………………. 2X mastermix5 µl …………………………………… Amorces et sondes d’hydrolyse MCpn de Diagenode5 µl……………………………………. Amorces et sondes d’hydrolyse de l’EIC de Diagenode10 µl …………………………………. Echantillon humain (ou contrôle positif de Mycoplasmapneumoniae et Chlamydophila pneumoniae)5 µl …………………………………… Eau Diagenode50 µl …………………………………. Volume finalNB :Avec le système ABI, vous pouvez ajouter 1 μl de solution ROX (Qiagen).• PCR 25 µl:12,5 µl …………………………………. 2X mastermix2,5 µl ………………………………… Amorces et sondes d’hydrolyse MCpn de Diagenode2,5 µl……………………………… … Amorces et sondes d’hydrolyse de l’EIC de Diagenode10 µl …………………………………Echantillon humain (ou contrôle positif de Mycoplasmapneumoniae et Chlamydophila pneumoniae)2,5 µl ………………………………… Eau Diagenode25 µl …………………………………. Volume final• PCR 25 μl(Pour Cepheid SmartCycler II)5 µl ……………………………..…… 5X MM GMO-DAMMDU5-1002.5 µl …………………………………… Amorces et sondes d’hydrolyse MCpn de Diagenode2.5 µl……………………………………. Amorces et sondes d’hydrolyse de l’EIC de Diagenode10 µl …………………………………....Echantillon humain (ou contrôle positif)5 µl…………………………………....Diagenode Buffer25 µl …………………………………….Volume final+ 0.5 µl …………………………………… MgCl 2Europe Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com


PAGE 15• PCR 20 μl(Roche Lc2.0)Attention4 µl …………………………………… 5X mastermix2 µl …………………………………… Amorces et sondes d’hydrolyse MCpn de Diagenode2 µl……………………………………. Amorces et sondes d’hydrolyse de l’EIC de Diagenode10 µl …………………………………. Echantillon humain (ou contrôle positif de Mycoplasmapneumoniae et Chlamydophila pneumoniae)2 µl …………………………………… Eau Diagenode20 µl …………………………………. Volume finalNB :Avec le système Roche LC2.0, les amorces et les sondes d’hydrolyse du contrôle d’extractiond’ADN et d’inhibition PCR de Diagenode (fluorophore jaune) ne peuvent pas être utilisées dans lemême capillaire. Vous aurez besoin d’un deuxième capillaire.Il faut préparer un nouveau mélange pour chaque nouveau test PCR. Le Mastermix (non fourni) et lesamorces/sondes fournies dans la trousse doivent être placées sur de la glace pendant toute l’étape depréparation de la PCR.www.diagenodediagnostics.com


DIAGENODE Mycoplasma/ Chlamydophila pneumoniae PCR EN TEMPS REEL MANUEL D'UTILISATIONB.4. Programme PCR‣ ABI 7000-7300-7500-7900HT/ Roche Lc480/ Biorad iCycler-IQ5- CFX96/ StratageneMX3000P-3005P/ Qiagen Rotor-Gene)NiveauDescription1 2 minutes à 50°C (1 cycle)2 10 minutes à 95°C (1 cycle)3 Programme du cycle (45 cycles)- Étape 1 : 15 secondes à 95°C- Étape 2 : 60 secondes à 60°CNB :Lors de la deuxième étape du niveau 3, il est fortement recommandé de diminuer la vitesse de changementde température (°C/s) de 50%.‣ Roche Lc2.0NiveauDescription1 10 minutes à 95°C (1 cycle)2 Programme du cycle (45 cycles)Étape 1 : 10 secondes à 95°CÉtape 2 : 40 secondes à 60°CÉtape 3 : 1 seconde à 72°C3 30 secondes à 40°C (1 cycle)‣ Cepheid SmartCyclcer IINiveau Description1 2 minutes à 50°C (1 cycle)2 10 minutes à 95°C (1 cycle)3 Programme du cycle (45 cycles)Étape 1 : 15 secondes à 95°CÉtape 2 : 30 secondes à 60°C30 secondes à 68°CEurope Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com


PAGE 17B.5. Sélection des fluorophores appropriés• ABI 7000-7300-7500-7900HTNom du détecteur Émetteur AbsorbeurMycoplasma pneumoniae FAM FAM (aucun)Chlamydophila pneumoniae Yellow Dye Vic (aucun)DIA-EIC/DNA(DR)-050 Orange dye NED (aucun)DIA-EIC/DNA(Cy5)-050 Cy5 Cy5 (aucun)Sélectionnez la référence passe : ROX (si vous utilisez un Mastermix avec ROX)Sélectionnez la référence passive: néant (si vous utilisez un Mastermix sans ROX).DIA-DNA/EIC(DR)-050 : ABI 7000 or 7300 or 7500 or 7900DIA-DNA/EIC(Cy5)-050 : ABI 7500• Roche Lc480-Lc2.0Nom du détecteur Émetteur AbsorbeurMycoplasma pneumoniae FAM FAM (aucun)Chlamydophila pneumoniae Yellow dye Vic/Hex (aucun)DIA-EIC/DNA(Cy5)-050 Cy5 Vic/Hex (aucun)Pour le LC 2.0, utilisez le DIA-EIC/DNA(YD)-050 dans un second capillaire.N.BAvant d’utiliser notre trousse PCR en temps réel sur le système Roche LightCycler 480 ou 2.0, vousdevez créer un fichier de compensation pour les fluorophores spécifiques à l’application.• Biorad iCycler-IQ5-CFX96Nom du détecteur Émetteur AbsorbeurMycoplasma pneumoniae FAM FAM (aucun)Chlamydophila pneumoniae Yellow dye Vic/Hex (aucun)DIA-EIC/DNA(Cy5)-050 Cy5 Cy5 (aucun)• Stratagene MX3000P-3005PNom duÉmetteur AbsorbeurdétecteurMycoplasma pneumoniae FAM FAM (aucun)Chlamydophila pneumoniae Yellow dye Vic/Hex (aucun)DIA-DNA/EIC(Cy5)-050 Cy5 Cy5 (aucun)NB :Dans les paramètres « Filter Set Gain Settings » :- FAM : sélectionnez x8- Hex/JOE (Yellow Dye) : x2- Cy5 : sélectionnez x4www.diagenodediagnostics.com


DIAGENODE Mycoplasma/ Chlamydophila pneumoniae PCR EN TEMPS REEL MANUEL D'UTILISATION• Qiagen Rotor-GeneNom du détecteurMycoplasma pneumoniae FAM VertCanalChlamydophila pneumoniae Yellow dye JauneDIA-DNA/EIC(Cy5)-050 Cy5 RougeNB :Réalisez une optimisation à 60 degrés au début de chaque test pour les canaux verts et rouges.• Cepheid SmartCycler IINom du détecteur Émetteur AbsorbeurMycoplasma pneumoniae FAM FA (aucun)Chlamydophila pneumoniae Yellow dye Alexa532 (aucun)DIA-DNA/EIC(TR)-050 Texas red Texas red (aucun)B.6. Interprétation des résultatsMycoplasmapneumoniaeDétection du signalFAMSignal au-dessus duseuilSignal en dessous duseuilSignal au-dessus duseuilSignal en dessous duseuilSignal en dessous duseuilChlamydophilapneumoniaeDétection du signalYellow dyeSignal en dessous duseuilSignal au-dessus duseuilSignal au-dessus duseuilSignal en dessous duseuilSignal en dessous duseuilContrôle d’extractiond’ADN et d’inhibitionDétection du signalOrange dyeTexas redCy5Signal au-dessus ou endessous du seuilSignal au-dessus ou endessous du seuilSignal au-dessus ou endessous du seuilSignal au-dessus duseuilSignal en dessous duseuilInterprétation des résultatsL’échantillon est positif :Mycoplasma pneumoniaeL’échantillon est négatif :Chlamydophila pneumoniaeL’échantillon est négatif :Mycoplasma pneumoniaeL’échantillon est positif :Chlamydophila pneumoniaeL’échantillon est positif :Mycoplasma pneumoniaeChlamydophila pneumoniaeL’échantillon est négatif :Mycoplasma pneumoniaeChlamydophila pneumoniaeLe test est invalide.Cf le guide de résolution desproblèmes.Europe Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com


PAGE 19Guide de résolution des problèmes• Isolation de l’acide nucléiqueRéférez-vous à la mention du fabricant concernant le produit.N.BRéalisez l’entretien des postes de travail pour l’extraction automatisée (en fonction desrecommandations du fabricant). Vérifiez la date d’expiration et les conditions de stockage dessolutions fournies.• PCRLe signal détecté pour le contrôle positif du Mycoplasma pneumoniae et Chlomydophilapneumoniae, le contrôle d'extraction d’ ADN & d'inhibition de la PCR sont négatifs ou faibles.Les conditions de la PCR ne sont pas conformes au protocole.1. Vérifiez la procédure d’extraction.Il est important de sélectionner la procédure d’extraction appropriée. La procédure d’extractiondoit être validée et limiter la présence de facteurs inhibiteurs.2. Vérifiez la préparation de la réaction PCR.Pour obtenir une haute sensibilité, vous devez respecter les volumes décrits et les Mastermixsuggérés.NB :Vérifiez l’étalonnage des pipettes utilisées (en fonction des recommandations du fabricant).Vérifiez la date d’expiration et les conditions de stockage des mastermix suggérés.4. Vérifiez le cycle de PCR.Pour obtenir une haute sensibilité, suivez le protocole adapté à la machine PCR en temps réelutilisée.5. Vérifiez les fluorophores sélectionnés.Vérifiez et sélectionnez les fluorophores adaptés à chaque plate-forme PCR en temps réel.6. Interprétation des résultats.Vérifiez le tableau et sélectionnez le canal approprié.Remarque importante:Vérifiez les conditions de stockage (pendant et après l’expérience) et la date d’expiration.Ces deux conditions influencent fortement les résultats obtenus.• Système de PCR en temps réelRéférez-vous à la mention du fabricant concernant le produit.NB :Réalisez l’entretien de la plateforme PCR en temps réel (en fonction des recommandations dufabricant).Pour tout problème/question, veuillez nous contacter:Tél. : +32 4 364 20 50 / info@diagenodediagnostics .comwww.diagenodediagnostics.com


DIAGENODE Mycoplasma/ Chlamydophila pneumoniae PCR EN TEMPS REEL MANUEL D'UTILISATIONÉvaluation des performances1. Sensibilié analytiqueL’ADN de « “Two Quality Control Exercises Involving Nucleic Acid Amplification Methods fordetection of Mycoplasma pneumoniae and Chlamydophila pneumoniae and Carried Out 2 YearsApart (in 2002 and 2004)” (Loens, Beck et al.2006) a été extrait avec le système NucleisenseasyMAG ® (Biomerieux) (cf: point B.2.: Extraction d’échantillons/Isolation d’ADN) et a été soumisà une amplification PCR. Une dilution a été jugée positive si le fluorophore correspondantdépassait le seuil comme établi par le programme de détection ABI 7000 (Applied Biosystems).Les résultats suivants ont été obtenus:OrganismeLimite de la détectionMycoplasma pneumoniaz 500 CCU/100 µlChlamydophila pneumoniae 49 IFU/100 µl2. Spécificité analytiqueLes amorces et sondes spécifiques ont été choisies à partir de la littérature (Templeton,Scheltinga et al.2003; Welti, Jaton et al.2003; Templeton, Scheltinga et al.2005; Loens,Beck et al.2006). Une vérification de possibles homologies entre les amorces et les sondesspécifiques et d’autres séquences connues a également été effectuée par analyse comparativede.séquence. Les amorces et les sondes sont utilisées au quotidien dans les laboratoires dediagnostic clinique pour les liquides broncho-alvéolaires humains, les expectorations et lescuretages.La séquence de contrôle interne a également été contrôlée par analyse de séquence.Des tests de réactions croisées ont également été effectués avec les virus suivants :ArchanobacteriumpyogenesHaemophilusinfluenzaeProteus mirabilis StaphylococcussaprophyticusCandida albicans HaemophilusparainfluenzaeProteus vulgaris StreptococcusagalactiaeCitrobacter freundii KlebsiellaSalmonella typhi Virus varicelle-zonapneumoniaeClostridiumLegionella Serratia marcescens Streptococcus mitissporogenespneumophilaEnterobacter cloacae Moraxella catarrhalis Shigella sonei StreptococcuspneumoniaeEnterococcus faecalis Neisseria meningitidis Staphylococcus Adenovirus 3epidermidisCytomegalovirus Virus d’Epstein barr Herpes simplex type 1 Herpes simplex type 2Europe Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com


PAGE 21Restrictions concernant l’utilisation du produit• Tous les réactifs doivent servir exclusivement au diagnostic in vitro.• Le respect strict du manuel d’utilisation est nécessaire pour obtenir des résultats optimaux.• La fiabilité des résultats dépend du prélèvement, du transport, du stockage et desprocédures de traitement adéquates des échantillons.• Ce test a été validé pour utilisation avec : lavage broncho-alvolaire, liquide vésiculaire,liquide oculaire, curetage cornéen, liquide céphalorachidien, liquide amniotique, plasma,sérum, biopsie/tissu.• Le test a été validé avec les systèmes PCR en temps réel ABI 7000-7300-7500-7900HT/Roche Lc480-Lc2.0 / Biorad iCycler-IQ5-CFX96 / Stratagene MX3000P-3500P /Qiagen Rotor-Gene / Cepheid SmartCycler II.Contrôle qualitéDiagenode a obtenu les certifications ISO 9001 et ISO 13485 pour la conception, la production etla vente d’instrument de diagnostic in vitro utilisant la technologie des acides nucléiques pour lesmaladies infectieuses.La PCR en temps réel du Mycoplasma/Chlamydophila pneumoniae est testée en fonction despécifications prédéterminées pour assurer la qualité du produit.RéférencesLoens, K., T. Beck, et al. (2006). "Two quality control exercises involving nucleic acidamplification methods for detection of Mycoplasma pneumoniae and Chlamydophilapneumoniae and carried out 2 years apart (in 2002 and 2004)." J Clin Microbiol 44(3): 899-908.Templeton, K. E., S. A. Scheltinga, et al. (2003). "Comparison and evaluation of real-time PCR,real-time nucleic acid sequence-based amplification, conventional PCR, and serology fordiagnosis of Mycoplasma pneumoniae." J Clin Microbiol 41(9): 4366-71.Templeton, K. E., S. A. Scheltinga, et al. (2005). "Improved diagnosis of the etiology ofcommunity-acquired pneumonia with real-time polymerase chain reaction." Clin Infect Dis41(3): 345-51.Welti, M., K. Jaton, et al. (2003). "Development of a multiplex real-time quantitative PCR assayto detect Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila and Mycoplasma pneumoniae inrespiratory tract secretions." Diagn Microbiol Infect Dis 45(2): 85-95.www.diagenodediagnostics.com


DIAGENODE Mycoplasma/ Chlamydophila pneumoniae PCR EN TEMPS REEL MANUEL D'UTILISATIONExplication des symbolesRéférenceNuméro de lotNombre d'expériencesTempérature de conservationyyyy-mmDate d'expirationDispositif médical de diagnostic In vitroSe référer au manuel d'utilisationRisque biologiqueContrôleContrôle négatifContrôle positifÀ protéger de la lumièreFabriquantEurope Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 - 3 e étage // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: info@diagenode.com


PAGE 23Avis à l’acheteurCe produit est optimisé dans le cadre d’un usage dans la réaction en chaine par polymérase (PCR)couverte par les licences de Roche Molecular Systems, Inc. et F. Hoffmann-La Roche ltd. (Roche).Aucune autorisation relative à ces licences pour l’usage du procédé de PCR ne peut être transféréeexpressément ou par implication de l’acheteur suite à l’achat de ce produit. L’autorisation d’utiliser leprocédé de PCR dans certaines recherches et activités de développement implique l’achat de certainsréactifs chez les fournisseurs agréés, lorsqu’ils sont utilisés en combinaison avec un thermocycleuragréé et sont disponibles chez Applied Biosystems. Pour plus d’informations concernant l’achat deslicences autorisant le procédé de PCR, contactez le responsable des licences chez AppliedBiosystems, 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404 ou chez Roche Molecular Systems,Inc, 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California 94501.• ABI (Applied Biosystems) Prism 7000 ou 7300 ou 7500 ou 7900HT sont des marquescommerciales de Applera Corporation.• Roche LightCycler 480 et 2.0 sont des marques commerciales de Roche.• Biorad iCycler ou IQ5 ou CFX96 sont des marques commerciales de Biorad.• Stratagene MX3000P ou 3500P sont des marques commerciales de Stratagene.• Qiagen Rotor-Gene est une marque commerciale de Qiagen.• Cepheid SmartCycler II est une marque commerciale de Cepheid.• Nuclisens EASYMAG System est une marque commerciale de Biomerieux.• MagNa pure LC system est une marque commerciale de Roche.• QIAamp UltraSens Virus Kit (50) est une marque commerciale de Qiagen.• Quantifast Multiplex+R kit est une marque commerciale de Qiagen.• Optima DU Master Mix 5x DNA est une marque commerciale de Diagenode.• Optima Ro Master Mix 2X DNA est une marque commerciale de Diagenode* Classe Ea1: virus pouvant provoquer des maladies chez les animaux et présentantles caractéristiques suivantes (à des degrés divers): importance géographique limitée,transmissibilité interespèce faible, vecteur ou porteur inexistant.Il ne nécessitegénéralement aucune mesure de confinement particulière. Il existe habituellement uneprophylaxie et/ou un traitement efficace.MA-MCpn-FR-V1_20_11_12www.diagenodediagnostics.com


Diagenode saCHU, Tour GIGA, 3e étageAvenue de l’hôpital, 14000 Liège – BELGIUMTel. +32 4 364 20 50info@diagenodediagnostics.comwww.diagenodediagnostics.com

More magazines by this user
Similar magazines