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COURS chromatographie liquide
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La chromatographie liquide
I. Généralités sur la chromatographie
1. Description
2. Paramètres intervenant dans la séparation
3. Tableau résumé des différents types de chromatographie
4. Les supports ou matrices pour phases stationnaires
II. Chromatographie d'échange d'ions
1. Les différents types d'échangeurs d'ions
2. Principe
III. Chromatographie d'exclusion ou filtration sur gel
1. Remarque préliminaire
2. Principe
3. Détermination de la masse molaire d'une molécule
IV. Chromatographie d'affinité
1. Principe et applications
2. Structure de gels d'affinité - Activation du gel pour le couplage du ligand - Bras espaceurs
V. Interactions hydrophobes
V.A. Chromatographie à polarité de phase inversée ou en phase reverse
1. Structure du gel de silice
2. Principe de l'adsorption et de la désorption en phase reverse
3. Exemples d'application
V.B. Chromatographie d'interactions hydrophobes
1. Principe
2. Quelques particularités de la chromatographie d'interactions hydrophobes
VI. Chromatographie de partage et chromatographie d'adsorption
VII. Avantages et inconvénients des différents types de chromatographie liquide / solide
I. Généralités sur la chromatographie.
1. Description :
La chromatographie est une technique d'analyse pour séparer les constituants d'un mélange ;
les molécules à séparer sont entraînées par un fluide (un liquide ou un gaz) que l'on appelle la phase mobile ;
elles interagissent ou au contraire n'interagissent pas avec un support (ou matrice) fixe (un solide ou un liquide fixé) que l'on
appelle la phase stationnaire : il y a donc une distribution ou partition des composants entre ces deux types de phase ;
le flux du fluide vecteur étant continu, c'est la rétention plus ou moins longue des différentes molécules sur le support fixe, qui va les
séparer les unes des autres.
Historiquement, c'est au russe Mikhaïl Semenovivch Tswett (1872 - 1919) que l'on doit la première publication (1906) de travaux de
chromatographie, ayant utilisé cette technique pour séparer les pigments d'épinard (voir historique 1 et historique 2 de la
chromatographie). Le mot chromatographie vient du grec "kroma"" (couleur) et "graphein"" (écrire).
Remarque : Il existe un site extrêmement complet sur cette méthode (et bien d'autres)": "Techniques de l'Ingénieur".
2. Paramètres intervenant dans la séparation.
Les paramètres physico-chimiques sur lesquels reposent les principes de séparation sont :
paramètres type de chromatographie domaine d'application
la charge électrique
échange d'ions
protéines
polypeptides
acides aminés
acides nucléiques
sucres
la taille et la forme (en fait, le volume)
l'existence de structures particulières qui permettent
d'établir des liaisons spécifiques
exclusion ou gel de filtration
affinité
protéines
polypeptides
acides nucléiques
sucres
lipides
protéines
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la polarité
et/ou
l'hydrophobicité
polarité de phase inversée
ou phase reverse
interactions hydrophobes
protéines
polypeptides
acides aminés
acides nucléiques
sucres
acides gras
protéines
Cependant, si un type de chromatographie repose sur une caractéristique physico-chimique donnée, la séparation peut être influencée de
manière "secondaire" par d'autres caractéristiques. Par exemple :
un échangeur d'ions comportant un groupement hydrophobe, comme le noyau phényl du " DOWEX ", interagit aussi par
second interactions lieu la hydrophobes séparation de : ainsi ces molécules pour 2 acides ; aminés de charge identique, l'hydrophobicité de la chaîne latérale influencera en
un gel de filtration "Sephadex" peut être utilisé comme gel d'affinité pour les protéines qui fixent les dérivés du glucose tel que le
dextran.
3. Tableau résumé des différents types de chromatographie.
phase
principe de
catatéristiques de
principe de la fixation
stationnaire
liquide
solide
séparation
partage
adsorption
adsorption
(phase inverse)
échange d'ions
exclusion
(filtration sur gel)
affinité
la phase stationnaire
liquide fixé sur un support inerte (papier,
silice...)
adsorbant solide polaire
molécules hydrophobes greffées sur de la silice
résine (polymères d'oses) porteuse de
groupements chargés négativement ou
positivement
solide poreux
support sur lequel est greffée une molécule (le
ligand) spécifiquement reconnue par un des
composants de l'échantillon à analyser
et de l'élution
distribution des composants du mélange à
séparer dans les deux phases liquides selon leur
coefficient de partage
phénomène de surface : formation de liaisons
spécifiques entre les composants et la surface
adsorbante
interactions hydrophobes et élution par
diminution de la polarité de la phase mobile
interactions électrostatiques avec les composants
de charge opposée
les composants de diamètre supérieur à celui des
billes du support sont "exclus" et ceux de
diamètre inférieur y diffusent et sont freinés
déplacement de l'équilibre de liaison [molécule -
ligand greffé] en faveur de l'équilibre [molécule -
tierce molécule]
4. Les supports ou matrices pour phases stationnaires.
Le support ou matrice utilisé pour constituer la phase stationnaire s'appelle un gel de résine. Ce gel se présente souvent sous la forme de
billes (sphériques ou, plus rarement, de forme irrégulière). Ces billes sont elles mêmes des polymères de différents types de molécules, par
exemple :
de styrène - divinylbenzène pour certaines résines d'échange d'ions ;
de polyholosides pour les gels de filtration ;
de silice pour la chromatographie en phase reverse.
Différents traitements ou modifications de ces différentes résines permettent d'obtenir tel type de phase stationnaire ou tel autre type.
II. Chromatographie d'échange d'ions.
1. Les différents types d'échangeurs d'ions.
Les échangeurs d'ions sont des billes qui portent des groupements ionisables dont la charge est :
positive : résines échangeuses d'anions
négative : résines échangeuses de cations
qui fixent des molécules chargées négativement : ---R+ ...M -
nature de la fonction ionisable : ---R+
qui fixent des molécules chargées positivement : ---R- ...M +
nature de la fonction ionisable : ---Rbase
forte base faible acide fort acide faible
ammonium quaternaire : ---NR + 3
exemple : triméthylammonium
---N(CH 3 ) + 3
forme protonnée d'une amine I, II ou III
:
---NHR + 2
exemple : diéthylaminoéthylammonium
exemple : sulfonate
---SO - 3
exemple : carboxyméthyl
---O-CH 2 -CO - 2
2. Principe.
Voir un schéma de l'ionisation de la diéthylaminoéthylammonium et carboxyméthyl en fonction du pH
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Dans un premier temps, la résine est équilibrée dans un tampon dont le pH est tel que le groupement porté par l'échangeur d'ions soit
ionisé :
dans le cas d'une base (échangeur d'anions), le pH doit être inférieur au pK a du groupement ionisable (exemple : le pK a du
groupement diéthylaminoéthylammonium est 9,5) ;
dans le cas d'un acide (échangeur de cations), le pH doit être supérieur au pK a du groupement ionisable (exemple : le pK a du
groupement carboxyméthyl est 4).
Les molécules à séparer sont dans le même tampon (donc au même pH) et en fonction de leur point isoélectrique (pI), elle porte une charge
nette :
négative : le pI de l'albumine de sérum bovin est 4,9, cette protéine est chargée négativement à pH 7 ;
nulle ;
positive : le pI du cytochrome c est 10,7, cette protéine est chargée positivement à pH 7 ;
Voir un exemple de la variation de la charge nette d'une protéine en fonction du pH.
Il y a deux manières d'éluer les molécules fixées sur la résine :
En modifiant le pH de la phase mobile de telle sorte que les molécules qui sont chargées ne le soient plus (ou qu'elles portent une
charge de même signe que l'échangeur d'ions) ; il n'y a plus alors d'interaction électrostatique entre les molécules et le groupement
chargé porté par la résine et les molécules sont éluées.
En ajoutant un sel (à une concentration croissante) qui apporte forcément un ion de même charge que les molécules fixées à la résine
: cet ion s'appelle un contre - ion.
L' ordre d'efficacité croissant des contre - ions pour les résines échangeuses de cations est le suivant :
cations monovalents : Li + < H + < Na + < NH4 +
cations divalents : Cd + 2 < Mn + 2 < Mg + 2 < Zn + 2 < Cu + 2 < Ca + 2 de plus, l'efficacité augmente avec la charge : K + < Ca + 2 < Al + 3
III. Chromatographie d'exclusion ou filtration sur gel.
1. Remarque préliminaire.
Le principe de la chromatographie d'exclusion (appelée aussi filtration sur gel ou tamisage moléculaire ou chromatographie de
perméation) repose en première approximation sur la masse molaire des molécules à séparer.
En toute rigueur, le paramètre physico-chimique qui intervient est la dimension des molécules, donc leur volume et donc plus précisément
leur rayon de Stokes. Mais cette relation univoque [masse molaire - rayon de Stokes] n'est valable que pour des protéines dites
"globulaires", c'est-à-dire assimilées à des sphères.
Différents paramètres influencent le volume des molécules et peuvent fausser la détermination de la masse molaire réelle par ce type de
chromatographie :
la géométrie : pour une même masse molaire, une protéine "allongée" (exemple, la calmoduline) n'aura pas les mêmes dimensions
qu'une protéine globulaire ;
les modifications post-traductionnelles : par exemple, les longues chaînes d'oses modifient fortement la géomètrie des protéines
glycosylées et les rend plus denses ; à l'inverse, les lipoprotéines sont "allégées" par la présence de lipides ;
la présence de sels, d'agents chaotropiques, de détergents...
2. Principe.
La phase stationnaire est constituée de billes de polysaccharides (type "Sephadex" ou "Sepharose") gonflées dans le solvant utilisé
pour l'élution :
le volume des billes est très finement calibré ;
ainsi les molécules dont le volume est supérieur à celui des billes ne peuvent y pénétrer et sont éluées rapidement ;
en revanche, les molécules dont le volume est inférieur à celui des billes y pénétrent et y subissent des frottements qui les retardent.
En conclusion, si l'on connait la masse molaire de la molécule que l'on veut séparer d'un mélange par cette technique, il faut choisir le gel
le mieux adapté : c'est celui dont le domaine de fractionnement, c'est-à-dire la gamme des masses molaires pour lesquelles il y a diffusion
partielle ou totale, englobe la masse molaire de la molécule à purifier (voir un exemple).
3. Détermination de la masse molaire d'une molécule.
Un mélange de molécules (que l'on appelle standard ) de masse molaireconnue est séparé par chromatographie de filtration sur gel (voir un
exemple de séparation) :
chaque molécule est éluée avec un volume d'élution
V ; e par ailleurs, le volume d'exclusion
du gel (V 0 ) est le volume d'élution d'une molécule non retardée par le gel, c'est-à-dire une
molécule de taille supérieure à celle des billes et qui n'y diffuse pas. Bien souvent, on utilise le bleu dextran, polymère d'ose de masse
molaire supérieure à 2 10 6 Da ;
enfin, le volume total du gel (V t ) est la somme du volume des billes et du volume externe aux billes : il est donné par le volume
d'élution d'une molécule qui diffuse totalement dans les billes et qui est donc totalement retardée.
On définit le coefficient de partition :
V e - V 0
K = -----------
D
V t - V 0
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on trace la droite étalon : log (masse molaire) = f (K D ) (ou masse molaire = f (K D ) sur une échelle semi-logarithmique
-logarithmique).
on détermine le volume d'élution d'une molécule X dans les mêmes conditions de chromatographie que pour le mélange des
standards ;
on reporte le K D de la molécule X sur la partie linéaire de la droite étalon et ainsi on détermine sa masse molaire.
IV. Chromatographie d'affinité.
1. Principe et applications.
C'est le type de chromatographie le plus sélectif , une protéine pouvant être purifiée d'un facteur 10 3 à 10 4 en une seule fois.
Le principe de la chromatographie d'affinité repose sur la reconnaissance
entre une molécule du mélange à séparer et une molécule greffée sur la
résine, que l'on appelle le ligand, ces deux molécules interagissant de
manière hautement spécifique :
l'adsorption
de la molécule à séparer sur le ligand fixé à la résine est
effectuée dans des conditions physico-chimiques (pH, force ionique,
concentration de la molécule à adsorber...) favorables ˆ la liaison
molécule - ligand ;
dans ces conditions, les molécules du mélange à séparer qui n'ont pas
(ou peu) d'affinité pour le ligand sont éluées au fur et à mesure qu'on
le fait passer sur la résine ;
on désorbe ensuite les molécules spécifiquement fixées au ligand en
modifiant les conditions physico-chimiques de telle sorte que la
liaison molécule - ligand soit rompue : le plus souvent, on ajoute une
tierce molécule qui entre en compétition avec le ligand greffé pour la
molécule à séparer.
En d'autres termes, on déplace l'équilibre de liaison molécule - [ligand
greffé] en faveur de l'équilibre molécule - [tierce molécule]. Cette tierce
molécule peut-être :
le ligand greffé lui-même (sous forme libre) à une concentration plus
élevée que celle du ligand greffé ;
une molécule dont la structure est analogue à celle du ligand greffé
mais pour laquelle la molécule a plus d'affinité.
L'une des principales applications de la chromatographie d'affinité est l'isolement de protéines ou d'acides nucléiques dont voici quelques
exemples :
ligand
protéine A (recombinante)) : protéine de Staphylococcus aureus à haute
affinité pour le fragment F c des anticorps de type IgG ;
IgG
protéine G (recombinante)) : protéine de surface des streptocoques du
groupe G, recepteur de type III du fragment F c des anticorrs de type IgG.
concanavaline A (les lectines en général ) : protéines qui se fixent sur des
résidus spécifiques de la partie osidique des glycoprotéines et qui ont des
propriétés agglutinantes (exemple : érythrocytes).
ADN natif ou dénaturé de thymus de veau
lysine
iminodiacétate : chélateur de métaux
boronate
colorants de l'industrie textile (exemple : bleu de procion ou "Cibacron
blue®") : les enzymes qui fixent les mono- ou dinucléotides puriques
interagissent avec les cycles portés par les colorants dont la structure est
très proche de celle du NAD + .
poly(U) (acide polyuridylique)
voir l'exemple du "Bleu A"
exemples de molécules isolées
IgG de mammifères
exonucléases
fixation sur des résidus
-D-mannopyranosylou
-D-glucopyranosyl
terminaux des glycoprotéines
exonucléases
polymerases (ADN, ARN)
plasminogène
ARN ribosomal
métalloprotéines
protéines à groupements cis-diol
déshydrogénases à NAD(P) +
kinases dépendantes de l'ATP
ARN messagerspar hybridation à leur queue
poly(A)
protéines se liant au poly (U) (interféron,
transcriptase inverse)
2. Structure de gels d'affinité - Activation du gel pour le couplage du ligand - Bras espaceurs.
Les supports ou matrices utilisés pour la chromatographie d'affinité peuvent être des billes d' agarose ("Sepharose", Pharmacia®), de
polyacrylamide d'agarose, de verre poreux, de polyvinyle, de polyméthacrylate ...
L'immobilisation du ligand sur la matrice nécessite qu'il soit préalablement activé, c'est-à-dire qu'il faut créer des sites réactionnels qui
permettent d'établir des liaisons covalentes. Parmi les diverses méthodes d'activation, on peut citer :
l'activation des groupes hydroxyles du support (l'agarose par exemple) par le bromure de cyanogène dans une solution dont le pH
est finement contrôlé (pH 8,3). Des groupements imidocarbonates sont formés sur lesquels on peut fixer des ligands contenant des
amines libres, par exemple une protéine par la chaîne latérale de ces lysines. Les groupes hydroxyles qui n'ont pas réagit sont
bloqués par action de l'éthanolamine ou la glycine;
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les groupes hydroxyles du support peuvent être activés par le carbonyl di-imidazole ;
l'activation du support peut être faite avec le gtutaraldéhyde qui se polymérise et forme des chaînes à 5 carbones qui constituent des
points de fixation à une certaine distance de la matrice ;
une autre méthode d'activation utilise le chlorure de tosyle et elle permet le couplage de molécules qui possèdent un groupement
aminé, thiol ou phénol.
Pour rendre certains ligands accessibles au site de fixation sur la molécule avec laquelle ils interagissent, il est nécessaire d'augmenter la
longueur de la chaîne carbonée à l'extrémité de laquelle se situe le groupement activé. Cette chaîne additive s'appelle un bras espaceur.
La chromatographie d'affinité est la méthode la plus sélective. Cependant, c'est aussi la plus délicate à mettre en oeuvre car elle nécessite
la mise au point des conditions expérimentales idoines pour obtenir un gel correctement activé :
le ligand doit être orienté de manière optimale pour une parfaite reconnaissance stéréochimique de la molécule que l'on veut séparer
;
il ne faut pas que le ligand subisse l'action des enzymes, c'est pour celà qu'on utilise davantage des analogues de substrats
(inhibiteurs compétitfs par exemple) que les substrats eux-mêmes ;
il faut trouver des conditions d'élution de la molécule fixée au ligand qui préserve sa fonction biologique ;
en conséquence, cette méthode chromatographique est coûteuse.
V. Chromatographie d'adsorption à polarité de phase inversée ou phase reverse.
V.A. Chromatographie
à polarité de phase inversée ou en phase reverse.
1. Structure du gel de silice.
Les matrices pour chromatographie en phase reverse sont souvent à base de silice (SiO 2 ), appelée aussi gel de silice car elle est plus ou
moins hyratée :
la silice provient de la déshydratation de l'acide silicique et se présente sous forme d'une poudre dont les grains (les billes) sont très
fins ;
ces billes peuvent être sphériques ou irrégulières ;
à la surface de la silice on trouve des groupes silanols (-OH) et des groupes siloxanes (-O-) qui lui confèrent un caractère polaire et
acide et qui lui permettent de former des liaisons hydrogènes ;
on utilise fréquemment une silice sur laquelle des chaînes alkylées (ou autres, voir les différents groupes utilisés) sont greffées au
niveau des groupements silanols.
2. Principe de l'adsorption et de la désorption en phase reverse.
Les chaînes alkylées confère à la silice un caractère très hydrophobe :
si la phase mobile est très polaire (donc très peu hydrophobe), certaines molécules hydrophobes vont établir des interactions
hydrophobes avec la phase stationnaire et ainsi être adsorbées ;
on augmente alors la concentration en solvant organique (apolaire donc hydrophobe) dans la phase mobile ;
à une concentration donnée l'hydrophobicité de la phase mobile étant plus importante que celle de la phase stationnaire, les
molécules hydrophobes sont désorbées et éluées.
La phase mobile est donc constituée d'un mélange eau / solvant organique, en proportion variable :
1.
2.
la phase aqueuse :
l'eau
est le solvant le plus polaire (le moins hydrophobe) ;
on ajoute un sel pour tamponner le milieu. Cependant, on emploie souvent un acide fort (l'acide trifluoroacétique) et une amine
quaternaire (la triéthylamine, par exemple) car ces deux composés ioniques forment des paires d'ions avec les molécules à séparer,
neutralisant ainsi des charges portées par ces dernières. Celà a pour conséquence d'augmenter l'hydrophobicité des molécules et
ainsi qu'elles s'adsorbent davantage sur la phase stationnaire.
le solvant organique :
il en existe un grand nombre que l'on peut utiliser puisque la silice leur résiste. Cependant, les plus employés sont l' acétonitrile et le
méthanol ;
le choix du solvant organique dépend grandement de l'hydrophobicité des molécules à séparer : pour des molécules très
hydrophobes, on peut choisir d'utiliser une forte concentration d'un solvant organique de polarité moyenne ou une faible
concentration d'un solvant organique de polarité faible ;
les solvants organiques ne doivent pas comporter d'impurétés ni avoir une forte absorbance aux faibles longueurs d'onde
(ultra-violet) pour ne pas interférer avec les propriétés optiques des molécules à séparer. De plus selon sa qualité, on peut ou non
utiliser un solvant organique pour un type d'analyse donnée. En conséquence, il faut prendre des solvants certifiés "ultra-purs" qui
coûtent chers.
3. Exemples d'application.
La chromatographie en phase reverse s'applique quasiment à tous les types de molécules. C'est une méthode de chromatographie
extrêmement t efficace qui permet de séparer des échantillons complexes.
Parmi les applications, on peut citer :
la détermination de la séquence primaire des protéines par la dégradation de Pehr Edman : la fonction
-aminée de l'acide aminé en
position N-terminale de la chaîne polypeptidique d'une protéine (ou d'un polypeptide) est traitée à pH alcalin par l'isothiocyanate
de phényle (PITC), appelé aussi réactif d'Edman. Après action d'acides et de solvant organique, la liaison peptidique liant l'acide
aminé en position N-terminale est spécifiquement coupée.
l'analyse des des acides aminés libres (voir un exemple d'application à Medicago truncatula).
Dans les deux cas, les acides aminés sont dérivés par le PITC qui incorpore un groupement qui absorbe dans l'ultra-violet. On peut ainsi
séparer, identifier et quantifier les PTH - acide aminés par chromatographie en phase reverse avec une phase stationnaire sur laquelle est
greffée une chaîne alkylée en C18 (octadécyl).
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V. B. Chromatographie
d'interactions hydrophobes.
On peut considérer que ce type de chromatographie est une "variante"" de la chromatographie en phase reverse, puisque l'adsorption des
molécules sur la phase stationnaire met en jeu le même type d'interactions. Les gels de chromatographie d'interactions hydrophobes
portent un groupement hydrophobe à l'extrémité d'une chaîne carbonée.
1. Principe.
Quand un composé hydrophobe se trouve dans un environnement polaire comme l'eau, il en résulte un état thermodynamiquement
défavorable. L'interaction hydrophobe est la conséquence de deux phénomènes opposés : une augmentation de l'entropie des molécules
d'eau autour du composé hydrophobe (c'est-à-dire une diminution de leur organisation) concomittante à une diminution de l'entropie du
composé hydrophobe.
1ère étape (voir le shéma) : On fixe la protéine à séparer sur le support chromatographique en présence d'une forte concentration en sel :
dans un milieu à haute force ionique, les molécules d'eau de l'enveloppe d'hydratation des protéines sont "mobilisées" pour
hydrater les anions et les cations issus de la dissociation du sel, c'est le phénomène de "salting -out" ;
il en résulte une modification de l'organisation des molécules d'eau autour des protéines et ce changement d'environnement est
favorable (comme celà est défini ci-dessus) à l'établissement d'interactions hydrophobes entre les régions hydrophobes à la surface
des protéines et le groupement hydrophobe porté par la phase stationnaire.
2ème étape : Après rinçage du gel afin d'éliminer les protéines non adsorbées, l'élution des protéines fixées est obtenue :
en faisant passer un tampon de force ionique décroissante, les ions du sel étant ainsi progressivement éliminés ;
les acides aminés chargés ou polaires à la surface des protéines peuvent de nouveau établir des liaisons hydrogène avec la phase
mobile, c'est-à-dire que la solubilité des protéines dans la phase mobile redevient maximale et elles sont éluées.
Il existe d'autres moyens d'éluer les protéines fixées :
ajouter un ion aux propriétés chaotropiques qui induit une diminution de l'organisation des molécules d'eau (donc une
augmentation de leur entropie) ) : la force des interactions hydrophobes est ainsi diminuée ;
ajouter un détergent / augmenter le pH / diminuer la température puisque la force des interactions hydrophobes diminue avec celle
-ci.
2. Quelques particularités de la chromatographie d'interactions hydrophobes.
Le choix de la matrice :
la densité du ligand fixé sur les matrices utilisées pour la chromatographie d'interactions hydrophobes est moindre que celle des
supports de phase reverse.
le profil d'hydrophobicité d'une protéine dépend essentiellement de la présence et de la répartition des acides aminés : Ile, Leu, Val
et Phe. Donc pour une protéine donnée, on ne peut déterminer le support de chromatographie d'interactions hydrophobes le mieux
adapté qu'en testant différents types de gels.
cependant, le meilleur choix pour commencer est un gel avec un groupement phényl. En effet, ce groupement est d'hydrophobicité
intermédiaire entre le n - butyl et le n - pentyl. Par ailleurs, les protéines très hydrophobes ne sont pas facilement éluées des gels
contenant le groupement octyl.
Les listes suivantes présentent certains anions et cations dans un ordre de moins en moins favorable à la formation d'interactions
hydrophobes :
anions : PO 3- 4 > SO4 2- >CH 3 COO- >Cl - > Br - > NO3 - > SCN -
cations : NH + 4 > Rb + > K + > Na + > Li + > Mg 2+ > Ca 2+ > Ba 2+
Remarque pratique : l'inconvénient de la chromatographie d'échange d'ions (voir le tableau comparatif) est que l'on obtient la molécule
séparée dans un tampon qui contient une forte concentration en sel et, bien souvent, on ne peut l'utiliser dans de telles conditions. Pour
éliminer le sel (ou "dessaler") on peut soit :
dialyser l'échantillon : c'est une méthode délicate qui induit beaucoup de pertes (elle(
nécessite donc d'avoir une grande quantité initiale
de matériel ) ;
enchaîner sur une chromatographie de gel de filtration (en utilisant un gel qui fractionne dans le domaine des faibles masses molaires) ) ;
enchaîner sur une chromatographie d'interactions hydrophobe puisqu'elle recquière une forte concentration en sel pour que la
molécule s'adsorbe.
VI. Chromatographie de partage et chromatographie d'adsorption.
Si l'on considère :
chromatographie de partage : liquide / liquide
deux solvants S et S 1 2 (non miscibles), S 2 étant la phase
stationnaire ;
un composant C de solubilité différentes dans chacun des
deux solvants ;
chromatographie d'adsorption: liquide / solide
La phase stationnaire est solide (adsorbant pulvérulant) et non
ionique. La concentration C 2 du composant C adsorbé par unité
de masse de phase stationnaire est donnée par la loi de Freundlich
ou loi de Langmuir :
on a :
C2 = K . C1n
(avec n inférieur ou égal à 1)
C 2
K = -------- (relation 1)
C 1
ou bien encore :
K C 2
------------ = --------
C 1-n
1 C 1
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K est le coefficient de partage entre les deux phases et il dépend de la température ;
C 1 est la concentration du composant C dans le solvant S1 ;
C 2 est la concentration du composant C dans la phase stationnaire : soit le solvant S2 (partage), soit le solide (adsorption).
En fait, la chromatographie de partage et la chromatographie l'adsorption peuvent être rapprochés :
en effet, la solubilité et l'adsorption sont deux phénomènes liés aux forces de Van der Waals et aux affinités respectives du
composant C dans chacune des deux phases ;
par ailleurs, la relation 1 n'est qu'un cas particulier de la loi de Freundlich.
VII. Avantages et inconvénients des différents types de chromatographie liquide / solide.
caractéristiques échange d'ions filtration sur gel affinité phase reverse
interactions
hydrophobes
résolution de la
séparation
concentration de la
molécule d'intérêt à l'issue
de la chromatographie
recouvrement ent de l'activité
enzymatique
capacité de rétention
(fixation) du gel
régéneration du gel
autres
moyenne à élevée
augmentée
moyenne à élevée
exceptionnelle
protéines élevée pour et les
polypeptides de
faible masse molaire
moyenne
souvent diminuée augmentée augmentée augmentée
bon bon bon
élevée
supporte l'action
d'une base forte
moyenne
domaines
d'application très
nombreux
domaines
d'application très
-------
nombreux
nécessité de
"dessaler"
permet le dessalage
l'échantillon de la
à l'issue
d'échantillons
chromatographie
élevée
ne supporte pas les
agents chimiques
agressifs
domaines
d'application
restreints
nécessité de coupler
la phase mobile
organique peut
dénaturer les
enzymes
moyenne
ne supporte pas les
agents chimiques
agressifs
domaines
d'application très
nombreux
le coût ligand élevé d'où du gel un
-------
bon
élevée
supporte l'action
d'une base forte
domaines
d'application
restreints
nécessité de
"dessaler"
l'échantillon de la
à l'issue
chromatographie
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