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COURS chromatographie liquide
http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chro...
on trace la droite étalon : log (masse molaire) = f (K D ) (ou masse molaire = f (K D ) sur une échelle semi-logarithmique
-logarithmique).
on détermine le volume d'élution d'une molécule X dans les mêmes conditions de chromatographie que pour le mélange des
standards ;
on reporte le K D de la molécule X sur la partie linéaire de la droite étalon et ainsi on détermine sa masse molaire.
IV. Chromatographie d'affinité.
1. Principe et applications.
C'est le type de chromatographie le plus sélectif , une protéine pouvant être purifiée d'un facteur 10 3 à 10 4 en une seule fois.
Le principe de la chromatographie d'affinité repose sur la reconnaissance
entre une molécule du mélange à séparer et une molécule greffée sur la
résine, que l'on appelle le ligand, ces deux molécules interagissant de
manière hautement spécifique :
l'adsorption
de la molécule à séparer sur le ligand fixé à la résine est
effectuée dans des conditions physico-chimiques (pH, force ionique,
concentration de la molécule à adsorber...) favorables ˆ la liaison
molécule - ligand ;
dans ces conditions, les molécules du mélange à séparer qui n'ont pas
(ou peu) d'affinité pour le ligand sont éluées au fur et à mesure qu'on
le fait passer sur la résine ;
on désorbe ensuite les molécules spécifiquement fixées au ligand en
modifiant les conditions physico-chimiques de telle sorte que la
liaison molécule - ligand soit rompue : le plus souvent, on ajoute une
tierce molécule qui entre en compétition avec le ligand greffé pour la
molécule à séparer.
En d'autres termes, on déplace l'équilibre de liaison molécule - [ligand
greffé] en faveur de l'équilibre molécule - [tierce molécule]. Cette tierce
molécule peut-être :
le ligand greffé lui-même (sous forme libre) à une concentration plus
élevée que celle du ligand greffé ;
une molécule dont la structure est analogue à celle du ligand greffé
mais pour laquelle la molécule a plus d'affinité.
L'une des principales applications de la chromatographie d'affinité est l'isolement de protéines ou d'acides nucléiques dont voici quelques
exemples :
ligand
protéine A (recombinante)) : protéine de Staphylococcus aureus à haute
affinité pour le fragment F c des anticorps de type IgG ;
IgG
protéine G (recombinante)) : protéine de surface des streptocoques du
groupe G, recepteur de type III du fragment F c des anticorrs de type IgG.
concanavaline A (les lectines en général ) : protéines qui se fixent sur des
résidus spécifiques de la partie osidique des glycoprotéines et qui ont des
propriétés agglutinantes (exemple : érythrocytes).
ADN natif ou dénaturé de thymus de veau
lysine
iminodiacétate : chélateur de métaux
boronate
colorants de l'industrie textile (exemple : bleu de procion ou "Cibacron
blue®") : les enzymes qui fixent les mono- ou dinucléotides puriques
interagissent avec les cycles portés par les colorants dont la structure est
très proche de celle du NAD + .
poly(U) (acide polyuridylique)
voir l'exemple du "Bleu A"
exemples de molécules isolées
IgG de mammifères
exonucléases
fixation sur des résidus
-D-mannopyranosylou
-D-glucopyranosyl
terminaux des glycoprotéines
exonucléases
polymerases (ADN, ARN)
plasminogène
ARN ribosomal
métalloprotéines
protéines à groupements cis-diol
déshydrogénases à NAD(P) +
kinases dépendantes de l'ATP
ARN messagerspar hybridation à leur queue
poly(A)
protéines se liant au poly (U) (interféron,
transcriptase inverse)
2. Structure de gels d'affinité - Activation du gel pour le couplage du ligand - Bras espaceurs.
Les supports ou matrices utilisés pour la chromatographie d'affinité peuvent être des billes d' agarose ("Sepharose", Pharmacia®), de
polyacrylamide d'agarose, de verre poreux, de polyvinyle, de polyméthacrylate ...
L'immobilisation du ligand sur la matrice nécessite qu'il soit préalablement activé, c'est-à-dire qu'il faut créer des sites réactionnels qui
permettent d'établir des liaisons covalentes. Parmi les diverses méthodes d'activation, on peut citer :
l'activation des groupes hydroxyles du support (l'agarose par exemple) par le bromure de cyanogène dans une solution dont le pH
est finement contrôlé (pH 8,3). Des groupements imidocarbonates sont formés sur lesquels on peut fixer des ligands contenant des
amines libres, par exemple une protéine par la chaîne latérale de ces lysines. Les groupes hydroxyles qui n'ont pas réagit sont
bloqués par action de l'éthanolamine ou la glycine;
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