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COURS chromatographie liquide
http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chro...
V. B. Chromatographie
d'interactions hydrophobes.
On peut considérer que ce type de chromatographie est une "variante"" de la chromatographie en phase reverse, puisque l'adsorption des
molécules sur la phase stationnaire met en jeu le même type d'interactions. Les gels de chromatographie d'interactions hydrophobes
portent un groupement hydrophobe à l'extrémité d'une chaîne carbonée.
1. Principe.
Quand un composé hydrophobe se trouve dans un environnement polaire comme l'eau, il en résulte un état thermodynamiquement
défavorable. L'interaction hydrophobe est la conséquence de deux phénomènes opposés : une augmentation de l'entropie des molécules
d'eau autour du composé hydrophobe (c'est-à-dire une diminution de leur organisation) concomittante à une diminution de l'entropie du
composé hydrophobe.
1ère étape (voir le shéma) : On fixe la protéine à séparer sur le support chromatographique en présence d'une forte concentration en sel :
dans un milieu à haute force ionique, les molécules d'eau de l'enveloppe d'hydratation des protéines sont "mobilisées" pour
hydrater les anions et les cations issus de la dissociation du sel, c'est le phénomène de "salting -out" ;
il en résulte une modification de l'organisation des molécules d'eau autour des protéines et ce changement d'environnement est
favorable (comme celà est défini ci-dessus) à l'établissement d'interactions hydrophobes entre les régions hydrophobes à la surface
des protéines et le groupement hydrophobe porté par la phase stationnaire.
2ème étape : Après rinçage du gel afin d'éliminer les protéines non adsorbées, l'élution des protéines fixées est obtenue :
en faisant passer un tampon de force ionique décroissante, les ions du sel étant ainsi progressivement éliminés ;
les acides aminés chargés ou polaires à la surface des protéines peuvent de nouveau établir des liaisons hydrogène avec la phase
mobile, c'est-à-dire que la solubilité des protéines dans la phase mobile redevient maximale et elles sont éluées.
Il existe d'autres moyens d'éluer les protéines fixées :
ajouter un ion aux propriétés chaotropiques qui induit une diminution de l'organisation des molécules d'eau (donc une
augmentation de leur entropie) ) : la force des interactions hydrophobes est ainsi diminuée ;
ajouter un détergent / augmenter le pH / diminuer la température puisque la force des interactions hydrophobes diminue avec celle
-ci.
2. Quelques particularités de la chromatographie d'interactions hydrophobes.
Le choix de la matrice :
la densité du ligand fixé sur les matrices utilisées pour la chromatographie d'interactions hydrophobes est moindre que celle des
supports de phase reverse.
le profil d'hydrophobicité d'une protéine dépend essentiellement de la présence et de la répartition des acides aminés : Ile, Leu, Val
et Phe. Donc pour une protéine donnée, on ne peut déterminer le support de chromatographie d'interactions hydrophobes le mieux
adapté qu'en testant différents types de gels.
cependant, le meilleur choix pour commencer est un gel avec un groupement phényl. En effet, ce groupement est d'hydrophobicité
intermédiaire entre le n - butyl et le n - pentyl. Par ailleurs, les protéines très hydrophobes ne sont pas facilement éluées des gels
contenant le groupement octyl.
Les listes suivantes présentent certains anions et cations dans un ordre de moins en moins favorable à la formation d'interactions
hydrophobes :
anions : PO 3- 4 > SO4 2- >CH 3 COO- >Cl - > Br - > NO3 - > SCN -
cations : NH + 4 > Rb + > K + > Na + > Li + > Mg 2+ > Ca 2+ > Ba 2+
Remarque pratique : l'inconvénient de la chromatographie d'échange d'ions (voir le tableau comparatif) est que l'on obtient la molécule
séparée dans un tampon qui contient une forte concentration en sel et, bien souvent, on ne peut l'utiliser dans de telles conditions. Pour
éliminer le sel (ou "dessaler") on peut soit :
dialyser l'échantillon : c'est une méthode délicate qui induit beaucoup de pertes (elle(
nécessite donc d'avoir une grande quantité initiale
de matériel ) ;
enchaîner sur une chromatographie de gel de filtration (en utilisant un gel qui fractionne dans le domaine des faibles masses molaires) ) ;
enchaîner sur une chromatographie d'interactions hydrophobe puisqu'elle recquière une forte concentration en sel pour que la
molécule s'adsorbe.
VI. Chromatographie de partage et chromatographie d'adsorption.
Si l'on considère :
chromatographie de partage : liquide / liquide
deux solvants S et S 1 2 (non miscibles), S 2 étant la phase
stationnaire ;
un composant C de solubilité différentes dans chacun des
deux solvants ;
chromatographie d'adsorption: liquide / solide
La phase stationnaire est solide (adsorbant pulvérulant) et non
ionique. La concentration C 2 du composant C adsorbé par unité
de masse de phase stationnaire est donnée par la loi de Freundlich
ou loi de Langmuir :
on a :
C2 = K . C1n
(avec n inférieur ou égal à 1)
C 2
K = -------- (relation 1)
C 1
ou bien encore :
K C 2
------------ = --------
C 1-n
1 C 1
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