02.07.2013 Views

Fluoreszcencia módszerek

Fluoreszcencia módszerek

Fluoreszcencia módszerek

SHOW MORE
SHOW LESS

Create successful ePaper yourself

Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.

<strong>Fluoreszcencia</strong> <strong>módszerek</strong><br />

(Kioltás, Anizotrópia, FRET)<br />

Modern Biofizikai Kutatási Módszerek<br />

2012. 11. 08.


Fotonok és molekulák ütközése<br />

Fény (foton) ütközése a molekulákkal<br />

fényszóródás<br />

abszorpció<br />

Fényelnyelés:<br />

-Egy foton energiája -> molekula energiája ( E = h / ).<br />

-Az elnyelt energia átalakul:<br />

- Hő<br />

- <strong>Fluoreszcencia</strong><br />

- Foszforeszcencia<br />

E=hν<br />

Jablonski diagramm<br />

- <strong>Fluoreszcencia</strong> kioltás és fluoreszcencia rezonancia energia transzfer


Gerjesztés<br />

A gerjesztett állapotú elektron<br />

Alap állapot<br />

lecsengési lehetőségei<br />

10 -15 s<br />

Relaxáció<br />

<strong>Fluoreszcencia</strong><br />

10 -9 s<br />

k f<br />

Kioltás vagy<br />

Energia transzfer<br />

Gerjesztett állapot<br />

k q<br />

Foszforeszcencia<br />

10 -3 s<br />

k ph<br />

k ic<br />

Internal conversion<br />

(HŐ)


<strong>Fluoreszcencia</strong> alapfogalmak<br />

• Intenzitás: az időegység alatt emittált fotonok számával arányos.<br />

• Kvantumhatásfok: Milyen hatásfokkal fordítódik az elnyelt energia<br />

fénykibocsátásra. A kibocsátott fotonok száma, osztva az elnyelt<br />

fotonok számával.<br />

• Élettartam: az az időtartam ami alatt az intenzitás az e-ed<br />

részére csökken le.<br />

k<br />

f<br />

1<br />

k<br />

nr<br />

Q<br />

f<br />

k<br />

f<br />

k<br />

f<br />

k<br />

nr


Fényforrás<br />

Gerjesztési monokromátor<br />

Minta<br />

Emissziós monokromátor<br />

Detektor<br />

A detektálás a gerjesztés síkjára merőlegesen történik!!!


<strong>Fluoreszcencia</strong> Anizotrópia<br />

• Izotróp rendszer: Irányultság szempontjából homogén rendszer.<br />

• Anizotróp rendszer: olyan rendszer, melyben vannak kitüntetett<br />

irányok.<br />

Polarizált fény: Elektromos térerősség vektor síkja a fény terjedése<br />

során nem változik.<br />

<strong>Fluoreszcencia</strong> anizotrópia: Polarizált fény segítségével az izotróp<br />

fluorofór populációt anizotróppá alakítjuk át.


Nem polarizált fény<br />

Polarizált fény<br />

Polarizátor<br />

Polarizált<br />

fény<br />

Polarizált fény: Elektromos térerősség vektor egy jól definiált síkban rezeg.


Polarizált fény abszorpciója<br />

Abszorpciós vektor:<br />

meghatározza a polarizált fény abszorpciójának valószínűségét.


Fotoszelekció<br />

Csak a megfelelő orientáltságú abszorpciós momentummal rendelkező<br />

fluorofórok gerjesztődnek a mintában! A fotoszelekciónak megfelelően, a<br />

gerjesztett állapotú fluorofórok a z tengely köré rajzolható igen kis kúpszögű (ϑ)<br />

forgás-kúpon belül helyezkednek el.


Anizotrópia meghatározás<br />

A vertikális és horizontális síkban mért intenzitások segítségével<br />

lehet meghatározni az anizotrópiát!<br />

r<br />

I<br />

I<br />

vv<br />

vv<br />

I<br />

2I<br />

vh<br />

vh


Perrin egyenlet<br />

(Francis Perrin-1926)<br />

Az anizotrópia mértéke függ a<br />

rotációs diffúziótól és az<br />

élettartamtól, amely alatt az<br />

emissziós vektor elfordul.<br />

Rotációs korrelációs idő a molekulák rotációs diffúziós<br />

képességéről ad információt!


A fluoreszcencia anizotrópia a tér három irányába emittáló fluorofórt<br />

jellemzi, vagyis az emissziós polarizáció mértéke, mellyel a molekulák<br />

rotációját lehet kimutatni.<br />

Anizotrópia<br />

Ha a fluorofór x irányba terjedő, x-z síkban vertikálisan polarizált<br />

fénnyel világítjuk meg, a fotoszelekció következtében a vertikálisan<br />

elhelyezkedő fluorofór molekulák gerjesztődnek, és a gerjesztett<br />

állapotú fluorofórok a rotációjuk következtében a z tengely köré<br />

rajzolható forgáskúpon belül helyezkednek el.<br />

• dimenziónélküli<br />

• nem függ a fluorofór koncentrációjától<br />

• a fluorofór rotációs diffúziós mozgása befolyásolja<br />

• additív !!!<br />

Normál érték: -0,2 és 0,4 között van. Ha ettől eltérőt mérünk az valami műtermék,<br />

hiba (pl.: fényszórásból).


Akalmazás<br />

• Molekulák rotációs diffúziójának meghatározása<br />

• Molekulák közti interakciók detektálása<br />

• Konformácós változások észlelése<br />

• Membránok fluiditásának meghatározása


<strong>Fluoreszcencia</strong> kioltás<br />

• A fluorofórok által kibocsátott fény intenzitásának<br />

csökkenése olyan molekulák vagy ionok jelenlétében, melyek<br />

elektronszerkezete megfelelő ahhoz, hogy a gerjesztett<br />

állapotban lévő fluorofórral „ütközve” annak gerjesztési<br />

energiáját átvegyék, majd azt valamilyen formában disszipálják<br />

(például hő).<br />

• Versengés a fluoreszcencia kibocsátása és a nem sugárzásos<br />

átmenet között csökkent fluoreszcencia emisszió.<br />

<strong>Fluoreszcencia</strong> intenzitás lecsökken!


Kinint kioltjuk klorid ionnal. Nem fog<br />

fluoreszkálni a minta.<br />

Kinin fluoreszcenciája –<br />

kéken világít


1. Statikus kioltás<br />

Kioltás típusai<br />

A kioltó és a fluorofór még a gerjesztés előtt egy komplexet (sötét<br />

komplex) alkot, mely komplex nem képes fényt emittálni.<br />

Diffúzió által nem befolyásolt!<br />

<strong>Fluoreszcencia</strong> élettartam nem érzékeny rá!<br />

Fluorofór Kioltó<br />

+ : Nincs emisszió<br />

Sötét komplex<br />

(a gerjesztés előtt jön létre)<br />

Gerjesztés


2. Dinamikus kioltás<br />

A kioltó és a fluorofór molekulák diffúziós folyamatok révén egymás<br />

közelébe kerülnek, egy ütközési komplexet hoznak létre, majd a<br />

gerjesztett fluorofór átadja az energiáját a kioltónak.<br />

Diffúzió által befolyásolt<br />

<strong>Fluoreszcencia</strong> élettartamot csökkenti!<br />

Fluorofór<br />

F 0/F= 0/<br />

+ : +<br />

Kioltó<br />

h*υ<br />

Gerjesztés<br />

Ütközési komplex<br />

(a gerjesztés után<br />

jön létre)<br />

Fluorofór Kioltó


Stern-Volmer egyenlet ( a kioltás mértékének<br />

kvantifikálása)<br />

Max Volmer (1885-1965)<br />

Otto Stern (1888-1969)<br />

Fizikai Nobel díj (1943)


Stern-Volmer egyenlet<br />

Ha a fluorofór élettartamát vizsgáljuk a kioltó<br />

koncentrációjának a függvényében, akkor lineáris összefüggést<br />

kapunk:<br />

0<br />

D<br />

τ 0 – kioltó távollétében az élettartam<br />

τ D – kioltó jelenlétében mért élettartam<br />

1 k q 1 K q<br />

0 SV<br />

K + - állandó, mely jellemzi a fluorofór és a kioltó transzportját valamint a hozzáférhetőséget.<br />

K sv – egyenes meredeksége, Stern-Volmer állandó


F 0 : fluoreszcencia intenzitás<br />

a kioltó hiányában<br />

F : fluoreszcencia intenzitás<br />

a kioltó jelenlétében<br />

K sv : Stern-Volmer állandó<br />

*Q+ : kioltó koncentrációja<br />

Stern-Volmer egyenlet<br />

F0<br />

1 K [ Q]<br />

sv<br />

F


Stern-Volmer állandó(K sv)<br />

A fluorofór hozzáférhetőségéről ad információt!<br />

Dinamikus kioltás<br />

K sv=k q* τ 0<br />

k q : bimolekuláris sebességi állandó, ami a fluorofór és a kioltó diffúziós<br />

képességével, illetve a fluorofór hozzáférhetőségével áll összefüggésben<br />

k q = 1x10 10 M -1 s -1 diffúzió kontrollált<br />

k q < 1x10 10 M -1 s -1 sztérikus lefedettség<br />

k q > 1x10 10 M -1 s -1 kötés


Módosított Stern-Volmer egyenlet<br />

(Lehrer-egyenlet)<br />

A kioltó számára nem egyformán hozzáférhető fluorofórok esetén!


Hogyan dönthető el milyen típusú<br />

kioltásról van szó?<br />

Dinamikus kioltás Statikus kioltás


Kioltók típusai<br />

1. Semleges kioltók:<br />

akrilamid, nitroxidok<br />

sztérikus viszonyok feltérképezése<br />

2. Töltéssel rendelkező kioltók:<br />

jodid, cézium, kobalt<br />

Töltés viszonyok meghatározása


Alkalmazás<br />

• Fehérjék „folding”-jának vizsgálata<br />

• Fehérjék konformációs állapotának és töltés<br />

viszonyainak feltérképezése<br />

• Membránok permeabilitása<br />

• Diffúziós állandók meghatározása<br />

Ld: később


Triptofán fluoreszcenciájának kioltása<br />

akrilamiddal


<strong>Fluoreszcencia</strong> Rezonancia Energia Transzfer<br />

(FRET) - Theodor Förster, 1948<br />

• „A Förster típusú energiatranszfer a gerjesztett állapotban<br />

lévő fluoreszkáló molekula (donor), valamint egy megfelelő<br />

spektroszkópiás követelményeket kielégítő molekula (akceptor)<br />

között dipól-dipól kölcsönhatás révén, sugárzás nélküli<br />

energiaátadás formájában jön létre.”<br />

• A gerjesztett donor relaxációja az akceptor molekula<br />

emissziója révén valósul meg!<br />

k t~1/R 6<br />

E<br />

R


A FRET feltételei<br />

• Fluoreszcens donor és akceptor molekula.<br />

• A donor és akceptor molekula közötti távolság 2-10 nm!<br />

•Megfelelő orientáció<br />

• Átfedés a donor emissziós spektruma és az akceptor<br />

abszorpciós spektruma között.


A FRET molekuláris mechanizmusa


Hogyan határozható meg a transzfer<br />

τ DA : élettartam az akceptor jelenlétében<br />

τ D : élettartam az akceptor hiányában<br />

hatásfok?<br />

F DA : fluoreszcens intenzitás az akceptor jelenlétében<br />

F D : fluoreszcens intenzitás az akceptor hiányában<br />

Donor emissziója csökken!<br />

Akceptor<br />

emissziója nő!


Energia transzfer hatásfok a donor-<br />

akceptor távolság függvényében<br />

Förster féle kritikus távolság (R 0): Az a donorakceptor<br />

távolság, aminél a transzfer hatásfok 0.5<br />

E<br />

R<br />

6<br />

0<br />

R<br />

6<br />

0<br />

R<br />

6


Förster féle kritikus távolság<br />

donor-akceptor pároknál


Energia transzfer típusai<br />

• Heterotranszfer: különböző fluorofórok között jön létre.<br />

• Homotranszfer: azonos fluorofórok között jön létre,<br />

melyeket kis Stokes eltolódás jellemez.<br />

Homotranszfer Heterotranszfer


Összefoglalás<br />

• FRET távolságok meghatározására alkalmas megfelelő<br />

donor akceptor párok esetén.<br />

• Molekulák közötti kölcsönhatások tanulmányozása.<br />

• Molekulákon belüli szerkezeti változások<br />

tanulmányozása.


FRET alkalmazások<br />

• Fehérjék interakciója<br />

• Makromolekulák asszociációs vizsgálata (pl. DNS)<br />

• Távolság mérés (molekuláris mérőszalag)<br />

• Fehérjék konformációs vizsgálat


Gyakorlati alkalmazások<br />

Aktin monomer<br />

Milyen a nukleotid kötő<br />

zsebben található fluorofór<br />

hozzáférhetősége?<br />

Cofilin<br />

ε-ATP<br />

Nukleotidkötő-zseb<br />

Profilin<br />

ε-ATP


Gyakorlati alkalmazások<br />

FRET<br />

Fehérjék konformációs változása


Fehérjék interakciója<br />

Gyakorlati alkalmazások<br />

FRET

Hooray! Your file is uploaded and ready to be published.

Saved successfully!

Ooh no, something went wrong!