Polarizáció fogalma

Kiselőadás! 

Fluoreszcencia 

polarizáció, 

anizotrópia 

FRAP 

2011.02.14. 

Polarizált fény, 

polarizáció 

Polarizáció fogalma 

• Az elektromágneses sugárzás elektromos (és mágneses) 

térerősségének vektora meghatározott görbe mentén mozog (térbeli 

irányultság!). 

• Ha a görbe egyenes: lineáris v. sík polarizáció 

• Ha a görbe kör: cirkuláris polarizáció 

• (Ha a görbe elipszis: elliptikus polarizáció) 

• A polarizálatlan fényben a polarizációs síkok keverednek. 

• A polarizált fényben a polarizációs síkok összhangban vannak 

(azonosak). 

Hogyan számolja ki egy foton energiáját és impulzusát? 

Milyen függvény szerint csökken a fény intenzitása optikailag homogén 

közegben? 

Mi az abszorpció definíciója? 

Mi a különbség fluoreszcencia és foszforeszcencia között? 

Mia különbség a gerjesztési és az abszoprciós spektrum között? 

Mi a kvantumhatásfok? 

Elektromágneses hullámok 

Polarizáció 

Lineáris polarizáció: adott pont rezgésének orientációja egy egyenesbe esik 

Cirkuláris polarizáció: adott pont rezgésének iránya egyenletesen körbejár 

Megjelenés fotózáskor! 

Miért van ilyen hatása? 

1

Polarizált fény Síkban polarizált fény 

A polarizátor 

• Definíció: A polarizátor egy olyan eszköz 

mely képes a polarizálatlan 

elektromágneses sugárzást (fény) olyan 

sugárzássá alakítani, melyben csak egyféle 

polarizációs sík van jelen. 

Hol találkoztunk már polarizátorral? 

Polarizátor elve 

2 

= max cos I I 

Korábbi ismereteink: pl. optikai aktivitás 

Optikai aktivitás: poláros fény sikját elforgatják 

Fényforrás 

Polarizátor 

Mintatartó 

• királis molekulák 

• nem kell gerjeszteni! 

α ⎡α ⎤ lc 

t 

= ⎣ λ ⎦ 

Analizátor 

Megfigyelő 

Θ 

Polariméter 

2

gerjesztés 

Polarizátor 

Polarizáció, intenzitások 

x 

z 

θ A 

Intenzitás egy adott 

irányban: 

Ι=Ι Θ 

2 

max cos 

Párhuzamos állás: 

Θ = 0°, I = Imax Merőleges állás: 

Θ = 90°, I = 0 

abszorpciós vektor: megszabja a foton abszorpciójának valószínűségét. 

E r 

E 

M A = abszorpciós vektor 

y 

Mila Zinkova: 

Minta (víz) 

Tárgylemez (üveg) 

Teljes belső visszaverődés 

mikroszkópia (TIRF) 

Teljes visszaverődés 

A fény abszorpciója Fotoszelekció 

θ A 

Nincs abszorpció (θ= 90 o ) 

Maximális abszorpció (θ= 0 o ) 

Abszorpció ~ cos 2 θ A (max=1) 

A fotoszelekció eredménye Fluoreszcencia emisszió 

gerjesztés 

I Z = I V 

E 

I x = I H 

I Y = I H 

z 

I X 

I Z 

x 

θ E 

I Y 

ME = emissziós vektor 

ME ~ Intenzitás 

y 

Detektor 

I sum = I Z + I X + I Y 

I sum = I V + I H + I H 

I sum = I Z + 2I H 

emissziós vektor: megszabja a foton emissziójának valószínűségét. 

3

Fluoreszcencia polarizáció 

Emissziós anizotrópia 

Az anizotrópia jelentése és 

alkalmazásai 

Polarizált fény 

Fluoreszcencia polarizáció 

• dimenzió nélküli 

p = (I VV -GI VH) / (I VV + GI VH) 

• nem függ a fluorofór koncentrációjától 

• a fluorofór rotációs diffúziós mozgása befolyásolja 

• nem additív !!! 

• értéke 0-tól 1-ig változhat 

• dimenzió nélküli 

Emissziós anizotrópia 

r = (I VV -GI VH) / (I VV + 2GI VH) 

• nem függ a fluorofór koncentrációjától 

• a fluorofór rotációs diffúziós mozgása befolyásolja 

• additív !!! 

• értéke 0-tól 1-ig változhat 

Fluoreszcencia emisszió 

z 

I X 

I Z 

x 

θ E 

I Y 

y 

τ 

Rotációs diffúzió 

z 

I X 

I Z 

x 

θ E 

G = I HV / I HH 

I Y 

G = I HV / I HH 

y 

Részben polarizált fény 

4

Határérték anizotrópia (r 0) 

A teljes mozdulatlan, „fagyott” fluorofór anizotrópiája. 

2 

2 ⎛ 3cos 

β −1 

⎞ 

r = ⎜ ⎟ 

0 ⎜ ⎟ 

5 ⎝ 2 ⎠ 

β: az abszorpciós és emissziós vektor által bezárt szög. 

β 

0 

45 

54.7 

90 

r0 0.4 

0.1 

0 

-0.2 

Perrin egyenlet 

r0 

r0 

r = = 

τ 

1+ 

1+ 

6Dτ 

Θ 

Alkalmazások 

x 

z 

β 

r ~ 

• r0 • 1/τ 

• Θ 

• 1/D 

Abszorpciós vektor 

Emissziós vektor 

Szerkezeti tulajdonságok vizsgálata 

• Fehérje denaturáció nyomonkövetése 

• Protein-ligand kölcsönhatás vizsgálata 

• Szerkezet vizsgálata a környezeti paraméterek (pH, ionok) 

változásának függvényében 

Dinamikus tulajdonságok vizsgálata 

• Membránhoz kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a 

membrán belsejében lévő viszkozitásról 

•Fehérjékhez kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a 

fehérjemátrix flexibilitásáról 

y 

r 

Perrin egyenlet: 

Francis Perrin - 1926 

ROTÁCIÓS DIFFÚZIÓ ⇒ flureszcencia depolarizáció 

r0 

r0 

r = = 

τ 

1+ 

1+ 

6Dτ 

Θ 

Rotációs korrelációs idő 

határérték anizotrópia 

ηV 

Θ = 

RT 

diffúziós állandó 

Az anizotrópia időfüggése 

I(t) = I 0 exp -t/τ 

r( t) 

= r0 

∑ai 

exp( −t 

/ θ ) 

Példa alkalmazásra 

t 

Mire emlékeztet az időfüggés? 

5

Dimer 

Nucleation 

De De novo novo polymerisation of actin 

Actin monomer Actin filament 

Trimer 

Kutatási kérdés 

Depolymerisation 

Elongation 

T. D. Pollard: Cell, 112, 453-465, 2003. 

Hogyan változik meg az aktin filamentumok 

szerkezete a forminok kötődésének 

hatására? 

A mérések alapelve 

bending 

monomer 

rotation 

twisting 

segmental 

motion 

longer rotational 

correlation time (ns) 

A forminok domén dom szerkezete 

GBD FH3 FH1 

FH2 

DAD 

Mammalian Diaphanous-related formins 

Formin homology (FH) domains: FH1, FH2, FH3 

Rho-GTPase binding domain (GBD): 

Autoregulation 

Diaphanous Autoregulatory domén (DAD): 

Alkalmazott módszerek m dszerek 

800 

600 

400 

200 

Fehérj Feh rjék (formin, miozin miozin, 

, aktin, a tin, tropomiozin 

tropomiozin) 

) 

prepar preparálása 

sa. 

Mérések sek fluoreszcencia anizotrópia anizotr pia lecsengés lecseng s 

módszer dszerével. vel. 

0 

shorter rotational 

correlation time (ns) 

Anisotrópia lecsengés mérése 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

0 1 2 3 4 5 

[mDia1-FH2] (μM) 

A 

0 1 2 3 4 5 


half angle (degree) 

30 

25 

20 

15 

C 

0 1 2 3 4 5 


A forminok megnövelték az aktin filamentumok flexibilitását. 

6

Hogyan értelmezhetjük az eredményeket? 

Side - binding 

End - binding 

A „Photobleaching” fogalma 

fluorofór irreverzibilis fotokémiai destrukciója 

gerjesztő fény tönkreteszi a fluoreszcens molekulát 

elkerülése: 

• anti-photobleaching oldat (pl. glükóz 

oxidáz – kataláz – merkaptoetanol) 

• expoziciós idő csökkentése 

• pulzusszerű gerjesztés 

• alacsonyabb intenzitású gerjesztő fény 

• ellenállóbb fluorofor (pl. Alexa) 

használata: 

• háttér eliminálása 

• autoquenching 

• FLIP, FRAP 

Alkalmazás 

• Membránkomponensek laterális diffúziója 

• Monomer turnover / beépülés 

• Fehérje motilitás 

• Diffúziós konstans meghatározás 

2 

ω 

D = 

4t 

1/2 

flexibility (arb. units) 

3,0 

2,5 

2,0 

1,5 

T = 30 o C 

1,0 

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 

[mDia1-FH2+linker] : [actin] 

www.microscopyu.com 

FRAP 

(„Fluorescence Recovery After Photobleaching”) 

• cél: membrán-fehérjék laterális diffúziójának 

(DL) vizsgálata 

• • Fehérjék szelektív jelölése fluorofórral 

• • Fényforrás: lézer 

• • Mikroszkóp a fluoreszcencia detektálására 

• • „Photobleaching” = fotohalványodás 

(kifehéredés) 

1. Fluoreszcens minta 

2. Meghatározott terület 

„kiégetése” (pl. lézerrel) 

3. Fluoreszcencia 

helyreállás 

4. Egyensúly beállta 

(általában: y < x) 

Módszer 

Relativ 

fluoreszcencia (%) 

I0 

I0 

2 

Photobleach 

x y 

0 t 1/2 

Példák (mozik) 

Idő 

Lippincott-Schwartz, 2003 

7

A polarizátorok típusai 

• Definíció: A polarizátor egy olyan eszköz mely képes a polarizálatlan 

elektromágneses sugárzást (fény) olyan sugárzássá alakítani, melyben csak 

egyféle polarizációs sík van jelen. 

• Típusai: 

–Prizmás (Nicol; Glan-Thomson; Glan- 

Taylor) 

–Film-polarizátor (kinyújtott polimer 

háló – nagy tűrőképesség – lézerekben 

gyakran előfordul) 

Θ = arcsin 

1 

Snellius –Descart törvény 

sin Θ 

sin Θ 

1 

2 

n 2 

= 

= 

n 

1 

c 

c 

1 

2 

Θ1 

Θ 2 


sin Θ1 

n2 

= 

sin Θ n 

2 

1 

1 

sin Θ1 

n2 

= 

o 

sin 90 n 

sin Θ1 

n2 

= 

1 n 

n2 

Θ1 

= arc sin 

n 

1. 

55 

1. 

658 

o 

Θ1 

= 69. 

2 

1 

1 

Θ = arcsin 

1 

1. 

55 

1. 

486 

Θ1 

= ! ?! 

Θ1 

Θ 2 

n 1 

n 2 

n 1 

n 2 

A polarizátorok működése 

v 2 

v 2 

sin Θ 

68° 

22 ° 

2 

β 

Refrakció és teljes visszaverődés 

α 

α h 

v 1 

levegő 

v 1 

sin Θ1n 

= 

n 

2 

n 2 

n 1 

víz 

levegő 

n 2 

n 1 

víz 

Snellius-Descartes törvény 

sinα 

sin β 

v 

1 = = n21 

v2 


1. komponens 

13.06 ° 

76.94 

90 ° 90° 

° 

90 ° 

CaCO 3 

1 

22 ° 

sinα h = n21 

n levegő =1.00028 

n Nicol1 =1.658 

n Nicol2 =1.486 

n Kanada-balzsam =1.555 

8

sin Θ 

68° 

22 ° 

2 

90 ° 

14.6 ° 

90 ° 

sin Θ1n 

= 

n 

2 

2. komponens 

CaCO 3 

1 

90 ° 

75.4 ° 22.37 ° 

67.63 ° 

22 ° 

67.63 ° 

75.4 ° 

n levegő =1.00028 

n Nicol1 =1.658 

n Nicol2 =1.486 

n Kanada-balzsam =1.555 

Glan-Thomson prizma 

ordinárius sugár 

Összefoglalás 

kötőanyag 

-Polarizált fény; 

-Fotoszelekció; 

-Fluoreszcencia polarizáció és anizotrópia; 

-FRAP 

Segédanyagok: 

extra ordinárius sugár 

http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook 

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/index.html 

http://chemistry.rutgers.edu 

http://calvino.polito.it 

http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence 

Kettős törés!! 

Határszög!! 

68 ° 

Kanada-balzsam 

Nicol-prizma 

CaCO 3 


CaCO 3 


William Nicol (1768 – 1851) Skót fizikus, geológus, a Nicol prizma megalkotója 

(1828). 

Glan-Taylor prizma 


levegő 


9

Polarizáció fogalma

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?