Van élet az elektroporlasztásos ionizáción kívül?

kromat.hu

Van élet az elektroporlasztásos ionizáción kívül?

Van élet az

elektroporlasztásos ionizáción

kívül?

Ludányi Krisztina

Semmelweis Egyetem

Gyógyszerészeti Intézet


Ionizációs technikák


Történeti áttekintés

1965: Atmoszférikus nyomású ionizáció β-emitter 63 Ni ill. korona

kisüléssel (Shahin)

1966: Kémiai ionizáció (Munson and Field)

1968: Polisztirén makromolekulák vizsgálata Electrospray-vel (Dole)

1973: API kapcsolása nagyvákuum tömegspektrometriával (Horning)

1974: API LC-MS kapcsolás (Horning)

1982: API LC-MS-MS kapcsolás (Henion)

1985: Jelenleg használt Electrospray ionforrás kifejlesztése

(Whitehouse és Fenn)

1988:Elsı kereskedelmi APCI interface

Többszörös töltéső ionok vizsgálata ESI-vel (Fenn)

1993-:Alkalmazások több, mint 35 %-a ESI

2000: APPI (Robb, Covey, Bruins)


Elektroporlasztásos ionizáció-

Electrospray (ESI)

J. B. Fenn

Kémiai Nobel

díj

2002

"for the development of methods for identification and

structure analyses of biological macromolecules"


Atmoszférikus nyomású kémiai

ionizáció – APCI

HPLC

Heater

Nebuliser

gas inlet

Skimmers

Lenses

HED detector

Nebuliser

Capillary

Octopole

Quadrupole

+ +

+ +

+ +

+ + + + + +

+ + +

+

Corona

needle

heated N 2

Analyte/sample plasma


Koronakisülés: pozitív ion képzıdés

mechanizmusa

+HV

H NH

+

3

O + 4

H 2

O +

N

+

2 O2

+

N

+

2

e N H - 2 + 2 O +

O

+

2

H H

3 O+ 3 O+ H 3

O + H 3

O +

H 3

O +

e ē- N 2

+

H 3

O +

H 3

O +

NH 4

+

H 3

O +

H 3

O +

NH 4

+

H 3

O + H 3

O +

• Az elsı fázisban a tő

elektronokat fog be és N 2+ ,

O 2+ , H 2 O + … ionok (primer ionok)

képzıdnek.

• A primer ionok rövid élettartamúak:

átadják töltésüket

az oldószernek, H 3 O + , NH 4+ ,

RH 2 O + … (reaktáns ionok)

keletkeznek.

• A reaktáns ionok átadják

töltésüket a vizsgálandó

vegyületnek, [M+H] + képzıdik.


Koronakisülés: negatív ion képzıdés

mechanizmusa

-HV

OH - OH - OHŌH-

NO 2

- CO 3 - HCO 3

-


O

-

2 O2

-

3 -

CO 3

-

e O - 3 - eēŌ O

-

2

2 -

OH -

RO - • Az elsı fázisban a tő

elektronokat bocsát ki és O 3- ,

O 2- , NO 2 -, CO 3- (primer ionok)

képzıdnek.

OH -

O 2

-

NO 2

-

CO 3

-

RO - OH -

• A primer ionok rövid élettartamúak

: átadják

töltésüket az oldószernek,

OH - , HCO 3- , RO - (reaktáns

ionok) keletkeznek.

• A reaktáns ionok átadják

töltésüket a vizsgálandó

vegyületnek, [M-H] - képzıdik.


Ionizációs folyamat: koronakisülés

APCI

Koronakisülés (elektronok)

1 µsec

500 µsec

Primer ionok (levegı)

Reaktáns ionok (oldószer)

Egyensúly (visszaalakulási energia)

Mintaionok [M+H] + , [M-H] -

Egyensúly (protonaffinitás)


APCI LC-MS Interface elınyei és hátrányai

Elınyök

☺ CI spektrumok: molekulatömeg

információ

☺ Pozitív és negatív ionok, közepesen

poláros/illékony komponensek

☺ Lágy és ´kemény´ ionizációra is

alkalmas

☺ Nincs nemkívánatos fragmentáció

☺ Kvalitatív és kvantitatív

meghatározás

☺ 0,2-2 ml/perc áramlási sebesség

☺ pH nem befolyásolja az ionizációt

☺ Jobban tolerálja a puffereket, mint

az ESI (nagyobb érzékenység)

☺ Könnyő installálni és üzemeltetni

☺ Egyszerően kapcsolható HPLC-vel

Hátrányok

☹ Nincs fragmentáció

☹ Hıbomlás következhet be

☹ Nem illékony pufferek???

☹ Csak egyszeres töltéső ionok

keletkeznek

☹ Nem alkalmas apoláros molekulák

vizsgálatára

☹ Poláros vegyületek – ESI

érzékenyebb


Példa: Hosszú láncú zsírsavak meghatározása

• eltérés peroxiszomális zavarok esetén

• ált.: extrakció, származékképzés, GC-MS

(hosszadalmas, munkaigényes)

• ált. tendencia: GC-MS ⇒ HPLC-MS

• fejlesztés: származékképzés nélküli

HPLC-MS

- gyors, hatékony, érzékeny

- alkalmas vér analízisére

(szőrıpapírra szárított vércsepp)

Nagy et al, Anal Chem 76, 1935 (2004)

Nagy et al, J. Chrom. A 1078, 90 (2005)


Zsírsavak vizsgálata

• std. keverék ill. vér-extraktum vizsgálata

beszárított vér (~50 µl) + belsı std.

foszfolipidek, gliceridek, észterek hidrolízise (CH 3 CN/HCl)

extrakció hexánnal

• új HPLC módszer – szokatlan gradiens:

metanol-víz vs. metanol-hexán, gyors gradiens

részben elegyedı oldószerek!

• negatív ionok detektálása APCI ionizációval


HPLC módszer

• jól reprodukálható, robusztus

• gyors elválasztás

100

C18

C26

0.7 ml/perc áramlás mellett a zsírsavak

elválasztása 2 percen belül

kiváló apoláros vegyületek vizsgálatára

az oszlopnak csak kis hatása van az elválasztásra

80

60

40

20

C16

C22

C20

C24

pl. trigliceridek, szteroidok, szterolok

0

0 2

Time [minute]


MS

• APCI kedvezıbb mint ESI: pozitív és negatív ionizáció, de

- pozitív ionizáció eseten gázfázisú metilezés:

ront a reprodukálhatóságon

- negatív ionizáció lényegesen szelektívebb

• intenzív [M-H] - ion

• kvantitatív meghatározáskor az egyes

zsírsavakhoz külön-külön belsı std, pl.

hexakozánsav (C26)

• jó linearitás a fiziológiai-patologikus

koncentrációtartományban

• érzékeny: kimutatási határ 1-5 pg

hasonló a GC-MS-hez !

Intensity [%]

100

80

60

40

20

0

100 150 200 250 300 350 400 450 500

m/z [Thomson]

339

[M-H] - C22


Vérminták vizsgálata

std. keverék

100

C18

100

vérminta

C22

C24

80

C26

80

Intensity [%]

60

40

C16

C20

C22

C24

60

40

C20

20

20

C19

C26

0 2 4 6 8 10

Time [minute]

0

0 5 10

Retenciós idõ [perc]


Zsírsavak vérbıl történı meghatározása:

• betegségek diagnosztikájára

• jó érzékenység, kedvezı mennyiségi meghatározás

• gyors mérések, sorozatmérésekhez jól használható

• más apoláris vegyületek vizsgálatára is kiváló

És mire jó még?

Cholesterol

Lathosterol

Cholestanol

Sitosterol

Desm osterol

2 4 6 8 10 12 14


Atmoszférikus nyomású

fotoionizáció - APPI

HPLC

inlet

Nebulizer

Vaporizer

(heater)

Drying

gas


+ +

+

+ + + +

UV Lamp

Capillary


Fotoionizáció elve

Fotoionizáció: hν > IP

M + hν → M +• + e -

Gerjesztés (de nem ionizálás): hν < IP

M +hν → M*

Legtöbb szerves vegyület IP < 10 eV

Tipikus HPLC oldószerek IP > 10 eV


Szelektív ionizálás

3 lámpa

alkalmazható

Ar: 11.2 eV

Kr: 10.0 eV

Xe: 8.4 eV

Nitrogen 15.58

Water 12.62

Acetonitrile 12.20

Oxygen 12.07

Methanol 10.84

Methyl pentanoate 10.40

Hexane 10.13

Heptane 9.93

Acetone 9.70

Pyridine 9.26

Benzene 9.24

Amphetamine 8.99

Toluene 8.83

Naphthalene 8.14

Reserpine 7.88

Triethylamine 7.53

Ionizációs potenciál (eV)


“Dopant”

Az ionizáci

ció hatékonys

konysága növelhetn

velhetı un.

“dopant” molekula alkalmazásával

val.

Direkt fotoionizáció

M + hν → M +• + e -

Dopant-közvetített fotoionizáció

D + hν → D +• + e -

D +• + M → D + M +•

Általánosan alkalmazott „dopant” molekulák:

toluol

ol, , aceton


Párhuzamos reakciók: protonált ionok

keletkezése

Az M +• gyökion képzıdése mellett protonált

ionok [M+H] + is keletkeznek (domináns vagy

kizárólagos is lehet):

pl.

D + hνh

→ D +• + e -

D +• + S → [D-H]

• + [S+H]

+

[S+H]

+ + M → S + [M+H]

+


APPI LC-MS Interface elınyei és hátrányai

Elınyök

☺ Pozitív és negatív ionok,

apoláros komponensek

☺ Molekulatömeg információ

☺ Minimális háttérinterferencia,

szelektív

ionizáció

☺ Könnyő installálni

☺ Egyszerően kapcsolható

HPLC-vel

☺ Kombinált ionforrások

Hátrányok

☹ Új technika…

☹ Gyökion vagy protonált

molekulaion?

☹ Nem illékony pufferek???

☹ Nem alkalmas poláros

molekulák vizsgálatára


Ionizációs technikák vs. alkalmazások


Problémák, tévhitek

• NEM minden anyag detektálható az MS-ben

• Jelintenzitás arányos a koncentrációval, de különbözı

típusú anyagok esetén nagyságrendi különbségek

lehetnek (lásd elızı példa)

Χ Tömegspektrométer = tömegszelektív detektor

(mint a nitrogén szelektív detektor)

Χ Olyan egyszerő, mint a FID vagy UV

Χ Nem szükséges érteni hozzá a számítógép mindent megcsinál

Χ LC-MS ionforrások bármilyen kromatográfiás

körülményekkel használható


Köszönet

MTA KK SZKI MS Osztály:

Prof. Vékey Károly

Dr. Drahos László

Dr. Nagy Kornél

Dr. Jakab Annamária

SE Gyógyszerészeti Intézet: Prof. Klebovich Imre

More magazines by this user
Similar magazines