13_186Perbandinganmetodemolekuler

kalbemed.com

13_186Perbandinganmetodemolekuler

TEKNIK

Perbandingan Beberapa Metode Molekuler dalam

Uji DNA HPV (Human Papillomavirus)

Metode PCR dan Elektroforesis

PCR (Polymerase Chain Reaction) atau reaksi

berantai polimerase adalah suatu metode enzi-

matis untuk memperbanyak secara eksponen-

sial suatu sekuen nukleotida tertentu secara

invitro [1]. PCR pertama kali dikembangkan oleh

Kary Mullis pada tahun 1985 seorang peneliti

dari CETUS Corporation [2]. PCR dapat melipat

memperbanyak molekul DNA dan memisahkan

gen-gen; kelebihan metode ini adalah

suhu yang dapat tinggi dan rendah dengan

cepat selain itu PCR juga bekerja dengan

komponen yang jumlahnya sedikit[1].

Pada tahun 1990 Ting dan Manos telah me-

ngembangkan suatu metode deteksi HPV

dengan PCR [3]. Metode tersebut dikembangkan

dengan mengidentifikasi suatu daerah homo-

logi di dalam genotipe HPV yang kemudian di-

gunakan sebagai dasar untuk mendesain

primer untuk amplifikasi [1]. Daerah homologi

tersebut panjangnya 20-25 pasangan basa

dan diketahui setelah dilakukan perbandingan

urutan nukleotida HPV-6, HPV-11, HPV-16,

HPV18, dan HPV-33 terutama pada daerah

ORF E1 dan L1 [1,3]

Gambar 1. Alat PCR (Polymerase Chain Reaction) [2]

356

Sinta Sasika Novel1, Ratu Safitri1, Sri Hartini Harijanto2, Sukma Nuswantara3 1Jurusan Biologi, FMIPA Universitas Padjadjaran, Jatinangor, 2Rumah Sakit Kanker Dharmais Slipi Jakarta Barat,

3Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bogor

ABSTRAK

Uji DNA HPV telah dipakai sebagai uji tambahan paling efektif cara mendeteksi keberadaan HPV sedini mungkin. Uji DNA HPV

dapat mengetahui golongan hr-HPV atau lr-HPV dengan menggunakan teknik HC II atau dengan metode PCR, uji DNA HPV juga

dapat melihat genotipe HPV dengan metode DNA-HPV Micro Array System, Multiplex HPV Genotyping Kit, dan Linear Array HPV

Genotyping Test.

Prinsip kerja PCR dan elektroforesis yaitu (1)

isolasi DNA sampel dari bahan klinis atau dari

jaringan yang disimpan pada paraffin [4], (2)

proses amplifikasi DNA yang telah diisolasi;

proses amplifikasi sendiri terbagi tiga tahapan

yaitu denaturasi, annealing, dan elongasi.

Tahapan denaturasi terjadi pada suhu 970C [1].

Pada proses ini terjadi denaturasi linearisasi

DNA[5]. Tahap kedua adalah penempelan

primer atau annealing pada DNA target yang

akan diperbanyak, membutuhkan suhu sekitar

550C [6]. Tahap ketiga adalah elongasi (polime-

risasi) membutuhkan suhu 720C agar siklus

polimerisasi lebih optimal [7], (3) hasil amplifikasi

dideteksi menggunakan alat elektroforesis

pada gel agarosa [1]; teknik elektroforesis

adalah teknik yang memisahkan

molekul-molekul bentuk, muatan netto, dan

berat molekulnya dalam sebuah medan listrik

pada medium padat atau semipadat [5,7].

Metode PCR dan elektroforesis hanya di-

gunakan untuk mendeteksi ada atau tidaknya

DNA HPV di dalam sel epitel yang dicurigai ter-

infeksi HPV [6]; sulit untuk menentukan geno-

tipe HPV yang menginfeksi [4]. Proses geno-

typing dengan metode PCR dan elektroforesis

memerlukan waktu yang cukup lama, karena

hanya menggunakan satu kontrol positif untuk

satu genotipe HPV saja [5,7]; umumnya HPV-16

atau HPV-18 [1]. Pada gambar 2 dapat dilihat

nomor 1 sd.11, nomor 1 dan 2 merupakan

kontrol negatif dan kontrol positif genotipe

HPV-16. Nomor 3-11 adalah sampel-sampel

yang positif terinfeksi; ke-9 sampel menunjukkan

sinyal yang sama dengan nomor 2,

menunjukkan bahwa ke-9 sampel tersebut

positif terinfeksi HPV, namun tidak cukup

untuk menentukan genotipe HPV dalam

setiap sampelnya [4,8].

Gambar 2. Hasil amplifikasi yang dideteksi meng-

gunakan PCR pada pemeriksaan infeksi HPV [2,4]

Metode Hybrid Capture System (HC-II)

Hybrid Capture System (HC-II) adalah metode

pemeriksaan hibridisasi dengan teknologi ter-

baru di bidang biologi molekuler [2]. Teknik

HC-II memeriksa pada kondisi lebih awal yaitu

kemungkinan seseorang terinfeksi HPV se-

belum virus tersebut membuat perubahan

pada serviks yang akhirnya dapat mengakibat-

kan terjadinya kanker serviks [9]. HC-II telah di-

akui dunia serta disahkan oleh FDA (Food

and Drug Administration) Amerika Serikat [10].

HC-II memiliki keakuratan yang tinggi dalam

mendeteksi infeksi HPV karena mampu men-

deteksi keberadaan DNA HPV dalam jumlah

yang sangat kecil [9].

CDK 186/Vol.38 no.5/Juli-Agustus 2011


Teknik HC-II adalah antibody capture/solution

hybridization/signal amplication assay [9,10]

yang memakai deteksi kualitatif chemiluminescence

terhadap DNA HPV; secara umum

HC-II ialah teknik berbasis DNA-RNA yang

dapat mendeteksi secara akurat dan cepat

dengan sensitivitas 98% dan spesifisitas HC-II

98% [10]

Prinsip kerja HC-II yaitu (1) menghancurkan

protein kapsid virus HPV dalam sampel yang

telah dimasukkan ke dalam botol sampel yang

telah disediakan [4], (2) Setelah kapsid dirusak,

tahap berikutnya adalah mendenaturasi DNA

untai ganda menjadi untai tunggal dengan

menambahkan larutan denaturasi [2]. Denaturasi

merupakan langkah awal prosedur untuk

mengeluarkan DNA (release DNA) target dari

sel [2], (3) hibridisasi antara DNA virus dengan

probe RNA menghasilkan DNA-RNA hybrid

yang ditangkap oleh antibodi yang kemudian

akan bereaksi dengan antibodi kedua [4].

Antibodi kedua ini bertindak sebagai sinyal

amplifikasi; makin banyak hibrid DNA-RNA

yang tertangkap pada dinding capture plate

maka makin banyak pula antibodi kedua

yang dapat mengenali hibrid DNA-RNA[9],

(4) Kuantitas antibodi yang terikat pada hibrid

DNA-RNA diukur dengan menambahkan zat

chemiluminescent sehingga menghasilkan

sinyal chemiluminescent, (5) sinyal ini akan di-

tangkap oleh alat luminometer yang dihubung-

kan dengan komputer. Gambar 3 menunjuk-

kan visualisasi prinsip kerja HC-II [10].

Gambar 3. Prinsip kerja HC-II (1) DNA yang sudah

terdenaturasi, (2) hibridisasi DNA Virus dengan

probe RNA, (3) hibrid DNA-RNA berikatan antibodi

spesifik, (4) ikatan antibodi dengan hibrid DNA-RNA

akan bereaksi dengan alkaline phosphatase, (5) reaksi

ini menghasilkan sinyal chemiluminescent, (6) sinyal

amplifikasi dalam bentuk emisi cahaya, diukur Lumino-

meter, (7) pengukuran tersebut tersambung dengan

perangkat komputer menghasilkan nilai RLU (Relative

Light Unit) [2]

Penentuan nilai positif uji DNA HPV didasarkan

pada perbandingan sampel dengan rata-

rata RLU/PV; jika perbandingan RLU/PC (relative

light unit/posirif kontrol) melebihi nilai ambang

CDK 186/Vol.38 no.5/Juli-Agustus 2011

positif maka spesimen dinyatakan positif

terhadap tes DNA HPV [9]. Penentuan konsentrasi

ambang DNA HPV yang akan berpeluang

terbentuknya kanker leher rahim adalah

sangat penting. Digene menetapkan nilai

ambang positif sebesar 1.0 RLU/PC [2,4,9].

Bila dibandingkan dengan PCR, HC-II memiliki

ketepatan 92-94% terhadap teknik peme-

riksaan sitologi/histologi, waktu yang lebih

singkat, tidak terdapat atau hanya sedikit

kontaminasi, dan disertai dengan probe [2].

Probe A untuk melacak DNA lr-HPV seperti

HPV-6, HPV-11, HPV-42, HPV-43, dan HPV-44,

sedangkan probe B untuk melacak 13 tipe

DNA hr-HPV yaitu HPV-16, HPV-18, HPV-31,

HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51,

HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, dan

HPV-68 [10]. Namun HC-II tidak dapat digunakan

untuk menentukan genotipe HPV karena

tes ini hanya memperkirakan kuantitatif jumlah

virus tanpa mengetahui genotipe HPV-nya [4,9,10].

Metode Multiplex HPV Genotyping Kit

Metode Multiplex HPV Genotyping Kit adalah

metode yang digunakan untuk mengetahui

genotipe HPV [4]. Multiplex HPV Genotyping

Kit dapat medeteksi 24 genotipe HPV :

HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-26,

HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-42,

HPV-43, HPV-44, HPV-45, HPV-51, HPV-52,

HPV-53, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66,

HPV-68, HPV-70, HPV-73, dan HPV-82 [4,11].

Prinsip kerja Multiplex HPV Genotyping Kit :

(1) ekstraksi sel untuk mengisolasi DNA, (2)

DNA yang telah diisolasi kemudian di amplifikasi

menggunakan PCR yang telah diberi

label biotin pada primer sehingga DNA yang

diperbanyakpun akan terlabel biotin. Biotin

penting dalam proses deteksi hasil hibridisasi.

Primer akan mengamplifikasi DNA β-globin

manusia dan DNA ke-24 HPV, (3) hasil amplifikasi

dihibridisasi menggunakan probe spesifik

dari ke-24 genotipe HPV; pada proses hibri-

disasi ini diperlukan sejumlah DNA untai

tunggal; untuk mendenaturasi DNA untai

ganda menjadi DNA untai tunggal pada

metode ini menggunakan suhu tinggi

sehingga DNA akan terdenaturasi, (4) kemudian

proses deteksi menggunakan Luminex

analyzer : produk PCR akan terdeteminasi oleh

Phycoerythrin fluorescens [4,11].

TEKNIK

Metode DNA-HPV Micro Array

Metode DNA-HPV Micro Array adalah metode

yang digunakan untuk mengetahui genotipe

HPV [4]. DNA-HPV Micro Array dapat mendeteksi

24 genotipe HPV : HPV-6, HPV-11,

HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-34,

HPV-35, HPV-39, HPV-40, HPV-42, HPV-43,

HPV-44, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-53,

HPV-54, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66,

HPV-68, dan HPV-70 [12].

Prinsip kerja DNA-HPV Micro Array : (1) eks-

traksi sel untuk mengisolasi DNA, (2) DNA

yang telah diisolasi kemudian diamplifikasi

menggunakan PCR, (3) hasil amplifikasi di-

hibridisasi menggunakan probe spesifik dari

ke-24 genotipe HPV; proses hibridisasi ini

memerlukan sejumlah DNA untai tunggal,

(4) kemudian proses deteksi sehingga akan

terlihat genotipe-genotipe HPV pada sampel

yang diperiksa [4,12]. (gambar 4).

Gambar 4. Hasil deteksi genotipe HPV [12]

Linear Array HPV Genotyping Test

Metode ini sudah digunakan pada banyak

penelitian mengenai HPV [13]; di RS Kanker

Dharmais digunakan untuk diagnosis infeksi

HPV penyebab kanker serviks dan kutil [4]. Teknik

ini adalah salah satu teknik terbaru di dunia

molekuler untuk mendeteksi HPV [13]. Kelebihan

teknik ini adalah dapat diketahuinya tipe

HPV yang menginfeksi, apakah tipe lr-HPV

atau hr-HPV yang dapat menyebabkan kaker

serviks. Linear Array HPV Genotyping Test

mampu mendeteksi 37 genotipe HPV baik

hr-HPV maupun lr-HPV secara bersamaan [13,14].

Ke-37 genotipe HPV yaitu HPV-6, HPV-11,

HPV-16, HPV-18, HPV-26, HPV-31, HPV-33,

HPV-35, HPV-39, HPV-40, HPV-42, HPV-45,

HPV-51, HPV-52, HPV-53, HPV-54, HPV-55,

HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-61, HPV-62,

HPV-64, HPV-66, HPV-67, HPV-68, HPV-69,

HPV-70, HPV-71, HPV-72, HPV-73, HPV-81,

HPV-82, HPV-83, HPV-84, HPV-IS39, dan

HPV-CP6108[13].

357


TEKNIK

Gambar 5. Perangkat diagnostik Linear Array HPV

Genotyping Test (1) PCR N9700, (2) reagen, (3) typing

tray, dan (4) Linear Array HPV Genotyping Strip [4] .

Prinsip kerja Linear Array HPV Genotyping

Test terbagi menjadi empat tahapan [14]. Tahap

pertama ekstrasi DNA dari sampel meng-

gunakan Amplilute Liquid Media Extration

Kit, ekstraksi dimulai dengan melisis jaringan

menggunakan buffer ATL, merusak protein

dengan Proteinase K, merusak RNA dengan

RNase sehingga akan diperoleh DNA yang

diinginkan [4,13].

Tahap kedua yaitu amplifikasi DNA menggunakan

PCR TC9700 [4]. Prinsip dasar PCR pada

metode Linear Array HPV Genotyping Test

adalah enzim AmpliTaq Glod DNA polyme-

rase memperbanyak sekuen spesifik yang di-

mulai dengan pelekatan primer dan menyatu-

kan dNTP-dNTP yang berlangsung dalam

reaksi termal [13,14]. Proses pra-denaturasi dan

denaturasi DNA membutuhkan suhu 95 0C,

penempelan atau annealing membutuhkan

suhu 55 0C. Suhu 55 0C adalah suhu hasil

optimasi agar primer tidak salah menempel

(mispriming) [1]. Proses elongasi membutuhkan

waktu 1 menit dan suhu 72 0 C, hal tersebut

sesuai dengan teori bahwa untai DNA tunggal

yang disintesis oleh Taq polimerase mem-

butuhkan suhu 72 0 C [5,7].

Tahap ke tiga yaitu hibridisasi DNA; pada

proses ini diperlukan sejumlah DNA untai

tunggal sehingga DNA hasil amplifikasi harus

didenaturasi menjadi DNA untai tunggal [13,17].

Salah satu perlakuan untuk memecah ikatan

hidrogen antar basa nitrogen adalah dengan

penambahan senyawa alkali seperti NaOH

yang terdapat pada larutan pendenaturasi [18].

358

(1) (2)

(3) (4)

Hibridisasi asam nukleat mempunyai dua unsur

utama yaitu DNA target dan pelacak. DNA

target yaitu DNA yang telah terdenaturasi.

Pelacak yang digunakan memiliki urutan

spesifik untuk 37 genotipe HPV [4].

Gambar 6. Mekanisme hibridisasi dan deteksi pada

metode LA HPV GT (a) membran nilon pada strip (b)

pelacak yang berada di atas membrane (c) DNA hasil

amplifikasi (d) larutan hibridisasi (e) DNA yang sudah

terlabel biotin (f) biotin label non radioaktif (g) strepta-

vidan yang berikatan dengan biotin dan horseradish

-peroxidase (h) H2O2 dan TMB [4]

Pada tahap ke empat, prinsipnya DNA akan

berikatan dengan pelacak yang menempel

pada membran nilon bermuatan [17]. DNA sudah

diberi label biotin sehingga ikatan antara

pelacak dan DNA akan terdeteksi dan menghasilkan

sinyal [5]. Sinyal tersebut akan ditangkap

oleh streptavidin-horseradish peroxidase me-

nandakan bahwa ikatan pelacak dan DNA

berhasil [4]. Streptavidin-horseradish peroxidase

akan berikatan dengan H2O2 dan TMB (Tetra-

methylbenzine) [13]. Ikatan ini akan menghasilkan

warna biru pada membran nilon yang me-

nunjukkan genotipe HPV [17]. Hasil deteksi akan

terlihat berwarna biru di atas Linear Array HPV

Genotyping Strip yang akan menunjukkan

genotipe HPV sampel [4].

Gambar 7. Hasil deteksi LA HPV Genotyping Test (1)

β-globin high, β-globin low, HPV-16, HPV-42 (2)

β-globin high, β-globin low, HPV-11, HPV-61,

HPV-68 [4]

SIMPULAN

1. Metode PCR dan elektroforesis dapat

mengetahui keberadaan HPV tanpa me-

ngetahui genotipe secara spesifik.

2. Metode Hybrid Capture II System digunakan

untuk mengetahui keberadaan HPV

dengan memperkirakan kuantitas/jumlah

virus tanpa mengetahui genotipe HPV-nya.

3. Metode Multiplex HPV Genotyping Kit digunakan

untuk mendeteksi 24 genotipe

HPV.

4. Metode DNA-HPV Micro Array digunakan

untuk mendeteksi 24 genotipe HPV.

5. Metode Linear Array HPV Genotyping Test

digunakan untuk mendeteksi 37 genotipe

HPV.

DAFTAR PUSTAKA

1. Yuwono T. Teori dan Aplikasi PCR. Yogyakarta: Penerbit

Andi, 2006.

2. Nuswantara S. Seminar Deteksi Dini dan Penanganan

Terkini Kanker Leher Rahim: Deteksi Human Papilloma Virus

Dalam Pencegahan Dini Kanker Leher Rahim. Bandung:

Santosa Bandung International Hospital, 2008.

3. Lörincz AT, Reid R, Jenson AB, Greenburg MD, Lancaster W,

Kurman RJ. Human Papillomavirus Infection of The Cervix:

Relative Risk Associations of 15 Common Anogenital Types.

Obstetr. Gynecol. 1998; 79: 328-37.

4. Novel SS, Safitri R, Nuswantara S. Analisis Distribusi Genotipe

HPV Dengan Metode Linear Array HPV Genotyping Test.

Bandung: Biologi FMIPA-UNPAD, 2009.

5. Bartlett JMS, Stirling J. PCR Protocols. Totowa: Human Press,

1999.

6. Nuswantara S. Dasar-dasar Molekuler. Bandung: Laboratorium

Bioteknologi Sandia Biotech Diagnostic Centre,

Santosa Bandung International Hospital, 2007.

7. Brown TA. Essential Molecular Biology. Inggris: Oxford Univ

Press., 1995.

8. Wolfe SL. An Introduction to Cell and Molecular Biology.

Belmont: Wadsworth Publ. Co. 1995.

9. Novel SS, Safitri R, Nuswantara S. Aplikasi Hybrid Capture

II System dalam Deteksi Dini Kanker Serviks. CDK 2009;

36(1): 24-6.

10. Castle PE, Lorincz AT, Lohnas IM. Result of Human Papillomavirus

DNA Testing with the Hybrid Capture II Assay are

Reproducible. Clin. Microbiol. 2002; 40: 1088-90.

11. Monk BJ, Tewari KS. The Spectrum and Clinical Sequelae

of Human Papillomavirus Infection. Gynecol. Oncol.2008;

107: 6-13.

12. Zhao Y, Lin H, Shen D, Xuan Y, Lin Z. Distribution of HPV

Genotypes in Uterine Cervical Lesions in Yanbian, Northern

China. Pathol. Internat. 2008; 58: 643-7.

13. van Hamont D, van Ham MAPC, Bakkers JMJ., Massuger

LFAG, Melchers WJG. Evaluation of The SPF10-INNO LiPA

Human Papillomavirus (HPV) Genotyping Test an the Roche

Linear Array HPV Genotyping Test. Clin. Microbiol. 2006;

44(9): 3122-9.

14. van Doorn LJ, Quint W, Kleter B, Olivera HS. Genotyping of

Human Papillomavirus in Liquid Cytology Cervical Specimens

by the PGMY Line Blot Assay and the SPF10 Line

Probe Assay. Clin. Microbiol. 2002; 40(3): 979-83.

15. Verteramo R, Pierangeli A, Mancini E. Human Papillomaviruses

and Genital Co-infections in Gynaecological

Outpatients. BMC Infect. Dis. 2009; 9(16): 1-7

16. Syrjanen KJ. HPV Infections and Oesophageal Cancer.

J. Clin. Pathol. 2002; 55(10): 721-8.

17. Sudjadi. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kanisius,

2008.

18. Yuwono T. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga, 2005.

CDK 186/Vol.38 no.5/Juli-Agustus 2011

More magazines by this user
Similar magazines