Mintzetan txertaketa bideratzen duten sekuentziak - Euskara
Mintzetan txertaketa bideratzen duten sekuentziak - Euskara
Mintzetan txertaketa bideratzen duten sekuentziak - Euskara
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Jakintza-arloa: Natur Zientziak<br />
<strong>Mintzetan</strong> <strong>txertaketa</strong><br />
<strong>bideratzen</strong> <strong>duten</strong><br />
<strong>sekuentziak</strong><br />
Birus fusio proteinak eta<br />
biroprinak<br />
Egilea: SILVIA SANCHEZ MARTINEZ<br />
Urtea: 2007<br />
Zuzendaria: JOSE LUIS NIEVA ESCANDON<br />
Unibertsitatea: UPV-EHU<br />
ISBN: 978-84-8428-277-5
Hitzaurrea<br />
2003 apirilean Jose Luis Nieva doktorearen zuzendaritzapean tesi-proiektu hau<br />
hasi nuen, tesia 2007 otsailan defendatu nuen. Laburpenean azaltzen dudan<br />
moduan tesian bi gai ezberdin aztertzen dira, alde batetik poliobirusaren 2B<br />
proteinaren egitura-funtzioaren arteko erlazioaren analisia eta bestetik GIB-1-en<br />
MAb2F5 eta 4E10 antigorputzek mintzean murgildurik daudenean edo/eta<br />
soluzioan daudenean, beraien epitopoak ezagutzeko gaitasunaren azterketa.<br />
2B proiektuak, Aitziber Agirre doktoreak zenbait urte lehenago hasi zuen,<br />
Madrilgo Luis Carrasco Doktorearen taldearekin kolaborazioan. Beraz proiektu<br />
hau bere lanaren jarraipenean eta oinarrituta dago eta Madrilgo taldearekin<br />
kolaborazio bat da.<br />
Biroporinak, birusek kodeturiko proteina txiki eta oso hidrofobikoak dira, zelula<br />
mintzarekin elkarrekiteko ahalmena daukate eta ondorioz, mintza, ioi eta<br />
molekula txikiek irazkor bihurtzen dute.<br />
Garai hartan 2B biroporinak mintzaren irazkortasuna areagotzeko erabiltzen<br />
zuen mekanismoa ez zegoen oso argi, eta honetan sakontzea beharrezkoa<br />
iruditu zitzaigun. Bestalde, beste hipotesi bat frogatu nahi genuen ere;<br />
mintzetan poroak eragitea, organismo askok, defentsa zein erasorako<br />
erabiltzen <strong>duten</strong> mekanismo zaharrenetariko bat da, beraz, mintzaren<br />
irazkortasuna handitzea animalia-birusen ohiko ezaugarri bat izanik, arraroa<br />
zen horrelako produktu zitotoxikorik birus-proteinen artean aurkitu ez izana.<br />
Birusek zelulak infektatzean adierazten dituzten produktu zitotoxikoen<br />
sekuentzia osoek edo partzialek, zelularen irazkortasuna areagotzeko<br />
gaitasuna zuten frogatu nahi genuen.<br />
Lan honen ondorioz, 2B biroporinak toxina zitolitiko moduan jar<strong>duten</strong> duela<br />
esan dezakegu.<br />
Gaur egun, Madrilgo taldeak biroporinen ikerketan jarraitzen du lanean.<br />
Taldean ikerketa lerro nagusi batean lan egiten da bereziki, GIB-1-ren gp41<br />
proteina aztertzen eta proteina hau ezagutzen <strong>duten</strong> antigorputz<br />
neutralizatzaileak aztertzen. Esan bezala, nire tesiaren bigarren proiektua<br />
antigorputz neutralizatzaile hauen azterketa da. Garai hartan gero eta<br />
ebidentzia gehiago zeuden, Mab2F5 eta Mab4E10-ak ekintza immunologikoa<br />
betetzeko, lipidoekin batu behar direla sustatzen zutenak:<br />
Lehenengoa, gp41 errekonbinanteak lipido hutsezko mintzekin inkubatuz gero,<br />
Mab2F5 eta 4E10-ren ezagupena areagotzen duela ikusi zen.<br />
Bigarrena, analisi molekularrak, eta Mab 2F5 eta 4E10-en zatikiak (Fabs),<br />
epitopoekin loturik, lorturiko kristal egituraren erresoluzioak kate astunetan<br />
CDR3 bigizta luzeen presentzia adierazten zuten. CDR3 loop luze hauetan<br />
hondar aromatikoak eta hidrofobikoak aurkitzen zirela, hondar hauek,<br />
epitopoekin ez zituzten kontaktu zuzenik ezartzen, beraz, mintzarekin
kontaktuak ezarri beharko zituztenaren posibilitatea zegoen. Dena den, eta<br />
behintzat 2F5-aren kasuan, nahiz eta bigizta hauek antigenoarekin<br />
elkarrekintza espezifikoak ez izan, antigorputzaren aktibitaterako guztiz<br />
beharrezkoak zirela ikusi zen. Mab4E10-ren kasuan aldiz, bigizta honen<br />
funtzioa ez zen determinatu, baina mutagenesi saioak burutzen ari ziren garai<br />
hartan bigiztaren garrantzia aztertzeko.<br />
Hirugarrena, Haynes eta lankideek, ikusi zuten Mab2F5 eta 4E10-ak<br />
kardiolipina (CL) fosfolipidoa espezifikoki ezagutzen zuela, MPER-eko<br />
epitopoak ezagutzeko erabiltzen zituzten gune berdinak erabiliz.<br />
Tesiaren bigarren proiektu honetan, zenbait galdera erantzuten saiatu ginen:<br />
-Antigorputzak, mintzekin elkar zitezkeen.<br />
-<strong>Mintzetan</strong> barreiatutako epitopo-<strong>sekuentziak</strong> ezagutzeko gai al ziren.<br />
-Fosfolipidoekin modu espezifikoaz elkarrekiteko gai al ziren.<br />
Bi antigorputz hauek, mintz ingurunean dauden epitopo eta fosfolipidoak, bi<br />
adaptazio mekanismo ezberdinen bidez ezagutzen dituzte.<br />
Taldean, gaur egun, gai honetan ikertzen jarraitzen da.<br />
Silvia Sanchez<br />
2009
Tesi hau Euskal Herriko Unibertsitateko <strong>Euskara</strong><br />
Errektoreordetzak, “<strong>Euskara</strong>zko tesiak sustatzeko beka”<br />
eta Biofisikako Unitate-ko (CSIC-UPV/EHU) proiektuei<br />
atxekituriko beka eta kontratuei esker burutu da.
Aita eta amari,
Aurkibidea<br />
AURKIBIDEA<br />
______________________________________________________________________<br />
1.Kapitulua: SARRERA OROKORRA ETA HELBURUAK<br />
1.1. MINTZ-BIOLOGIKOAK.............................................................1<br />
1.1.1. Mintz biologikoen funtzio eta ezaugarriak..........................1<br />
1.1.2. Mintzaren osaketa.............................................................2<br />
1.1.2.1. Mintz-proteinak....................................................4<br />
1.1.2.2. Lipidoak................................................................5<br />
1.1.2.2.1. Sailkapena................................................6<br />
1.1.2.2.1.1. Glizerofosfolipidoak......................7<br />
1.1.2.2.1.2. Esfingolipidoak.............................8<br />
1.1.2.2.1.3. Esterolak......................................9<br />
1.1.3. Lipido banaketa asimetrikoa mintzetan...........................10<br />
1.1.3.1. Lipido banaketa organulu intrazelular<br />
ezberdinen mintzetan zehar................................................................10<br />
1.1.3.2. Lipido banaketa mintz plasmatikoan...................10<br />
1.1.3.2.1. Zeharkako asimetria: Mintz<br />
plasmatikoaren kanpoaldeko eta barnealdeko monogeruzak...............11<br />
1.1.3.3. Lipido-domeinuak...............................................15<br />
1.1.4. Bigeruzaren egitura.........................................................17<br />
1.1.5. Bigeruzaren ezaugarri elektrostatikoak............................19<br />
1.1.5.1. Gainazaleko potentzial elektrostatikoa.................19<br />
1.1.5.2. Potentzial elektrostatiko dipolarra.......................19<br />
1.1.5.3. Mintzaren zeharkako potentzial elektrostatikoa...20<br />
1.2. WIMLEY-WHITE-en HIDROFIBIZITATE ESKALA.....................22<br />
1.3. POROAK ERATZEKO GAITASUNA DUTEN PROTEINA ETA<br />
PEPTIDO SOLUGARRIAK..............................................................25<br />
1.3.1. Polipeptidoetan oinarritutako poroak...............................26<br />
1.3.1.1. α-Hemolisina.......................................................26<br />
1.3.1.2. Kolizinak.............................................................29<br />
1.3.2. Peptido laburretan oinarritutako poroak..........................30<br />
1.3.2.1. β-Orri egiturako peptidoak..................................31<br />
1.3.2.1.1. A-Gramizidina........................................31<br />
1.3.2.1.2. Defentsinak............................................32<br />
1.3.2.2. α-Helize egiturako peptidoak...............................33<br />
1.3.2.2.1. Alametizina.............................................33<br />
1.3.2.2.2. Zekropinak.............................................35<br />
I
II<br />
Aurkibidea<br />
1.3.2.2.3. Magaininak.............................................36<br />
1.4. BIROPORINAK.......................................................................38<br />
1.4.1. Biroporinaren definizioa..................................................38<br />
1.4.2. Biroporina egituraren ezaugarri orokorrak.......................39<br />
1.4.3. Mintzaren irazkortasuna aldatzen <strong>duten</strong> glikoproteina<br />
birikoak............................................................................................ 41<br />
1.5. HELBURUAK.........................................................................43<br />
2. Kapitulua: MATERIALAK, TEKNIKA ESPERIMENTALAK<br />
ETA PROTOKOLOAK<br />
2.1. MATERIAL EZ-BIOLOGIKOA..................................................47<br />
2.1.1. Peptidoak........................................................................47<br />
2.1.1.1. Peptidoen diseinua..............................................47<br />
2.1.2. Antigorputzak..................................................................48<br />
2.1.3. Konposatuak eta inhibitzaileak........................................49<br />
2.1.4. Lipidoak..........................................................................49<br />
2.1.5. Tanpoiak.........................................................................50<br />
2.2. MATERIAL BIOLOGIKOA.......................................................51<br />
2.2.1. Lerro zelular eukariotoak................................................51<br />
2.2.2. Bakterio-anduiak............................................................51<br />
2.3. ZELULA EUKARIOTOEN MANIPULAZIOA................................51<br />
2.3.1. Kultibo-medioak..............................................................52<br />
2.3.2. Zelulen elektroporazioa in vitro sintetizaturiko RNA<br />
erabiliz...............................................................................................52<br />
2.3.3. Zelula eukariotoen mintz-irazkortasun aldaketak: B-<br />
Higromizina eta α-Sartzinaren sarrera................................................53<br />
2.3.3.1. Adierazitako proteinen aktibitatea aztertzeko<br />
protokoloa..........................................................................................53<br />
2.3.3.2. Peptidoen irazkortasun ahalmena aztertzeko<br />
protokoloa..........................................................................................54<br />
2.3.3.3. α-Sartzinaren sarrera..........................................54<br />
2.3.4. Proteinen markaketa erradiaktiboa..................................55<br />
2.3.5. Elektroforesia poliakrilamida geletan...............................55<br />
2.3.6. Fluorografia.....................................................................56<br />
2.3.7. Fluoreszentziazko mikroskopia konfokala........................56<br />
2.3.8. Sintzitio-eraketaren inhibizioa.........................................57<br />
2.3.8.1. Sintzitioen eraketarako protokoloa .....................58<br />
2.3.8.2. Sintzitio-eraketaren inhibizio protokoloa ............58
Aurkibidea<br />
2.4. MINTZ-EREDUEN SISTEMAK.................................................59<br />
2.4.1. Liposomak......................................................................59<br />
2.4.1.1. Liposomen prestakuntza.....................................61<br />
2.4.1.1.1. LUV-en prestakuntza..............................62<br />
2.4.1.1.2. SUV-en prestakuntza..............................63<br />
2.4.1.2. Lipidoen kontzentrazioaren determinazioa...........63<br />
2.4.2. Monogeruzak...................................................................64<br />
2.5. SAIO BIOFISIKOAK...............................................................66<br />
2.5.1. Fluoreszentzia bidez egindako neurketak........................66<br />
2.5.1.1. Solutuen askapena.............................................67<br />
2.5.1.1.1. ANTS/DPX saioa.....................................68<br />
2.5.1.1.2. FITC-Dextrano saioa...............................69<br />
2.5.1.2. Solutuen sarrera.................................................70<br />
2.5.1.3. Peptidoko triptofanoen eta dansilo zundaren<br />
arteko energi transferentzia...............................................................72<br />
2.5.1.4. Peptidoen fluoreszentzia intrintsekoaren<br />
aldaketa bidezko batura-isoterma: ura-mintza banaketaren<br />
neurketa.............................................................................................75<br />
2.5.2. Dikroismo zirkularra.......................................................76<br />
2.5.2.1. CD-aren adierazpena...........................................77<br />
2.5.2.2. Egitura sekundarioen determinazioa ..................80<br />
2.6. ELISA....................................................................................81<br />
2.6.1. ELISA zuzena..................................................................82<br />
2.6.2. Liposometan oinarrituriko ELISA.....................................82<br />
2.7. BESTELAKO TEKNIKAK........................................................84<br />
2.7.1. Saio antimikrobianoa......................................................84<br />
2.7.2. Saio hemolitikoa..............................................................85<br />
2.7.2.1. Giza odol-eritrozitroen isolaketa..........................85<br />
2.7.2.2. Hemolisi saioa.....................................................85<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I. ZELULA-<br />
MINTZEAN POROAK ERAGITEKO AHALMENA<br />
AURKEZTEN DUEN 2B PROTEINAREN DOMEINUA<br />
Aitzinsolasa 89<br />
3.1. SARRERA..............................................................................90<br />
3.1.1. Poliobirusaren 2B proteina..............................................91<br />
III
IV<br />
Aurkibidea<br />
3.2. ERABILITAKO MATERIALAK, TEKNIKA ESPERIMENTALAK<br />
ETA PROTOKOLOEN SAILKAPENA...............................................95<br />
3.2.1. Peptido <strong>sekuentziak</strong>.........................................................95<br />
3.2.2. Dikroismo zirkularra.......................................................95<br />
3.2.3. Kultibo zelularrekin saioak..............................................96<br />
3.2.3.1. Zelulan espresatzen diren proteinen<br />
irazkortasun ahalmena aztertzeko protokoloa.....................................96<br />
3.2.3.2. Peptidoen irazkortasun ahalmena HB-arekiko.....96<br />
3.2.3.3. Peptidoen irazkortasun ahalmena<br />
α-sartzinarekiko.................................................................................97<br />
3.2.3.4. TM1 peptidoak eragindako<br />
irazkortasunaren inhibizioa................................................................97<br />
3.2.3.5. TM1 eta TM2 peptido biotinilatuen kokapena......98<br />
3.2.4. Lipido-monogeruzekin saioak..........................................98<br />
3.2.5. Lipido-besikulekin saioak................................................98<br />
3.2.5.1. Solutuen askapen saioa......................................99<br />
3.2.5.2. Solutuen sarrera saioa........................................99<br />
3.2.6. AMC eta hemolisi saioak................................................100<br />
3.3. EMAITZAK..........................................................................100<br />
3.3.1. Peptidoen <strong>sekuentziak</strong> eta aurkezten dituzten<br />
egiturak............................................................................................100<br />
3.3.2. Mintz-zelularraren irazkortasunaren handipena<br />
peptidoen bidez.................................................................................103<br />
3.3.3. Aktibitatearen kokapena................................................106<br />
3.3.4. TM1 sekuentziaren karakterizazioa................................109<br />
3.3.5. Karga elektrikoaren eragina...........................................117<br />
3.3.6. Peptidoen aktibitate antimikrobianoa eta hemolitikoa....120<br />
3.4. EZTABAIDA.........................................................................121<br />
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II. GIB-1 BIRUSA<br />
NEUTRALIZATZEKO AHALMENA DUTEN ANTI-GP41 2F5<br />
ETA 4E10 ANTIGORPUTZEK BURUTUTAKO FOSFOLIPIDO<br />
ETA EPITOPOEN EZAGUMENDUA MINTZ-GAINAZALEAN<br />
Aitzinsolasa 129<br />
4.1. SARRERA............................................................................130<br />
4.1.1. 1 motatako giza immunoeskasiaren birusa...................130<br />
4.1.1.1. Birioiaren egitura..............................................130<br />
4.1.1.2. Bizi zikloa .........................................................132
Aurkibidea<br />
4.1.1.3. GIB-aren glikoproteinaren egitura eta<br />
funtzioa............................................................................................134<br />
4.1.1.3.1. Gp41: azpiunitate integrala…………......135<br />
4.1.1.3.2. Transmintz-aurreko sekuentzia ............136<br />
4.1.1.4. GIB-zelula fusio-mekanismoa............................140<br />
4.1.1.5. Antigorputz neutralizatzaileak...........................141<br />
4.2. ERABILITAKO MATERIALAK, TEKNIKA ESPERIMENTALAK<br />
ETA PROTOKOLOEN SAILKAPENA.............................................145<br />
4.2.1. Peptido <strong>sekuentziak</strong> eta antigorputzak...........................145<br />
4.2.2. ELISA ...........................................................................146<br />
4.2.2.1. ELISA protokolo orokorra..................................146<br />
4.2.2.2. Liposometan oinarrituriko elisa protokoloa........146<br />
4.2.2.3. Lehiaketa elisa protokoloa.................................147<br />
4.2.3. Fluoreszentzia bidez egindako neurketak.......................147<br />
4.2.4. Sintzitio-eraketaren inhibizioaren blokeoa.....................148<br />
4.3. EMAITZAK..........................................................................149<br />
4.3.1. Igarpenak mintz-banaketarako......................................149<br />
4.3.2. Mab-mintza banaketaren azterketa liposometan<br />
oinarritutako ELISA bat erabiliz........................................................154<br />
4.3.3. Peptido-epitopoaren ezagumendua mintzaren<br />
interfasean.......................................................................................157<br />
4.3.4. Fosfolipido-Mab elkarrekintzaren espezifizitatea:<br />
Fosfolipidoaren ezagumendua soluzioan eta mintzetan.....................160<br />
4.4. EZTABAIDA.........................................................................166<br />
5. Kapitulua: LABURPENA ETA ONDORIOAK<br />
5.1. Laburpena........................................................................173<br />
5.1.1. Zelula-mintzean poroak eragiteko<br />
ahalmena aurkezten duen 2B proteinaren domeinua........................173<br />
5.1.2. GIB-1 birusa neutralizatzeko ahalmena <strong>duten</strong><br />
anti-gp41 2F5 eta 4E10 antigorputzek burututako fosfolipido<br />
eta epitopoen ezagumendua mintz-gainazalean.................................174<br />
5.2. Ondorioak........................................................................176<br />
6. Kapitulua: BIBLIOGRAFIA.......................................179<br />
Autorearen argitalpenak<br />
V
LABURDUREN eta SINBOLOEN ZERRENDA<br />
AMP: Saio antimikrobianoa<br />
APC: Antigenoak aurkezten<br />
dituzten zelulak<br />
BCA: Azido bizinkoninikoaren<br />
saioa<br />
Biot-PE: Fosfatidiletanolamina<br />
biotinilatua<br />
BSA: Behiaren sero-albumina<br />
Ca 2+ : Kaltzio ioia<br />
CBD: Kabeolinara batzen deneko<br />
domeinua. Ingelesetik, “Caveolin<br />
binding domain”<br />
Ci: Kurioa<br />
CD: Dikroismo zirkularra<br />
CD4 + : GIB-ak ezagutzen duen Tlinfozitoen<br />
giza errezeptorea<br />
CHO: Hamster txinatarraren<br />
obario zelulak<br />
CHO-env: GIB-aren<br />
glikoproteina gainazalean<br />
espresatzen <strong>duten</strong> CHO zelulak<br />
Chol: Kolesterola<br />
CL: kardiolipina<br />
Cl - : Kloro ioia<br />
Cs + : Zesio ioia<br />
Da: Daltona<br />
d-DHPE: N-(5dimetilaminonaftaleno-1sulfonil)-oa<br />
buruan duen 2-<br />
Dihexadekanoilfosfatidiletanola<br />
mina<br />
DilysoCL: Dilisokardiolipina<br />
DMEM: Dulbecco´s Modified<br />
Eagle Medium<br />
DMSO: Dimetilsulfoxidoa<br />
DNA: Azido desoxirribonukleikoa<br />
DNS: N-(5dimetilaminonaftaleno-1sulfonil)<br />
edo dansiloa<br />
VI<br />
Aurkibidea<br />
DOPC: 1,2-Dioleilfosfatidilkolina<br />
dsDNA: Kate bikoitzeko DNA<br />
DTT: Ditiotreitola<br />
Env: GIB-aren gainazaleko<br />
proteina aitzindaria<br />
ER: Erretikulu endoplasmatikoa<br />
Fab: Antigenoa batzen deneko<br />
zatikia, ingelesetik antigen<br />
binding fragment<br />
FD-4: 4.000 kDa-eko<br />
fluoreszeina dextranoa<br />
FD-10: 10.000 kDa-eko<br />
fluoreszeina dextranoa<br />
FITC-strep: Fluoreszeinarekin<br />
markaturik dagoen<br />
estreptabidina<br />
FP: Fusio-peptidoa<br />
GIB: Giza immunoeskasiaren<br />
birusa<br />
GM: Gangliosidoa<br />
gp160: 160 kDa-eko GIB<br />
glikoproteina<br />
gp120: 120 kDa-eko GIB<br />
glikoproteina<br />
gp41: 41 kDa-eko GIB<br />
glikoproteina<br />
HB: B-Higromizina<br />
HC: C-muturreko erregio<br />
errepikakorra<br />
HeLaT4: Henrietta Lakcs-en<br />
uteroaren minbizi zelulak. CD4<br />
errezeptorea eta CXCR koerrezeptorea<br />
espresatzen dituzte<br />
HFIP: Hexafluoroisopropanola<br />
HN: N-muturreko erregio<br />
errepikakorra<br />
HPLC: Presio altuko<br />
kromatografia likidoa<br />
hRBC: Giza-eritrozito zelulak
HR1: 2B proteinaren lehengo<br />
erregio hidrofobikoa<br />
HR2: 2B proteinaren bigarren<br />
erregio hidrofobikoa<br />
HTLV: Linfozitoen leuzemia<br />
eragiten duen birusa<br />
IC50: Peptido edo proteina<br />
kontzentrazioa zeinetan<br />
hemolisiaren %50-a lortzen den<br />
IgG: G motatako<br />
immunoglobulina<br />
HIESA: Harturiko<br />
immunoeskasiaren sindromea<br />
Kb: Kilobasea<br />
Kcal: Kilokaloria<br />
kDa: Kilodaltona<br />
KX: Itxurazko batura konstantea<br />
K + : Potasio ioia<br />
LPS: Lipopolisakarido<br />
Li + : Litio ioia<br />
LUV: Lamela bakarreko besikula<br />
luzea<br />
LysoPC: Lisofosfatidilkolina<br />
LysoPG: Lisofosfatidilglizerola<br />
LysobiPA: Azido fosfatidikoaren<br />
lisoeratorria<br />
L0: Egoera likido ordenatua<br />
Lα: Fase lamelar isurkorra<br />
Ld: Egoera likido-desordenatua<br />
Mab: Antigorputz monoklonala.<br />
Ingelesetik, “Monoclonal<br />
Antibody”<br />
MIC: Hazkuntzaren inhibizioa<br />
emateko beharrezkoa den<br />
kontzentrazio minimoa<br />
MLV: Lamela anitzeko besikula<br />
MPER: Mintzari gertu dagoen<br />
kanpoaldeko alderdia.<br />
Ingelesetik “Membrane proximal<br />
external region”<br />
mV: Miliboltioa<br />
MW: Pisu molekularra<br />
NATA: N-azetil triptofanoamida<br />
Aurkibidea<br />
NBD: 7-Nitrobentzeno-2-oxa-1,3diazol-4-il<br />
nM: Nanomolar<br />
NMR: Erresonantzia magnetiko<br />
nuklearra<br />
Na + : Sodio ioia<br />
nm: nanometroa<br />
PA: Azido fosfatidikoa<br />
PC: Fosfatidilkolina<br />
PE: Fosfatidiletanolamina<br />
PG: Fosfatidilglizerola<br />
PI: Fosfatidilinositola<br />
POPC: 1-Palmitil-2oleilfosfatidilkolina<br />
PreTM: Transmintz-aurreko<br />
erregioa<br />
PS: Fosfatidilserina<br />
Rh-PE: B-sulfonil lisamina<br />
rodamina baturik duen<br />
fosfatidiletanolamina<br />
RNA: Azido erribonukleikoa<br />
Rb + : Rubidio ioia<br />
SDS: Sodio dodezil sulfatoa<br />
SDS-PAGE: SDS-aren<br />
presentzian egindako<br />
elektroforesia poliakrilamida<br />
geletan<br />
SIV: Tximinoaren<br />
immunoeskasiaren birusa<br />
Ingelesetik “Simian<br />
Inmunodeficiency virus”<br />
SLE: Eritematosoa eta<br />
sistemikoa den Lupusa<br />
SM: Esfingomielina<br />
ssRNA+: Kate bakarreko eta<br />
polaritate positiboa duen RNA<br />
ssRNA-: Kate bakarreko eta<br />
polaritate negatiboa duen RNA<br />
Strp: Estreptabidina<br />
SUV: Lamela bakarreko<br />
liposoma txikiak<br />
SV: Sindbis birusa<br />
Tm: Lipidoen fusio tenperatura<br />
VII
TMD: Transmintz domeinua<br />
TM1: Lehenengo transmintz<br />
domeinua. 2B proteinari<br />
dagokion 35-55 aminoazidoak<br />
TM2: Bigarren transmintz<br />
domeinua. 2B proteinari<br />
dagokion 61-81 aminoazidoak<br />
UV: Ultramorea<br />
[θ]: Eliptizitate molarra<br />
Deg.cm 2 .dmol -1<br />
6-HB: 6-helize sorta. Ingelesetik,<br />
“6 helix bundle”<br />
[ 35 S]met/Cys:<br />
[ 35 S]metionina/[ 35 S]zisteina<br />
marka erradiaktiboa<br />
α-HL: α-hemolisina<br />
VIII<br />
Aurkibidea<br />
Ǻ: Angstrom<br />
∆Ψ: Transmintz potentziala<br />
Ψ0: Gainazaleko potentzial<br />
elektrostatikoa<br />
Ψd: Potentzial elektrostatiko<br />
dipolarra<br />
µF: mikrofaradio<br />
λ: Uhin-luzera<br />
λexc: Kitzikatze uhin luzera<br />
λem: Igorpen uhin luzera<br />
πc /πexc: Txertaketarako presio<br />
kritikoa<br />
π0: Hasierako presioa<br />
σ: Gainazaleko karga dentsitatea
Aurkibidea<br />
IX
X<br />
Aurkibidea
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
______________________________________________________________________<br />
1.1. MINTZ-BIOLOGIKOAK<br />
Mintzarekin batera bizitza jaio zen. Mintza agertu arte ez zen izaki<br />
bizidunik existitzen, soilik osagai biologiko askeak. Bizitzak, mugak<br />
behar ditu, zelularen barne-osagaiak sakabanatu ez daitezen eta<br />
inguruneko osagaiak sar ez daitezen. Mintza zaindariz beteriko harresi<br />
baten modukoa da, mezuak edo energia eramaten dituzten molekulen<br />
sarrera eta irteera selektiboa baimentzen duena.<br />
1.1.1. MINTZ-BIOLOGIKOEN FUNTZIO ETA<br />
EZAUGARRIAK<br />
Mintz plasmatikoaren egitura azaltzeko, Singer eta Nicolson-ek<br />
(Singer, S. J. eta Nicolson, G. L., 1972) mosaiko isurkorraren eredua<br />
proposatu zuten. Eredu honek mintzaren izaera isurkorra eta<br />
dinamikoa isladatzen du, fosfolipidoak eta proteinak mintzaren<br />
gainzaletik lateralki barreiatzeko ahalmena dutela iradokitzen duelarik.<br />
Baina eredu honek ez ditu beste ezaugarri batzuk aintzat hartzen, hain<br />
zuzen ere mintza funtzionalki eta egituralki konplexua egiten<br />
dituztenak.<br />
Ikuspuntu mekanikotik, mintzak ondorengo definizioa izan<br />
dezake: “Aldamenean dituen bi domeinu likido banatzen dituen<br />
materiala, bere kurbatura erradioarekin alderatuz lodiera oso txikia<br />
duena eta inguruko medioak eragiten dizkion tentsioak jasateko<br />
gaitasuna duena (Bloom, M., Evans, E. eta lank., 1991).<br />
1
2<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
1.1. Irudia: Mintzaren egitura.<br />
Eredu orokorrak. A) Singer-Nicolson-en<br />
eredua. B) Bertsio eguneratua eta<br />
zuzendua (Engelman, D. M., 2005).<br />
Ikuspuntu funtzionaletik,<br />
zelula-mintzek elkar-erlazionaturik<br />
dauden lau funtzio orokor betetzen<br />
dituzte (Jain, M. K., 1988; Evans,<br />
W. H., 1989; Gennis, R. B., 1989;<br />
Wilschut, J., 1991):<br />
a) Zelula barneko atal ezberdinak banatzen dituzten hesi fisikoak<br />
dira. Modu honetan atal bakoitzaren osaketa mantentzen da, eta<br />
prozesu biokimikoak era egoki batean burutu daitezke.<br />
b) Mintzen egiturak irazkortasun selektiboa baimentzen duenez,<br />
molekulen garraio mugatua ematen da.<br />
c) Zelula barneko atalen artean seinale kimikoak edo/eta energia<br />
trukatzen <strong>duten</strong> interfaseak dira.<br />
d) Berauei atxekiturik dauden eta aurreko funtzioak bete behar<br />
dituzten molekulei ingurune egokiaz hornitzen diete. Besteak beste:<br />
entzimei, ioi-ponpei, errezeptoreei etab.<br />
1.1.2. MINTZAREN OSAKETA<br />
Mintzaren osagai nagusiak lipidoak eta proteinak dira.<br />
Karbohidratoak ere ageri dira, baina glikolipido edo glikoproteina<br />
moduan eta mintzaren pisu sikuaren %10 gainditu gabe.
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Mintz motaren arabera, lipido eta proteinen kantitate erlatiboak<br />
oso ezberdinak izan daitezke. <strong>Mintzetan</strong> aurkitzen den proteina<br />
kantitatea mintzaren dentsitatearekin erlazionaturik dago beraz, zenbat<br />
eta proteina kantitatea altuagoa izan, mintzaren dentsitatea altuagoa da<br />
(Gennis, R. B., 1989).<br />
Taula 1.1.: Lipido eta proteina osaketa zenbait animali eta bakterio mintzetan.<br />
L/P, lipido/proteina erlazioa pisu sikuan.<br />
Mintzak Lipido nagusienak a L/P<br />
(p/p)<br />
-Mielina (gizakiak) -PC 10%<br />
-PE 20%<br />
-PS 8,5%<br />
-SM 8,5%<br />
-Chol 27%<br />
-GM 26%<br />
-Eritrozitoak (gizakiak) -PC 25%<br />
-PE 22%<br />
-PS 10%<br />
-SM 18%<br />
-Chol 25%<br />
-Errezeptore<br />
-PC 24%<br />
kolinergikoaren mintza -PE 23%<br />
(Torpedo marmorata) -PS 9,6%<br />
-Chol 40%<br />
-Barnealdeko mintza -PE 74%<br />
(Escherichia coli)<br />
-PG 19%<br />
-CL 3%<br />
-Mintz purpura<br />
(Halobacterium halobium)<br />
-Fosfatidilglizerolfosfatoa<br />
52%<br />
-Glikolipidoak 30%<br />
-Lipido neutroak 6%<br />
Proteina nagusienak<br />
3-4 -Proteina basikoa<br />
-Lipofilina<br />
(proteolipidoa)<br />
0,75 -3. banda<br />
-Glikoforina<br />
-Glizeraldehido-3-fosfato<br />
deshidrogenasa<br />
0,7-<br />
0,5<br />
0,4<br />
-Azetilkolinaren<br />
errezeptorea<br />
0,2 -Bakteriorrodopsina<br />
a Erabili diren laburdurak hurrengoak dira: PC, fosfatidilkolina; PE,<br />
fosfatidiletanolamina; PS, fosfatidilserina; SM esfingomielina; PG, fosfatidilglizerola;<br />
Chol, kolesterola; CL, kardiolipina; GM gangliosidoa. Taula (Gennis, R. B., 1989)-etik<br />
moldatua izan da.<br />
3
4<br />
1.1.2.1. MINTZ PROTEINAK<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Mintzek, %20-%80 arteko (p/p) proteina-portzentajea daukate.<br />
Mintz-proteinak funtzio aktiboak betetzen dituzten osagaiak dira.<br />
Mintzari lau modu ezberdinetan loturik agertu daitezke:<br />
1.- Transmintz-proteinak. Bigeruza erabat zeharkatzen <strong>duten</strong><br />
proteinak dira. Bigeruza behin zeharkatu dezakete, glikoforinak egiten<br />
duen moduan, edo behin baino gehiagotan, bakteriorrodopsinak egiten<br />
duen bezala (1.2 irudia) (White, S. H. eta Wimley, W. C., 1999).<br />
2.- Mintzera ainguraleku baten bidez batzen diren proteinak.<br />
Ainguralekua aminoazido apolarren hondar zatiki bat izan daiteke.<br />
Zatiki hau aurreikuspen metodoen bidez identifikatu daiteke, b5<br />
zitokromo (Takagaki, Y., Radhakrishnan, R. eta lank., 1983) edo TrwBren<br />
kasuan egin zen moduan (Hormaeche, I., Iloro, I. eta lank., 2004).<br />
Gantz azidoak edo fosfolipidoak kobalenteki lotuta dituzten proteinek,<br />
gantz azido edo fosfolipido hauek erabiltzen dituzte ainguraleku gisa<br />
mintzera batzeko. Azken hauen adibideak, proteina miristilatuak eta<br />
palmitilatuak (Resh, M. D., 1994), eta glikosil-fosfatidilinositolera lotuta<br />
dauden proteinak dira (Cross, G. A., 1987; Low, M. G., 1987).<br />
3.- Mintzaren gainazalarekin elkarrekiten <strong>duten</strong> proteinak.<br />
Elkarrekintza elektrostatikoa izan daiteke, mielina proteina basikoan<br />
gertatzen den moduan (Cajal, Y., Boggs, J. M. eta lank., 1997), edo<br />
hidrofobikoa, zenbait peptido anfipatikoen kasuan (White, S. H. eta<br />
Wimley, W. C., 1999), edo E. coli-ren α-hemolisinaren kasuan bezala<br />
(Sanchez-Magraner, L., Cortajarena, A. L. eta lank., 2006).<br />
4.- Mintzean baturik dauden beste proteinekin elkarrekiten<br />
<strong>duten</strong>ak, adibidez, protoi ATPasa-ren F1 zatikiarekin gertatzen den<br />
moduan. F1 zatikia, mintza zeharkatzen duen F0 zatikira batzen da<br />
(Pedersen, P. L. eta Carafoli, E., 1987). Beste adibide bat eritrozito<br />
zitoeskeletoaren proteinak dira, mintzera “3. banda” transmintz<br />
proteinarekin elkarrekiten batzen direnak (Bennett, V., 1985; Hansen,<br />
J. C., Skalak, R. eta lank., 1997).
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
1.2. Irudia: Mintz-proteinak bigeruzan batu ahal diren modu ezberdinen<br />
eskema. (1) Behin edo (2) behin baino gehiagotan mintza zeharkatzen dituzten<br />
transmintz proteinak. (3) Mintzari lipido batera lotura kobalente baten bitartez batzen<br />
diren proteinak. (4) Mintzari beraien egitura sekundariokoaren parte den zatiki<br />
hidrofobiko baten bitartez lotzen diren proteinak. (5) Mintzaren gainazalari indar<br />
elektrostatikoen bitartez, edo (6) elkarrekintza hidrofobikoen bitartez batzen diren<br />
proteinak. (7) Beste transmintz proteina batera batzen diren proteinak. Irudia (Gennis,<br />
R. B., 1989)-tik egokitua izan da.<br />
Mintz-proteinak, proteina intrintsekoetan (integralak) edo<br />
estrintsekoetan (periferikoak) sailkatu daitezke. Sailkapen hau, proteina<br />
mintzetik erauzteko erabiltzen den tratamenduan oinarritzen da.<br />
Proteina estrintsekoak indar ioniko altuko tanpoiekin, pH aldaketekin<br />
edo EDTA moduko katioi dibalenteen kelatzaileekin erauzi daitezken<br />
proteinak dira. Proteina intrintsekoak erauzteko tratamendu<br />
gogorragoak erabili behar dira, askotan mintza ere deusezten <strong>duten</strong>ak,<br />
adibidez, detergenteak edo disolbatzaile organikoak erabiliz (Tanner, M.<br />
J. A.). Proteina estrintseko eta intrintsekoen arteko bereizketak, ez du<br />
proteina eta mintzaren arteko lotura mota nolakoa den zehazten, baina<br />
bai loturaren indar erlatiboa.<br />
1.1.2.2. LIPIDOAK<br />
Lipidoak oso talde heterogeneoa osatzen <strong>duten</strong> sustantziak dira.<br />
Hauen ezaugarri amankomuna, uretan disolbagarritasun baxua<br />
daukatela da.<br />
5
6<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Lipidoen definizioetako bat hurrengoa da: “Jatorri biologikoa<br />
daukaten sustantziak dira, kloroformoaren moduko disolbatzaile<br />
organikoetan disolbagarriak direnak eta uretan oso gutxi edo<br />
disolbaezinak direnak (Voet, D. eta Voet, J. G., 1992).<br />
Mintzaren egitura, bigeruza eratzeko ahalmena daukaten lipido<br />
anfipatikoei (batez ere fosfolipido eta esfingolipidoei) dagokie. Lipidoen<br />
ezaugarriei esker bigeruzek kimikoki oso ezberdinak diren bi alde<br />
dituzte: nukleo hidrofobikoa eta interfasea. Nukleo hidrofobikoa,<br />
fosfolipidoen kate hidrokarbonatuek eta kolesterolak osotzen <strong>duten</strong><br />
bitartean, interfasea lipidoen buru polarrek osatzen dute.<br />
Mintz biologikoen arteko lipido konposaketa oso ezberdina da,<br />
mintz mota bakoitzaren funtzioaren espezifizitatea modu honetan<br />
isladatzen delarik.<br />
Mintz-lipidikoen ezaugarri interesgarri bat, lipido mota ugarietan<br />
aberatsak direla da. Arestian, lipidoen funtzio bakarra bigeruza eratzea<br />
zela pentsatzen zen, baina azalpen hau ez da bat etortzen aurkezten<br />
<strong>duten</strong> dibertsitatearekin. Mintz bakar bat ehun bat lipido-espezie<br />
ezberdinez osoturik egon daiteke eta mintz mota bakoitzak lipido<br />
konposaketa ezberdin bat izango du. Azkenaldi honetan lipidoek<br />
mintzarekin erlazionatuta dauden prozesu aktiboetan parte hartzen<br />
dutela onartzen ari da, lipido bakoitzak prozesu horietan zenbait<br />
zeregin izanik.<br />
Zeregin hauetako batzuk bigeruzaren egitura eratzeaz gain,<br />
hurrengoak dira:<br />
-Bigeruzaren seinaleztapen zelularrean parte hartzea.<br />
-Bigarren mezulari moduan jokatzea.<br />
-Hazkuntza zelularraren erregulazioan parte hartzea.<br />
-Erreakzio biosintetikoetan parte hartzea.<br />
-Kurbadura negatiboa daukaten erregioak eratzea.<br />
1.1.2.2.1. SAILKAPENA<br />
Zelula-mintzak osatzen dituzten lipido nagusienak<br />
diazilglizerolean (fosfolipidoak) eta zeramidan (esfingolipidoak)<br />
oinarritzen dira.
1.1.2.2.1.1. Glizerofosfolipidoak<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Fosfolipidoetan glizerolaren hidroxilo primario taldea fosforilatua<br />
dago. 1.2 taulan glizerofosfolipidoen fosfato terminalari batu daitezkeen<br />
hondar ezberdinak irudikatzen dira, fosfatidilkolinak, fosfatidilserinak,<br />
fosfatidiletanolaminak lortzen direlarik besteak beste. Beste bi hidroxilo<br />
taldeak, orokorrean, beste bi gantz azidoei ester lotura baten bitartez<br />
loturik egoten dira. Gantz-azido hauen luzera eta asegabetasun maila<br />
oso aldakorra izaten da.<br />
1.2. Taula: Glizerofosfolipidoen egitura. Eskuinaldeko irudia:<br />
Glizerofosfolipidoen egitura orokorra; X-ak buru polar ezberdinak adierazten ditu.<br />
Ezkerreko taula: Buru polar ezberdinen egiturak. (Nelson, D. L. eta Cox, M. M.,<br />
2005)-tik egokitua.<br />
Glizerofosfolipidoaren<br />
izena<br />
Azido fosfatidikoa<br />
Fosfatidiletanolamina<br />
Fosfatidilkolina<br />
Fosfatidilserina<br />
Fosfatidilglizerola<br />
Fosfatidilinositola<br />
Kardiolipina<br />
X-ren formula<br />
Gantz-azido asea<br />
(Azido palmitikoa)<br />
Gantz-azido asegabea<br />
(azido oleikoa)<br />
Kardiolipinak (CL), 1,2-diazilfosfoglizerido dimerikoak dira eta oso<br />
ugariak dira batez ere mitokondriaren barne-mintzean eta zenbait<br />
bakterioen mintzetan (Dowhan, W., 1997).<br />
7
8<br />
1.1.2.2.1.2. Esfingolipidoak<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Esfingolipidoak esfingosinan oinarriturik daude (1.3 taula).<br />
Zeramidak, glizerolari amida lotura baten bitartez, bigarren gantz-azido<br />
bat loturik daukaten esfingosinak dira. Esfingolipido mota ezberdinak,<br />
fosfolipidoekin gertatzen den moduan, zeramidaren hidroxilo<br />
primarioari lotzen zaion talde polarraren arabera sailkatzen dira.<br />
Talde polarra fosforilkolina denean, esfingolipidoari esfingomielina<br />
deritzaio, azukre arrunt bat denean zerebrosidoak deritzaie eta azido<br />
sialiko hondar bat baino gehiagoko oligosakarido konplexuak<br />
dituztenean, ostera, gangliosidoak.<br />
1.3. Taula: Esfingolipidoen egitura. Ezkerraldeko irudia: Esfingolipidoen<br />
egitura orokorra, X-ak buru polar ezberdinak adierazten ditu. Eskuinaldeko taula:<br />
Buru polarren egiturak (Nelson, D. L. eta Cox, M. M., 2005)-tik egokitua.<br />
Gantz azidoa<br />
Esfingolipidoen<br />
izenak<br />
Zeramida<br />
Esfingomielina<br />
-Glikolipido neutroak:<br />
Glukosilzerebrosidoa<br />
Laktosilzeramida<br />
Gangliosidoa GM2<br />
X-aren formula
1.1.2.2.1.3. Esterolak<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Esterolak landareen, animalien eta mikroorganismo eukariotoen<br />
mintzetan aurkitzen dira. Kolesterola (chol) animalietan agertzen den<br />
esterolik ugariena da. Kolesterola molekula trinko, zurruna eta<br />
hidrofobikoa da, hidroxilo talde txikia buru polartzat daukana (1.3<br />
irudia).<br />
Animalien mintz plasmatikoan, lisosometan, endosometan eta<br />
Golgi aparailuan aurkitzen da. Animalien mintz plasmatikoaren %30-a<br />
gutxi gorabehera kolesterolez osaturik dago.<br />
Buru polarra<br />
Nukleo<br />
esteroideoa<br />
Alkilo<br />
alboko<br />
katea<br />
1.3. Irudia: Kolesterol molekularen irudikapen molekularra. (Nelson, D. L.<br />
eta Cox, M. M., 2005)-tik egokitua.<br />
9
10<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
1.1.3. LIPIDOEN BANAKETA ASIMETRIKOA<br />
MINTZEAN<br />
1.1.3.1. LIPIDOEN BANAKETA ZELULA BARNEKO ORGANULU<br />
EZBERDINEN MINTZETAN<br />
Zelula eukariotoan, organulu batetik bestera mintzetako lipido<br />
konposaketa asko aldatzen da. Organulu guztiek lipido espezie<br />
berdinak dituzte gutxi gorabehera, baina beraien arteko erlazio molarra<br />
oso ezberdina da (1.4. taula), organulu bakoitzeko mintzaren osaketa<br />
bakarra eta zehatza delarik. Kolesterolaren presentzia adibidez oso<br />
altua da mintz plasmatikoan, erretikuluko mintzarekin edo Golgi<br />
aparatuko mintzarekin konparatzen baldin badugu.<br />
Lipido gehiena erretikulu endoplasmatikoan sintetizatzen da,<br />
beraz mintzetan agertzen den lipido konposaketa ezberdintasun horrek,<br />
lipidoak organulu bakoitzera modu espezifiko batean garraiatuak izan<br />
behar direla iradokitzen du (van Meer, G., 1989). PE, PI eta PS,<br />
adibidez, erretikuluaren azalera zitoplasmatikoan bakarrik sintetizatzen<br />
dira eta bertan geratzen dira; PC-arentzat aldiz, bere translokazioa<br />
baimentzen dituzten flipasa espezifikoak daude. Honek zeharkako lipido<br />
asimetria bat eragiten du.<br />
Gantz azidoen insaturazio mailari dagokionez, ezberdintasunak<br />
daude organulu ezberdinen artean. PS-aren kasuan adibidez,<br />
erretikulu endoplasmatikoan gantz azido insaturatuen portzentajea<br />
%45-ekoa da %75-raino heldu daitekeelarik. Golgi aparatuan %36-koa<br />
da eta mintz plasmatikoan %29-koa (Keenan, T. W. eta Morre, D. J.,<br />
1970).
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
1.4. Taula: Arratoi gibelaren zenbait organulu intrazelularren ohiko lipido<br />
konposaketa. Baloreak lipido bakoitzaren portzentaje molarrari dagozkie. E. D. : Ez<br />
detektatua, (van Meer, G., 1989)-tik lorturiko datuak.<br />
Fosfolipidoa Mitokondriaren<br />
mintza<br />
SM<br />
PC<br />
PI<br />
PS<br />
PE<br />
CL<br />
LisobiPA<br />
Chol/fosfolipido<br />
(mol/mol)<br />
0.5 %<br />
40.3 %<br />
4.6 %<br />
0.7 %<br />
34.6 %<br />
17.8 %<br />
0.2 %<br />
0.03 %<br />
Erretikulu<br />
endoplasmatikoa<br />
2.5 %<br />
58.4 %<br />
10.1 %<br />
2.9 %<br />
21.8 %<br />
1.1 %<br />
e.d.<br />
0.08 %<br />
Mintzplasmatikoa<br />
16.0 %<br />
39.3 %<br />
7.7 %<br />
9.0 %<br />
23.3 %<br />
1.0 %<br />
e.d.<br />
0.4 %<br />
Lisosomaren<br />
mintza<br />
20.3 %<br />
39.7 %<br />
4.5 %<br />
1.7 %<br />
14.1 %<br />
1.0 %<br />
7.0 %<br />
0.5 %<br />
1.1.3.2. LIPIDOEN BANAKETA MINTZ PLASMATIKOAN ZEHAR<br />
Mintz plasmatikoa ez-uniformea eta konplexua den agregatu<br />
makromolekularra da, zelularen egoera fisiologikoaren arabera, bere<br />
konposaketa kimikoa eta fisikoa etengabe aldatzen duena. Mintz<br />
honetan konposaketa lipidikoan asimetria nabarmen bat agertzen da.<br />
1.1.3.2.1. ZEHARKAKO ASIMETRIA: MINTZ<br />
PLASMATIKOAREN KANPOALDEKO ETA BARNEALDEKO<br />
MONOGERUZAK<br />
Mintz plasmatikoaren bi monogeruzak euren konposaketan,<br />
propietateetan eta bertan ematen diren aktibitate metabolikoetan<br />
desberdintzen dira. Kanpoaldeko monogeruzak, azalerako markatzaile<br />
metabolikoen papera betetzen <strong>duten</strong> errezeptoreak eta karbohidrato<br />
espezializatuak ditu (Akiyama, S. K., Nagata, K. eta lank., 1990;<br />
Hakomori, S. eta Igarashi, Y., 1993; Hakomori, S. eta Igarashi, Y.,<br />
1995).<br />
11
12<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Barneko monogeruza eta alboan dagoen fase urtsua aldiz,<br />
erreakzio metaboliko konplexuak burutzen diren guneak dira. Erreakzio<br />
hauek, monogeruza osatzen <strong>duten</strong> lipidoen banaketa espazialagatik eta<br />
osaketagatik mugatuak daude. Zenbait lipido erreakzio hauetan<br />
partaide aktiboak dira, kofaktore eta substratu moduan jokatzen<br />
dutelako. Honen adibide on bat giro extrazelularretik barne ingurunera<br />
gertatzen den seinale transferentzian inplikaturik dauden bigarren<br />
mezulariak dira, fosfoinositidoak kasu (Berridge, M. J., 1987;<br />
Nishizuka, Y., 1992; Berridge, M. J., 1993). Lipido hauek funtzio zelular<br />
garrantzitsuak betetzen dituztenez, mintz plasmatikoan proportzio<br />
baxuan agertzen dira eta kontrol metaboliko zorrotz baten menpe<br />
aurkitzen dira. Beraz bi monogeruzen konposaketa lipidikoak azalera<br />
bakoitzaren funtzioa zehazten du.<br />
Mintzaren kanpo geruzaren funtzioa hesi geldo bat eratzea da.<br />
Orokorrean, kanpo monogeruzaren lipido-osagaiak ez du kanpo<br />
medioan dauden molekulekin elkarrekintza espezifikoetan parte<br />
hartzen.<br />
PC, SM eta chol-a mintz plasmatikoaren kanpo-monogeruzan<br />
sarrien agertzen diren lipidoak dira, baita glikolipidoak ere, baina maila<br />
baxuagoan (1.5 taula). Kolina taldeak oso hidratatuak daude, 25 eta 30<br />
ur molekula daude kolina buru polar talde bakoitzeko; etanolaminaren<br />
kasuan 10-12 ur molekula daude buru polar bakoitzeko (Simon, S. A.<br />
eta McIntosh, T. J., 1989). PC-aren hidratazio geruzak bi mintzak<br />
elkarri hurbiltzea edo beste molekula batzuk mintzarekin elkartzea<br />
eragozten du. PC-aren funtzio posible bat mintz plasmatikoaren<br />
kanpoko monogeruzan makroegitura hidratatuen kontaktua eragoztea<br />
izan daiteke (McIntosh, T. J., Magid, A. D. eta lank., 1989).
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
1.5. Taula: Mintz plasmatikoaren zeharkako asimetria. Eritrozitoen mintz<br />
plasmatikoaren kanpoko eta barneko mintzaren arteko fosfolipidoen banaketa<br />
adierazten da. Fosfolipido espezifikoen banaketa determinatzeko zelulak C<br />
fosfolipasarekin tratatzen dira. Entzima honek kanpoaldeko fosfolipidoen buru<br />
polarrak soilik erauzten ditu, barnealdekoak osorik mantentzen direlarik. Erauzi diren<br />
buru polarren proportzioak kanpoaldeko monogeruzaren lipido frakzioaren zenbatekoa<br />
ematen digu. Morez, kanpoaldeko monogeruzan banatuta agertzen diren lipido<br />
bakoitzaren portzentajeak azaltzen dira, eta arrosaz monogeruza zitoplasmatikoan<br />
agertzen direnena. (Zachowski, A., 1993; Nelson, D. L. eta Cox, M. M., 2005)-tik<br />
lorturiko datuak.<br />
Mintzeko fosfolipidoak Mintzeko<br />
fosfolipidoen<br />
portzentaje<br />
osoa<br />
-Fosfatidiletanolamina<br />
-Fosfatidilkolina<br />
-Esfingomielina<br />
-Fosfatidilserina<br />
-Fosfatidilinositola<br />
-Fosfatidilinositol-4fosfatoa<br />
-Fosfatidilinositol-4,5<br />
bifosfatoa<br />
-Azido fosfatidikoa<br />
30<br />
27<br />
23<br />
15<br />
5<br />
5<br />
5<br />
5<br />
Fosfolipidoen banaketa mintzean<br />
Kanpoaldeko Barnealdeko<br />
geruza geruza<br />
100 0 100<br />
13
14<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Fosfolipido anionikoek proteina ezberdin askorekin elkarrekiteko<br />
ahalmena daukatela ikusi da. Beraz, karga kanpo monogeruzan egongo<br />
balitz, molekula askoren elkarrekintza bigeruza lipidikoarekin<br />
faboratuko litzateke. Mintz plasmatikoaren kanpo-mintzean, kargadun<br />
molekulen agerpenak zenbait baldintza fisiologikoetan ematen den<br />
lipidoen transferentzia sistemaren erantzun esklusiboa da (Diaz, C. eta<br />
Schroit, A. J., 1996). Sistema honetan akatsak emateak, kanpo<br />
mintzean fosfolipido anionikoak agertzea dakar (PS-a adibidez), zelula<br />
arteko seinale batean bilakatuz, eta honela immunitate-sistemak zelula<br />
eliminatu egiten du (Connor, J., Pak, C. C. eta lank., 1994). Kanpo<br />
monogeruzan agertzen ohi den karga bakarra glikolipidoek eragindakoa<br />
da.<br />
Mintz plasmatikoaren barnealdeko monogeruzak,<br />
kanpoaldekoarekin konparatuz, oso lipido-osaketa berezia aurkezten du<br />
eta funtzio ezberdinak betetzen ditu. Barne mintzean ez dago<br />
karbohidratoez osoturiko geruzarik, hots, glikokalixaren antzeko<br />
zerbait. Geruza babesle honen gabeziak makromolekulek mintzaren<br />
gainazala errazago eskuratzea eragiten du. Nahiz eta PC, SM eta Chol<br />
monogeruza honetan agertu, PE osagai neutrorik arruntena da.<br />
Fosfolipido anioniko anitz eta kantitate altuan agertzen dira, PS eta PIren<br />
presentzia azpimarratzekoa delarik (1.5 taula). Fosfolipido hauek<br />
monogeruza zitoplasmatikoan bakarrik agertzen direnez,<br />
aldebakarrekoak direla esan daiteke. Kargadun talde hauek interfasean<br />
agertzen direnez, elkarrekintza elektrostatikoak alderdi honetan<br />
sarriagoak izaten dira. Beraz, mintz plasmatikoaren barnealdeko<br />
azalerara proteina ugari batzeko aukera handitzen da (Heimburg, T. eta<br />
Marsh, D., 1995; Leenhouts, J. M., van den Wijngaard, P. W. eta lank.,<br />
1995).<br />
Barnealdeko mintzarekin elkarregiteko ahalmena daukaten<br />
proteinek aminoazido kationikoetan oso aberatsak diren domeinu<br />
espezializatuak dituzte, nolabait lipido anionikoekin elkarrekintza<br />
elektrostatikoa faboratuz (Mosior, M. eta McLaughlin, S., 1992; Buser,<br />
C. A., Kim, J. eta lank., 1995; Heymann, J. B., Zakharov, S. D. eta<br />
lank., 1996).<br />
Kanpoko monogeruzarekiko, beste asimetria mota bat nabaritu<br />
daiteke, barne mintzean dagoen fosfolipido asegabeen portzentajea<br />
altuagoa da. Asegabetasun maila altu honek monogeruzari<br />
jariakortasun handia ematen dio, eta honek proteinen <strong>txertaketa</strong><br />
errazten du.
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Duela urte gutxi arte, mintzaren lipido-asimetria, bi monogeruzak<br />
kokatzeko <strong>duten</strong> berezko giro asimetriko naturalaren ondorioa zela uste<br />
zen. Baina monogeruza batetik bestera ematen den lipidoen difusioa<br />
prozesu geldoa da. Geroago, zelula biziek mintzeko fosfolipidoen<br />
zeharkako banaketa kontrolatu ahal izateko, mekanismo landu bat<br />
garatu dutela aurkitu zen (van Meer, G., 1989; Zachowski, A., 1993;<br />
Boon, J. M. eta Smith, B. D., 2002). Fosfolipasa endogenoek,<br />
erreazilasek, flipasek, etab hartzen dute parte mekanismo hauetan.<br />
1.1.3.3. LIPIDO DOMEINUAK<br />
Aurreko atalean aipatu den moduan, mintzeko lipidoen<br />
zeharkako banaketa ez da uniformea. Mintz-domeinuak, lipidoak<br />
mintzaren planoan zehar fase hetereogeneo ezberdinetan banatzen<br />
direnean eratzen dira (Simons, K. eta Ikonen, E., 1997). Mintzaren<br />
beste alderdi batzuekin alderatuz, propietate fisiko eta konposaketa<br />
ezberdinak dituzten erregioak dira. Domeinu hauek mintz<br />
plasmatikoetan zein eredu mintzetan ikus daitezke. Lipidoen zeharkako<br />
antolakuntza mintzetan kate hidrokarbonatuen ezberdintasunen menpe<br />
(Sankaram, M. B., Marsh, D. eta lank., 1994; Garidel, P., Johann, C. eta<br />
lank., 1997), eta berezko interfasean gertatzen diren elkarrekintzen<br />
menpe dago (Eklund, K. K., Vuorinen, J. eta lank., 1988; Gawrisch, K.,<br />
Ruston, D. eta lank., 1992; Huang, J., Swanson, J. E. eta lank., 1993).<br />
Kolesterol eta esfingomielinan aberatsak diren domeinuak<br />
adibidez, zurrunak eta ordenatuak dira (isurkortasun txikia dute).<br />
Detergente ez-anionikoak erabiliz askoz zailagoak dira solubilizatzen.<br />
Egoera likido desordenatuan dauden fosfolipido itsaso batean (Ld),<br />
egoera likido-ordenatuan (Lo) dauden SM eta chol-ak baltsa (raft)<br />
moduko bat osotuko dute (1.6. irudia). Esfingolipidoen kate<br />
hidrokarbonatu luze eta aseek, kate hidrokarbonatu asegabeek baino,<br />
elkarrekintza egonkorrago eta zurrunagoak eratzen dituzte<br />
kolesterolarekin. Esfingolipidoak bata bestearekin elkartzen dira, ziur<br />
aski buruen arteko elkarrekintzen bidez. Esfingolipidoen buruek, kanpo<br />
monogeruzaren planoan, berauen kate hidrokarbonatuek (orokorrean<br />
aseak direnak) baino azalera handiagoa betetzen dute. Honengatik<br />
esfingolipidoek utzitako hutsuneak kolesterol molekulek betetzen<br />
dituzte (Simons, K. eta Ikonen, E., 1997).<br />
15
16<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Raft motatako domeinuak ez daude mintzean era zurrun batean<br />
banatuta, honela, mintz-proteinak raft-etatik kanpora eta barnera<br />
mugitu daitezke, segundutako denbora eskalan.<br />
Mikrosegundutako eskala batean (prozesu biokimikoekin hobeto<br />
datorrena bat) proteinen gehiengoa raft-etan kokatuta dago.<br />
Esperimentu ezberdinek frogatzen dute, proteina hauen arteko<br />
seinaleztapena eten egiten dela mintz-plasmatikoan dagoen kolesterola<br />
bahitzen bada, lipido-raft hauek deuseztatzen baitira.<br />
1.6. Irudia: Mintz–plasmatikoan aurkitzen diren mikrodomeinuen (raft)<br />
egitura. Elkarketa hauek mintz proteinetan oso aberatsak dira, adibidez, mintzeko<br />
kanpo monogeruzako GPI-ra batzen diren proteinetan. Raft motako domeinuak indar<br />
atomikoko mikroskopiarekin ikusita: laranja kolorearekin SM-n aberatsak diren raftak<br />
eta beltzez DOPC-a; lipido bigeruza mika baten gainera transferitu da. Azaltzen<br />
diren hori koloreko tontortxoak GPI-ra batzen diren proteinak dira (Fosfatasa<br />
alkalinoa batuta daukate). Proteina hauek soilik raft-etan aurkitzen dira. Azpialdean<br />
adierazpen grafiko bat irudikatu da: esfingolipido eta kolesterolaren arteko elkarketa<br />
egonkorrak mintz plasmatikoan. Laranjaz SPM eta urdinez Chol adierazi dira. Irudia<br />
(Saslowsky, D. E., Lawrence, J. eta lank., 2002)-tik egokitu da.
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Lipido-raft-ak funtzio biologiko ugariekin erlazionatu dira,<br />
adibidez, seinale transdukzioarekin, zelularen morfogenesiarekin,<br />
zelula-mintzetako trafikoarekin eta birus eta toxinen sarrerarekin.<br />
1.1.4. BIGERUZAREN EGITURA<br />
Bigeruza bi erregiotan banatzen dela ezagutzea posiblea egin<br />
duen ebidentzia (interfase eta nukleo hidrokarbonatuan), 1,2-dioleil-snglizero-3-fosfatidilkolina<br />
(DOPC) lipidoa Lα fasean (fase lamelar<br />
isurkorra) kristalografikoki determinatzea izan zen (Wiener, M. C. eta<br />
White, S. H., 1991; Wiener, M. C. eta White, S. H., 1991; Wiener, M. C.<br />
eta White, S. H., 1992).<br />
DOPC lipidoaren Lα fasearen egitura, lipidoa osatzen <strong>duten</strong> talde<br />
molekularren banaketa espazialean oinarritzen da (karboniloak,<br />
fosfatoak…) (Wiener, M. C. eta White, S. H., 1991). Egiturak guztiz<br />
ebazteko, autoreek X-izpietan eta neutroien difrakzioan oinarrituriko<br />
teknikak erabili zituzten, leku estrategikoetan metal astunekin<br />
markaturiko laginak erabiliz. 1.7 irudian, transmintz ardatzen lipidoa<br />
osatzen <strong>duten</strong> talde molekularren batez besteko banaketa azaltzen da<br />
denboran zehar (White, S. H. eta Wimley, W. C., 1998). Adierazpen<br />
honek, bigeruza isurkorrak bi erregioetan banatzen direla iradokitzen<br />
du, fase-arteko erregio eta erdiko erregio hidrokarbonatuan. Uraren<br />
banaketa, bigeruzaren erditik hurbilen dagoen glizerolatik hasten da eta<br />
gero eta altuagoa da bigeruzatik urruntzen den heinean.<br />
Egitura honetatik ateratzen den ondoriorik nabarmenena<br />
ondorengoa da: interfaseak hartzen duen zabalera, gutxi gorabehera<br />
erregio hidrofobikoak betetzen duenaren berdina dela da (bakoitzak,<br />
guztira 30Å gutxi gorabehera hartzen ditu). Interfasearen erregioa urmolekulez,<br />
fosfolipidoen buru polarrez, glizerolez, karboniloz eta<br />
metileno taldeez osoturiko nahasketa konplexu bat da. Mintzaren alde<br />
honek peptido eta proteinekin elkarrekintza ez-kobalenteak eratzeko<br />
aukera ugari eskaintzen ditu. Bigeruzaren hemigeruza bakoitzaren<br />
(monogeruzak ere deituak) interfaseak 15 Å ditu. Tamaina hau nahikoa<br />
da α-helize bat (10 Å-eko diametroa duena) bere baitan, bigeruzari<br />
paraleloki kokatua moldatzeko (1.7 irudia). Interfaseak<br />
heterogeneizitate kimiko altua aurkezteaz gain, polaritate gradiente bat<br />
ere aurkezten <strong>duten</strong> erregioak dira (White, S. H. eta Wimley, W. C.,<br />
1998). Gero eta interfaseko erregioa erdigunetik gertuago egon, giroko<br />
polaritatea txikiagoa da (1.7 irudia). Beraz, interfaseak, euren<br />
17
18<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
heterogeneizitate kimiko eta polaritate gradienteen eraginez proteina ez<br />
konstitutiboekin (adibidez, toxinekin) elkarrekintzak emateko tokirik<br />
aproposenak dira (White, S. H. eta Wimley, W. C., 1999).<br />
Probabalitatea<br />
Karga dentsitatea<br />
Interfasea<br />
Nukleo<br />
hidrokarbonatua<br />
Interfasea<br />
Kolina Fosfatoa Glizerola<br />
Zentruarekiko distantzia Å<br />
α-<br />
heli<br />
zea<br />
1.7. Irudia: DOPC bigeruza baten egitura, egoera isurkorrean. A) Mintza<br />
osatzen <strong>duten</strong> talde kuasi-molekularren banaketa bigeruzan zehar. Bigeruza barnean,<br />
leku espezifiko batean, egitura talde zehatz bat aurkitzeko probabilitatea aurkezten<br />
da. B) DOPC bigeruza baten polaritate profila, karga partzialetatik eta fosfolipido talde<br />
ezberdinen bolumenetatik kalkulatua izan dena. Interfasearen polaritate gradientea,<br />
kargadun mintzen energi-aske elektrostatikoen profilekin bat dator. 10 Å-eko<br />
diametroa duen α-helize bat bigeruzari paraleloki kokatu daiteke interfasean. (White,<br />
S. H. eta Wimley, W. C., 1999)-tik moldatua izan da.
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
1.1.5. BIGERUZAREN EZAUGARRI<br />
ELEKTROSTATIKOAK<br />
Mintzekin erlazionatutako hiru potentzial mota daude:<br />
gainazaleko potentzial elektrostatikoa (ψo), potentzial elektrostatiko<br />
dipolarra (ψd) eta mintzaren zeharkako potentzial elektrostatikoa (∆ψ)<br />
(1.8 irudia).<br />
1.1.5.1. GAINAZALEKO POTENTZIAL ELEKTROSTATIKOA<br />
Gainazaleko potentzial elektrostatikoa, mintzaren gainazalean<br />
dauden molekula kargadunen ondorioa da. Barnealdeko mintzgainazalak,<br />
lehen aipatu den bezala, negatiboki kargaturik daude,<br />
bertan dauden proteinen karga negatibo eta fosfolipidoen eraginagatik<br />
(Gennis, R. B., 1989). Lipidoetako fosfatoen talde anionikoak<br />
gainazalean finko daude, eta dagozkien kontra-ioiekin neutralizatuak<br />
daude. Kontra-ioiak mugikorrak dira eta ez daude mintzaren<br />
gainazalean finkaturik; mugikortasun hau dispertsio entropikoen<br />
indarren eta kargen erakarpen elektrostatikoen arteko orekaren emaitza<br />
da. Beraz, kontra-ioiak ez dira gainazalean bertan kokatzen, baizik eta<br />
mintzetik distantzia batera, geruza elektriko bikoitza sortuz (1.8 irudia).<br />
1.1.5.2. POTENTZIAL ELEKTROSTATIKO DIPOLARRA<br />
Potentzial elektrostatiko dipolarra mintzaren barneko potentzial<br />
bat da. Potentzial hau, glizerola eta gantz azidoen edo/eta interfasean<br />
dauden ur molekulen arteko ester loturetatik dator (1.7 irudia). Talde<br />
hauek modu berezi batean orientatuak daude, eta orientazio honek<br />
mintzaren nukleo hidrofobikoa, kanpoaldeko fase urtsuarekin<br />
konparatuz, positiboa izatea baimentzen du. Potentzial dipolarrak<br />
ehuneko mV-tako balorea dauka (Honig, B. H., Hubbell, W. L. eta lank.,<br />
1986). Bigeruzaren barnealdean dagoen potentzial positibo bat denez,<br />
mintzean zehar anioien mugimendua laguntzen du katioien<br />
mugimenduarekin konparatuz (5.5 kcal.mol -1 –eko energi<br />
desberdintasun batekin) (Gennis, R. B., 1989).<br />
19
20<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Pisu molekular baxuko anioi eta katioien irazkortasuna mintzean<br />
zehar oso altua da baina, baldintza normaletan bi ioi mota hauen<br />
irazkortasun koefizienteetan potentzial elektrostatiko dipolarrak ez<br />
dauka eraginik, oso txikiak baitira (Gennis, R. B., 1989).<br />
1.1.5.3. MINTZAREN ZEHARKAKO POTENTZIAL<br />
ELEKTROSTATIKOA<br />
Mintzaren zeharkako potentzial elektrostatikoa, mintzak banatzen<br />
dituen bi fase urtsuen potentzial elektrostatikoen arteko<br />
ezberdintasuna bezala definitzen da (1.8 irudia). Mintzean potentzial<br />
elektrostatiko bat eratzeko zenbait modu daude: ohikoena ioi mota<br />
baterako espezifikoa den garraiatzaile (edo ionoforo) bat erabiltzea da.<br />
Balinomizinak adibidez, K + -a selektiboki garraiatzen du mintzean zehar<br />
(Ovchinnikov, Y. A., 1979). Transmintz potentzialek prozesu oso<br />
garrantzitsuetan eragin handia daukate, adibidez kloroplasto eta<br />
mitokondrien mintzetan ATP-aren sintesia (Nicholls, D. G., 1982).<br />
Mintzaren zeharkako potentzialak, zenbait peptidoek, Nisina kasu,<br />
mintzarekin daukaten elkarrekintzan eragina izan dezake (Moll, G. N.,<br />
Clark, J. eta lank., 1997).
Gainazaleko karga<br />
dentsitatea (σ)<br />
ψo<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Geruza<br />
dipolarra<br />
1.8. Irudia: Mintzaren potentzial elektrostatiko ezberdinak. Karga positibo<br />
batek lipido-bigeruza batean dauden eremu elektrostatikoekin izan ahal duen<br />
elkarrekintzaren profil energetikoa adierazten da. Proteinen edo kargadun lipidoen<br />
presentziak eragiten duen gainazaleko karga dentsitateak, σ, mintzaren gainazalean<br />
potentzial elektrostatiko bat sortarazten du (ψo). Mintzeko geruza dipolarrak barneko<br />
potentzial dipolar bat eragiten du, ψd , PC bigeruzetan 250 mV-tako balorea hartzen<br />
duena. Potentzial dipolarra, bigeruzaren nukleo hidrokarbonatua fase urtsuarekin<br />
konparatuz positiboa izatearen erruduna da. Bigeruzaren bi aldeen artean karga<br />
banaketa bat dagoenean, transmintz potentzial elektrostatiko bat sortarazten da, ∆ψ.<br />
Argitasun gehiagorekin ikusteko karga eta dipoloak mintzaren alde batean bakarrik<br />
adierazi dira, irudia (Cafiso, D. S., 1991)-tik moldatua izan da.<br />
21
22<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
1.2. WIMLEY-WHITE-en HIDROFOBIZITATE<br />
ESKALA<br />
Eskala honek solugarriak diren mintz proteinak, fase urtsutik<br />
lipido bigeruzara banatu ostean, mintzetan era egonkor batean<br />
txertatzeko <strong>duten</strong> ahalmena azaltzen du (Engelman, D. M., 1996).<br />
Zenbait aminoazido sekuentziek berez gordetzen dute mintzera<br />
banatzeko ahalmena (Parker, M. W., Pattus, F. eta lank., 1989;<br />
Engelman, D. M., 1996; Shatursky, O., Heuck, A. P. eta lank., 1999):<br />
ikuspuntu termodinamiko batetik, energetikoki faboragarriagoa baita<br />
lipido-proteina konplexua eratzea, proteina solugarriaren egitura<br />
tertziarioa edo kuaternarioa mantentzea baino.<br />
Erakarpen edo aldarapen elkarrekintza elektrostatikoen gabezian,<br />
mintzera ematen den banaketa, aminoazidoen alboko kateen izaera<br />
hidrofobikoa, lotura peptidikoaren transferentziaren gastua eta<br />
bigeruzaren efektuagatik energetikoki zuzendua egongo litzateke (White,<br />
S. H. eta Wimley, W. C., 1999). Proteinen deskribapen kuantitatibo bat<br />
egiteko, uretatik mintzera banatzeko eta bertan tolesteko oinarrizko<br />
betebehar bat hidrofobizitate eskala apropos bat izatea da. William<br />
Wimley eta Stephen White-k 1996-ean 20 aminoazido eta euren arteko<br />
lotura peptidikoarentzat hidrofobizitate eskala bat garatu zuten. Eskala<br />
hau egiteko, POPC-zko LUV-etara peptido txikiez osaturiko bi peptido<br />
familien banaketa neurtu zuten.<br />
Eskala hauek aurkezten <strong>duten</strong> berritasun garrantzitsu bat,<br />
lotura peptidikoaren banaketa mintzen interfasera emateko behar den<br />
gastu energetikoa kontuan hartzen dutela da. Lotura peptidikoaren<br />
gastu energetikoa aspartiko aminoazidoak daukanarekin konparagarria<br />
da. Honek, lotura peptidikoaren transferentzia mintzetara prozesu ezfaboragarri<br />
bat dela iradokitzen du. Ohiko hidropatia indizeetan<br />
ekarpen hau ez da kontuan hartzen, hauek aminoazidoen alboko<br />
kateen sarrera fase apolarrera kontuan hartzen baitute bakarrik (Kyte,<br />
J. eta Doolittle, R. F., 1982).
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
1.6. Taula: Hondar osoren hidrofobizitate eskalak. Interfasera (POPC)<br />
transferentzia gertatzeko behar den energi askea eta n-oktanoletik uretara pasatzeko<br />
behar dena (Wimley, W. C., Creamer, T. P. eta lank., 1996; Wimley, W. C. eta White,<br />
S. H., 1996).<br />
AMINOAZIDOA Interfaseko eskala<br />
∆G (kcal/mol)<br />
Oktanol eskala<br />
∆G (kcal/mol)<br />
Ala (A) -0.17 ± 0.06 -0.50 ± 0.12<br />
Arg (R) -0.81 ± 0.11 -1.81 ± 0.13<br />
Asn (N) -0.42 ± 0.06 -0.85 ± 0.12<br />
Asp (D) -1.23 ± 0.07 -3.64 ± 0.17<br />
Cys (C) 0.24 ± 0.06 0.02 ± 0.13<br />
Gln (Q) -0.58 ± 0.08 0.77 ± 0.12<br />
Glu (E) -2.02 ± 0.11 3.63 ± 0.17<br />
Gly (G) -0.01 ± 0.05 0.02 ± 0.13<br />
His (H) -0.96 ± 0.12 -2.33 ± 0.11<br />
Ile (I) 0.31 ± 0.06 1.12 ± 0.11<br />
Leu (L) 0.56 ± 0.04 1.25 ± 0.11<br />
Lys (K) -0.99 ± 0.11 -2.80 ± 0.11<br />
Met (M) 0.23 ± 0.06 0.67 ± 0.11<br />
Phe (F) 1.13 ± 0.08 1.71 ± 0.11<br />
Pro (P) -0.45 ± 0.12 -0.14 ± 0.11<br />
Ser (S) -0.13 ± 0.08 -0.46 ± 0.11<br />
Thr (T) -0.14 ± 0.06 -0.25 ± 0.11<br />
Trp (W) 1.85 ± 0.06 2.09 ± 0.11<br />
Tyr (Y) 0.94 ± 0.06 0.71 ± 0.11<br />
Val (V) -0.07 ± 0.05 0.46 ± 0.11<br />
23
24<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Ohiko eskala eta Wimley-White eskalen arteko beste<br />
ezberdintasun garrantzitsu bat, Wimley-White eskalak mintzen<br />
interfasearen alderdia kontuan hartzen duela da. Bi ezberdintasun<br />
hauek aminoazido hauen hidrofobizitate ekarpen erlatiboan adierazita<br />
ikusten dira erabili den eskalaren menpe (1.7. taula). Ikerketa osatzeko<br />
asmoarekin Wimley eta laguntzaileek (Wimley, W. C., Creamer, T. P. eta<br />
lank., 1996) eskala osagarri bat garatu zuten. Eskala honek<br />
aminoazidoen transferentzia n-oktanoletik (bigeruzen nukleo<br />
hidrokarbonatuen antzeko ingurune apolarra ematen duena) uretara<br />
emateko behar den energi askea neurtzen du.<br />
1.7. Taula: Aminoazido aromatiko eta zenbait aminoazido hidrofobikoen<br />
hidrofobizitate maximoaren ekarpen erlatiboa, hidropatia indize ezberdinak kontuan<br />
hartuz.<br />
AMINOAZIDOA WW1 KD E<br />
Trp 100 (1) 2 40 (10) 79 (5)<br />
Phe 81 (2) 81 (4) 95(2)<br />
Tyr 76 (3) 35 (12) 71 (10)<br />
Ile 60 (5) 100 (1) 100 (1)<br />
Val 50 (9) 97 (2) 92 (3)<br />
Leu 67 (4) 92 (3) 92 (4)<br />
1: WW, (Wimley, W. C. eta White, S. H., 1996); KD, (Kyte, J. eta Doolittle, R.<br />
F., 1982); E, (Eisenberg, D., Schwarz, E. eta lank., 1984).<br />
2: Parentesi artean dauden zenbakiak aminoazidoen kokapenari dagozkie,<br />
hidrofobikotik hidrofilikora ordenatzen direnean.<br />
Wimley-White eskala esperimentalean aminoazido aromatikoak<br />
hidrofobikoenak diren bitartean beste eskaletan erdiko hidrofobizitatea<br />
aurkezten dute, tirosinaren kasua nabarmena izanik.<br />
Azkenik Wimley eta White eskala gehigarria den bitartean besteak<br />
hidrofobizitate balio normalizatuetan oinarritzen dira (Kyte, J. eta<br />
Doolittle, R. F., 1982; Eisenberg, D., Schwarz, E. eta lank., 1984).<br />
Wimley-White-en eskalak, neurketa termodinamiko errealak eta<br />
absolutuak isladatzen ditu (0-ak oreka egoera adierazten du) (1.6 eta<br />
1.7 taulak). Gehigarritasun honek, proteinen sekuentzia zehatzak<br />
teorikoki aztertzea baimentzen du (White, S. H. eta Wimley, W. C.,<br />
1999).
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
1.3. POROAK ERATZEKO GAITASUNA DUTEN<br />
PROTEINA ETA PEPTIDO SOLUGARRIAK<br />
Poroak eratzen dituzten proteinak, solugarriak edo mintzintrintsekoak<br />
izan daitezke. Solugarrien artean gehiengoak toxinak dira,<br />
eta proteina luze edo peptido kationiko txiki moduan aurkitu daitezke.<br />
Poro mintz-integralak eratzen dituzten proteinak, orokorrean ez dira<br />
lipido bigeruzatik kanpo aurkitzen; oso arraroa da proteina hauek<br />
ingurune urtsu batean ondo tolestea eta ondoren mintzean txertatzea.<br />
Horregatik, azken hauek genetikoki kodetuak izan ostean itu mintzera<br />
bidali behar dira bertan txertatzeko. Normalean proteina hauek ioi<br />
kanalak eratzen dituzte. Modu zorrotz batean adierazita ioi-kanalak<br />
poroak dira, baina esan daiteke ioi-kanalak ioi konkretu batekiko<br />
selektiboak direla, zabaldu eta ixteko ahalmena daukatela, eta ahalmen<br />
hau erregulatua egon daitekeela. Poroak aldiz, ez dira hain selektiboak,<br />
ez-ionikoak diren molekulekiko irazkorrak izan daitezke, eta ez daukate<br />
zabaltzeko eta ixteko ahalmenik. Poroak eratzeko gaitasuna aurkezten<br />
<strong>duten</strong> proteina solugarriak eta mintz intrintsekoak diren proteinak<br />
ezaugarri amankomun bat aurkezten dute: mintza egoera normalean<br />
zeharkatu ezin dezaketen molekulei pasabide bat baimentzen dietela<br />
(Panchal, R. G., Smart, M. L. eta lank., 2002).<br />
Kapitulu honen hasieran adierazi den bezala, mintz<br />
plasmatikoaren funtzio garrantzitsu bat zelulari irazkortasun selektiboa<br />
duen hesi batez hornitzea da. Edozein sustantziaren eraginez zelulak<br />
bere irazkortasun hesia galtzen badu, metabolismorako beharrezkoak<br />
diren osagaiak galduko lituzke, barneko osaketa ionikoa aldatuz eta<br />
heriotz zelularra ekarriz. Arrazoi honengatik, zelulei (bai prokariotoei,<br />
bai eukariotoei) defentsarako edo erasorako hornitzeko, eta baita<br />
bizirauteko ere, naturak tresna bat diseinatu die, hots, mintzaren<br />
irazkortasuna handitzeko ahalmena, ezaugarri amankomun bezala<br />
daukaten zenbait proteina. Orokorrean proteina hauek uretan<br />
solugarriak diren arren, beraien sekuentzia primarioan mintzarekin<br />
elkarrekiteko informazioa daramate. Gaitasun bikoitz honek, ez du esan<br />
nahi, molekula derrigorrez anfipatikoa izan behar denik (Lesieur, C.,<br />
Vecsey-Semjen, B. eta lank., 1997). Dena den, mintzekin elkarrekiten<br />
<strong>duten</strong> peptido eta proteina gehienak anfipatikoak dira, edo beraien<br />
sekuentzian zehar anfipatikoa den zatiren bat aurkitzen da (Kaiser, E.<br />
T. eta Kezdy, F. J., 1987).<br />
25
26<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Mintzaren irazkortasuna handitzen <strong>duten</strong> proteinak eta peptidoak<br />
izen asko jaso dituzte: Zitolisinak, mintzean kalteak eragiten dituzten<br />
proteinak, mintzean azaleko ekintza daukaten proteinak, poroak eta<br />
kanalak eragiten dituzten proteinak, toxinak etab. Talde oso<br />
hetereogeneoa osatzen <strong>duten</strong>ez, sailkatzeko arazo handi bat dago.<br />
1.3.1. POLIPEPTIDOETAN OINARRITURIKO POROAK<br />
1.3.1.1. α-HEMOLISINA<br />
α−hemolisina (α-HL) Staphylococcus aureus-ek jariaturiko toxina<br />
solugarria da (Bhakdi, S. eta Tranum-Jensen, J., 1991). Espezie<br />
solugarri hauek itu gainazalean batzen dira eta bertan agregatu,<br />
konformazio aldaketa bat pairatzen dutelarik. Konformazio aldaketa<br />
honen ondorioz proteina oligomerizatzen da, β-kupel heptameriko bat<br />
eratuz (Menestrina, G., 1986; Belmonte, G., Cescatti, L. eta lank., 1987;<br />
Montoya, M. eta Gouaux, E., 2003).<br />
Beraz, poro funtzionala heptamero bat da, 1-2 nm-tako barne<br />
diametroa daukana eta 3000 Da-etako molekulak mintza zeharkatzea<br />
ahalbidetzen duena.<br />
Ikerketa biokimiko, biofisiko eta genetikoetan oinarrituz poroa<br />
eratzeko lau fase ematen direla iradoki da. Soluzioan, α−HL<br />
monomerikoa, N eta C domeinuak glizinetan aberatsa den bigizta baten<br />
bidez loturik daude (119-143 aminoazidoko hondarrak). α−HL<br />
mintzaren gainazalera monomero gisa batzen da, zazpi monomeroko<br />
subunitateak batzen dira eta litikoa ez den poro aitzindariaren<br />
konplexua eratzen da ondoren. Zazpi azpiunitateak mintzean txertatu<br />
eta litikoa den poro heptamerikoa eratzen da. Transmintz poroa<br />
glizinetan aberatsa den sekuentziaz gaineztaturik dago.
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Toxinaren egitura kristalinoa detergenteen presentzian, perretxiko<br />
itxura daukan heptamero homoligomeriko bat dela adierazten du (1.8<br />
irudia) (Song, L., Hobaugh, M. R. eta lank., 1996). Proteina<br />
konplexuaren dimentsioak 100 Å x 100 Å dira. Kanalaren diametroa<br />
luzeran eta zabaleran 46 eta 14 Å dira hurrenez-hurren.<br />
Toxinaren arkitektura hiru domeinutan banatuta dago, kapelan,<br />
ertzan eta zurtoinean. Kapelak 48 Å-eko altuera dauka eta hidrofilikoa<br />
da, 7 β−sandwich eta protomero bakoitzaren amino muturrak osatzen<br />
dute. Ertz domeinua, zelula mintzetik kanpoalderantz zuzentzen da,<br />
kapelaren beheko aldean kokatzen delarik eta 3 β−orriez osaturik dago.<br />
Zurtoina 14 β−orrik osatzen dute eta kanalaren transmintz zatikia<br />
definitzen du. Protomero bakoitzak kupelean bi β−orriekin parte hartzen<br />
du. Zurtoinak 52 Å ditu altueran eta 26 Å (Cα–Cα) zabaleran.<br />
β-kupelaren barnealdea hidrofilikoa den bitartean, kanpoaldea<br />
gerriko hidrofobiko bat dauka (Song, L., Hobaugh, M. R. eta lank.,<br />
1996; Gouaux, E., 1998; Panchal, R. G., Smart, M. L. eta lank., 2002;<br />
Tilley, S. J. eta Saibil, H. R., 2006).<br />
27
28<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
1.8. Irudia: Staphylococcus aureus-en α-hemolisinaren egitura. A) Alboko<br />
bista. Perretxiko itxura daukan heptamero homo-oligomerikoa 14 β orriez osaturik<br />
dago. Kolore ezberdinez protomero ezberdinak adierazi dira. Heptameroak gutxi<br />
gorabehera 100 Å-eko altuera dauka. B) Heptameroaren goi-aldeko bista. C)<br />
Protomeroaren egitura. β-sandwich-ak protomeroaren nukleoa eratzen du, hiruki<br />
itxurako erregioa, zurtoinaren β-orriak eta nukleoa batuz. Irudia (Montoya, M. eta<br />
Gouaux, E., 2003)-tik moldatua izan da.
1.3.1.2. KOLIZINAK<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Kolizinak Citrobacter freundii eta Escherichia coli-k ekoizturiko<br />
bakterioen kontrako toxinak dira. 600 aminoazidoez osoturik daude eta<br />
plasmidoetan kodetzen dira, bakterioari immunitatea emanez. Bkolizinek<br />
bakterio sentikorren barne mintzetan boltaiarekiko<br />
menpekoak diren kanalak eratzen dituzte, horrela, mintza despolarizatu<br />
eta ondorioz bakterioaren heriotza eragiten dute (Cramer, W. A.,<br />
Heymann, J. B. eta lank., 1995).<br />
Kanalaren diametroa 8 Å-etakoa da, barneko K + ateratzeko<br />
nahiko handia delarik (Stroud, R., 1995).<br />
Kolizina mintzarekin batu ahal izateko, karga negatibodun<br />
fosfolipidoak kanpo mintzean egotea beharrezkoa da (van der Goot, F.<br />
G., Didat, N. eta lank., 1993). Kolizina eta mintzaren artean ematen den<br />
lehendabiziko elkarrekintza, proteinaren alde batean dagoen karga<br />
positibodun eraztuna eta negatiboki kargaturik dauden fosfolipidoen<br />
buru polarren artean izan behar dela uste da (Lakey, J. H., Parker, M.<br />
W. eta lank., 1994). Kolizina mintzean batu denean, partzialki zabaltzen<br />
da eta “molten globule” deritzon (globulu urtua) egitura hartzen du.<br />
Egitura zabalik dagoenean hidrofobikoak diren azalerak aurkezten dira<br />
eta elkarrekintza tertziarioak galdu egiten dira, baina egitura<br />
sekundarioak (batez ere α helizeak) mantenduz (van der Goot, F. G.,<br />
Gonzalez-Manas, J. M. eta lank., 1991)(1.9. irudia). Transmintz<br />
potentzial bat ezartzen denean kanala zabaldu egiten da zenbait helize<br />
mugitzen direlako, bai translokatzen direlako, bai mintzean txertatzen<br />
direlako (Slatin, S. L., Qiu, X. Q. eta lank., 1994). Kanala eratzen <strong>duten</strong><br />
helizeak nola kokatzen diren oraindik argitzeke dago. Kanala eratzeko<br />
zenbait kolizina molekula, hots, oligomero bat, beharrezkoa izan arren,<br />
badira emaitza esperimentalak kolizina molekula bakarra nahikoa izan<br />
daitekeela kanala eratzeko iradokitzen <strong>duten</strong>ak (Cramer, W. A.,<br />
Heymann, J. B. eta lank., 1995).<br />
29
A B<br />
30<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
1.9. Irudia: Mintzean E1 kolizinaren <strong>txertaketa</strong> emateko proposatu diren<br />
bitartekariak. A irudian “labana” eredua aurkezten da eta B irudian “euritako”<br />
eredua. E1 kolizina hauetako bi bitartekarietan bilakatu daiteke. Zilindroek kolizinak<br />
osatzen dituzten α-helizeak adierazten dituzte. Berdez irudikaturiko α-helizeak,<br />
“euritako” eredua jarraituz txertatzen den urkila hidrofobikoarekin bat datoz.<br />
Transmintz potentzial baten presentzian gorriz irudikaturik dauden helizeak mintzean<br />
txertatzen dira edo translokatzen dira. Horiz eta zuriz margoturik agertzen diren<br />
helizeak, ∆ψ-a ematerakoan mintzaren albo berdinean geratzen dira. Irudia (Kim, Y.,<br />
Valentine, K. eta lank., 1998)-etik egokitu egin da.<br />
1.3.2. PEPTIDO LABURRETAN OINARRITURIKO<br />
POROAK<br />
Zelula hiltzeko, peptido litiko ugari erabiltzen dituen mekanismo<br />
bat mintzaren irazkortasuna areagotzea da. Ikasketa ugari egin diren<br />
arren, peptido hauen akzio-mekanismoa ez da guztiz ezaguna eta itu<br />
zelularekiko espezifikotasuna zertan oinarritzen den ez da ezagutzen.<br />
Kasu gehienetan, peptidoen jokamoldeak zelula mintzaren lisi zuzena<br />
dakar. Aktibitate antimikrobianoa aurkezten <strong>duten</strong> peptidoak espezie<br />
guztietan defentsa sistema natural gisa existitzen dira. Hauetako<br />
peptido asko gizakiak agente terapeutiko moduan erabiltzen ditu<br />
(adibidez magaininak eta eratorriak), batez ere antibiotiko topiko gisa.<br />
Peptido antibiotikoen garapenak, bakterioak garatzen ari diren<br />
antibiotiko arruntekiko erresistentzia arindu dezake etorkizun hurbil<br />
batean. Lisi mekanismoa ulertzeak, peptido molekula indartsuagoak<br />
garatzeko orduan asko lagunduko luke. Naturan aurkitzen ditugun<br />
peptidoak, zekropinak, magaininak, melitina eta defentsinak adibidez,<br />
molde moduan erabil daitezke diseinu berriak gauzatzeko.
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Peptido hauek lerro tumoraleko zelulak lisatzeko ere<br />
selektibotasuna aurkeztu dezakete, hots, minbiziaren kontrako<br />
aktibitatea izan dezakete (Andreu, D., Merrifield, R. B. eta lank., 1983;<br />
Chen, H. M., Clayton, A. H. eta lank., 2001; de Jong, A. S., Melchers, W.<br />
J. eta lank., 2004).<br />
1.3.2.1. β-ORRI EGITURAKO PEPTIDOAK<br />
1.3.2.1.1. A-GRAMIZIDINA<br />
A-gramizidina Bacillus brevis bakterioak sintetizaturiko peptido<br />
hidrofobiko bat da. Peptido hau 15 aminoazidoz osoturik dago<br />
(Bernheimer, A. W. eta Rudy, B., 1986; Wallace, B. A., 1998) eta<br />
kanalak eratzen dituzten peptidoen artean hoberen karakterizatu dena<br />
da.<br />
Bere egitura primarioa ez da oso arrunta, bere konfigurazioan L<br />
eta D aminoazidoak tartekatzen baitira. A gramizidina ez da uretan<br />
solugarria, bai ostera disolbatzaile organikoetan. Peptido hau<br />
erraztasun handiarekin txertatzen da mintzetan, egitura β-helikoidalak<br />
eratuz. Egitura β-helikoidal hauetan, aminoazidoen alboko kateak<br />
lipidoen kate azilikoetara zuzentzen diren bitartean, karboniloak<br />
helizearen barnealdean babesten dira. <strong>Mintzetan</strong> A-gramizidinaren bi<br />
egitura aktibo existitzen dira: (1) helize dimerikoaren egitura, eta (2)<br />
helize bikoitzaren egitura, DNA-ren harizpi bikoitza gogora ekartzen<br />
duena (1.10. irudia). Helize dimerikoa bi gramizidina molekulez osoturik<br />
dago, bakoitza bigeruzaren alde batean kokatua, kanal ioniko bat<br />
eratzen dutelarik. Helize bikoitzaren egiturak, hain sarri ematen ez<br />
dena, poroen eraketa dakar (Wallace, B. A., 1998).<br />
31
32<br />
A B<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
1.10. Irudia: A-gramizidinak mintzetan izan ditzakeen egiturak. (A) Helize<br />
bikoitzaren egitura eta (B) Helize dimerikoaren egitura. Helize bikoitzaren egiturak<br />
mintzetan poroak eratzen ditu eta, helize dimerikoak aldiz, kanalak eratzen ditu. N eta<br />
C letrak amino eta karboxilo muturrei dagozkie. Irudia (Wallace, B. A., 1998)-tik<br />
egokitua izan da.<br />
A-gramizidina kanalaren (helize dimerikoaren konformazioa)<br />
ezaugarri garrantzitsuenak hurrengoak dira: (1) Katioi<br />
monobalenteekiko irazkorra da, hurrengo ordenean, Cs + > Rb + > K + ><br />
Na + > Li + , (2) Cl - guztiz baztertzen du, nahiz eta kanalaren tamaina Cl - -<br />
ak zeharkatu ahal izateko nahiko handia izan (4 Å), eta (3) kanala ireki<br />
egiten da dimeroa eratzen den momentuan, 10 ms eta 1 s tarteko<br />
erdibizitza duelarik; denbora hau nahikoa da 10 6 eta 10 8 ur molekulek<br />
kanala zeharkatzeko.<br />
1.3.2.1.2. DEFENTSINAK<br />
Hiru defentsina mota ezberdin existitzen dira: α-defentsinak, βdefentsinak<br />
eta intsektu-defentsinak (White, S. H., Wimley, W. C. eta<br />
lank., 1995).
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Defentsinak peptido kationiko txikiak dira; 29-35 aminoazido<br />
hondarrez osaturik daude, arginina hondar kationiko nagusiena<br />
delarik. Berezitasun moduan, sei zisteina hondar dituzte, beraien<br />
artean hiru disulfuro zubi eratzen dituztenak (Ganz, T. eta Lehrer, R.<br />
I., 1995; White, S. H., Wimley, W. C. eta lank., 1995).<br />
Nagusiki β−orri egitura daukate, disulfuro zubien bitartez<br />
egonkortua. Azken ezaugarri honek, beste peptido antimikrobianoetatik<br />
ezberdintzen ditu, ia gehienek helize anfifilikoak eratzen baitituzte.<br />
Defentsinak mintzera elektrostatikoki batzen dira eta ondorioz<br />
poro multimerikoak eratzen dituzte. Defentsinen espektro<br />
antimikrobianoa oso zabala da, bakterio gram positiboak eta gram<br />
negatiboak, onddo ugari eta gainazaladun zenbait birusekiko aktiboak<br />
direlarik (Panchal, R. G., Smart, M. L. eta lank., 2002).<br />
1.3.2.2. α-HELIZE EGITURAKO PEPTIDOAK<br />
1.3.2.2.1. ALAMETIZINA<br />
1.11. Irudia: 3. giza α-defentsina.<br />
Aminoazido kationiko eta hidrofobikoen<br />
taldeak domeinu ezberdinetan. Gorriz,<br />
aminoazido basikoak (positiboki kargaturik<br />
daudenak).<br />
hidrofobikoak.<br />
Berdez, aminoazido<br />
Alametizina, 20 aminoazidoez osoturiko eta Trichoderma viride<br />
onddotik isolatutako peptido antimikrobiano bat da (Meyer, P. eta<br />
Reusser, F., 1967). Aminoazido hidrofobikoez osoturik dago, eta<br />
azpimarratzekoa da zortzi α-metilalanina aminoazidoen presentzia<br />
(Cafiso, D. S., 1994; Bechinger, B., 1997). Bigeruza lipidikoari α-helize<br />
egiturarekin batzen da, baina bere orientazioa hidratazio graduaren eta<br />
lipido/proteinaren erlazio molarraren menpe dago (Wu, Y., He, K. eta<br />
lank., 1995; He, K., Ludtke, S. J. eta lank., 1996).<br />
33
34<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Proteina/lipido erlazio molarra 0.025 balorea baino altuagoa<br />
denean (lipido/proteina < 40) alametizina mintzean txertatzen da (1.12A<br />
irudia). Transmintz potentzial ezberdintasun bat (∆ψ) ezartzen denean,<br />
aldiz, kanal ionikoak eratzen ditu (Cafiso, D. S., 1994). Hau<br />
gramizidinarekiko ezberdintasun bat da, ez baitu transmintz potentzial<br />
ezberdintasun bat behar kanalak eratzeko. Alametizina kanalak zenbait<br />
peptido monomeroez osoturik daude (1.12B, C irudia).<br />
A B C<br />
1.12. Irudia: Alametizinaren egitura bigeruzetan. A) Irudian, alametizina<br />
monomeroaren egitura aurkezten da, POPC besikuletan txertatua dagoenean. B) 6<br />
alametizina molekulez osoturiko kanala, POPC bigeruzetan txertaturik ere. C)<br />
Kanalaren barneko aldea aurkezten da. A eta B irudietan peptidoaren egitura<br />
aurkezten da bolatxoen bidez, urdin kolorekoak nitrogenoari dagozkie, gorri<br />
kolorekoak oxigenoari eta grisak karbonoari. Lipidoaren kate azilikoak lerro berdeekin<br />
irudikatzen dira, eta bola berdeak lipidoaren karboniloei dagozkie. B irudian, baita<br />
ere, lipidoaren buru polarrean agertzen diren beste talde batzuk irudikatu dira. Horiz<br />
fosforoa eta gorriz oxigenoa (bai lipidoarenak, bai alderdi horretan aurkitzen diren ur<br />
molekulenak ere). B panelean dauden marra urdinak ur molekulak ordezkatzen<br />
dituzte. C panelean, alametizinaren α-helizeak irudikatzen dira urdin argiarekin,<br />
helize hauen Gln-en alboko kateak berdez, eta ur molekulak gorriz. Irudi guztiak<br />
dinamika molekularraren teknikaz 300 K-tan lortu ziren. Panelak (Tieleman, D. P.,<br />
Sansom, M. S. eta lank., 1999)-etik egokituak izan dira.
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Alametizina kanala eratzeko behar diren molekulen kopurua<br />
kanalaren eroankortasuna eta kooperatibitatetik kalkulatzen da, 2 eta<br />
11 molekulen artekoa izan daitekeelarik, bigeruzaren zabaleraren<br />
arabera (Eisenberg, M., Hall, J. E. eta lank., 1973; Hall, J. E.,<br />
Vodyanoy, I. eta lank., 1984). Ez da ezaguna kanala irekitzeko<br />
mekanismoa, baina alametizinaren dipolo helikoidala eta<br />
transmintzaren eremu elektrikoaren artean elkarrekintza bat gertatu<br />
behar dela uste da (Bechinger, B., 1997).<br />
1.3.2.2.2. ZEKROPINAK<br />
Zekropinak, identifikaturiko lehenetariko peptido<br />
antimikrobianoak dira. Hyalophora cecropia sitsetik isolatu ziren<br />
hasiera batean (Hultmark, D., Steiner, H. eta lank., 1980; Steiner, H.,<br />
Hultmark, D. eta lank., 1981; Hultmark, D., Engstrom, A. eta lank.,<br />
1982). Zekropinaren analogoak, intsektu espezie askotik (Maloy, W. L.<br />
eta Kari, U. P., 1995), eta ugaztunetik ere (txerria) (Lee, J. Y., Boman,<br />
A. eta lank., 1989) isolatu dira. Familia gisa, zekropinak 31-39<br />
aminoazido hondarrez osaturik daude. Amino mutur basiko eta<br />
anfipatiko bat daukate eta karboxilo mutur hidrofobiko bat.<br />
Dikroismo zirkularrarekin egindako azterketek, zekropinek<br />
soluzioan daudenean ez dutela egitura zehatzik aurkezten iradokitzen<br />
dute, baina hexafluoroisopropanol (HFIP), lipopolisakarido besikula<br />
(LPS), SDS mizela edo liposomen presentzian, α-helize egitura hartzen<br />
dute (Sato, H. eta Feix, J. B., 2006). NMR-arekin egindako ikerketek,<br />
%15 HFIP presentzian ondo bereizten diren bi α-helizeen presentzia<br />
adierazten dute. Helizeak, bata bestearekiko, 5-21 hondarrak eta 24-37<br />
hondarrak hartzen dituzte, hau da, amino muturrari dagokion<br />
domeinua eta karboxilo muturrari dagokion domeinua (Holak, T. A.,<br />
Engstrom, A. eta lank., 1988). Bi helizeak 70-100º-tako angeluarekin<br />
orientaturik daude, gly 23 -pro 24 giltzarriarekin bat datorrena (Sipos, D.,<br />
Andersson, M. eta lank., 1992; Sato, H. eta Feix, J. B., 2006).<br />
Mintzean poroaren mihiztadura aztertzeko, oinarri fisikokimikoak<br />
erabili dira, modelo informatiko bat garatuz. Modelo honek,<br />
peptidoaren amino eta karboxilo muturrek eratzen dituzten helizeek,<br />
biek, poroa eratzeko gaitasuna aurkezten dutela iradokitzen du. Poroa,<br />
“barrel stave” egitura aurkezten duen oligomero bat da (Silvestro, L.,<br />
Weiser, J. N. eta lank., 2000; Panchal, R. G., Smart, M. L. eta lank.,<br />
2002; Sato, H. eta Feix, J. B., 2006).<br />
35
36<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Zekropinek aktibitate antibakteriano zabala aurkezten dute<br />
bakterio gram positibodun eta gram negatibodunen aurrean.<br />
Leishmania, C. albicans eta malaria sortarazten duen parasitoa,<br />
Plasmodium falciparum-en kontra aktibitatea ere aurkezten dutelarik.<br />
Zenbait lerro tumoralen zelulen kontra aktibitatea dauka. Kontrara,<br />
zelula eukariotiko normalen kontra toxizitate baxua eta aktibitate<br />
hemolitiko baxua daukatela ikusi da (Sato, H. eta Feix, J. B., 2006).<br />
1.3.2.2.3. MAGAININAK<br />
Magaininak Xenopus laevis igel afrikarraren azaletik eta<br />
hesteetatik isolatu dira. Aktibitate antimikrobiano eta antifungiko<br />
zabala aurkezten dute. Peptido kationiko eta anfipatikoak dira eta mintz<br />
gainazalera batzen direnean α-helize egitura hartzen dute.<br />
Kontzentrazio altuetan lipido matrizea irazkortzen dute, nm-tako<br />
tamaina daukaten poro toroidalak eratuz, eta zelularen heriotza ekarriz<br />
(Leontiadou, H., Mark, A. E. eta lank., 2006). Fosfolipido anionikoak<br />
dituzten bigeruza naturalak eta mintzak irazkortzeko lehentasuna<br />
aurkezten dute. Esperimentalki ikusi da, mintza irazkortzeko peptido<br />
kontzentrazioa nahikoa denean, peptidoan orientazio aldaketa bat<br />
gertatzen dela, eta mintzari paralelo egotetik, peptido kopuru bat<br />
perpendikularki jartzera pasatzen dela. Fenomeno hau, lipidoen flipflop-arekin<br />
eta mintzean zehar peptidoaren translokazioarekin loturik<br />
dago.<br />
Poroaren ezaugarri bat, hidrofilikoa dela da. Uste da peptidoek<br />
poroa egonkortu dezaketela, poroa inguratzen <strong>duten</strong> lipidoen buru<br />
polarrekin elkarrekintzak eratuz.
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
1.13. Irudia: Ekintza antimikrobianoa zehaztasun atomikoan. Magainina<br />
peptido antimikrobianoak eragindako poroaren bat-bateko eraketa. Peptido/lipido<br />
erlazioa 1/32 da. Hasiera batean peptidoa fase urtsuan aurkitzen da (t=0 nsg),<br />
peptidoa agregatzen doa mintzarekin batzen den heinean (t=10 nsg). Mintzari batuketa<br />
gertatu ostean, peptidoa bigeruzaren barnealdera translokatzen da (t=30 nsg). Honek<br />
estresa sortarazten du mintzean eta poroaren eraketa gertatzen da (t= 40 nsg). Poroak<br />
egitura toroidala hartzen du. Peptido bat mintzean txertatuta ikus daiteke, eta beste<br />
bat poroaren zabalgunearen inguruan (t=60 nsg). Azkenengo egitura hau egonkorra<br />
mantentzen da simulaziorako. Alboko kate garrantzitsu eta funtzionalak nabarmendu<br />
dira (goiko panela). Lipido isatsak grisez daude, eta ur molekulak urdin zian<br />
kolorekoak. Buru polarrak urdinez (kolina), purpuraz (fosfatoak) daude goiko<br />
panelean, edo larrosaz/purpuraz (fosfatoak) beheko panelean. (Leontiadou, H., Mark,<br />
A. E. eta lank., 2006)-tik egokitua.<br />
1.4. BIROPORINAK<br />
37
38<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Birusek zelulak infektatzen dituztenean, itu zelulan zenbait kalte<br />
sortarazten dituzte. Hauetako kalte batzuk zelula-mintzean eragin<br />
zuzena daukate, adibidez, mintz-plasmatikoa eta zelula barneko<br />
sistema besikularra aldatzea. Behatu daitekeen ohiko efektua,<br />
mintzaren irazkortasunaren handipena ematen dela da (Carrasco, L.,<br />
1995). Zenbait birus-proteina aldaketa hauen eragileak dira, adibidez,<br />
proteasak (Chang, Y. S., Liao, C. L. eta lank., 1999; Blanco, R.,<br />
Carrasco, L. eta lank., 2003), glikoproteinak (Arroyo, J., Boceta, M. eta<br />
lank., 1995; Tian, P., Estes, M. K. eta lank., 1995; Newton, K., Meyer, J.<br />
C. eta lank., 1997; Ciccaglione, A. R., Marcantonio, C. eta lank., 1998)<br />
eta biroporinak (Carrasco, L., 1995).<br />
1.4.1. BIROPORINAREN DEFINIZIOA<br />
Biroporinak, birusek kodeturiko proteina txiki eta oso<br />
hidrofobikoak dira, zelula mintzarekin elkarrekiteko ahalmena<br />
daukatenak eta, honen ondorioz, mintzaren irazkortasuna aldatzen<br />
<strong>duten</strong>ak. Mintza, ioi eta molekula txikiekiko irazkor bihurtzeko<br />
ahalmena daukate beraz (Carrasco, L., 1995).<br />
Biroporinak existitzen zirela orain dela zenbait urte iradoki zen,<br />
zenbait birus-zelula sistemetan mintzaren irazkortasuna handitzen zela<br />
ikusi zenean (Carrasco, L., 1978). Birusek zelula infektatzen <strong>duten</strong>ean<br />
mintzaren irazkortasunaren aldaketa bi momentu ezberdinetan eman<br />
daiteke, lehenengoa zolduraren lehendabiziko momentuetan, birusaren<br />
sarrerarekin lotuta dagoena, eta birioiak berak eraginda; bigarrena,<br />
zoldura aurrera doan heinean eta zenbait birus osagai kodetu direnean.<br />
Birusaren geneekin kodetzen diren osagai hauen artean biroporinak<br />
aurkitzen dira, zolduraren fase berantiarrean mintzaren<br />
irazkortasunaren handitzearen eragileak direlarik (Fernandez-Puentes,<br />
C. eta Carrasco, L., 1980; Carrasco, L., 1994).
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
1.4.2. BIROPORINA EGITURAREN EZAUGARRI<br />
OROKORRAK<br />
Orokorrean 50-120 aminoazido kopurua daukaten proteinak dira<br />
eta α-helize bat eratzeko gaitasuna daukan 20 aminoazido inguruko<br />
domeinu hidrofobiko bat izaten dute. Biroporinek, mintzean txertatu<br />
ostean oligomeroak eratzeko gaitasuna aurkezten dute. Oligomero<br />
hauek poro hidrofiliko bat eratuko lukete, aminoazido hidrofobikoak<br />
bigeruzaren fosfolipidoekin kontaktuan jarriz eta hondar hidrofilikoak<br />
poroaren barnealderantz orientatuz (Grice, A. L., Kerr, I. D. eta lank.,<br />
1997; Pinto, L. H., Dieckmann, G. R. eta lank., 1997; Agirre, A., Barco,<br />
A. eta lank., 2002; Melton, J. V., Ewart, G. D. eta lank., 2002; Wilson,<br />
L., McKinlay, C. eta lank., 2004). Poro hauen eraketa, gehienetan<br />
tetrameroak direnak (nahiz eta beste egitura oligomerikoak posibleak<br />
izan), ioi eta pisu molekular baxuko konposatuen pasabidea<br />
baimentzen dute era ez-espezifiko batean (Carrasco, L., 1995).<br />
Zenbait biroporinek bigarren transmintz domeinu bat daukate,<br />
Orokorrean aminoazido basikoz osoturik dagoena eta eremu<br />
anfipatikoak eratzen dituena. Erregio anfipatiko hauek oso arruntak<br />
dira bakteriofagoen mintz-toxinetan eta lehen aipatu diren jatorri birala<br />
ez daukaten peptido litikoetan, magaininetan eta zekropinetan adibidez<br />
(Young, R., 1992; Matsuzaki, K., 1998). Erregio hauek mintzaren<br />
irazkortasunaren aldaketetan parte hartu dezakete lipido bigeruza<br />
desegonkortuz.<br />
Orain dela gutxi mintzekin elkarrekin dezakeen beste domeinu<br />
bat aurkitu da biroporinetan. Aminoazido aromatikoetan aberatsa da<br />
eta bigeruzaren interfasean txertatzeko ahalmena aurkezten du,<br />
mintzaren desegonkortasuna indartuz eta bere irazkortasuna handituz<br />
(Sanz, M. A., Madan, V. eta lank., 2003).<br />
Biroporinen funtzio nagusiena zoldurik dauden zeluletatik birus<br />
berrien irteera baimentzea da (Carrasco, L., 1995). Birusek, mintzplasmatikoa<br />
lisatzeko ahalmenarekin gene pare bat izatea oso<br />
garrantzitsua da (batez ere gainazalik ez daukaten birusen kasuan).<br />
Bi kasuetan mintzak eraldatuak izango ziren biroporinek<br />
eragindako poroengatik (Carrasco, L., 1995). Beraz, nahiz eta proteina<br />
hauek beharrezkoak ez izan birusen erreplikaziorako, beraien<br />
presentziak birus-partikulen eraketa modu adierazgarri batean<br />
handitzen du (Klimkait, T., Strebel, K. eta lank., 1990; Harada, T.,<br />
39
40<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Tautz, N. eta lank., 2000; Watanabe, T., Watanabe, S. eta lank., 2001;<br />
Takeda, M., Pekosz, A. eta lank., 2002; Kuo, L. eta Masters, P. S.,<br />
2003).<br />
1.8. Taula: Biroporinen sailkapena.<br />
Birus familia Birusa Biroporina Aminoazido<br />
kopurua<br />
Picornaviridae (ssRNA+)<br />
Togaviridae (ssRNA+)<br />
-Polio 2B, 3A 97,87<br />
-Coxsackie 2B<br />
99<br />
-Hepatitis A<br />
107<br />
-Sindbis 6K<br />
55<br />
-Semliki Forest 60<br />
-Ross River<br />
Retroviridae (ssRNA+) -GIB-1 Vpu 81<br />
Flaviviridae (ssRNA+)<br />
Coronaviridae (ssRNA+)<br />
-C hepatitisa p7 63<br />
-Entzefalitis<br />
japoniarra<br />
-Arratoiaren<br />
hepatitisa<br />
-SARS<br />
Paramyxoviridae (ssRNA-) -Arnas-sintzitial<br />
birusa<br />
62<br />
NS2B 131<br />
E<br />
83<br />
76<br />
SH 64<br />
Ortomyxoviridae (ssRNA-) -A motako gripea M2 97<br />
Rhabdoviridae (ssRNA-) -Behi-sukar birusa p10? 88<br />
Reoviridae (dsRNA)<br />
-Hegazti reobirusa p10 98<br />
-Bursitis infekziosoa VP5 149<br />
Phycodnaviridae (dsDNA) -Chlorella birusa Kcv? 94<br />
Papillomaviridae (dsDNA) -Giza papiloma<br />
birusa<br />
E5? 83<br />
Poxviridae (dsDNA) -Vaccinia birusa A14.5L? 53
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Orokorrean, biroporinak birusaren egituran ez dira agertzen,<br />
mintz plasmatikoan oso kantitate baxuetan agertzen direlarik (Klimkait,<br />
T., Strebel, K. eta lank., 1990; Loewy, A., Smyth, J. eta lank., 1995;<br />
Watanabe, T., Watanabe, S. eta lank., 2001; Hatta, M. eta Kawaoka, Y.,<br />
2003; McInerney, G. M., Smit, J. M. eta lank., 2004).<br />
Funtzio honetaz aparte, zoldurik dauden zelulen gain mintzaren<br />
potentziala xahutu eta heriotz zelularra gertatu baino lehen, proteina<br />
hauen espresioak efektu kaltegarriak eragiten ditu. Eragin hauek,<br />
zelularen morfologia eta besikulen garraio sistemaren eta<br />
metabolismoaren aldaketen agerpenarekin adierazten dira besteak<br />
beste (Carrasco, L., 1995).<br />
Biroporinen taldea 1.5 taulan erakutsi diren proteinez osatua<br />
dago.<br />
1.4.3. MINTZAREN IRAZKORTASUNA ALDATZEN DUTEN<br />
GLIKOPROTEINA BIRIKOAK<br />
Zenbait birusen glikoproteinek mintzaren irazkortasuna<br />
sustatzen dute. Hauen artean, Semliki forest birusaren E1 proteina, C<br />
hepatitis birusaren E1 proteina, Rotabirusaren NSP4 eta VP7 proteinak,<br />
Bluetongue birusaren NS3 proteina, Vaccinia birusaren A38L proteina,<br />
Zitomegalobirusaren US9 proteina, Ebola birusaren GP proteina eta<br />
GIB-1 birusaren gp41 proteina (Arroyo, J., Boceta, M. eta lank., 1995;<br />
Maidji, E., Tugizov, S. eta lank., 1996; Sanderson, C. M., Parkinson, J.<br />
E. eta lank., 1996; Tian, P., Ball, J. M. eta lank., 1996; Charpilienne, A.,<br />
Abad, M. J. eta lank., 1997; Dong, Y., Zeng, C. Q. eta lank., 1997; Yang,<br />
Z. Y., Duckers, H. J. eta lank., 2000; Ciccaglione, A. R., Costantino, A.<br />
eta lank., 2001; Nyfeler, S., Senn, K. eta lank., 2001; Han, Z. eta Harty,<br />
R. N., 2004). Hauetako glikoproteina batzuen arkitekturak,<br />
oligomerizazioa gertatu ondoren poro físiko baten eraketa ekarriko<br />
luke. Poro hauek fusio peptidoz eta transmintz domeinuen<br />
elkarrekintzagatik osatuak egongo lirateke.<br />
Mintza desegonkortzen <strong>duten</strong> fasearteko motiboak deskribatu<br />
dira. Motibo hauek transmintz erregioaren alboan kokatzen dira<br />
(Suarez, T., Gallaher, W. R. eta lank., 2000; Garry, R. F. eta Dash, S.,<br />
2003; Nieva, J. L., Sanz, M. A. eta lank., 2004).<br />
41
42<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Birusak bi taldetan sailkatu daitezke genoman ohiko<br />
biroporinaren genearen presentzia edo gabezia kontuan hartuz.<br />
Biroporina bat kodetzen <strong>duten</strong> birusek, mintzaren irazkortasuna<br />
areagotzeko gaitasuna duen glikoproteina bat ere kodetu dezakete.<br />
Kasu honetan mintzean eragindako kaltea zolduraren azkeneko<br />
denboratan, bai biroporinek eraginda, bai glikoproteinek eraginda izan<br />
daiteke. Beste aukera bat izan daiteke, zolduraren hasieran ematen den<br />
mintzaren irazkortasunaren handitzea glikoproteinen ondorioa izatea<br />
eta azkenengo faseetan gertatzen dena, nagusiki biroporinen<br />
eraginagatik izatea.<br />
Biroporinaren genea aurkezten ez den birusetan beste molekulek<br />
betetzen dute bere funtzioa. Adibidez, GIB-2 birusaren kasuan, ez da<br />
Vpu biroporina kodetzen eta gp41 proteinaren transmintz domeinuak<br />
irazkortasuna aldatzeko ahalmena bere baitan darama (Arroyo, J.,<br />
Boceta, M. eta lank., 1995; Saez-Cirion, A., Arrondo, J. L. eta lank.,<br />
2003). Ebola moduko beste animalia-birusek ez dute biroporinarik<br />
kodetzen, baina glikoproteinak dituzte mintzen irazkortasuna aldatzeko<br />
ahalmenarekin (Saez-Cirion, A., Gomara, M. J. eta lank., 2003).
1.5. HELBURUAK<br />
Tesiaren lehengo lan hipotesiak ezartzen du:<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
Birusek zelulak infektatzen dituztenean, produktu zitotoxikoak<br />
adierazten dituzte eta produktu hauen sekuentzia osoek edo partzialek<br />
mintz zelularren irazkortasuna areagotzeko gaitasuna dute.<br />
Hipotesi hau kontrastatzeko, 2B proteinaren sekuentziatik<br />
eratorriak diren peptidoen aktibitatea aztertuko da in vitro, 2B-ren<br />
domeinu litikoa kokatzeko asmoz. Modelo-mintzen kasuan, <strong>txertaketa</strong><br />
monogeruzetan eta liposomen irazkortasunaren aldaketa neurtzeko<br />
teknikak erabiliko dira. Animali zelulen kasuan, B-higromizinaren<br />
sarrera eta ondorioz sortarazten duen proteina zelularren sintesiaren<br />
inhibizioa aztertuko da. Biotinadun <strong>sekuentziak</strong> erabiliz, peptidoen<br />
kokapena aztertuko da zelulan, mikroskopia konfokala erabiliz.<br />
Tesiaren bigarren lan hipotesiak ezartzen du:<br />
Mab2F5 eta Mab4E10 antigorputz neutralizanteek, gp41<br />
proteinaren kanpo-domeinuko <strong>sekuentziak</strong> ezagutzen dituzte mintzean<br />
murgildurik daudenean. Hipotesia kontrastatzeko, ezagumendu<br />
prozesuan kanpo mintzaren azalerak daukan efektua aztertuko da.<br />
Modelo-mintzak erabiliko dira bi antigorputz hauek mintzaren<br />
interfasera transferitzeko, eta bertan dauden epitopoak ezagutzeko<br />
daukaten ahalmena aztertzeko<br />
43
44<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak<br />
45
46<br />
1. Kapitulua: Sarrera orokorra eta helburuak
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
______________________________________________________________________<br />
2.1. MATERIAL EZ-BIOLOGIKOA<br />
2.1.1. PEPTIDOAK<br />
Tesi honetan erabili diren peptido sintetikoak, Pompeu Fabra<br />
Unibertsitateko Proteomika zerbitzuak sintetizatu zituen, 433A peptido<br />
sintetizatzaile (Applied Biosystems) bat erabiliz. Hauek, erresoluzio<br />
altuko kromatografia likidoarenbitartez (HPLC) purifikatu ziren. Pisu<br />
molekularrak, MALDI-TOF Voyager STR (Applied Biosystems) masa<br />
espektrometro baten laguntzaz kalkulatu ziren.<br />
2.1.1.1 PEPTIDOEN DISEINUA<br />
2B proteinaren sekuentzian oinarrituz TM1, TM2 N-ter1, N-ter2,<br />
TURN eta C-ter peptidoak sintetizatu ziren.<br />
NEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK (2F5preTM) sekuentzia<br />
GIB-1-ren gp41 proteinatik dator.<br />
Zekropina “bachem” etxe komertzialera erosia izan zen.<br />
Peptido soluzioak dimetilsulfoxidoan (DMSO, gradu<br />
espektroskopikoa, Merck) prestatuak izan ziren eta kontzentrazioak<br />
azido bizinkoninikoaren mikrosaioarekin (BCA, Pierce, Rockford, IL,<br />
USA) determinatu ziren.<br />
47
48<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
2.1. Taula: 2B eta gp41 sekuentzietatik eratorriak diren peptidoak.<br />
Aminoazidoen kokapena adierazten da<br />
Peptido aa<br />
Sekuentzia<br />
izena kokapena<br />
2B 2B (1-97) GITNYIESLGAAFGSGFTQQISDKITELTNMVSTITEKLLKNLIK<br />
IISSLVIITRNYEDTTTVATLALLGCDASPWQWLRKKACDVLEI<br />
PYVIKQ<br />
N-ter1 2B (1-22) GITNYIESLGAAFGSGFTQQIS<br />
N-ter2 2B (23-46) DKITELTNMVSTITEKLLKNLIK<br />
TM1 2B (35-55) KTITEKLLKNLIKIISSLVIITWKK<br />
Turn 2B (46-69) KIISSLVIITRNYEDTTTVAT<br />
TM2 2B (59-82) KKKTTTVATLALLGCDASPWQWLR<br />
C-ter 2B (73-97) DASPWQWLRKKACDVLEIPYVIKQ<br />
Zekropina 1-37 KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK<br />
2F5preTM Gp41<br />
(656-683)<br />
NEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK<br />
2F5ep Gp41<br />
(656-671)<br />
ELDKWA Gp41<br />
(662-667)<br />
NEQELLELDKWASLWN<br />
ELDKWA<br />
2.1.2. ANTIGORPUTZAK<br />
Erabili diren Mab2F5 eta Mab4E10 antigorputz neutralizanteak,<br />
IgG1 birkonbinatu gisa CHO zeluletan ekoiztu ziren (Kunert, R.,<br />
Steinfellner, W. eta lank., 2000). Beroiek isolatzeko GIB-1-rekin<br />
infektaturik dauden, baina sintomarik aurkezten ez dituzten gaixoen<br />
odol-zelula mononuklearrak erabili ziren.<br />
Fosfatasa alkalinoa konjugatua daukaten antigorputz<br />
sekundarioak Pierce-ra erosiak izan dira. ELISA teknikarako 1:10.000<br />
diluzioan erabili ziren.
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
2.1.3. KONPOSATUAK ETA INHIBITZAILEAK<br />
FITC-estreptabidina (Sigma): Streptomyces avidinii bakteriotik<br />
datorren proteina ez glikosilatua da. Biotinari afinitate altuarekin<br />
batzen da. Estreptabidina proteina bakoitza (52,8 kDa) biotina batzeko<br />
lau gune ditu. Kasu honetan fluoreszeina isotiozianato fluoroforoari<br />
baturik dago. Immunofluoreszentzia saiorako 1:300 diluzioan erabili<br />
zen.<br />
Azido 8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfonikoaren gatz disodikoa<br />
(ANTS) eta p-xileno-bis-piridinio bromuroa (DPX), solutuen askapen<br />
saioan erabili ziren eta Molecular Probes-era (Eugene, OR, EE.UU.)<br />
erosi ziren. Liposoma barnean enkapsulatu ez den zunda kentzeko<br />
“Sephadex G-75” erretxina (Amershan Pharmacia) erabili zen.<br />
Mintzak solubilizatzeko erabili zen Triton X-100 detergentea eta<br />
solutuen askapen saioan erabili ziren 4 eta 10 Kda-etako FITCdextranoak<br />
eta “Sephacryl 500-HR” erretxina Sigma-koak (St. Louis,<br />
MO, EE.UU.) ziren. LUV-ak prestatzeko erabili ziren polikarbonatozko<br />
filtroak, Nucleopore-koak (Cambridge, MA, EE.UU.) izan ziren.<br />
Proteinen markaketa erradiaktiboa egiteko Amersham-eko trans<br />
( 35 S)-label (( 35 S) metionina/( 35 S) zisteina, >1000 ci/mmol), erabili zen.<br />
Kultibo zelulen irazkortasun saiorako erabili ziren B-Higromizina<br />
eta α-sartzina Boehringer Mannheim-ra erosi ziren.<br />
Tween 20 Merck etxe komertzialekoa zen eta “Cell dissociation<br />
buffer”-a GIBCO-tik lortu zen.<br />
Gainerako erreaktiboak kalitate analitikoa zeukaten.<br />
2.1.5. LIPIDOAK<br />
Fosfatidilkolina (PC), kardiolipina (CL), fosfatidilserina (PS),<br />
fosfatidilglizerola (PG), fosfatidilinositola (PI), lisofosfatidilkolina<br />
(lysoPC), lisofosfatidilglizerola (lysoPG), dilisokardiolipina (dilysoCL),<br />
fosfatidiletanolamina biotinilatua (biot-PE) eta N-(B sulfonil rodamina)<br />
fosfatidiletanolamina (N-Rh-PE) Avanti Polar Lipids-era (Birmingham,<br />
AL, USA) erosi ziren, eta aldiz N-(5-dimetilaminonaftalenoa-1-<br />
49
50<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
sulfoniloa)-1,2-dihexadekanoil-sn-glizero-3-fosfoetanolamina (d-DHPE)<br />
Molecular Probes-era (Junction City, OR, USA).<br />
2.1.6. TANPOIAK<br />
-ANTS/ DPX tanpoia solutuen askapen saiorako: 12.5 mM ANTS,<br />
45 mM DPX, 5 mM Hepes eta 30 mM NaCl, 0.205 osm/kg, pH 7.4.<br />
-Dikroismo zirkularrerako tanpoia: 2 mM Hepes pH 7.4.<br />
-Fluorografia tanpoia: Sodio salizilato 1 M.<br />
-Gel Finkatzailea: %7.5 azido azetikoa, %20 etanola.<br />
-Proteinen zama tanpoia elektroforesirako: 0.37 mM Tris-HCl (pH<br />
6.8), %17 glizerola, 0.1 M ditiotreitola (DTT), %1 SDS, %0.024 bromofenol<br />
urdina.<br />
-PBS tanpoia: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 eta<br />
1.5 mM KH2PO4, pH 7.4.<br />
-SDS-PAGE 10X tanpoia: 200 mM glizina, %1 SDS (p/v), 25 mM<br />
Tris-HCl, pH 8.3.<br />
-SuperBlock blocking buffer: Liposometan oinarrituriko ELISA-n,<br />
leku ez-espezifikoak blokeatzeko erabili zen. Pierce-ko tanpoi komertziala<br />
da.<br />
7.4.<br />
-Tanpoi arrunta: 100 mM NaCl, 5 mM Hepes, 0.205 osm/kg, pH<br />
-Hemolisi saiorako tanpoi fisiologikoa: 125 mM NaCl, 5 mM KCl,<br />
32 mM hepes, 5 mM glukosa, 1 mM MgSO4.7H2O, 1 mM CaCl2.2H2O, pH<br />
7.4, 0.300 osm/kg.
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
2.2. MATERIAL BIOLOGIKOA<br />
2.2.1. LERRO ZELULAR EUKARIOTOAK<br />
Tesi honetan erabili egin diren lerro zelular eukariotoak<br />
hurrengoak dira:<br />
-BHK-21 (ATCC CCL 10), hamsterraren giltzurrun zelulak.<br />
-CHO-Env, lerro zelular honek GIB-1 birusaren env genearen<br />
sekuentzia darama, beraz gainazalean gp41-gp120 proteinak<br />
espresatzen dituzte (C. Weiss eta J. White-i esker lortua, NIH AIDS<br />
Research and Reference Reagent Program-etik (ARRRP))<br />
-HeLaT4 + , lerro zelularra CD4 eta CXCR4 ko-errezeptoreak<br />
espresatzen ditu (R. Axel-i esker lortua, NIH AIDS Research and<br />
Reference Reagent Program-etik (ARRRP)).<br />
2.2.2. BAKTERIO-ANDUIAK<br />
Saio antimikrobianoa burutzeko erabili zen anduia Escherichia<br />
Coli BL21 izan zen.<br />
Bakterioak LB (Luria Broth, Pronadisa) medioan saturaziorarte<br />
hazi ziren, 37 ºC-tan eta irabiaketa motelarekin.<br />
2.3. ZELULA EUKARIOTOEN MANIPULAZIOA<br />
2.3.1. KULTIBO-MEDIOAK<br />
Zelula guztiak 37 ºC-tan eta %5 CO2 atmosfera batean hazi ziren.<br />
CHO-Env eta HeLa T4 zelulen propagazio medioa, DMEM (GIBCO)<br />
medioa G418 500 µg/ml gehigarri gisa zuelarik, izan zen.<br />
51
52<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
BHK zelulak hazteko DMEM medioa erabili zen (Dulbecco, R. eta<br />
Freeman, G., 1959). DMEM medioari %5 (v/v) txahalaren sero fetala<br />
(Flow), penizilina 50 U/ml, estreptomizina 50 U/ml eta 0.2 mg/ml azido<br />
p-hidroxibentzoikoaren ester butirikoa (Sigma) gehitu zitzaion.<br />
Oinarrizkoak ez diren aminoazidoak eta 4 mM glutamina (Merck) ere<br />
gehitu zitzaiolarik.<br />
Zelulak nitrogeno likidoan kontserbatu ziren, %20 txahalaren<br />
sero fetalarekin eta %7 DMSO kriobabesle moduan duen DMEM<br />
medioan.<br />
Proteinen [S 35 ]Met/Cys markaketa metabolikoa burutzeko,<br />
metionina eta zisteina gabeko DMEM medioan zelulak hazi ziren.<br />
2.3.2. ZELULEN ELEKTROPORAZIOA IN VITRO<br />
SINTETIZATURIKO RNA-ekin<br />
Teknika hau birusen proteinen espresioaren efektua aztertzeko<br />
erabili zen. Jarraitu zen protokoloa Liljeström eta lankideek araturikoa<br />
izan zen (Liljestrom, P. eta Garoff, H., 1991) aldakuntza txiki<br />
batzuekin. RNA-k in vitro itzulpenaren bidez lortu ziren eta<br />
kontzentrazioa determinatua izan zen.<br />
BHK-21 zelulak erabili ziren saio honetan.<br />
-Zelulak 24 ordu lehenago erein egin ziren eta subkonfluentziararte<br />
hazi ziren.<br />
-Zelulak tripsinarekin altxatu ziren eta 2000 rpm-tara 2 minutuz<br />
zentrifugatu ziren.<br />
-3 ml PBS tanpoi hotzarekin garbitu ziren, berriro zentrifugatzeko.<br />
Zentrifugazio honen ostean 2.5 x 10 6 zelula/ml lortzeko behar zen PBS<br />
tanpoian birreseki ziren.<br />
-Elektroporazioa giro tenperaturan burutu zen eta 0.4 ml zelulei<br />
itzulpen nahasketaren 50 µl gehitu zitzaien. Nahasketa 0.2 cm-tako<br />
elektroporazio kubeta (Bio-rad) batera transferitu zen, eta jarraian bi<br />
pultsu eman ziren (1500 V, 25 µF y R= ∞) elektroporadore batean (Gene<br />
Pulser, Bio-Rad).<br />
-Elektroporaturiko zelulak kultibo medioan diluitu ziren (0.7 ml) eta<br />
zentrifugatu ziren.<br />
-Geroago nahi izan zen kultibo medio bolumenean birreseki ziren<br />
eta plaketan erein ziren.
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
2.3.3. ZELULA EUKARIOTOEN MINTZ-<br />
IRAZKORTASUN ALDAKETAK: B-HIGROMIZINA ETA α-<br />
SARZINAREN SARRERA<br />
Mintz-plasmatikoan irazkortasunaren aldaketak gertatzen diren<br />
aztertzeko, proteina zelularren sintesiaren inhibizioa aztertu genuen.<br />
Zeluletan B-higromizina antibiotikoaren (HB) (Mr= 0.527 kDa.)<br />
edo α−sartzinaren (Mr=16.8 kDa) sarrera gertatzen denean proteina<br />
zelularren sintesia inhibitu egiten da.<br />
Hiru protokolo jarraitu ziren, lehenengoa, elektroporaturiko RNAak<br />
espresatzen zituzten proteinak mintza HB-ari irazkorra bihurtzeko<br />
ahalmena zuten aztertzeko, bigarrena kanpoaldetik gehituriko<br />
peptidoak mintza HB-ari irazkorra bihurtzeko ahalmena zuten<br />
aztertzeko eta hirugarrena peptidoek mintza α-sartzinari irazkorra<br />
bihurtzeko ahalmena zuten aztertzeko.<br />
2.3.3.1 ADIERAZITAKO PROTEINEN IRAZKORTASUN<br />
AHALMENA AZTERTZEKO PROTOKOLOA:<br />
-Lehenbizi, zelulak, in vitro itzuli diren RNA-ekin elektroporatzen<br />
dira eta L24 plaketan ereiten dira.<br />
-Elektroporazio osteko denbora ezberdinetan 1 mM HB-a gehitu<br />
zen, 15 minutuz, edo ez ziren HB-arekin tratatu (HB-ren kontrol negatibo<br />
moduan).<br />
-Jarraian proteinen markaketa erradiaktiboa burutu zen<br />
[ 35 S]metionina/[ 35 S]zisteina-rekin ([ 35 S]Met/Cys), 2.3.4 atalean azaltzen<br />
den modura..<br />
-Proteinen sintesia SDS-PAGE bidez, fluorografia eta<br />
autorradiografia bidez aztertu ziren.<br />
-Proteinen bandak densitometria bidez aztertu zen GS-710<br />
calibrated Imaging Densitometer (Bio-Rad) dentsitometroarekin.<br />
53
54<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
2.3.3.2. PEPTIDOEN IRAZKORTASUN AHALMENA<br />
AZTERTZEKO PROTOKOLOA:<br />
-BHK zelulak 16 mm-tako putzuetan erein ziren eta gau osoan<br />
zehar hazten utzi ziren.<br />
-Zelulak txahalaren sero fetal gabeko DMEM medioarekin garbitu<br />
ziren.<br />
-Peptidoak, zegokion kontzentraziotan, DMEM medioan disolbaturik<br />
gehitu ziren. Ordu batez 37 ºC-tan C02 inkubadorean inkubatu ziren.<br />
-Zelulak, peptido kontzentrazio bakoitzarentzako bi putzutan erein<br />
ziren, honela putzu batean 1 mM HB gehitu zen eta bestean ez (HB-ren<br />
kontrol negatibo moduan). HB-arekin 15 minutuz inkubatu ziren.<br />
-DMEM medioarekin garbitu ziren eta 10 µCi/µl [ 35 S]Met/Cys-rekin<br />
markatu ziren 40 minutuz.<br />
-Inkubazioaren ostean proteinen karga tanpoian laginak jaso ziren,<br />
5 minutuz 95 ºC-tan irekin ziren.<br />
-Proteinen sintesia SDS-PAGE bidez, fluorografia eta<br />
autorradiografia bidez aztertu ziren.<br />
-Proteinen bandak densitometria bidez aztertu ziren GS-710<br />
calibrated Imaging Densitometer (Bio-Rad) dentsitometroarekin.<br />
2.3.3.3. α-SARTZINAREN SARRERARAKO PROTOKOLOA<br />
α-Sartzinak erribosomaren 60S subunitatea inaktibatuz, itzulpen<br />
zelularra inhibitzen duen 16.8 kDa-etako RNAsa bat da. Inhibitzaile<br />
zelular hau erabili zen, TM1 peptidoak eragiten duen poroak zelula<br />
barnealderantz makromolekulen sarrera ematen den edo ez aztertzeko.<br />
α-Sartzina, B-higromizinarekin konparatzen badugu, Bhigromizina<br />
antibiotiko txikia da (0.527 kDa), eta honek bai TM1-ek<br />
eragindako poroak zeharkatu ditzazke eta itzulpen zelularra inhibitu.<br />
Gaitzik gabeko zelulak α-sartzinara irazgaitzak dira.<br />
-BHK zelulak peptidoekin inkubatu ziren (5 µM sero gabeko DMEM<br />
medioa) 1 h-z eta 37 ºC-tan.<br />
-Ondoren α-sartzinarekin 20 minutuz aurretik tratatu ziren (10<br />
µg/ml), peptidoa kendu barik.<br />
-Medioa kentzen da eta proteinen markaketa erradiaktiboa egiten<br />
da 10 µCi/µl [ 35 S]Met/Cys–rekin. Marka metionina eta zisteina gabeko
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
DMEM medioan disolbatzen da α-sartzinaren presentzian (+) eta<br />
gabezian (-), 40 minutuz.<br />
-Proteinen sintesia SDS-PAGE bidez (%15), fluorografia eta<br />
autorradiografia bidez aztertu ziren.<br />
-Proteinen bandak densitometria bidez aztertu ziren GS-710<br />
calibrated Imaging Densitometer (Bio-Rad) dentsitometroarekin.<br />
α-sartzinaren sarreraren kontrol positibo moduan, zelulak SVrekin<br />
(Sindbis birusa) infektatu ziren, birus honen endozitosi bidezko<br />
sarrerarekin batera, kultibo medioan dauden makromolekulak sartzen<br />
sartzen baitira.<br />
-Zelulak SV-rekin 10 eta 100 pfu/zelula infektatu ziren 1 h-z eta<br />
37 ºC-tan (birusaren adsortzioa eta sarrera baimentzeko denbora) αsartzinaren<br />
presentzian 10 µg/ml (birusaren sarrerarekin batera<br />
inhibitzailearen sarrera eman dadin).<br />
-Ondoren medioa kendu eta proteinen markaketa erradiaktiboa<br />
egin zen.<br />
2.3.4. PROTEINEN MARKAKETA METABOLIKOA<br />
-Proteinen markaketa erradiaktiboa egiteko, zelulei 1 µl<br />
([ 35 S]Met/Cys (10 mCi/ml [ 35 S]metionina/[ 35 S]zisteina) nahasketa 200 µl<br />
metionina eta zisteina gabeko DMEM medioan gehitu zitzaien.<br />
-Zelulak markarekin 30-40 minutuz inkubatu ziren, laginak<br />
proteinen zama tanpoian jasoz.<br />
2.3.5. ELEKTROFORESIA POLIAKRILAMIDA<br />
GELETAN<br />
Proteina-laginak poliakrilamida geletan baldintza<br />
desnaturalizatzaileetan elektroforesi bidez aztertu ziren (SDS-PAGE,<br />
(Sambrook, J., Fritsch, E. R. eta lank., 2001). Erabili ziren gelak %15<br />
poliakrilamida zeramaten.<br />
-Proteinen zama tanpoian jaso ziren laginak 95 ºC-tan irakin ziren<br />
5 minutuz.<br />
-Laginak %15 poliakrilamida geletan kargatu ziren eta gelak 45 mA<br />
55
56<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
konstantepean migratu ziren SDS-PAGE tanpoia elektrolito moduan<br />
erabiliz.<br />
2.3.6. FLUOROGRAFIA<br />
[ 35 S]Met/Cys-ekin markatu eta SDS-PAGE bidez aztertu ziren<br />
proteinak fluorografiarekin tratatu ziren, seinale erradioaktiboa<br />
areagotzeko.<br />
-Gelak %7.5 azido azetiko, %20 etanola eta ur distilatua zeukan<br />
disoluzio batekin finkatu ziren 15 minutuz.<br />
-Ur distilatuarekin garbitu eta gero, 1 M sodio salizilato disoluzio<br />
fluorografikoan inkubatu ziren ordu batez.<br />
-Gelak 3 mm-tako Whatman orrietan lehortu ziren, 80 ºC-tan gel<br />
lehorgailu batean.<br />
-Gelak film autorradiografikoetan (Kodak) errebelatu ziren.<br />
2.3.7. FLUORESZENTZIAKO MIKROSKOPIA<br />
KONFOKALA<br />
Azken urteetan mikroskopia optikoan eman den aurrerapen<br />
handienetariko bat, fluoreszentziako mikroskopia konfokala izan da.<br />
Teknika honekin zelula biziak, zelula finkatuak eta ehunak<br />
zehaztasun handiarekin ikustea lortzen da. Bestalde, laginen bai<br />
kanpoaldeko, bai barnealdeko hiru dimentsiotako azterketa egitea eta<br />
materiale zehatz batzuen kasuan erreflexio ikerketak egitea<br />
ahalbidetzen du.<br />
Mikroskopia mota honen beste aplikazio bat zelularen alderdi<br />
batean markatzaile ezberdinen kokapena aztertzea da. Laser iturri<br />
anitzak erabiliz uhin luzera ezberdinetan, aldi berean lagina kitzikatzea<br />
lortzen da.<br />
Mikroskopia konfokalaren teknika asko hobetu da, ordenagailuen<br />
aurrerapenak, informazioa gordetzeko teknologiaren aurrerapenak<br />
direla, laser sistema berrien ondorioz, interferentzia filtroen<br />
agerpenagatik, itu espezifikoen kontrako fluoroforoen garapenagatik.<br />
Garapen guzti hauek fluoreszentzia teknikarik erabiliena bihurtu dute.
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
-BHK zelulak aurretik sugarrean esterilizaturiko porten gainean<br />
erein ziren.<br />
-Kubreak 16 mm-tako putzuetan kokatu ziren eta gau osoan zehar<br />
hazten utzi ziren.<br />
-Txahalaren sero fetal gabeko medioan garbituriko zelulei 10 µM<br />
peptido gehitu zitzaien (DMEM medioan disolbaturik). Ordu batez<br />
inkubatu ziren 37 ºC-tan eta C02 inkubatzailean.<br />
-Zelulak finkatu baino lehen, hiru bider PBS tanpoiarekin garbitu<br />
ziren.<br />
-Zelulak finkatzeko %4 paraformaldehido erabili zen 10-25 minutuz<br />
eta berriro PBS-z garbitu ziren.<br />
-Zelulak irazkortzeko %0.1 Triton X-100 zeraman PBS tanpoia<br />
erabili zen.<br />
-Zelulak irazkortu ostean, FITC-estreptabidinadun tanpoiaz ordu<br />
batez inkubatu ziren ilunpetan. konposatua zegokion diluzioan (1:300)<br />
%0.1 triton X-100 eta %1 BSA zeraman PBS tanpoian gehitu zen.<br />
-Irazkortu gabeko zelulak, finkatu eta PBS-rekin garbitu ostean,<br />
FITC-estreptabidina gehitu zitzaien.<br />
-Bi kasutan zelulak berriro PBS tanpoiarekin garbitu ziren eta<br />
kubreak portetan prestatu ziren Mowiol-az (Calbiochem) finkatuz.<br />
-Zelulak Radiance 2000 (Bio-Rad/Zeiss) mikroskopio konfokalean<br />
63X/1.4 oil Plan-Apochromat (Zeiss) objetiboa erabiliz aztertu ziren.<br />
2.3.8. SINTZITIO-ERAKETAREN INHIBIZIOA<br />
Sintzitioen eraketa GIB-1 birusaren zikloan zehar agertzen den<br />
ezaugarri bat da, batez ere gaixotasuna aurrera doanean CXCR4<br />
errezeptore menpekoa delarik.<br />
Esperimentu honen bidez (Muster, T., Steindl, F. eta lank., 1993)<br />
bi zelulen arteko fusioa ematen dela ikus dezakegu. CHO-Env zelulak<br />
gp41-gp120 proteinak gainazalean espresatzen dituzte, GIB-1 birioia<br />
emulatuz. HeLaT4 zelulek aldiz, CD4 errezeptorea eta CXCR4 koerrezeptorea<br />
espresatzen dituzte, zelula ostalaria imitatuz. Bi lerro<br />
zelular hauek batera ereiten direnean, fusioa gertatzen da eta nukleo<br />
anitzeko zelulak agertzen dira. Esperimentu honen bidez, konposaturen<br />
batek edo antigorputzen batek sintzitioen eraketa inhibitzen <strong>duten</strong>entz<br />
azter daiteke.<br />
57
58<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
2.3.8.1. SINTZITIOEN ERAKETARAKO PROTOKOLOA<br />
-CHO-Env eta HeLaT4 lerro zelularrak bakoitza bere aldetik eta<br />
dagokien kultibo medioan hazten dira T-75 batean.<br />
-%70-80-ko konfluentzia lortu <strong>duten</strong>ean, CHO-Env zelulei 6 mM<br />
sodio butirato (Sigma; St. Louis, MO, EE.UU.) gehitzen zaie, eta 16 orduz<br />
inkubatzen dira. Sodio butiratoarekin gainazaleko proteinaren espresio<br />
altuagoa lortzen da.<br />
-Denbora hori igaro ondoren, zelulak proteasa gabeko medio<br />
batekin altxatzen dira, “cell dissociation buffer”-arekin (Gibco invitrogene)<br />
hain zuzen.<br />
-Zelulak zenbatu direnean, zelula mota bakoitzetik 35.000<br />
zelula/putzu bakoitzeko ereiten dira, 96 putzuetako plaketan.<br />
-MSX gabeko GMEM gehitzen zaie eta 6 orduz inkubatzen dira.<br />
Denbora hau pasa ondoren sintzitioak ikus daitezke, orduan in situ<br />
argazkiak ateratzen dira Camedia C-5050 kamara digital batez<br />
(Olympus-Europe, Hamburg, Germany) ekipatuta dagoen Olympus<br />
CKX41 mikroskopio alderantzikatu (Olympus-Europe, Hamburg,<br />
Germany) batekin eta fase kontrastea erabiliz. Zelulak hain labilak<br />
direnez ez dira finkatzen ezta tindatzen sintzitioak altxatzen direlako.<br />
-Esperimentu guztia 37 ºC-tan eta %5 CO2 duen inkubadore batean<br />
burutu zen.<br />
2.3.8.2. SINTZITIO-ERAKETARAREN INHIBIZIO<br />
PROTOKOLOA<br />
-Peptidoak eta antigorputz neutralizatzaileak zelulen fusioa<br />
inhibitzeko gaitasuna zutela aztertzeko, aurreko protokoloa jarraitu zen<br />
baina antigorputza edo peptidoak CHO-Env zelulekin 90 minutuz<br />
inkubatuz. Ondoren HeLaT4 erein zen eta plaka 6 ordu ostean aztertu<br />
zen.<br />
Inhibizio efektuaren itzulpena ikusteko, hots, inhibizioaren<br />
blokeoa, hurrengoa egin zen:<br />
-CHO-WT zelulei Mab-ak gehitu baino lehen, hauek peptido edo<br />
fosfolipidoekin 90 minutuz inkubatu ziren giro tenperaturan.<br />
-Ondoren CHO-Env zelulak 90 minutuz nahasketarekin inkubatu<br />
ziren.
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
-Denbora hori pasata HeLaT4 zelulak CHO-Env zelulekin erein<br />
ziren.<br />
-Zelulak 6 orduz inkubatu ziren 37 ºC-tan eta %5 CO2 duen<br />
inkubadore batean.<br />
-Sintzitio-eraketaren protokoloan egiten den bezala, in situ<br />
argazkiak ateratzen dira Camedia C-5050 kamara digital batez<br />
(Olympus-Europe, Hamburg, Germany) ekipatuta dagoen Olympus<br />
CKX41 mikroskopio alderantzikatu (Olympus-Europe, Hamburg,<br />
Germany) batekin eta fase kontrastea erabiliz.<br />
2.4. MINTZ-EREDUEN SISTEMAK<br />
Mintz-eredu sistema ugari diseinatu egin dira lipido puruak,<br />
lipido-nahasketak eta lipido-proteina nahasketen propietateak<br />
aztertzeko. Mintz-eredu hauek erabiltzearen helburua, mintz<br />
biologikoen dinamikan eta lipido-proteinen arteko elkarrekintzetan<br />
gehiago sakontzea da. Bigeruza artifizialak eta zelula-mintzak egitura<br />
anisotropikoak dira, mugikortasuna murriztua daukate mintzaren<br />
planora, bertan lipidoak bi dimentsiotan mugitzen direlarik. Bigeruza<br />
artifizialak oso eredu arruntak dira, baina zelula-mintzek dauzkaten<br />
ezaugarri jakin batzuk zehaztasun handiarekin imitatzen dituzte.<br />
Lipido-besikulak eratzeko metodo ezberdinak, lipidoek<br />
bigeruzaren oinarrizko egitura hartzeko ahalmenean oinarritzen dira.<br />
Jokabide hau lipidoen izaera anfipatikoaren ondorioz da. Lipidoaren<br />
alde hidrofilikoa ingurune-urtsura begira kokatzen da, lipidoaren kate<br />
hidrokarbonatuak ingurune honekin ahalik eta kontaktu azalera<br />
txikiena aurkeztuz.<br />
Mintz-eredu hauek, energetikoki faboragarriak diren<br />
monogeruzetan, bigeruza lauetan eta liposometan antolatzen dira<br />
(Gennis, R. B., 1989).<br />
2.4.1. LIPOSOMAK<br />
Liposomak mintz-eredu sistema oso erabilgarriak dira,<br />
biokimikan, biofisikan, farmakologian eta kosmetika arloetan besteak<br />
beste.<br />
59
60<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
Liposomak, bigeruza batez edo gehiagoz osoturiko besikula<br />
artifizialak dira (New, R. R. C., 1990). Liposomen barnealdea,<br />
prestatuak izan direneko, soluzioaren bolumena gordetzen dute<br />
(Gennis, R. B., 1989; New, R. R. C., 1990). Lipidoak ingurune urtsu<br />
batean sakabanatzen direnean, liposomak berez eratzen dira. Sortzen<br />
diren besikulen populazioa, bai tamainan, bai forman, eta bai lamela<br />
kopuruan ezberdinak izan daitezke. Liposomek osagai solugarriak<br />
enkapsulaturik, edo mintzera baturik osagai liposolugarriak garraia<br />
ditzakete. Mintz-ereduak sistema moduan garrantzi handikoak dira,<br />
osagai naturalekin sortu daitezkeelako eta zelula-mintzaren lipido<br />
osaketa eta proportzio berdinarekin prestatu ahal direlako (New, R. R.<br />
C., 1990).<br />
Liposomak tamainaren arabera eta lamela kopuruaren arabera<br />
sailkatu daitezke (2.1 irudia ikusi) (Moscho, A., Orwar, O. eta lank.,<br />
1996):<br />
-SUV-ak: Lamela bakarreko besikula txikiak dira (ingelesetik<br />
Small Unilamellar Vesicles). SUV-ak fosfolipidoek eratu ditzaketen<br />
tamaina txikienetariko besikulak dira. Tamainaren muga inguruko<br />
indar ionikoaren eraginez edo mintzaren lipido-osaketaren eraginez<br />
aldatu daiteke. Normalean 10-50 nm-tako diametroa daukate.<br />
-LUV-ak: Lamela bakarreko besikula handiak dira (ingelesetik,<br />
Large Unilamellar Vesicles). LUV-en tamaina 100-500 nm ingurukoa<br />
izaten da.<br />
-MLV-ak: Lamela ugariak dituzten besikulak dira (ingelesetik,<br />
Multilamellar Vesicles). Tamaina ezberdineko besikulak dira, 100-1000<br />
nm tartekoak eta zentrokideak diren 7-10 lamela edo bigeruzez osatuta<br />
daude.<br />
-GUV-ak: Lamela bakarreko besikula erraldoiak dira (ingelesetik,<br />
Giant Unilamellar Vesicles). Lipido osaketaren arabera tamaina<br />
ezberdina hartu dezakete, 25 µm-tik 100 µm-tara (Akashi, K., Miyata,<br />
H. eta lank., 1996).<br />
SUV-ek kurbadura erradio handia daukatenez lipidoak bi<br />
monogeruzetan era ezberdinetan sakabanatzen dira, lipido totalen %40a<br />
barnealdeko monogeruzan kokatzen delarik eta %60-a kanpoaldeko<br />
monogeruzan (Chapman, D., 1984). Besikulen tamaina zenbat eta<br />
handiagoa izan, bi monogeruzen azalera gero eta lauagoa den geometria
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
bat hartuko du, bi monogeruza hauetan dauden lipidoen banaketa<br />
homogeneoagoa eginez (%49 barneko monogeruzan eta lipidoen %51<br />
kanpoaldeko monogeruzan, 100 nm-tako tamaina daukaten LUV-etan<br />
(Mayer, L. D., Hope, M. J. eta lank., 1986).<br />
2.1. Irudia: Liposoma mota ezberdinen eraketa: MLV: Lamela anitzak<br />
dituzten liposomak; LUV: Lamela bakarreko liposoma handiak; SUV: Lamela<br />
bakarreko liposoma txikiak. Lipidoek bigeruzan izango luketen parakuntza<br />
adierazteko bigeruzaren eremu bat handitu da.<br />
2.4.1.1. LIPOSOMEN PRESTAKUNTZA<br />
-Etxe komertzialek lipidoak hautsetan eta liofilizaturik bidaltzen<br />
dituzte. Hautsetan dauden lipidoak, disolbatzaile organikoetan<br />
disolbatzen dira, orokorrean kloroformo:metanolean (2:1, bol:bol) edo<br />
kloroformoan soilik (Merck).<br />
-Prestatu nahi ditugun liposomen osaketa eta kontzentrazioa<br />
kontuan hartuz, lipido kantitate ezberdinak nahasten dira.<br />
-Fase organikoa lurruntzen da nitrogeno gas korronte batekin edo<br />
errotabapore batekin (lurrundu behar den bolumenaren arabera).<br />
Lurrinketa prozesu endotermiko bat denez, lipidoa daraman saiodia<br />
61
62<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
hozten da, beraz batzuetan saiodia pixka bat berotu behar da prozesua<br />
errazteko.<br />
-Lipido-filma saiodiaren beheko aldean eratzen denean, saiodia 1-2<br />
orduz huts ponpa bati konektaturik dagoen lehorgailu batean uzten da.<br />
Azkenengo pausu hau disolbatzaile organikoaren arrastorik ez geratzeko<br />
ematen da.<br />
-Lipido filma tanpoi arruntean (edo zundak enkapsulatu behar<br />
direnean, dagokion tanpoian) bireseki egiten da trantsizio tenperaturarik<br />
(Tm) altuena daukan lipidoaren Tm-a baino 5 ºC altuagora.<br />
-Nahasketa bortex batean bost minutuz irabiatzen da, lipido-filma<br />
saiodiko paretetatik altxatu arte. Lortzen den esekidura, zuria eta<br />
homogeneoa izan behar da. Esekidura hau, MLV-z osaturik dago eta Tm<br />
altuena daukan lipidoaren Tm-a baino 5 ºC gehiagotan mantendu behar<br />
da.<br />
-MLV-en lamela zentrukideak kongelazio eta deskongelazio zikloak<br />
eginez desegonkortzen dira, lagina nitrogeno likidotik (-180ºC) fusio<br />
tenperatura altuena daukan lipidoaren tenperaturara dagoen bainu<br />
batera pasatuz. Prozesu hau 10 bider errepikatu behar da; honela lortzen<br />
diren egiturei FTMLV-ak deritze (ingelesetik, Freeze and Thaw<br />
Multilamellar Vesicles).<br />
Liposomei tamaina eta itxura egokia emateko Hope-ek (Hope, M.<br />
J., Bally, M. B. eta lank., 1985) deskribaturiko estrusio metodoa<br />
erabiltzen da. Metodo honetan besikulak polikarbonatozko filtroetatik<br />
pasatzen dira (Nucleopore Cambridge, MA, EEUU). Polikarbonatozko<br />
filtro hauek, laser baten bidez diametro zehatzeko poroak egin zaizkien<br />
polimero lamina meheak dira. Poroaren diametroa aldatuz tamaina<br />
ezberdineko besikulak egin daitezke. Poroaren diametroa ez da bat<br />
etortzen besikulen tamainarekin, 100 nm-tako poroen kasuan izan ezik<br />
(Hunter, D. G. eta Frisken, B. J., 1998). Hau, fosfolipido besikulek<br />
daukaten malgutasunagatik gertatzen da; besikulek konformazioa<br />
aldatu dezakete eta porotik itzuri. Dena den, poroa baino diametro<br />
handiagoa daukaten liposomak prozesuan apurtu egiten dira, besikulen<br />
batez besteko diametroa gutxituz.<br />
2.4.1.1.1. LUV-en prestakuntza<br />
-Tesi honetan LUV-ekin buruturiko esperimentuetarako, 100 nmtako<br />
bi polikarbonato mintz erabili ziren (Nucleopore, Cambridge, MA,<br />
EEUU). LUV zurien edo ANTS/DPX barnean enkapsulaturik dituzten LUVen<br />
kasuan, eta 200 nm-takoak FITC-dextranoak barnean enkapsulaturik
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
zituzten LUV-ak prestatzeko. Mintzak bata bestearen jarraian jarri ziren<br />
liposoma populazio homogeneo bat lortzeko.<br />
-Liposomak, 200 psi nitrogeno gasa erabiliz estrusore batetik<br />
pasarazten dira. Estrusoretik pasatzen den esekiduraren abiadura,<br />
liposomen tamaina, kontzentrazioa, kolesterolaren edukia eta<br />
fosfolipidoen insaturazio mailaren menpe dago, bigeruza isurkorragoa<br />
aurkezten <strong>duten</strong> liposomak zailago apurtzen direlarik.<br />
-Zundak enkapsulatu nahi izan zirenean, lipido filma zundadun<br />
tanpoian birreseki zen. Beti kontuan izanik tanpoia, saioko tanpoiarekin<br />
isotonikoa izan behar zela eta, beraz bi tanpoien indar ionikoa doitu egin<br />
zen. Izozte/desizozte zikloak egin ostean, prestakina irazpen<br />
molekularreko zutabe batetik pasatu zen, kanpoaldean enkapsulatu<br />
gabe geratzen zen zunda kentzeko. ANTS/DPX zundak enkapsulatu nahi<br />
izan zirenean, “Sephadex G-75” erretxina erabili zen eta FITC-dextranoak<br />
enkapsulatu nahi izan zirenean “Sephacryl HR-200” erretxina.<br />
2.4.1.1.2. SUV-en prestakuntza<br />
-SUV-en prestakuntzarako, MLV besikulak 10 minutuz sonikatzen<br />
dira.<br />
-Jarraian 13.000 rpm-tara, 10 minutuz eta 4 ºC-tan lagina<br />
zentrifugatzen da, sonikatzerakoan, zundatik erori izan ahal den<br />
zundaren metala kentzeko.<br />
SUV-en desegonkortasuna dela eta, prestatu eta hurrengo 12<br />
orduetan erabili ziren.<br />
2.4.1.2. LIPIDOEN KONTZENTRAZIOAREN DETERMINAZIOA<br />
Liposomen kontzentrazioa zuzenean determinatzea nahiko zaila<br />
da. Erabiltzen den metodoa ez-zuzena da, eta sistemako fosforoaren<br />
kuantifikazioan oinarritzen da (Bartlett, G. R., 1959). Kuantifikazio hau<br />
egiteko erabiltzen den aldaera erabiliena Bottcher eta lankideek<br />
garatutakoa da (Bottcher, G. J. F., Van Gent, C. M. eta lank., 1961).<br />
Metodo honetan laginean dagoen fosfolipidoen fosforoa, fosfato<br />
inorganikora liseritzen da. Amonio heptamolibdatoak, fosfolipidoen<br />
fosfatoa azido fosfomolibdenikoan bihurtzen du. Azido hau, azido<br />
askorbikoarekin nahasterakoan erreduzitzen da, urdin koloreko<br />
63
64<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
konposatu bat emanez. Kolorearen intentsitatea espektrofotometro<br />
batean neurtzen da, eta zuzen patroi batekin konparatu egiten da,<br />
fosforo kontzentrazioa lortuz.<br />
Erreaktiboak:<br />
-%70 azido perklorikoa (HClO4)<br />
-Amonio heptamolibdato erreaktiboa: litro bat<br />
Amonio hepatamolibdatoa [(NH4)6Mo7O24.4H2O] 2,2 gr<br />
Azido sulfurikoa (H2SO4) %95-98, 14,3 ml<br />
-%10 azido askorbikoa (p/b)<br />
Garapena:<br />
1mM-tan dagoen NaPO4 2- .H2O disoluzio batekin zuzen patroia<br />
prestatzen da, bolumen ezberdineko alikuotak jarriz.<br />
Saioa hiru ataletan banatzen da:<br />
a) Liseriketa: Saiodi bakoitzari HClO4 70 % 0.5 ml bota<br />
zitzaion eta 45 minutuz 204 ºC-tan inkubatu ziren.<br />
b) Kolorea ematen duen erreakzioa: Saiodi bakoitzari 4<br />
ml molibdato erreaktiboa bota zitzaion eta jarraian 0.5 ml azido<br />
askorbiko, laginak bortex baten laguntzaz nahastu zirelarik. Saiodiak 10-<br />
15 minutuz 100 ºC-tan inkubatu ziren.<br />
c) Irakurketa: Philips (Philips analytical, Cambridge, EB)<br />
kolorimetro batean absorbantziak neurtu ziren uhin luzera 812 nm-tan<br />
finkatuz.<br />
2.4.2. MONOGERUZAK<br />
Langmuir monogeruzak oso erabiliak izan dira, maila<br />
molekularrean informazio ugari ematen baitute. Monogeruza hauek,<br />
uretan disolbaezina den eta anfipatikoa den konposatu bat, adibidez<br />
fosfolipido bat, azalera urtsu batean sakabanatzean eratzen dira.<br />
Fosfolipido molekulak azalera urtsuaren interfasean kokatzen dira eta<br />
molekula bakoitzeko azaleraren arabera antolatu eta orientatu egiten<br />
dira. Kate hidrofobikoak airerantz begira eta buru polarrak ingurune<br />
urtsura begira kokatuko dira.
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
Lipidoz osaturiko monogeruzak, peptidoek eta proteinek<br />
mintzekiko ezartzen dituzten elkarrekintzak aztertzeko oso tresna<br />
garrantzitsuak dira (Maget-Dana, R., 1999). Liposomekin gertatzen ohi<br />
ez den bezala, lipido-monogeruzetan, lipido osaketak ez du eraginik<br />
monogeruzaren egoera fisikoan, beraz ezin dira fase lamelarrak edo fase<br />
hexagonalak eratu (Micol, V., Sanchez-Pinera, P. eta lank., 1999); are<br />
gehiago, lipidoen paketamenduaren dentsitatea aukeratu daiteke.<br />
Molekula batek gehitzen den monogeruzarekiko afinitatea<br />
aurkezten badu, monogeruza interfasearen azalera-presioan aldaketak<br />
(∆π) ematen dira. Azalera-presioaren aldaketa, monogeruzan txertatzen<br />
den proteina kantitatearekin erlazionaturik dago (Fidelio, G. D., Maggio,<br />
B. eta lank., 1986). Hasierako azalera-presioaren funtzioan gertatzen<br />
diren ∆π aldaketak aztertuz, proteinaren presio kritikoa (πc) edo esklusio<br />
presioa (πexc) atera daiteke. πc honek proteina edo peptidoa<br />
monogeruzan edo mintzean zein π −tik gora ezin den txertatu<br />
adierazten digu (2.2 irudia). Zentzu honetan, peptidoak edo proteinak<br />
mintz biologikoek aurkezten dituzten presioetan txertatzeko gai diren<br />
edo ez aztertu dezakegu.<br />
Gainazaleko presio aldaketa µTrough S (Kibron, Helsinki,<br />
Finlandia) sistemarekin eta Wilhemy-ren metodoa erabiliz aztertu zen<br />
(Davies, J. T. eta Rideal, E. K., 1963). Wilhemy-ren metodoa,<br />
monogeruza batekin kontaktuan dagoen zunda batek detektatzen duen<br />
pisu aldaketen neurketan oinarritzen da. Zunda, kontrako muturretik<br />
elektro-balantza batera loturik dago. Hortaz, balantzak hiru indarren<br />
emaitza den pisua detektatzen du; grabitatea, azalera-tentsioa eta<br />
likidoaren bultzada, azken indar hau beste bien kontra egiten duelarik.<br />
Neurketak egiten ari diren bitartean pisua eta likidoaren bultzada<br />
aldatzen ez direnez, detektatzen diren aldaketak azaleko tentsioaren<br />
aldaketen ondorioa dira soilik.<br />
-Neurketak irabiaketa konstantepean eta azalera konstantea zuen<br />
kubetan egin ziren.<br />
-Kubetaren diametroa 2 cm-takoa zen eta 1 ml-tako bolumena<br />
zeukan.<br />
-Fase-urtsu modura tanpoi arrunta (Hepes 5 mM, NaCl 100 mM, pH<br />
7.4) erabili zen.<br />
-Kloroformotan (Merck) disolbaturik zeuden lipido nahasketak,<br />
fase-urtsutik sakabanatzen dira nahi den hasierako azalera-presioan<br />
(π0). 10 minutu itxaron zen kloroformoa guztiz lurrintzeko eta monogeruza<br />
egonkortu zedin.<br />
65
66<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
-Peptidoa subfasean injektatu zen, “Hamilton” mikroxiringa baten<br />
laguntzaz.<br />
Azalera-presioaren aldaketak denboraren funtziopean neurtu<br />
ziren. Peptidorik gabe, tanpoiaren bolumen berdinak injektatuz, ez zen<br />
inolako presio aldaketarik behatu.<br />
2.2. Irudia: Peptido baten <strong>txertaketa</strong> fosfolipidoz osaturiko monogeruza<br />
batean. Peptidoaren <strong>txertaketa</strong>k azalera-presioaren handipena dakar, interfasean<br />
dauden molekulen paketatzea handitzen delako.<br />
2.5. SAIO BIOFISIKOAK<br />
2.5.1. FLUORESZENTZIA BIDEZ EGINDAKO<br />
NEURKETAK<br />
Fluoreszentzian oinarrituriko espektroskopia teknika oso erabilia<br />
da, batez ere, proteina eta peptidoek mintzekin dituzten elkarrekintzen<br />
prozesu biofisikoak aztertzeko orduan. Proteinen berezko ezaugarriek<br />
(fenilalanina, tirosina eta triptofano aminoazidoak fluoroforoak baitira),<br />
zunda fluoreszenteak erabili ahal izateak (lipido fasean txertaturik<br />
erabiliz, besikula barneko ingurune urtsuan sarturik, edo proteinetara<br />
lotura kobalenteen bidez loturik erabiliz) fluoreszentziari erabilera<br />
handia ematen diote. Teknika honen bidez oso ikasketa ezberdinak
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
burutu daitezke, adibidez eta batzuk aipatzeagatik, bigeruzen<br />
isurkortasuna neurtzea (Lakowicz, J. R., 1983), besikulen<br />
irazkortasunaren aldaketa eta hauen fusioa aztertzea (Ellens, H., Bentz,<br />
J. eta lank., 1985), mintzen lipido-nahasketa aztertzea (Struck, D. K.,<br />
Hoekstra, D. eta lank., 1981), mintzetara proteinen batuketa aztertzea<br />
(White, S. H. eta Wimley, W. C., 1998), proteinen oligomerizazioaren<br />
azterketa (Rapaport, D. eta Shai, Y., 1991) eta proteinen tolespenaren<br />
azterketa (Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S. eta lank., 2000).<br />
Mintzen egitura eta dinamikaren azterketarako, zunda<br />
fluoreszenteen erabilpena ohikoena da. Hala ere, zundek zenbait<br />
ezaugarri bete behar dituzte emaitzak fidagarriak izan daitezen:<br />
1-Mintzen ezaugarrietan ezin dituzte aldaketarik eragin.<br />
2-Lipido monomero bakoitzaren mugimenduetara sentikorrak<br />
izan behar dira, neurketa fluoreszenteak ematen diren denbora eskalan.<br />
3- Estintzio koefiziente altua eta etekin kuantiko ona izatea.<br />
4-Xurgapen eta igorpen limite zabalak izatea.<br />
5-Bigeruzaren paketamendu naturalean ahalik eta gutxien<br />
elkarregitea.<br />
6-Modu zuzen batean orientatu behar dira.<br />
Jarraian azaltzen dira tesi honetan erabili diren fluoreszentzian<br />
oinarrituriko tekniken metodo esperimentalak.<br />
2.5.1.1. SOLUTUEN ASKAPENA<br />
Liposomen barnealdean enkapsulaturiko solutuen askapen<br />
saioarekin, kanpoko eragile batek liposomaren irazkortasun hesia<br />
apurtzeko gaitasuna neurtu daiteke. Prozesu hau (Ellens, H., Bentz, J.<br />
eta lank., 1985) garaturiko metodoarekin neurtu zen. Metodoa,<br />
partikulen kolisioaren eraginez ematen den energi transferentzian<br />
oinarriturik dago.<br />
67
68<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
2.5.1.1.1. ANTS/DPX saioa<br />
p-xileno-bis-piridinio bromuro molekulak (DPX) 8aminonaftaleno-1,3,6-trisulfoniko<br />
azidoarekin (ANTS) talka egiterakoan,<br />
azkenengoaren fluoreszentzia moteltzen da (2.3 irudia). ANTS<br />
molekularen kitzikapen eta igorpen maximoak 355 eta nm-tan<br />
aurkezten ditu hurrenez-hurren. Liposomen barnealdean bi molekulak<br />
batera enkapsulatzen direnean (DPX:ANTS ~ 4:1, MW= 422 eta 427 Da.<br />
hurrenez hurren), ANTS-aren igorpena DPX-ek moteltzen du, eta<br />
neurtzen den fluoreszentzia minimoa da. Mintzaren irazkortasuna<br />
handitzen baldin bada, bi konposatuak liposometatik aterako dira, eta<br />
kanpo medioan diluituko dira, kolisio fenomenoak murriztu egiten<br />
direlarik. Beraz, DPX-ak ANTS-aren gainean eragiten duen atenuazio<br />
fenomenoa desagertzen denez, ANTS-aren fluoreszentzia igorpenaren<br />
seinalea handituko da. Mekanismo hau hurrengo irudian adierazita<br />
agertzen da.<br />
-ANTS/DPX LUV-ak prestatzeko, 2.4.1.1 atalean adierazi den<br />
moduan jar<strong>duten</strong> da, baina lipido filma ANTS/DPX tanpoian birresekiz<br />
(ikusi 2.1.5 atala).<br />
-LUV-ak prest daudenean, esklusio molekularreko zutabe batetik<br />
pasatu ziren (Sephadex G-75, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala,<br />
Suedia), honela besikulen kanpoaldean geratu den zunda baztertu zen.<br />
-Irazkortasun saioan erabiltzen den tanpoi arrunta, ANTS/DPX<br />
tanpoiarekin orekan egon behar da, liposomak apurtu ez daitezen.<br />
Honetarako bi tanpoien osmolaritatea osmometro batean doitu zen<br />
(Osmomat 030, Gonotec).<br />
Askatzen den zundaren portzentajea hurrengo ekuazioarekin<br />
kuantifikatu zen:<br />
% Askapena=[(Ff – F0)/ (F100 – F0)] x 100 (1)<br />
Ff, peptidoa gehitu ostean fluoreszentziaren baloreari dagokio, F0<br />
liposomen hasierako fluoreszentzia balorea da, peptidoa gehitu baino<br />
lehenagokoa; eta F100 triton X-100 detergentea gehitu ostean lortzen<br />
den ANTS-aren fluoreszentzia maximoa. Triton X-100-ekin liposomak<br />
erabat solubilizatzen dira eta barnealdean dagoen zunda guztia<br />
kanpoaldera ateratzen da.
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
2.3. Irudia: Solutuen askapen saioaren adierazpen eskematikoa. Hasiera<br />
batean molekulak besikulen barnealdean aurkitzen dira, hauen kontzentrazioa altua<br />
izanik, beraz ANTS eta DPX molekulen arteko kolisioak faboratzen dira. Ondorioz,<br />
DPX-ak ANTS-aren fluoreszentzia moteldu dezake. Sistemari molekula litiko bat<br />
gehitzen zaionean, liposomaren irazkortasun hesia apurtzen da eta bi zundak<br />
kanpoaldean askatu eta diluitzen dira. Diluzioaren ondorioz DPX-ak ANTS-ari eragiten<br />
dion moteldura desagertu egiten da eta ANTS-aren fluoreszentziaren igorpena<br />
handitzen da. Goiko panelean zunda hauen egitura molekularrak adierazi dira. λex eta<br />
λem ANTS molekulak uretan aurkezten dituen kitzikapen eta igorpen uhin luzera<br />
maximoak direlarik.<br />
2.5.1.1.2. FITC-Dextrano saioa<br />
Kasu Honetan liposomen barnealdean FITC-dextranoak sartu<br />
ziren (4.000 eta 10.000 Da.). Saioaren oinarria, aurrekoaren berdina da,<br />
talka bidezko energi transferentzia gertatzen da, baina kasu honetan<br />
dextranoak berak, bere buruarekiko. Molekula honen igorpen eta<br />
69
70<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
kitzikatze uhin luzerak oso gertu daudenez (λexc= 490 nm eta λem= 530<br />
nm), dextranoa bere burua moteltzen du.<br />
Lehen bezala, dextranoa liposomen barnealdean dagoenean<br />
neurtzen den fluoreszentzia minimoa da baina mintzaren irazkortasuna<br />
handitzen baldin bada, konposatua liposometatik aterako da kanpo<br />
medioan diluituz eta talka fenomenoak murriztuz.<br />
Dextranoak barnealdean gordetzen dituzten besikulak<br />
prestatzeko 2.4.1.1. protokoloan aldaera batzuk sartu behar dira:<br />
1-Dextranoak tanpoi arrutan 100 mg/ml-ko kontzentrazioan<br />
disolbatzen dira, eta lipido filma disoluzio honetan birreseki egiten da.<br />
Kasu honetan LUV-en barnealdeko eta kanpoaldeko osmolaritate<br />
ezberdinatuna 10 mosm direnez tanpoiak ez dira doitu behar.<br />
2-Hamar izozte/desizozte ziklo egin beharrean, 20 ziklo egiten dira<br />
zundaren enkapsulazio etekina emendatzeko.<br />
3- LUV-ak prest daudenean, ANTS/DPX-ekin egiten den moduan<br />
esklusio molekularreko zutabe batetik pasatu behar dira (Sephacryl 500-<br />
HR, Sigma) besikulen kanpoaldean geratu den zunda baztertzeko. Kasu<br />
honetan besikulak derrigor %0.6 rho-PE-rekin markatu behar dira,<br />
zutabetik eluitzean begi bistaz ikusi ahal izateko.<br />
Kasu honetan ere askatzen den zundaren portzentajea (1)<br />
ekuazioarekin lortzen da.<br />
2.5.1.2. SOLUTUEN SARRERA<br />
Ditionito sodikoaren sarrera-saioak, peptidoek eragindako<br />
besikulen irazkortasuna, denboran zehar egonkorra den efektu baten<br />
eraginez den aztertzea baimentzen digu. Ditionito sodikoak eragiten<br />
duen NBD zunda fluoreszentearen nitro taldearen erredukzioa,<br />
zundaren fluoreszentziaren murrizpena neurtuz jarraitu daiteke<br />
(McIntyre, J. C. eta Sleight, R. G., 1991) (2.4 irudia).<br />
Horrela, LUV simetrikoek (hots, NBD-a bi monogeruzetan<br />
<strong>duten</strong>ak) irazkortasun hesiaren osotasuna mantentzen baldin badute,<br />
ditionitoak soilik kanpoaldeko monogeruzan dagoen NBD-a erreduzitu<br />
dezake. Irazkorrak diren besikulek soilik (poroen eraketaren ondorioz<br />
adibidez) ditionitoaren sarrera baimenduko dute eta ondorioz,
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
barnealdeko monogeruzan dagoen NBD zundaren erredukzioa emango<br />
da (NBD zunda totalaren erredukzioa, hain zuzen ere) (2.5 irudia).<br />
2.4. Irudia: NBD nitro taldearen erredukzioa, amino talde batera<br />
ditionitoaren eraginagatik. Ditionitoak NBD-aren nitro taldea (fluoreszentea dena)<br />
7-aminobentzeno-2-oxa-1,3-diazol-4-il (ABD) konposatua (fluoreszentea ez dena)<br />
erreduzitzen du (McIntyre, J. C. eta Sleight, R. G., 1991).<br />
-%0.6 NBD-PE-dun besikulak prestatu ziren, 2.4.1.1 atalean<br />
adierazten den moduan. Modu honetan zunda fluoreszentea simetrikoki<br />
besikulen bi monogeruzetan banatzen da.<br />
-Sodio ditionitoa 1 M-eko kontzentrazioan prestatu zen, pH 7.0-an<br />
zegoen 1M Tris-HCl tanpoian. Ditionitoa 4 ºC-tan eta argitik babestua<br />
mantendu zen denbora guztian.<br />
-Ditionitoak eragiten duen fluoreszentziaren murrizpena konparatu<br />
zen besikula soiletan eta peptidoekin inkubaturiko besikuletan.<br />
-Neurketak, NBD zundaren igorpen uhin luzera jarraituz egin ziren<br />
(λem=530 nm). Kitzikatze uhin luzera 465 nm finkatu zen eta 515 nm-tako<br />
filtro bat erabili zen argiaren dispertsio efektua ekiditzeko.<br />
Besikulen barnealdean dagoen NBD-aren erredukzioaren<br />
portzentajea hurrengo ekuazioarekin determinatu zen:<br />
% NBDi erreduzitua= [(Fd-Fx)/Fd-F100)]x100 (2)<br />
Non, NBDi barnealdeko monogeruzaren NBD-aren erredukzioa<br />
den; Fd ditionitoz trataturiko besikulen fluoreszentziaren balorea den;<br />
Fx lehenbizi peptidoekin inkubatuak eta gero ditionitoa gehitu zaien<br />
besikulen fluoreszentziaren balorea. F100, ditionitoarekin tratatuak izan<br />
diren besikulei, Triton X-100 gehitu ostean lortzen den<br />
fluoreszentziaren balorea den.<br />
71
72<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
2.5. Irudia: Solutuen sarrera saioaren adierazpen grafikoa. Hasiera batean<br />
ditionitoak bakarrik kanpoaldeko monogeruzan dagoen NBD-a erreduzitu dezake.<br />
Besikulak molekula litiko batekin inkubatuz gero, ditionitoa besikularen barnealdera<br />
sar daiteke eta barnealdeko NBD-a erreduzitu.<br />
2.5.1.3. PEPTIDOKO TRIPTOFANOEN ETA DANSILO<br />
ZUNDAREN ARTEKO ENERGI TRANSFERENTZIA<br />
Mintzaren interfasean peptidoaren barneraketa ematen den edo<br />
ez aztertzeko, peptidoaren Trp-tik, gainazalean dagoen d-DHPE zundara<br />
ematen den energi transferentzia jarraitu zen (Ruiz-Arguello, M. B.,<br />
Goni, F. M. eta lank., 1998).<br />
N-(5-dimetilaminonaftaleno-1-sulfonil)-1,2-dihexadekanoifosfatidiletanolamina<br />
lipidoa (dDHPE) bere buru polarrean, dansilo<br />
(DNS) zunda loturik dauka (2.6 irudia). Zunda hau kitzikatzeko<br />
erabiltzen den uhin luzera (335 nm) triptofanoaren igorpen uhin<br />
luzerarekin gainezartzen da (330-350 nm). Beraz, bi fluoroforoak hurbil<br />
baldin badaude, kitzikatuta dagoen triptofanotik (λex ≈ 280 nm) dansilo<br />
zundara energi transferentzia fenomeno bat gertatzen da. Energi<br />
transferentzia honek triptofanoaren igorpen-fluoreszentziaren<br />
murrizpen bat dakar, DNS-aren igorpen fluoreszentziaren<br />
areagotzearekin batera (520 nm-tan igorpen maximoa). Lipido hau bi
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
monogeruzetan (kanpoko edo barneko monogeruzan) txertatuta edo<br />
asimetrikoki bakarrik kanpoko monogeruzan txertatuta, erabili daiteke.<br />
Peptidoa mintzean txertatzen bada, peptidoaren triptofanoa, mintzaren<br />
kanpo monogeruzaren interfasetik gertu dagoen edo barneko<br />
monogeruzaren interfasetik gertu dagoen jakin daiteke saio honen bidez<br />
(Jelokhani-Niaraki y cols., 1998).<br />
-Tesi honetan liposoma simetrikoak erabili dira, eta hauek<br />
prestatzeko, DNS-DHPE-z markaturik dagoen lipidoa, kloroformoan<br />
disolbatzen da eta fase organikoan dagoen lipido nahasketari dagokion<br />
erlazio molarrean gehitzen zaio (%6 sunda, lipido totaleko).<br />
-Nahasketa erabiliz, 2.4.1.1. atalean deskribatzen den bezala<br />
liposomak prestatzen dira.<br />
-Zuzenduriko espektroak SLM Aminco espektrofluorimetro batean<br />
jaso ziren. Espektrofluorimetroa irabiagailu magnetikoa eta kubeta<br />
berotzeko bainua zeraman.<br />
-Kitzikatze uhin luzera, 280 nm-tan finkatu zen eta igorpen uhin<br />
luzera 350 nm-tan. Slit-en zabalera 5 nm-tan finkatu zen bi kasutarako.<br />
-Lipido-peptido nahasturak 30 minutuz inkubatu ziren espektroak<br />
jaso baino lehen.<br />
Energi transferentziaren eraginkortasuna (E) hurrengo<br />
ekuazioaren bitartez kalkulatzen da (3) (Stryer, L., 1978):<br />
E = 1- (QT / Q0) (3)<br />
Non, Q0 eta QT triptofanoaren fluoreszentziaren intentsitateak<br />
diren DNS moteltzailearen presentzian eta gabezian, hurrenez-hurren.<br />
73
74<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
2.6. Irudia: Triptofanoa eta dansiloaren arteko energi transferentzia<br />
saioaren adierazpen eskematikoa. Goikoaldean DNS zundaren egitura molekularra<br />
DHPE lipidoaren buru polarrari baturik adirazi da. Sunda mintzean txertaturik<br />
dagoenean mintzaren interfasean kokatzen da. Mintzean txertaturik dagoen sundaren<br />
kitzikatze eta igorpen uhin luzerak adierazten dira. Dansiloaren hasierako seinalea<br />
handitzen doa, peptidoa mintzaren interfasearekin elkarregiten duen heinean.
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
2.5.1.4. PEPTIDOEN FLUORESZENTZIA INTRINTSEKOAREN<br />
ALDAKETA BIDEZKO BATURA-ISOTERMA: URA-MINTZA<br />
BANAKETAREN NEURKETA<br />
Proteina edo peptidoen hondar fluoreszenteak polaritate baxuko<br />
ingurugiro hidrofobiko batean aurkitzen badira, igorpenaren uhin<br />
luzeran desplazamendu bat urdinalderantz (uhin luzera baxuagotara)<br />
eta intentsitatearen handipen bat behatu daiteke. Ezaugarri hau<br />
erabiliz, fluoroforo naturalen fluoreszentzia intrintsekoa jarraitzen bada<br />
besikula kantitatea gehitzen den heinean, mintzerango itxurazko<br />
banaketa konstatea (KX) determinatu daiteke.<br />
-Banatze-kurbak, lipido kontzentrazioaren titulazio bat eginez<br />
gertatzen den Trp-aren igorpen fluoreszentziaren aldaketarekin,<br />
zenbatetsiak izan ziren.<br />
-Peptido gehi liposoma nahstura 30 minutuz eta 37 ºC-tan inkubatu<br />
ziren neurketa egin baino lehen, sistema orekara heldu dadin<br />
(seinalearen egonkortasuna denboran).<br />
-Kitzikatze uhin luzera 280 nm-tan finkatu zen eta igorpen uhin<br />
luzera 350 nm-tan.<br />
-Seinalea diluzioarekin zuzendua izan zen eta barneko filtroaren<br />
zuzenketa NATA trp-aren analogoarekin egin zen (NATA ez da mintzetan<br />
banatzen).<br />
KX-a balio esperimentalak hurrengo ekuaziora doituz kalkulatua<br />
izan zen (4):<br />
[(Fmax/F0)-1] [L]<br />
F/F0 = 1 + -------------------- (4)<br />
K+ [L]<br />
non, L lipido kontzentrazioa den, F0 liposomen gabezian lortzen<br />
den fluoreszentzia, F liposoma kontzentrazio bakoitzerako lortzen den<br />
fluoreszentzia eta K lipidoaren kontzentrazioa zeinean peptidoaren<br />
frakzioa 0.5 den. Beraz, Kx= [W]/K, non [W] uraren kontzentrazio<br />
molarra den, [W] = 55.3M izanik (Eckert, D. M. eta Kim, P. S., 2001).<br />
75
76<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
2.5.2. DIKROISMO ZIRKULARRA<br />
Dikroismo zirkularra (CD) egitura sekundarioa eta tertziarioan<br />
ematen diren aldaketa egituralak behatzeko eta biomolekulen<br />
egonkortasun konformazionala determinatzeko teknika<br />
sentikorrenetarikoa da. Metodo enpiriko bat izateaz gain, peptido edo<br />
proteina baten egitura sekundarioan gertatzen diren aldaketak<br />
zuzenean neurtu daitezke.<br />
Proteinen CD espektroa ultramore urrunean (far-UV) oso<br />
sentikorra da proteinaren egitura sekundarioa determinatzeko.<br />
Ultramore hurbileko espektroa aldiz (near-UV) proteina eta peptidoen<br />
alboko kate aromatikoen eta disulfuro zubien kontribuzioa adierazten<br />
du (Perczel, A. eta Hollósi, M., 1996).<br />
CD-a oso teknika erabilia da, analisia erraza delako eta erabili<br />
behar den produktu kantitate oso txikia delako. Baina teknika honen<br />
bitartez ezin da proteinaren egitura tridimentsionala determinatu.<br />
Dikroismo zirkularraren fenomenoa, ingurune asimetriko batean<br />
dauden bi kromoforo argi polarizatuarekin elkarregiten <strong>duten</strong>ean<br />
ematen da. Proteinaren kasuan, prozesu honetan parte hartzen <strong>duten</strong><br />
lotura peptidikoen amida taldeek eta alboko kate aromatikoek talderik<br />
anitzenak dira. Amida taldeen nπ eta ππ* transitzioen kiralitatea eta<br />
hauen arteko elkarrekintza kirala, peptidoen kromoforoek aurkezten<br />
dituzten antolamendu espazialen menpe daude. Peptidoen kromoforoen<br />
alderdian (
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
α-helize batek minimo bikoitz bat aurkezten du 222 nm eta 208-<br />
210 nm-tan eta maximo handi bat 191-193 nm-tan. Banda hauen<br />
intentsitateek, aztertzen diren peptido edo proteinen eliptizitate<br />
proportzioa adierazten dute. CD espektroa β egitura ezberdinen artean<br />
asko aldatu daiteke. Orokorrean, β orri konformazioek, minimo bakar<br />
bat aurkezten dute 210-225 nm-tan eta maximo bakar bat 190-200<br />
nm-tan, hauen intentsitatea α−helizeei dagokienak baino baxuagoak<br />
direlarik. P2 elementu egiturala, 205 nm-tan banda negatibo handi bat<br />
izateagatik bereizten da. Azkenik, egitura desordenatuak, 200 nm-tik<br />
hurbil banda negatibo handi bat eta positiboak edo negatiboak izan<br />
daitezkeen zenbait banda ahul 220 nm eta 230 nm tartean izateagatik<br />
bereizten dira.<br />
[θ] (Deg.cm2 .dmol-1 [θ] (Deg.cm )<br />
2 .dmol-1 )<br />
200 220 240<br />
λ (nm)<br />
2.8. Irudia: Egitura sekundario ezberdinei dagozkien CD espektroak.<br />
2.5.2.1. CD-aren ADIERAZPENA<br />
Linealki polarizatua dagoen argiak bi osagai ditu: (1) Ezkerretara<br />
zirkularki polarizatua dagoen osagaia (rpc) eta (2) eskuinetara zirkularki<br />
polarizatua dagoen osagaia (lpc). Rpc osagaiaren bektore elektrikoa, argi<br />
sortaren norantza daukan ardatz perpendikular baten inguruan birak<br />
ematen ditu, erloju baten ardatzen kontrako norantza hartuz. Lcp<br />
77
78<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
osagaia aldiz, erloju baten ardatzen norantzan biratzen du. Konposatu<br />
kiral batek aktibitate optikoa aurkezten duenean, rcp-aren xurgapena<br />
eta lcp-aren xurgapena berdinak ez direlako da. Dikroismo zirkularra,<br />
argi polarizatuaren rcp eta lcp osagaien xurgapenaren ezberdintasuna<br />
bezala definitu daiteke. Lambert-Beer-en legea kontuan hartuz gero<br />
(UV-ikuskorra espektroskopiaren transitzio elektronikoa definitzen<br />
duena), xurgapen ezberdintasun hauek hurrengo formularekin adieraz<br />
daitezke:<br />
∆A=A1-Ar=(εl c l)-(εr c l)= ∆ε c l (5)<br />
non, c solutu kiralaren kontzentrazio molarra den, ε estintzio<br />
molarraren koefizientea den eta l argiaren hari-neurria den;<br />
∆ε = εl -εr izanik.<br />
Argi polarizatuak ingurugiro kiral bat zeharkatzen duenean,<br />
bektore elektrikoek, ardatz nagusiarekiko biraketa angelu bat eratzen<br />
dagoen elipse bat deskribatzen dute. Osagai zirkularren bektore<br />
elektrikoek norantza berdina daukatenean, beraien magnitudeen<br />
baturak elipsearen ardatz erdi-nagusia sortzen dute. Aurkako norantza<br />
daukatenean, beraien magnitudeen ezberdintasunak, elipsearen ardatz<br />
erdi-txikia sortzen dute. CD-a ardatz erdi-nagusiaren eta erdi-txikiaren<br />
erlazioa bezala definitzen da. Erlazio hau, eliptizitate bezala ezaguna<br />
den θ angeluaren tangentea da (2.9 irudia).
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
2.9. Irudia: Eliptikoki polarizatua dagoen argia. Eliptizitatea θ angelua da,<br />
angelu honen tangentea elipsearen ardatz nagusia eta txikiaren arteko erlazioa da. α<br />
angelua, elipsearen ardatz nagusiaren eta argiaren polarizazio planoaren arteko<br />
angelua da eta biraketa optikoa adierazten du.<br />
Angelu hau orokorrean oso txikia denez, θ−ren tangentea θ−ren<br />
berdina da eta xurgapenarekin hurrengo adierazpenaren bidez<br />
erlazionatzen da:<br />
θ (deg) = 32.98 ∆A (6)<br />
Argiaren pasabidearen eta solutuaren kontzentrazio molarraren<br />
arteko menpekotasun lineala kentzeko, eliptizitate molarra hurrengo<br />
moduan definitzen da:<br />
[θ] = 100 θ /c l (7)<br />
(5) eta (6) ekuazioak (7) ekuazioan ordezkatuz hurrengo<br />
adierazpena lortzen da:<br />
[θ] = 3298 ∆ε (8)<br />
non, laginak azaltzen duen dikroismoaren magnitudea estintzio<br />
koefizienteen ezberdintasunaren menpe dagoen definitzen den.<br />
79
80<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
Polipeptido eta proteinen CD-an ostera, hondar bakoitzeko<br />
eliptizitate molarraren adierazpena erabiltzen da (7. ekuazioa). Hondar<br />
bakoitzeko eliptizitate molarra deg.cm 2 .dmol -1 .hondar -1 unitateak ditu<br />
eta eliptizitate molarra, peptidoak edo proteinak dituen n aminoazido<br />
hondarrengatik zatitzerakoan lortzen da.<br />
Bi peptidoen arteko elkarrekintza aztertu nahi dugunean, beraien<br />
aldetik bi peptidoak emango lituzketen espektroak neurtu behar dira<br />
eta bi peptidoen espektroak batzerakoan ematen duen espektroa, biak<br />
batera benetan neurtzean ematen duen espektroarekin konparatu<br />
behar da. Eliptizitate molarra 7. ekuazioan adierazten den bezala<br />
kalkulatuko litzateke baina, bi peptidoak kontuan hartu beharko<br />
lirateke eta bien aminoazido hondarren kopurua.<br />
Aintzakotzat hartu daiteke, xurgapen elektronikoa eta dikroismo<br />
zirkularraren espektroa zenbait bandaz osaturik daudela. Banda<br />
bakoitza oinarrizko egoera batetik elektronikoki kitzikatua dagoen<br />
egoera batera ematen den transitzioari dagokio. Banda bakoitza zenbait<br />
parametroen bidez bereiz daiteke. Lehenengoa, uhin luzerak edo<br />
maiztasunak zehazten <strong>duten</strong> kokapenean oinarritzen da. Orokorrean<br />
λmax edo νmax moduan adierazten da, eta CD-aren xurgapenak balore<br />
maximoa erdietsi egiten duen uhin luzera edo maiztasuna dira.<br />
Bigarren parametroa intentsitatea da, εmax modura adierazten dena<br />
xurgapenerako eta ∆εmax CD-erako, eta muturreko banden baloreak<br />
direnak.<br />
2.5.2.2. CD BIDEZ EGITURA SEKUNDARIOEN<br />
DETERMINAZIOA BURUTZEKO PROTOKOLOA<br />
Tesi honetan burutu diren CD neurriak, Jasco J-810 dikroismo<br />
zirkularrerako espektropolarimetroan neurtu ziren.<br />
Espektropolarimetroa tenperatura kontrolatzeko Peltier sistema bat<br />
darama eta azido (1S)-(+)-10-kamporsulfonikoarekin maiz kalibratzen<br />
da.<br />
-Peptidoen stock-ak dagokien kontzentrazioan DMSO-n disolbatu<br />
ziren eta gau osoan zehar liofilizatzen utzi ziren. Neurketak burutu baino<br />
lehen, peptidoak 0.03 mM kontzentrazioan 2 mM Hepes (pH, 7.4)<br />
tanpoian disolbatu ziren.<br />
-Espektroak 1 mm-ko pasu optikoa duen kuartzozko kubeta batean<br />
37 ºC-tan neurtu ziren.
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
-Neurketak 180-260 nm tartean jaso ziren.<br />
-Erabili ziren neurketa–baldintzak hurrengoak izan ziren:<br />
-100-eko sentikortasuna<br />
-1 nm-tako banda zabalera<br />
-1 s-tako erantzun denbora<br />
-0.0025 nm-ko eta 20 nm/minutuko abiadura<br />
-Lorturiko espektroa, 20 espektroen batez bestekoa izan<br />
zen.<br />
-Espektroak jaso ostean tanpoiaren seinalea kendu zitzaien eta<br />
lorturiko mgrad-etan (ε ) zegoen seinalea, batez beste hondarren<br />
eliptizitatera [θ] (gradu.cm 2 .dmol -1 ) aldatu egin zen hurrengo formularekin:<br />
(θ)= ε (mgradu)/(10.C.n.l) (9)<br />
non, C peptidoaren kontzentrazio molarra den, n peptidoaren<br />
aminoazido kopurua eta l kubetaren pasu optikoa cm-tan.<br />
2.6. ELISA<br />
ELISA (ingelesetik, Enzyme Linked Immunoabsorvent Assay), oso<br />
teknika erreza eta sentikorra da. Orokorrean immunologian erabiltzen<br />
den teknika bat da, seroko antigorputz kontzentrazioa (GIB edo West<br />
Nile birusen testarako adibidez) determinatzeko edo antigeno baten<br />
presentzia detektatzeko erabiltzen delarik. Beste zenbait aplikazio ditu<br />
ere, adibidez janari industrian alergeno potentzialak detektatzeko<br />
(esnean, kakahuetetan, almendretan, intxaurretan etab.).Metodoa<br />
aplikazio oso handia izan du batez ere antigorputzen bidez, produktuen<br />
kuantifikazioa egin behar den alorretan: diagnostiko klinikoan,birusen<br />
detekzioan,antigorputzen sailkapena isotipoetan, antigorputz<br />
monoklonalen bilaketan etab.<br />
Teknikaren oinarria, antigenoa fase solido baten gainean<br />
geldiaraztea da eta bi antigorputz erabiliz detektatzea da. Erabiltzen den<br />
lehenengo antigorputza antigeno-espezifikoa da, eta bigarrena antigenoantigorputz<br />
konplexuarekin erreakzionatzen du. Bigarren antigorputzak<br />
orokorrean entzima bat loturik darama, koloredun edo fluoreszentedun<br />
sustrato bat sortarazten duena.<br />
81
82<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
2.6.1. ELISA ZUZENA<br />
-DMSO-an disolbaturik dauden peptidoak (kasu honetan<br />
2F5preTM) PBS tanpoian disolbatu ziren 1 µM-eko kontzentrazioan.<br />
-Putzu bakoitzeko 100 µl-tako lagin bolumena bota zen “C96<br />
Maxisorp microplate wells” (Nunc, Denmark) plaketan eta gau osoan<br />
zehar inkubatu ziren giro tenperaturan.<br />
-Hurrengo goizean plaka %0.05 Tween 20 (Merck) zeraman PBS<br />
tanpoiarekin garbitu zen, 200 µl putzu bakoitzean jarriz.<br />
-Putzuan geratu ahal izan diren peptido gabeko tokiak %3 BSA<br />
zuen PBS tanpoiarekin blokeatu ziren, 300 µl putzu bakoitzean, bi orduz<br />
eta giro tenperaturan.<br />
-Plaka blokeatu ostean birritan garbitu zen eta %1 BSA, %0,02<br />
Tween 20 zeraman PBS tanpoian antigorputzak disolbatu ziren eta<br />
plakara gehitu.<br />
-Plaka antigorputzekin 4 orduz eta giro tenperaturan inkubatu zen.<br />
-Denbora hori pasata plaka birritan garbitu zen eta antigorputz<br />
sekundarioa gehitu zitzaion (untxi-kontrakoa, Pierce, Rockford, IL, USA).<br />
Antigorputz sekundarioa %1 BSA eta %0.02 Tween 20 zeraman PBS<br />
tanpoian eta dagokion diluzioan (1:10000), putzuetara gehitu zen eta<br />
ordu batez inkubatu zen giro tenperaturan.<br />
-Ondoren plaka hiru bider garbitu zen.<br />
-Antigorputz sekundarioak fosfatasa alkalino bat konjugatua<br />
dauka, beraz entzima honen sustratoa, p-nitrofenilo fosfatoa (Sigma, St.<br />
Louis, MO, USA) gehitu zitzaion.Antigorputzek peptidoa ezagutzen<br />
<strong>duten</strong>ean fosfatasa alkalinoak katalizatzen duen erreakzio bat ematen<br />
da, bere sustratoaren presentzian kolore horia ematen duena.<br />
-Plaka Synergy HT microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., VT,<br />
USA) plaka lektorean 405 nm-tako uhin luzeran irakurri zen.<br />
-Balore positibotzat hartu ziren, hiru bider balore negatiboen<br />
desbiazio estandarrak zirenak.<br />
-Balore negatiboak BSA kontrolak izan ziren.<br />
2.6.2. LIPOSOMETAN OINARRITURIKO ELISA<br />
Mab-mintza elkarrekintza aztertzeko Liposometan oinarrituriko<br />
ELISA erabili zen. SUV-ak %1 Biotina-PE-rekin markatzeak,<br />
estreptabidinaz gaineztaturiko mikroplaterretara (Nunc, Denmark)<br />
espezifikoki batzea ahalbidetzen du.
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
%5 N-Rho-PE lipidoarekin markaturik zeuden liposomak erabiliz,<br />
kalibratu zen saioa.<br />
-Protokolorako, 100 µΜ lipido besikulak estreptabidinaz<br />
gaineztaturiko mikroplaterretan landatu ziren, 100 µl/putzu-ko.<br />
-2 orduz giro tenperaturan inkubatu ziren agitazio oso motelarekin.<br />
Denbora honetan SUV-ak plakako esteptabidinara batuta daude.<br />
-Plaka hiru bider tanpoi arruntarekin garbitu zen.<br />
-Plakan geratzen diren leku ez espezifikoak blokeatzeko<br />
blokeatzeko “SuperBlock” tanpoi komertziala erabili zen (Pierce).<br />
-Hemendik aurrera hiru protokolo ezberdin jarraitu ziren:<br />
1-Mab eta mintzaren arteko elkarrekintza aztertu nahi izan zenean:<br />
-MAb-ak zegokien kontzentrazioan gaineratu ziren tanpoi<br />
arruntean disolbaturik. Lau orduz giro tenperaturan inkubatu ziren.<br />
2-Antigorputza bere epitopoa mintzean txertatua dagoenean nola<br />
ezagutzen duen aztertzeko:<br />
-Liposomak landaturik zeudela peptidoa 1 µM kontzentrazioan<br />
gehitu zitzaion tanpoi arruntean disolbaturik, gau osoan zehar giro<br />
tenperaturan inkubatu zelarik.<br />
-Ondoren Mab-ak zegokien kontzentrazioan gaineratu ziren tanpoi<br />
arruntean disolbaturik. Lau orduz giro tenperaturan inkubatu zirelarik.<br />
Emaitza berdinak lortu ziren Liposomak eta peptidoa elkarrekin<br />
soluzioan ere inkubatuz eta ondoren plaketara batuz edo aurreko<br />
moduan bezala, lehenengo liposomak plakara batuz eta ondoren<br />
peptidoa botata.<br />
3-Lehiaketa ELISA<br />
-Antigorputzak peptidoekin soluzioan inkubatu ziren ordu erdiz eta<br />
giro temperaturan.<br />
-Ondoren plaketara gehitu ziren eta lau orduz giro tenperaturan<br />
inkubatu ziren<br />
Ondoren protokolo berdinarekin jarraitzen da hiru kasutan:<br />
-Inkubazioaren ostean plakak tanpoi arruntarekin garbitu ziren.<br />
83
84<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
-Antigorputz sekundarioa tanpoi arruntean 1:10.000 diluzioan<br />
disolbaturik gehitu zen ordu batez inkubatzeko.<br />
-ELISA arruntean bezala, antigorputz sekundarioak fosfatasa<br />
alkalinoa konjugatua dauka eta beraz sustratoa bota ostean plaka<br />
lektorean xurgapena 405 nm-tan neurtu zen.<br />
Protokolo guztian zehar ez zen Tween 20 erabili liposomak ez<br />
apurtzeko.<br />
Itxurazko afinitate konstatea (K) lortzeko, batura balore<br />
maximoen erdira estrapolatu ziren. Batura balore hauek, balio<br />
esperimentalak hurrengo ekuaziora doituz lortu ziren (Doms, R. W. eta<br />
Moore, J. P., 2000):<br />
Abs = Absmax=[MAb]/(K+[MAb]) (10)<br />
Non, Abs xurgapena den, Absmax xurgapen maximoa eta [MAb],<br />
antigorputz primarioaren kontzentrazioa.<br />
2.7. BESTELAKO TEKNIKAK<br />
2.7.1. SAIO ANTIMIKROBIANOA (AMP)<br />
Peptidoen aktibitate antimikrobianoa, E. coli BL21 anduian<br />
mikrodiluzioei sentikortasuna aztertzen duen test baten bidez aztertu<br />
zen (Oren, Z., Hong, J. eta lank., 1999; Oren, Z., Lerman, J. C. eta<br />
lank., 1999).<br />
-Bakterioak saturaziorarte hazi ziren eta 96 putzu esteril dituen<br />
plaka batean (nunc, Denmarck), 50 µl bakterio 10 6 CFU /ml<br />
kontzentrazioan jarri ziren (620 nm-tan 10 8 CFU/ml bakterio 0.35-eko<br />
dentsitate optikoa aurkezten dute (Silvestro, L., Weiser, J. N. eta lank.,<br />
2000)).<br />
-DMSO-an disolbaturik zeuden peptidoak gau osoan zehar<br />
liofilizatu ziren eta ur distilatu esterilean errekonstituitu ziren zegokien<br />
kontzentrazioan.<br />
-Hodietan, 100 µM-etik hasita peptidoen diluzioak egin<br />
ziren.Putzuetara diluzio bakoitzetik 50 µl peptido gehitu zen.
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
-Plaka 37 ºC-tan 4 orduz inkubatu zen eta bakterioen hazkuntza<br />
Synergy HT microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., VT, USA) plaka<br />
lektorean 492 nm-tako uhin luzeran neurtu zen.<br />
Kontrol modura, bakterioak peptido gabe hazi ziren eta LB<br />
medioa bakterio eta peptido gabe. Aktibitate antimikrobianoaren<br />
kontrol positibo modura zekropina peptido antimikrobianoa erabili zen.<br />
2.7.2. SAIO HEMOLITIKOA<br />
Peptidoen aktibitate hemolitikoa aztertzeko gizaki eritrozitoak<br />
erabili ziren (hRBC, ingelesetik Human red blood cells). Eritrozito<br />
mintzen lisiaren adierazle modura, hemoglobinaren irteera erabili zen.<br />
2.7.2.1. ODOL-ERITROZITOEN ISOLAKETA<br />
-Giza eritrozitoak odoletik erauzteko, 3.5 ml odol 30 ml hemolisi<br />
tanpoi fisiologikoan (ikusi 2.1.5 atala) diluitzen dira. Tanpoia ioien<br />
kelatzailea den eta koagulazioa ekiditen duen EDTA ez darama,<br />
extrakziorako erabili ziren tuboak bazeramatelako.<br />
-Tuboa 300 xg-tara 10 minutuz zentrifugatu zen, 4 ºC-tan. Pausu<br />
honetan, gainjalkinean, plaketak geratzen dira.<br />
-Jalkina, jalkinaren bi bolumen diren hemolisi tanpoi fisiologikoan<br />
oso leunki birreseki zen.<br />
-Odola berriro zentrifugatu zen 1000 xg-tara 10 minutuz.<br />
-%5 hRBC lortzeko, jalkina 20 bider bere bolumena zuen hemolisi<br />
tanpoi fisiologikoan birreseki zen.<br />
%5 hRBC, 333 milioi eritrozito/ml dira eta 412 nm-tan 0.5 a.u.<br />
dira (Oren, Z., Hong, J. eta lank., 1999; Oren, Z., Lerman, J. C. eta<br />
lank., 1999; Zelezetsky, I., Pacor, S. eta lank., 2005).<br />
2.7.2.2. HEMOLISI SAIOA<br />
Saio antimikrobianoan egin zen moduan, peptidoen aktibitate<br />
hemolitikoa hauen mikrodiluzio test bat eginez aztertu zen. Eritrozitoen<br />
85
86<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
hemoglobinaren irteera 412 nm-tan neurtu zen Synergy HT microplate<br />
reader (Bio-TEK Instruments Inc., VT, USA) plaka lektore batean.<br />
-DMSO-an disolbaturik zeuden peptidoak gau osoan zehar<br />
liofilizatzen utzi ziren.<br />
-Hurrengo egunean zegokien kontzentrazioan hemolisi tanpoi<br />
fisiologikoan berrosatu ziren.<br />
-Hodietan peptidoen diluzio jarraituak prestatu ziren. Eppendorf<br />
bakoitzean 50 µl %5 hRBC eta 50 µl peptido zegokion kontzentrazioan<br />
nahastu ziren eta 30 minutuz giro tenperaturan inkubatu ziren.<br />
-Hodiak 800 xg-tara 10 minutuz zentrifugatu ziren eta gainjalkinak,<br />
kontu handiarekin “C96 Maxisorp microplate wells” (Nunc,<br />
Denmark) plaketako putzuetara transferitu ziren.<br />
-Plaka, 412 nm-tan Synergy HT microplate reader (Bio-TEK<br />
Instruments Inc., VT, USA) plaka lektorean neurtu zen.<br />
Azterturiko peptidoak aktibitate hemolitikoa izanez gero,<br />
eritrozitoetatik hemoglobina askatuko litzateke.<br />
Hemolisi totalaren kontrol modura, % 1 triton X-10 erabili zen<br />
(eritrozitoen mintza erabat solubilizatzen duelako eta beraz,<br />
hemoglobina guztia askatuko da). %0 hemolisi kontrol moduan %5<br />
hRBC erabili zen (Oren, Z., Hong, J. eta lank., 1999; Oren, Z., Lerman,<br />
J. C. eta lank., 1999; Zelezetsky, I., Pacor, S. eta lank., 2005).
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
87
88<br />
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak
2. Kapitulua: Materialak, teknika esperimentalak eta protokoloak<br />
______________________________________________________________________<br />
AITZINSOLASA:<br />
Birusek, mintzak desegituratzeko mekanismo desberdinak garatu<br />
dituzte, modu honetan zelula barnera sartu, bertan erreplikatu eta<br />
bertatik atera daitezkeelarik. Pikornabirusen 2B proteina ez-egiturala,<br />
birusaren erreplikaziorako beharrezkoa da eta zolduraren fase<br />
berantiarretan gertatzen den mintz plasmatikoaren irazkortasunean<br />
zerikusi handia dauka. Tesi honetan prozesu honen mekanismo<br />
molekularrari ikuspegi berria ematen zaio. Poliobirusaren 2B<br />
proteinaren sekuentziatik eratorriak diren bi transmintz domeinuak,<br />
peptido gisa erabili dira poroak eratzeko aurkezten <strong>duten</strong> aktibitatea<br />
aztertzeko.<br />
Zitopatikoak ez diren kontzentrazioetan TM1 peptidoa (2B-ren<br />
sekuentzian 35-55 aminoazidoak) kultiboan dauden zelulak<br />
irazkortzeko gaitasuna aurkezten du (IC50 ≈ 4x10 -7 M), B-Higromizina,<br />
pisu molekular baxuko solutua (MW: 527.5) zelula barnera sartzen<br />
delarik.<br />
Dikroismo zirkularrarekin lorturiko emaitzak, bat datoz peptido<br />
honek, mintzak helize moduan zeharkatzeko daukan ahalmenarekin.<br />
TM1 peptidoa poroak eratzeko gaitasuna duen domeinua dela<br />
frogatzeko, 2B sekuentzia osoa hartzen duen peptido bilduma erabiliz<br />
irazkortasun-aktibitatea kokatu da. Zelula kultiboak eta mintzmodeloak<br />
erabili dira TM1 peptidoa poro hidrofilikoak eratzeko<br />
gaitasuna duela aztertu ahal izateko. Poro hauetan zehar pisu<br />
molekular baxuko solutuek mintza zeharkatu dezakete.<br />
Poliobirusaren 2B proteinak toxina zitolitiko moduan jar<strong>duten</strong><br />
duela eta, hortaz, poroak eratzeko gaitasuna <strong>duten</strong> proteinen artean<br />
sailkatu daitekeela ondorioztatzen da.<br />
89
90<br />
3.1. SARRERA<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
<strong>Mintzetan</strong> poroak eragitea, organismo askok, defentsa zein<br />
erasorako erabiltzen <strong>duten</strong> mekanismo zaharrenetariko bat da (Ojcius,<br />
D. M. eta Young, J. D., 1991; Gouaux, E., 1997; Shai, Y., 1999; Parker,<br />
M. W. eta Feil, S. C., 2005). Animalia-zelulen mintz plasmatikoan<br />
poroak eratzeko gaitasuna daukaten proteina eta peptido zitolitikoak,<br />
bakterioetan, ornodunetan (immunitate sistemaren osagai bezala),<br />
itsaso-anemonetan, amebetan eta onddoetan ekoizten dira. Peptido eta<br />
proteina zitolitiko hauek, artropodo eta sugeen pozoietan ere aurkitu<br />
daitezke (Ojcius, D. M. eta Young, J. D., 1991; Kuhn-Nentwig, L., 2003;<br />
Hecht, O., Van Nuland, N. A. eta lank., 2004; Parker, M. W. eta Feil, S.<br />
C., 2005). Produktu zitotoxiko hauen sekuentzien artean oso homologia<br />
baxua egon arren, denek egitura irazkorrak eta aldagaitzak sortarazten<br />
dituzte. Egitura hauek, mintzean zehar esklusio limite zehatz bat<br />
daukaten solutu txikien eta ioien fluxu pasiboa baimentzen dute kasu<br />
askotan (Ojcius, D. M. eta Young, J. D., 1991; Shai, Y., 1999; Gilbert,<br />
R. J., 2002; Panchal, R. G., Smart, M. L. eta lank., 2002; Parker, M. W.<br />
eta Feil, S. C., 2005).<br />
Orain arte produktu hauen artean birus-jatorria daukan<br />
homologo funtzionalik ez da aurkitu. Mintzaren irazkortasuna<br />
handitzea animalia-birusen ohiko ezaugarri bat izanik, arraroa da orain<br />
arte horrelako produktu zitotoxikorik birus-proteinen artean aurkitu ez<br />
izana (Carrasco, L., 1995).<br />
Birusaren erreplikazioa ematen ari denean behatzen diren<br />
hainbat fenomeno hala-nola, mintzaren irazkortasunaren areagotzea<br />
eta zelularen aldaketa morfologikoak, (nukleoan gertatzen diren<br />
aldaketak, zitoeskeletoaren desantolaketa eta mintz-besikulen<br />
agerpena) birusak eragindako efektu zitopatikoak dira (Penman, S.,<br />
1965; Penman, S., 1965; Penman, S. eta Summers, D., 1965; Castrillo,<br />
J. L. eta Carrasco, L., 1985; Doedens, J., Maynell, L. A. eta lank., 1994;<br />
Doedens, J., Maynell, L. A. eta lank., 1994). Birus biluzien kasuan,<br />
autore batzuen ustetan, zelula barnean gertatzen den birus-partikulen<br />
pilaketa edo birus-produktuen espresio ugariak, mintzean sortarazten<br />
diren kalte ez-espezifikoen eragileak dira. Kalte hauek, mintzaren<br />
irazkortasuna areagotuko lukete eta zelularen lisia eragin, honela birus<br />
berrien irteera baimenduko litzatekeelarik (Koch, F. eta Koch, G., 1985;<br />
Castrillo, J. L., Vanden Berghe, D. eta lank., 1986).Baina ideia honen<br />
kontra, mintza zuzenean irazkortzeko ahalmena daukaten eta birusek
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
kodeturiko zenbait produktu existitzen dira (Carrasco, L. eta Smith, A.<br />
E., 1976; Carrasco, L., 1978; Carrasco, L., 1981). Are gehiago, mintza<br />
irazkortzeko prozesuan poro-antzeko egiturak eratzen direneko<br />
ebidentziak daude eta funtsa ematen diote azken ideia honi.<br />
Birus biluzien infekzioaren tarteko fasean gutxi gorabehera,<br />
mintzetik zenbait solutuen askapena gertatzen dela behatu da. Askapen<br />
hau ioi eta molekula txikietarako espezifikoa da (adibidez nukleotidoak,<br />
azukreak, aminoazidoak eta pisu molekular baxuko inhibitzaileak),<br />
baina ez makromolekuletarako. Birus biluziek kodetzen dituzten<br />
zenbait gene eta produktuen bakarkako espresioa zelula sistemetan,<br />
prozesu hauek errepikatzen dituztela ikusi da (Barco, A. eta Carrasco,<br />
L., 1995; Doedens, J. R. eta Kirkegaard, K., 1995; Aldabe, R., Barco, A.<br />
eta lank., 1996; van Kuppeveld, F. J., Galama, J. M. eta lank., 1996;<br />
Aldabe, R., Irurzun, A. eta lank., 1997; Van Kuppeveld, F. J.,<br />
Hoenderop, J. G. eta lank., 1997; Van Kuppeveld, F. J., Melchers, W. J.<br />
eta lank., 1997; Barco, A. eta Carrasco, L., 1998; Madan, V., Garcia<br />
Mde, J. eta lank., 2005).<br />
3.1.1. POLIOBIRUSAREN 2B PROTEINA<br />
Poliobirusa Picornaviridae familiako enterobirus bat da.<br />
Picornaviridae familiaren barnean birus biluzi eta zitolitiko ugari<br />
sailkatu dira. Poliobirusaren genoma 7.5 Kb eta polaritate positiboa<br />
daukan RNA molekula bakar batek osatzen du. RNA honek 220 kDaetako<br />
poliproteina bat kodetzen du (Porter, A. G., 1993; Wimmer, E. eta<br />
Nomoto, A., 1993). Poliproteina birus-proteasen eraginez prozesatzen da<br />
lau egitura-proteina emateko (kapsidearen proteinak) eta hamar<br />
proteina ez-egitural. Proteina ez-egituralen artean 2B, 2BC eta 3A<br />
proteinek, zeluletan espresatzen direnean, mintzak irazkortzeko<br />
ahalmena aurkezten dute (3.1. irudia) (Lama, J. eta Carrasco, L., 1992;<br />
Barco, A. eta Carrasco, L., 1995; Doedens, J. R. eta Kirkegaard, K.,<br />
1995; Aldabe, R., Barco, A. eta lank., 1996; Doedens, J. R., Giddings, T.<br />
H., Jr. eta lank., 1997; Sandoval, I. V. eta Carrasco, L., 1997; Van<br />
Kuppeveld, F. J., Hoenderop, J. G. eta lank., 1997; van Kuppeveld, F.<br />
J., Melchers, W. J. eta lank., 1997).<br />
91
92<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.1. Irudia: Polio-birusaren genoma eta poliproteinaren prozesamendua.<br />
Birusak daukan polaritate positibodun RNA-ren itzulpenaren ondorioz<br />
poliproteina aitzindari bat kodetzen da. Poliproteina hau proteasen bidez prozesatzen<br />
da, P1, P2 eta P3 bitartekariak sortzen direlarik. 2B proteina P2 bitartekaria<br />
prozesatzerakoan sortzen den produktu bat da<br />
Pikornabirusen zoldurak, zelula-mintzetan aldaketa egituralak<br />
eta funtzionalak eragiten ditu. Aldaketa hauen artean, zelula barneko<br />
mintzen birmoldaketa behatzen da. Mintzen birmoldaketa honek<br />
besikula-sistemaren funtzionamendu zuzena inhibitzen du (Cho, M. W.,<br />
Teterina, N. eta lank., 1994; Carrasco, L., Guinea, R., Irurzun, A. y<br />
Barco, A., 2002; Carrasco, L., Guinea, R. eta lank., 2002; Egger, D.,<br />
Gosert, R. eta Bienz, K., 2002). Ondorioz, glikoproteinen garraioa<br />
blokeatzen da eta zitoplasman besikula txikien metaketa ematen da.<br />
Besikula txiki hauetan birusaren erreplikaziorako konplexuak aurkitzen<br />
dira (Guinea, R. eta Carrasco, L., 1990; Bienz, K., Egger, D. eta lank.,<br />
1992; Doedens, J. R. eta Kirkegaard, K., 1995; Suhy, D. A., Giddings,<br />
T. H., Jr. eta lank., 2000; Rust, R. C., Landmann, L. eta lank., 2001).<br />
2BC aitzindariak, sekrezio bidean sortu diren besikula hauen<br />
produkzioan paper garrantzitsu bat jokatzen duela proposatu da (Bienz,<br />
K., Egger, D. eta lank., 1992; Cho, M. W., Teterina, N. eta lank., 1994;<br />
Aldabe, R. eta Carrasco, L., 1995; Doedens, J. R. eta Kirkegaard, K.,<br />
1995; Rust, R. C., Landmann, L. eta lank., 2001).
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
2BC aitzindaria poliobirusaren proteinarik irazkorrena da, 2B-k<br />
hartzen duen konformazioagatik, 2BC eta 2B artean ematen den<br />
kokapenaren ezberdintasunagatik, edo 2BC-k bere baitan gorde<br />
dezakeen aktibitate ezezagun batengatik izan daitekeelarik (Aldabe, R.,<br />
Barco, A. eta lank., 1996; Barco, A. eta Carrasco, L., 1998). 2B edo<br />
2BC-ren espresioa, nahikoa da Ca 2+ intrazelularra (ER eta Golgitik)<br />
askatzeko eta mintzaren irazkortasuna ioi honekiko eta pisu molekular<br />
baxuko konposatuekiko handitzeko (Lama, J. eta Carrasco, L., 1992;<br />
Aldabe, R., Irurzun, A. eta lank., 1997; Van Kuppeveld, F. J.,<br />
Hoenderop, J. G. eta lank., 1997). Azkenaldi honetan atera diren<br />
ikasketa batzuetan demostratu da, Coxsackie birusaren 2B proteinak<br />
eragiten duen Ca 2+ intrazelularraren homeostasiaren aldaketak, zelula<br />
ostalariaren apoptosiaren erantzuna, ziklo infektiboaren erdialderantz<br />
ezabatzen duela (Campanella, M., de Jong, A. S. eta lank., 2004).<br />
Postulatu egiten da, 2B-ren funtzio anti-apoptotikoa, ER eta<br />
mitokondriaren arteko Ca 2+ fluxuen seinaleztapenaren beherapenagatik<br />
ematen dela (Van Kuppeveld, F. J., de Jong, A. S. eta lank., 2005).<br />
2B proteinak mintzaren irazkortasuna areagotzeko erabiltzen<br />
duen mekanismoa oraindik ezezaguna da. Poliobirusarekin zoldurik<br />
dauden zeluletan, 2B proteina erreplikazio konplexuak aurkezten<br />
dituzten mintzetan aurkitu da (Bienz, K., Egger, D. eta lank., 1987;<br />
Schlegel, A., Giddings, T. H., Jr. eta lank., 1996; Rust, R. C.,<br />
Landmann, L. eta lank., 2001). 2B bakarrik espresatzen denean, ER<br />
mintzean eta Golgi aparailuaren mintzean aurkitzen da (Sandoval, I. V.<br />
eta Carrasco, L., 1997; de Jong, A. S., Wessels, E. eta lank., 2003).<br />
Van Kuppeveld eta lankideek iradokitzen dute, Coxsackie birusaren 2B<br />
proteinak zelula barneko mintzak zuzenean irazkortzen bere lana<br />
burutuko zuen bitartean, mintz-plasmatikoaren irazkortasuna<br />
areagotzeko beste mekanismo ezezagun baten bidez gertatu behar da<br />
(de Jong, A. S., Melchers, W. J. eta lank., 2004). Dena den 2B<br />
proteinan, Golgi eta ER mintzen irazkortasunean eragina daukaten<br />
mutazioak eragitean fenomeno hauek batera gertatu behar direla<br />
demostratu da mintzaren irazkortasuna ere gutxitzen dela ikusi baitute<br />
(Campanella, M., de Jong, A. S. eta lank., 2004).<br />
93
94<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.2. Irudia: Poliobirusaren 2B proteina ez-egituralaren sekuentzia. A) Poliobirusaren<br />
genomaren adierazpen grafikoa. B) 2B-ren sekuentzia primarioa. Goiko<br />
aldean bi hidropatia plot irudikatu dira: marra beltzez, bataz besteko hidrofobizitateari<br />
dagokio, Wimley eta White oktanol eskalarekin eta 11 aminoazidotako leihoa erabiliz<br />
kalkulatua izan dena, marra ez jarrai gorriarekin, α-helize konformazioari dagokion<br />
momentua. Beheko aldean agertzen diren bi zilindroak, iradokitzen diren bi<br />
transmintz domeinuak adierazten dituzte.
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.2. ERABILITAKO MATERIALAK, TEKNIKA<br />
ESPERIMENTALAK ETA PROTOKOLOEN<br />
SAILKAPENA<br />
3.2.1. PEPTIDO SEKUENTZIAK<br />
3.4 eta 3.8 irudietan agertzen diren, TM1, TM2, N-ter1, N-ter2,<br />
TURN eta C-ter peptidoak 2B-ren sekuentziatik eratorriak dira. Peptido<br />
hauek (tesiaren bigarren kapituluan azaltzen den bezala, 2.1.1 atala),<br />
beraien C-karboxiamida muturretik hasita, Fmoc “fase solido”<br />
sintesiaren bidez lortu eta HPLC-z purifikatuak izan ziren, Pompeu-<br />
Fabra-ko Unibertsitatean (Barcelona, Spain) .<br />
Zekropina peptido antimikrobianoa, lehen aipatu den bezala<br />
komertzialki lortu zen (Andreu, D., Merrifield, R. B. eta lank., 1983).<br />
3.2.2. DIKROISMO ZIRKULARRA<br />
Kapitulu honetan azaltzen diren CD saioak 2.5.2.2 atalean<br />
adierazi den moduan burutu ziren.<br />
-Peptido laginak zegokien kontzentrazioan gau oso batez liofilizatu<br />
ziren.<br />
-Liofilizatua 2 mM Hepes tanpoian 0.03 mM kontzentrazioan<br />
berrosatu zen. SDS-rekin buruturiko espektroetan liofilizatua 10 mM edo<br />
50 mM SDS zeraman 2 mM hepes tanpoian berrosatu zen.<br />
-Neurriak Jasco J-810 dikroismo zirkularrerako<br />
espektropolarimetroan burutu ziren.<br />
-Espektroak 1 mm-takoa pasu optikoa zuen kuartzozko kubeta<br />
batean neurtu ziren.<br />
-Neurketak 37 ºC-tan burutu ziren.<br />
-Datuak 1 nm-tako banda zabaleran eta 20 nm/min abiaduran<br />
jazo ziren. Lorturiko espektroa, 20 espektroen batez bestekoa izan zen.<br />
95
96<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.2.3. KULTIBO ZELULARREKIN SAIOAK<br />
Kapitulu honetan kultiboan dauden zelulekin egindako saio<br />
guztiak Luis Carrasco-ren laborategian, Vanessa Madan eta Miguel<br />
Angel Sanz-en kolaborazioarekin, Madrileko Unibertsitate Autonomoan<br />
(CBM-UAM) burutu ziren.<br />
Kapituluan zehar zenbait protokolo ezberdin jarraitu dira azaltzen<br />
diren esperimentu ezberdinak burutzeko. Esperimentu guztietan BHK-<br />
21 lerro zelularra erabili zen.<br />
-BHK-21 zelulak 37 ºC-tan hazi ziren Dulbecco-k eraldaturiko Eagle<br />
medioan (DMEM); gehigarri moduan, %5 txahal sero fetala (FCS) eta<br />
funtsezkoak ez diren aminoazidoak gaineratu zirelarik.<br />
-Peptidoek eragindako mintzaren irazkortasuna aztertzeko 2.3.3.<br />
atalean azaldu diren protokoloak jarraitu ziren.<br />
3.2.3.1. ZELULAN ESPRESATZEN DIREN PROTEINEN<br />
IRAZKORTASUN AHALMENA AZTERTZEKO PROTOKOLOA<br />
-Zelulak, in vitro itzuli diren RNA-ekin elektroporatu eta L24<br />
plaketan landatu.<br />
-Elektroporazio osteko denbora ezberdinetan zelulak 1 mM HBrekin<br />
15 minutuz (HB+) edo gabezian (HB-) tratatu ziren.<br />
3.2.3.2. PEPTIDOEN IRAZKORTASUN AHALMENA HB-arekiko:<br />
-BHK zelulak 16 mm-tako putzuetan erein ziren eta gau osoan<br />
zehar hazten utzi ziren.<br />
-Gau osoan zehar hazten egon diren zelulak FCS gabeko DMEM<br />
medioarekin garbitu ziren.<br />
-Peptidoak, zegokion kontzentraziotan, DMEM medioan disolbaturik<br />
gehitu ziren. Ordu batez 37 ºC-tan C02 inkubadorean inkubatu ziren.<br />
- 1 mM HB-rekin 15 minutuz (HB+) edo gabezian (HB-) tratatu ziren.
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.2.3.3. PEPTIDOEN IRAZKORTASUN AHALMENA α-<br />
SARTZINAREKIKO<br />
-Zelulak peptidoekin inkubatu ziren (5 µM sero gabeko DMEM<br />
medioa) 1 h-z eta 37 ºC-tan.<br />
-Ondoren α -sartzinarekin 20 minutuz aurretik tratatu ziren (10<br />
µg/ml), peptidoa kendu barik.<br />
-Medioa kentzen da eta proteinen markaketa erradiaktiboa egiten<br />
da.<br />
α-sartzinaren sarreraren kontrol positibo moduan, zelulak SVrekin<br />
(Sindbis birusa) infektatu ziren.<br />
-Zelulak SV-rekin 10 eta 100 pfu/zelula infektatu ziren 1 h-z eta<br />
37 ºC-tan α-sartzinaren presentzian 10 µg/ml.<br />
-Ondoren medioa kendu zen eta proteinen markaketa erradiaktiboa<br />
egiten zen 10 µCi/µl [ 35 S]Met/Cys-rekin, 40 minutuz (Sanz, M. A., Madan,<br />
V. eta lank., 2003; Madan, V., Garcia Mde, J. eta lank., 2005).<br />
-Inkubazioaren ostean proteinen zama tanpoian laginak jaso ziren,<br />
5 minutuz 95 ºC-tan irekin ziren.<br />
-Proteinen sintesia SDS-PAGE bidez, fluorografia eta<br />
autorradiografia bidez aztertu ziren.<br />
-Proteinen bandak densitometria bidez aztertu ziren GS-710<br />
calibrated Imaging Densitometer (Bio-Rad) dentsitometroarekin.<br />
3.2.3.4. TM1 PEPTIDOAK ERAGINDAKO<br />
IRAZKORTASUNAREN INHIBIZIOA<br />
-Bi protokolo erabili ziren:<br />
A) TM1 10 µM eta estreptabidina 0.1 edo 1 µM nahastu ziren 15<br />
minutuz. Ondoren nahasketa zelulei gehitu zitzaien eta 37 ºC-tan<br />
inkubatu ziren ordu batez.<br />
B) Lehenbizi zelulak TM1 peptidoarekin 15 minutuz inkubatu<br />
ziren eta gero estreptabidina gehitu egin zen, ordu batez inkubatzeko 37<br />
ºC-tan.<br />
-Zelulak 20 minutuz HB-ren presentzian (+) edo gabezian (-) 37 ºCtan<br />
inkubatu ziren, eta erradioisotopoarekin 40 minutuz markatu ziren.<br />
- Laginak SDS-PAGE bidez prozesatuak izan ziren.<br />
97
98<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.2.3.5. TM1 ETA TM2 PEPTIDO BIOTINILATUEN KOKAPENA<br />
-BHK-21 zelulak beirazko portetan hazi ziren.<br />
-Zelulak 1 µM TM1 edo 1 µM TM2 peptidoekin ordu batez eta 37<br />
ºC-tan inkubatu ziren.<br />
-Zelulak finkatzeko %4 paraformaldehidoa erabili zen.<br />
-Finkapenaren ostean, zelulak FITC-estreptabidinarekin 1:300<br />
erlazioan inkubatu ziren 45 minutuz eta giro tenperaturan.<br />
-Azkenik laginak DABCO mowiol-a erabiliz prestatu ziren eta<br />
Radiance 2000 (Bio-Rad/Zeiss) mikroskopio konfokalaren bidez behatu<br />
ziren.<br />
3.2.4. LIPIDO-MONOGERUZEKIN SAIOAK<br />
Peptidoen <strong>txertaketa</strong> monogeruzetan aztertzeko, azalera<br />
zirkularra eta finkoa duen kubeta batean azalera-presioa neurtu zen<br />
(µTrough S System, Kibron, Helsinki).<br />
-Neurketak 37 ºC-tan eta agitazioarekin burutu ziren.<br />
-1 ml tanpoi arrunta erabili zen fase-urtsu moduan.<br />
-Behar den hasierako presioa (π0) kloroformotan disolbaturik<br />
dagoen lipidoa gainazaletik barreiatuz lortu zen. Aire-ur interfasean<br />
aplikatzen den lipido kantitatea aldatuz gero, hasierako presioa<br />
moldatzen da.<br />
-Peptidoak fase-urtsuan injektatu ziren Hamilton mikroxiringa<br />
baten laguntzaz.<br />
-Erabili ziren peptido kontzentrazioak, aire-ur interfasean ez zuten<br />
presio nabarmenik eragin. TM1 0.25 µM eta gainontzeko guztiak 0.5 µM.<br />
π0 funtziopean gertatzen diren ∆π aldaketak aztertuz, peptidoen<br />
azaleko presio kritikoak πc lortu ziren.<br />
3.2.5. LIPIDO-BESIKULEKIN SAIOAK<br />
-Lamela bakarreko PC-zko eta PI-zko besikula handiak (LUV)<br />
extrusio metodoaren bidez prestatu ziren (2.4.1.1. atala ikusi) (Mayer, L.<br />
D., Hope, M. J. eta lank., 1986).
3.2.5.1. SOLUTUEN ASKAPEN SAIOA<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
Besikulen irazkortasuna ANTS/DPX eta FITC-dextranoak<br />
besikulen barnealdean enkapsulatuz aztertu zen (Ellens, H., Bentz, J.<br />
eta lank., 1985). Saioa 2.5.1.1. atalean adierazi den moduan burutu<br />
zen.<br />
-LUV kontzentrazioa finko mantendu zen 50 µM-tan eta koartzozko<br />
kubetan erabili zen bolumen finala 1 ml-takoa izan zen.<br />
-Peptidoak DMSO-an disolbaturik kubetara gehitu ziren zegokien<br />
kontzentrazioan (Peptidoak gehitu ziren bolumenetan DMSO-a eraginik<br />
ez zeukalarik besikulen gain)<br />
-30 minututako zinetikak neurtu ziren, 37 ºC-tan eta irabiaketa<br />
konstatenpean.<br />
-ANTS/DPX saioaren kasuan finkatu ziren uhin luzerak; λexc= 355<br />
nm eta λem= 520 nm izan ziren. Argiaren dispertsio efektua sahiesteko<br />
475 nm-tako filtro bat erabili zen. Zunda hauen pisu molekularra 422 eta<br />
427 Da. Dira hurrenez hurren.<br />
-FITC-dextranoen askapena neurtu zenean erabili ziren uhin<br />
luzerak; ; λexc= 490 nm eta λem= 530 nm izan ziren. Argiaren dispertsio<br />
efektua sahiesteko 515 nm-tako filtro bat erabili zen. 4000 eta 10000<br />
Da.-eko dextranoen askapena aztertu zen.<br />
Askatzen den zundaren portzentajea bigarren kapituluan<br />
deskribatu den (1) ekuazioarekin kuantifikatu zen:<br />
% Askapena=[(Ff – F0)/ (F100 – F0)] x 100<br />
3.2.5.2. SOLUTUEN SARRERA SAIOA<br />
Irazkortasun saioak osatzeko asmoarekin ditionitoaren sarrera<br />
besikulen barnealdera jarraitu zen, McIntyre eta Sleight-ek (McIntyre, J.<br />
C. eta Sleight, R. G., 1991) deskribatu zuten moduan eta Agirre eta<br />
lankideek (Agirre, A., Barco, A. eta lank., 2002) erabilitako aldaketekin.<br />
99
100<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
-Saio hau 2.5.1.2. atalean adierazten den moduan burutu zen.<br />
-%0.6 NBD-PE-dun PC besikulak prestatu ziren, 2.4.1.1 atalean<br />
adierazten den moduan. LUV kontzentrazioa 50 µM-eko izan zen.<br />
-LUV-ak peptidoarekin 30 min-z eta 37 ºC-tan inkubatu ziren,<br />
ondoren 20 mM ditionito sodikoa gaineratzeko.<br />
-Neurketak, NBD zundaren igorpen uhin luzera jarraituz egin ziren<br />
(λem=530 nm). Kitzikatze uhin luzera 465 nm finkatu zen eta 515 nm-tako<br />
filtro bat erabili zen argiaren dispertsio efektua ekiditzeko.<br />
Ditionitoak eragiten duen fluoreszentziaren murrizpena<br />
konparatu zen besikula soiletan eta peptidoekin inkubaturiko<br />
besikuletan. NBD-aren %55-ren erredukzio bezala kanpoaldean<br />
kokaturiko NBD-aren erredukzioa aintzakotzat hartu zen. Barnealdeko<br />
NBD portzentaje erreduzitua bigarren kapituluan deskribatu den (2)<br />
ekuazioarekin lortu zen.<br />
% NBDi erreduzitua= [(Fd-Fx)/Fd-F100)]x100<br />
3.2.6. AMP ETA HEMOLISI SAIOAK<br />
Aktibitate antimikrobianoa eta hemolitikoa bigarren kapituluko<br />
2.7 atalean adierazi den moduan aztertu ziren.<br />
3.3. EMAITZAK<br />
Pikornabirusen proteinak, poliproteina aitzindari bakar baten<br />
proteolisitik datoz (3.1 eta 3.2A irudiak). Animali zeluletan<br />
espresaturiko espezie errekonbinanteak erabiliz ondorioztatu den<br />
arabera, 2B produktu ez-egituralak, 2BC aitzindariaren eratorria dena,<br />
mintzak irazkortzeko aktibitatea bere baitan darama (Aldabe, R., Barco,<br />
A. eta lank., 1996; Van Kuppeveld, F. J., Hoenderop, J. G. eta lank.,<br />
1997).
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.3.1. PEPTIDOEN SEKUENTZIAK ETA AURKEZTEN<br />
DITUZTEN EGITURAK<br />
Egitura primarioari analisi bat egiten badiogu (van Kuppeveld, F.<br />
J., Galama, J. M. eta lank., 1996; van Kuppeveld, F. J., Melchers, W. J.<br />
eta lank., 1997), bigizta motz baten bidez loturik dauden bi sekuentzia<br />
hidrofobiko desberdindu daitezke, TM1 eta TM2 izendatuak (3.2B<br />
irudia). TM1 domeinuaren amino mutur alderdian dauden hiru lisinek<br />
aldizkako helizitatea aurkezten dute, eta honek domeinuari<br />
anfipatizitatea eman diezaioke (van Kuppeveld, F. J., Galama, J. M. eta<br />
lank., 1996; Nieva, J. L., Agirre, A. eta lank., 2003). Sekuentzia hauek<br />
oktanoletik uretara banatzeko behar <strong>duten</strong> energi aske nahikoa<br />
aurkezten <strong>duten</strong>ez, transmintz helize moduan bigeruza gurutzatzeko,<br />
eta bertan poro oligomeriko bat eratzeko iradoki daiteke (Nieva, J. L.,<br />
Agirre, A. eta lank., 2003).<br />
2B proteinak, bi sekuentzia hauen eraginez, mintz plasmatikoan<br />
poroak eratzeko gaitasuna daukala onartuz, bi peptido diseinatu ziren,<br />
TM1-a eta TM2-a (3.4A irudia). Lisina hondar gehigarriak jarri dira<br />
domeinu hauei solugarritasuna emateko. Sekuentzien muturretan jarri<br />
daitezkeen lisina hondar minimoak Deber eta lankideek deskribatu<br />
dituzte (Melnyk, R. A., Partridge, A. W. eta lank., 2003; Partridge, A. W.,<br />
Melnyk, R. A. eta lank., 2003). Autore hauen iritziz lisina-buztan hauek<br />
solugarritasuna ematen diote sekuentziari, mintzetan TMD-aren egoera<br />
natiboa oztopatzen ez <strong>duten</strong> bitartean.<br />
101
102<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.3. Irudia: A) Poliobirusaren 2B proteinaren TM1 sekuentziaren helize<br />
itxurako modeloa. Kolorearen eskala, panelean aurkezten den Wimley-White oktanol<br />
eskalari dagokiena da. B) 2B proteinak mintzean hartzen duen egituraren<br />
modeloa. Ezkerrean, α-helize-bigizta-α-helize motiboa mintzean. TM1 helize<br />
anfipatikoaren alde hidrofobikoa (beltza) eta hidrofilikoa (zuria) adierazi dira. TM2,<br />
grisez adierazten den helizea da. Transmintz poroa osatzen <strong>duten</strong> monomeroen<br />
kopurua, solutuen askapen saioen emaitzekin egindako modelo matematikoen bidez<br />
eta SDS-PAGE gelen bidezko oligomerizazioa saioen bidez kalkulatu da. (Nieva, J. L.,<br />
Agirre, A. eta lank., 2003)-etik egokitua.<br />
3.4B irudian TM1 eta TM2 peptidoen dikroismo zirkularreko<br />
espektroak adierazten dira, detergente mizelen presentzian eta<br />
gabezian. Bi sekuentzia hauen jarrera kontrakoa da, TM1-ak soluzioan<br />
egitura gradu txiki bat aurkezten duen bitartean, TM2-a egitura gabe<br />
azaltzen da. Are gehiago, TM1-ak SDS mizelen presentzian egitura αhelikoidala<br />
aurkezten du, eta TM2-k aldiz, aurkezten duen helizitatea<br />
baxuagoa da. Gainera, TM2-k ≈205 nm-tan minimo bat aurkezten du<br />
eta 200 nm-tik beherantz positibo bat, egitura flexibleagoa hartzen<br />
duenaren adierazlea dena.
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.4. Irudia: 2B proteinaren transmintz sekuentziatik eratorriak diren<br />
peptidoen izendapena eta egitura. A) 2B transmintz peptidoen <strong>sekuentziak</strong>. B) TM1<br />
eta TM2 peptidoen CD espektroak tanpoian (puntutxudun marra), eta 10 mM SDS<br />
detergentea duen tanpoian (marra ez jarraia) edo 50 mM SDS tanpoian (marra jarraia).<br />
3.3.2. MINTZ-ZELULARRAREN IRAZKORTASUNAREN<br />
HANDIPENA PEPTIDOEN BIDEZ<br />
3.5, 3.6 eta 3.7 irudietan TM1 eta TM2 peptidoek zelulak<br />
irazkortzeko daukaten ahalmena azaltzen da. Poliobirusaz infektaturik<br />
dauden zelulek B-higromizinarekiko (HB), proteinen sintesiaren<br />
inhibitzailea dena, irazkorrak bihurtzen dira infekzioaren erdialdeko<br />
faseetan (Carrasco, L., Guinea, R. eta lank., 2002). Alfabirusaren<br />
erreplikoia (2.3.2 eta 2.3.3.1. atalak ikusi) erabiliz, 2B proteina bakarrik<br />
zelula barnean espresatu daiteke, aurreko efektu berdina lortuz (3.5<br />
irudia).<br />
TM1 mediora gehitzerakoan zelulak HB-ra eraginkorki irazkorrak<br />
bihurtzen dira. TM2-ak aldiz, ez du eraginik aurkezten (ezkerraldeko<br />
panela).<br />
103
104<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.5. Irudia: BHK-21 zelulen mintz plasmatikoaren irazkortasun aldaketa<br />
2B transmintz peptidoen eraginez. Mintza irazkorra bihurtzen bada, HB, proteinen<br />
sintesiaren inhibitzailea dena, zelula barnera sartu daiteke eta proteina zelularren<br />
sintesiaren inhibizioa ikus daiteke. Ezkerraldeko panela: zelulak, TM1 eta TM2-rekin<br />
30 minutuz inkubatu ziren, ondoren higromizina gehitzeko. TM1-ekin tratatuak izan<br />
ziren zelulak bakarrik bihurtu ziren antibiotikoari irazkorrak. Kontrol modura<br />
peptidoekin tratatu gabeko zelulak erabili ziren, higromizinari irazgaitzak direnak.<br />
Bestalde peptidoak berez ez dute proteina zelularren inhibiziorik sortarazten (-HB).<br />
Eskuinaldeko panela: 2B proteinak, "repC+2B" Sindbis birus (SV) erreplikoiarekin<br />
espresaturiko 2B proteinak eragindako mintzaren irazkortasuna. Ia zelula gehienak<br />
ondo transfektatu ziren, SV birusaren kapsidearen proteina (C) eta 2B bakarrik<br />
detektatu ahal direlarik.<br />
Bestalde, TM1 peptidoaren gehipenak ez du eragiten α-sartzina<br />
(16.8 kDa.) molekularen sarrera zelula barnera (3.6 irudia). Behaketa<br />
honek zera iradokitzen du: mintzak jasotako kaltea ez dela eragin ezespezifiko<br />
baten ondorioa izan, baizik eta garatu diren zenbait<br />
zentzuzko eta tamaina zehatzeko egituren ondorioa. Ikuspuntu honen<br />
alde, TM1-ren eraginez HB-ra guztiz irazkorrak bihurtu diren zeluletan<br />
ez da ikusten inolako aldaketa morfologikorik, 2 ordutako<br />
tratamenduaren ostean (3.7 irudia).
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.6. Irudia: Peptidoek zelula mintzetan eragindako α−sartzina<br />
proteinarekiko irazkortasuna. BHK zelulak, adierazten den modura, TM1 ala TM2-z<br />
tratatu ziren. α-sartzinaren sarrerarako kontrol positibo modura, SV-rekin zoldurik<br />
dauden BHK-21 zelulak erabili ziren, 10 edo 100 pfu/zelula infektatuak erabiliz.<br />
Birusaren sarrera ematen denean, zelulak proteina honekiko irazkor bihurtzen dira.<br />
3.7. Irudia: TM1<br />
peptidoaz trataturik<br />
izan diren BHK-21<br />
zelulen morfologia. BHK:<br />
TM1 peptidoaz tratatu<br />
gabeko zelulen kontrola.<br />
TM1: zelulak TM1 2µMekin<br />
inkubatu ziren 2<br />
orduz eta fase kontraste<br />
bidez behatu ziren. SV:<br />
Infekzioaren ondorioz<br />
behatzen diren aldaketa<br />
morfologikoak. Zelulak SV<br />
birusarekin infektatu<br />
ziren 5 pfu/zelula<br />
kontzentrazioan.<br />
105
106<br />
3.3.3. AKTIBITATEAREN KOKAPENA<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
TM1 peptidoaren aktibitatea espezifikoa zen ikusteko, 20<br />
aminoazidotako peptido serieak sintetizatu ziren (N-ter1, N-ter2, TURN<br />
eta C-ter). Peptido hauek, TM1 eta TM2 barne, 2B-ren sekuentzia osoa<br />
esku hartzen dute (3.8A irudia).<br />
Peptido bilduma guztiarekin, 3.8 irudiko B panelean zelula<br />
mintzak irazkortzeko ahalmena aztertzen da. Datu hauekin baieztatzen<br />
da TM1-k duen eraginkortasun altua. Beste peptidoak TM1-rekin<br />
konparatzen baditugu, eragiten <strong>duten</strong> zelula mintzen irazkortasuna ez<br />
da hain nabaria.<br />
Saio hauetan peptidoak medio urtsutik, monogeruzean hazten<br />
ari diren zelula mintzetara banatzen dira. Baldintza esperimental hauen<br />
menpe eta peptidoek zelularen mintz plasmatikoan txertatzeko <strong>duten</strong><br />
ahalmena aztertzeko, lipido monogeruzetan peptido bakoitzaren<br />
<strong>txertaketa</strong> aztertu zen (3.8C panela eta 3.1. taula). Prozesuaren<br />
mekanismo zinetikoa, <strong>txertaketa</strong> ahalmena, peptidoek mintzak<br />
irazkortzeko ahalmenarekin bat datorrela adierazten du, TM2<br />
peptidoaren kasuan honela ez delarik.<br />
TM2 peptidoak mintzetan txertatzeko ahalmen altua aurkezten<br />
du baina ez ordea zelula mintzak irazkortzeko ahalmena. N-ter2 eta Cter<br />
peptidoek tarteko portaera aurkezten dute. Txertaketarako presio<br />
kritikoak (πc, <strong>sekuentziak</strong> monogeruzan txertatu ezin direneko azalerapresioa)<br />
TURN peptidoa bakarrik mintzetan ezin dela txertatu (πc ≥ 30<br />
mN/m) adierazten digu.
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.8. Irudia: 2B peptido bildumak mintza irazkortzeko daukan ahalmenaren azterketa. A) 2B aminoazido<br />
sekuentzia eta horren azpian erabili den peptido bilduma. B) Peptido bildumak eragindako zelulen irazkortasun maila<br />
(peptidoak zelulekin 10 µM-eko kontzentrazioan inkubatu ziren). C) 20 mN/m-tako hasierako presioan peptidoek<br />
eragiten <strong>duten</strong> alboko azalera-presioaren aldaketak PC monogeruzetan (erabili den kolore kodea, B grafikan erabili den<br />
berdina da). Peptidoak 0.5 µM-eko kontzentrazioan injektatu ziren subfasean.<br />
107
108<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
Azterketa estrukturala burutu zen ondoren. Orokorrean, N-ter1,<br />
N-ter2, TURN eta C-ter peptidoek ez dute aurkezten egiturarik soluzioan<br />
(3.9. irudia). N-ter1 peptidoak, α−helize konformazio nabarmena<br />
hartzen du SDS mizelen presentzian. N-ter2 eta C-ter sekuentziek<br />
egitura hartzen dute baina ez da N-ter1 peptidoak hartzen duen egitura<br />
bezain nabarmena (3.1 taula). Bestalde TM1 eta TM2 lotzen dituen<br />
bigiztak (TURN peptidoa) ez du egiturarik aurkezten SDS mizelen<br />
presentzian.<br />
3.9. Irudia: 2B proteinaren sekuentziatik eratorriak diren peptidoen<br />
egitura soluzioan eta SDS mizelen presentzian. Peptidoen CD espektroak<br />
adierazten dira. Puntutxudun marrarekin, peptidoak Hepes 2 mM tanpoian aurkezten<br />
<strong>duten</strong> egitura adierazten da. Peptidoak 10 mM SDS detergentea duen tanpoian (marra<br />
ez-jarraiak) eta 50 mM SDS detergentea duen tanpoian (marra jarraia) hartzen <strong>duten</strong><br />
egiturak adierazten dira.
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
Laburbilduz, 3.8 irudian eta 3.1 taulan ematen diren emaitzetan<br />
irazkortasun aktibitatea transmintz domeinu anfipatikoak (TM1)<br />
gordetzen duela ikus daiteke. Emaitzek ere iradokitzen dute TM1-<br />
TURN-TM2 motiboaren saihetsetik aurkitzen diren sekuentziek,<br />
mintzekin elkarrekiteko ahalmena daukatela baina ez mintzak<br />
irazkortzekoa.<br />
3.1. Taula: 2B peptidoen <strong>txertaketa</strong> PC-zko lipido monogeruzetan.<br />
Peptidoa ∆π20 (mN/m) a T1/2 (s) b πc<br />
(mN/m) c<br />
N-ter1<br />
N-ter2<br />
TM1<br />
TURN<br />
TM2<br />
C-ter<br />
3.4<br />
4.1<br />
14.1<br />
3.1<br />
8.4<br />
5.9<br />
693<br />
80<br />
406<br />
397<br />
113<br />
103<br />
33.2<br />
32.9<br />
44.1<br />
110<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.10. Irudia: Zelula-mintzen irazkortasuna TM1-ren eraginez. A) TM1-aren<br />
dosi menpekotasuna, HB-ren sarrerak eragiten duen proteina zelularren sintesiaren<br />
inhibizioarekin aztertzen da. B) Aurreko grafikoan behatzen den efektuaren<br />
kuantifikazioa. TM1-ek eragiten duen HB-ren sarrera (zirkuluak eta marra jarraiak)<br />
TM2-k eragiten duen HB-ren sarrerarekin konparatuz (karratuak eta marra ezjarraiak).<br />
3 saio ezberdinen desbiazio estandarren baloreak ploteatu dira.
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
TM2, kontrol negatibo espezifiko moduan erabili zen, mintzetan<br />
txertatzeko ahalmena duelako (ikusi 3.10. irudia) baina ez ditu maila<br />
eraginkor batean zelulak irazkortzen kontzentrazio altuetan (10 µM) (B<br />
panela). TM1-en kasuan zelula monogeruzaren irazkortasun<br />
mekanismoaren zinetika (3.11 irudia) bat dator lipido monogeruzaren<br />
<strong>txertaketa</strong> mekanismo zinetikoarekin (3.8 irudia eta 3.1 taula). Zazpi<br />
minutu inguruko t1/2-ak neurtuak izan ziren bi prozesuetarako. Honek<br />
iradokitzen du, medio urtsuan disolbaturik dagoen TM1 peptidoaren<br />
mintz-<strong>txertaketa</strong> urrats mugagarria dela zelulen irazkortasunerako.<br />
3.11. Irudia: TM1-ek eragindako zelula mintzaren HB konposatuarekiko<br />
iragazkortasunaren zinetika. TM1 zelulekin denbora ezberdinetan inkubatu zen.<br />
Erabili zen TM1 kontzentrazioa 5 µM izan zen.<br />
111
112<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.12 irudian aurkezten diren emaitzetan ikus daiteke, TM1-ek<br />
eragindako zelula-mintzaren irazkortasuna, errezeptore bidezko<br />
endozitosia inhibitua dagoen baldintzetan, hots 4 ºC-tan, ere ematen<br />
dela. Beraz, dosiaren menpekotasuna, mekanismo zinetikoak eta<br />
tenperaturaren efektuak iradokitzen dute zelularen mintz plasmatikoan<br />
gertatzen den irazkortasuna TM1 sekuentziaren <strong>txertaketa</strong>ren<br />
fenomenoagatik dela. Susmo hau 3.13 eta 3.14 irudietan agertzen<br />
diren emaitzek sustatzen dute.<br />
3.12. Irudia: TM1-ek eragindako HB-ren sarrera 4 ºC-tan. Zelulak 4 ºC-tan<br />
10 minutuz preinkubatu ziren eta ondoren TM1 peptidoa gehitu zitzaien (5µM) eta 30<br />
minutuz inkubatu ziren. 0 denboran medioa kendu zen eta zelulak erradiaktiboki<br />
markatu ziren HB-ren gabezian (-) edo presentzian (+) (HB 1 mM, 30 minutuz eta 37<br />
ºC-tan), edo 90 minutuz 37 ºC-tan inkubatu ostean medioa kendu zen eta HB-aren<br />
gabezian (-) edo presentzian (+) (HB 1 mM, 30 minutuz) erradiaktiboki markatu ziren.<br />
Fluoreszentziako mikroskopia bidez TM1 peptidoaren kokapena<br />
mintz plasmatikoan ezagutu zen (3.13 irudia). Detekzioa burutzeko<br />
fluoreszeinaz markaturik dagoen estreptabidina erabili zen.<br />
Estreptabidina, peptidoaren karboxilo muturrera itsatsita dagoen<br />
biotinara batzen da. TM2 sekuentzia ere mintz plasmatikoan kokatzen<br />
da, baina mintzean ematen den <strong>txertaketa</strong> hau, irazkortasuna<br />
gertatzeko nahikoa ez denaren ideia eutsiz.
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.13. Irudia: TM1 eta TM2-ren kokapena zelularen gainazalean. A)<br />
Biotinilaturik dauden TM1 eta TM2 peptidoen kokapena FITC-estreptabidina<br />
konposatu fluoreszenteaz baliatuz burutu zen. Zelulak peptidoekin 15 minutuz<br />
inkubatu ziren eta ondoren FITC-strep gehitu zitzaien (1:200 erlazioan) eta ordu batez<br />
inkubatu ziren. Jarraian %4 paraformaldehidoarekin fixatu ziren 10 minutuz, eta<br />
fluoreszentziazko mikroskopio konfokal batean behatu ziren. Zelularen mintz<br />
plasmatikoa markaturik agertu zen bi kasuetan. Kontrol modura zelulak FITC-strprekin<br />
soilik inkubatu ziren. B) TM1 peptidoak eragindako irazkortasunaren inhibizioa.<br />
Bi protokolo erabili ziren: “a” TM1 10 µM eta estreptabidina 0.1 edo 1 µM nahastu<br />
ziren 15 minutuz. Ondoren nahasketa zelulei gehitu zitzaien eta 37 ºC-tan inkubatu<br />
ziren ordu batez. “b” Lehendabizi zelulak TM1 peptidoarekin 15 minutuz inkubatu<br />
ziren eta gero estreptabidina gehitu zen, ordu batez inkubatzeko 37 ºC-tan. Zelulak 20<br />
minutuz HB-ren presentzian (+) edo gabezian (-) 37 ºC-tan inkubatu, eta<br />
erradioisotopoarekin 40 minutuz markatu ziren. Laginak SDS-PAGE bidez<br />
prozesatuak izan ziren.<br />
113
114<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
Estreptabidina biotinadun peptidoen aktibitatea inhibitzen dituen<br />
aztertzeko erabili zen. Estreptabidina molekula irazgaitza da (A panela),<br />
beraz TM1-ek eragiten duen mintzaren irazkortasuna mintz plasmatiko<br />
mailan gertatu behar da (B panela). Estreptabidina peptidoarekin<br />
soluzioan inkubatuz gero, TM1-ek eragindako irazkortasunean inhibizio<br />
efektu altuagoa ikusten da (“a” protokoloa). Baina inhibizio efektu hau<br />
ere behatzen da zelulak lehenik TM1 peptidoarekin inkubatzen direnean<br />
honen <strong>txertaketa</strong> baimentzeko (“b” protokoloa) ondoren estreptabidina<br />
gehituz. TM1-ek mintz plasmatikoan zelularen irazkortasuna<br />
areagotzen <strong>duten</strong> poro oligomerikoak eratzen dituela ondorioztatu<br />
daiteke.<br />
3.14. Irudia: PC LUV-en irazkortasuna TM1, TM2 eta N-ter1 peptidoen<br />
eraginez. A) Besikulen barnealdean dauden solutuen askapena (ANTS/DPX saioa)<br />
denboraren funtziopean. TM1 peptidoa marra urdinekin, TM2 marra berdeekin eta Nter1<br />
marra beltzekin adierazi dira. Kurbak lipido:peptido 1:1000 erlazioan lortu dira.<br />
B) 30 minututara lortzen diren ANTS/DPX solutuen askapenak, peptido:lipido erlazio<br />
ezberdinetara. Kasu guztietan erabili den lipido kontzentrazioa 50 µM izan da. Datuak<br />
bi esperimentuen batez besteko balioak dira.<br />
3.14 irudian agertzen diren emaitzek, TM1 peptidoak lipidobesikuletan<br />
poroak eratzeko ahalmena duelaren ebidentzia sustatzen<br />
dute. A panelean alderatu egiten dira, TM1 (mintzetan txertatzen dena<br />
eta hauek irazkorrak bihurtzen dituena), TM2 (mintzetan txertatzen<br />
dena, baina irazkorrak bihurtzen ez dituena) eta N-ter1 sekuentzien<br />
(kontrol inaktiboa) ahalmenak PC-zko LUV-en osagai urtsuen<br />
askapenean.
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
TM1-ek ANTS solutuaren askapena eragiten du peptido:lipido<br />
proportzio (Ri) baxuetan 1:10000 erlazioan solutuen %16-a askatzen<br />
da, eta 1:1000 erlazioan %50 baino gehiago. Hain erlazio baxuetan<br />
askapena ematen baldin bada, besikulen apurketa peptido kantitate<br />
masiboen gehipenaren ondorioz ez dela, iradokitzen du. Mintzaren<br />
irazkortasuna mekanismo espezifiko baten ondorioz izan behar da. TM2<br />
peptidoaren kantitate berdinak gehitzerakoan askapen adierazkorrik ez<br />
da gertatzen.<br />
Hurrengo irudietan lortzen diren emaitzek TM1-ek eragiten duen<br />
solutuen askapena peptido:lipido erlazio baxuetan poro litiko, egonkor<br />
eta diskretuen eraketaren bidez denaren ideia sendotzen dute. TM1-ek<br />
ANTS solutua (425 Da.) enkapsulatuta <strong>duten</strong> besikulak (peptido:lipido)<br />
erlazio baxuetan) oso ondo irazkortzen ditu, baina aldiz, FD-4<br />
(MW:4000) eta FD-10 (MW:10000) solutuak enkapsulatuta dituzten<br />
besikulak erlazio berdinetan ez ditu ondo irazkortzen (3.15 irudia).<br />
Honek besikuletatik askatzen diren solutuak esklusio tamaina bat izan<br />
behar dutela iradokitzen du.<br />
3.15. Irudia: TM1 peptidoak eragiten duen PC LUV-en irazkortasuna. A)<br />
Tamaina ezberdineko solutuen askapena. Erabili den TM1:PC erlazioa 1:5000 da. B)<br />
Peptido:lipido erlazio ezberdinetan behatzen den ANTS/DPX askapena (zirkuluak eta<br />
marra jarraia), FD-4 (karratuak eta marra ez jarraia) eta FD-10 (hirukiak eta<br />
puntutxudun marra).<br />
Solutu sarreraren esperimentuen bidezko, 3.15 irudiko emaitzek,<br />
TM1 peptidoak poroak eragiten dituela ondorioztatu daiteke.<br />
Peptidoaren <strong>txertaketa</strong>ren ondorioz eratzen den poroa, solutuen<br />
pasabidea baimenduko luke, mintz plasmatikoaren osotasuna galdu<br />
115
116<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
gabe. Solutuen sarrera lagatzen du orekara heldu ostean ere, hots,<br />
besikuletatik ANTS solutuen askapen osoa gertatu denean.<br />
Solutuen sarrera, kanpoaldetik gehitutako ditionitoak, besikulen<br />
NBD portzentajea erreduzitzeko duen ahalmenaren bidez aztertu zen.<br />
NBD-z simetrikoki markaturik dauden besikuletan, ditionitoak gutxi<br />
gorabehera besikulen kanpoaldean dagoen NBD-a erreduzitzen du<br />
kanpoaldetik gehitzen baldin bada (fluoreszentziaren %50-ren<br />
murrizpenarekin bat datorren prozesua, CTL kontrola). Balore hau<br />
solutuen sarrera gertatu ez denean, hots sarreraren %0-a da. Aldiz<br />
detergenteekin besikulak solubilizatzen direnean lortzen den balorea<br />
sarreraren %100-a da.<br />
3.16. Irudia: Solutuen sarrera peptidoek irazkorturiko PC besikuletan<br />
(Ditionitoren sarrera saioa). A) Ditionitoaren sarrerak eragiten duen NBD zundaren<br />
erredukzioa. CTL: Ditionitoarekin trataturiko PC:NBD-PE besikulen kontrola (30 stara<br />
gehitua). TM1 eta TM2: dagokien peptidoekin 30 minutuz eta 37 ºC-tan<br />
preinkubatu izan diren PC:NBD-PE besikulak peptido:lipido 1:500 erlazioan; ondoren<br />
ditionitoarekin trataturik izan dira. B) Ditionitoaren sarrera, TM1 eta TM2 dosiaren<br />
gehikuntzaren ondorioz irazkorturik dauden PC besikuletara (TM1 zirkulu urdinak eta<br />
TM2 karratu berdeak).<br />
3.16 irudian agertzen diren zinetikek, TM1 peptidoarekin tratatu<br />
diren besikulek solutuen sarrera baimentzen dutela ondorioztatzen<br />
dute. Bestalde, TM2-rekin tratatu diren besikulek ez dute hain<br />
eraginkorki solutuen sarrera gertatzea baimentzen. Laburbilduz, datu<br />
guzti hauek kontuan hartuz, iradokitzen da, besikulen mintzetan<br />
denboran zehar egonkorrak diren konexio urtsuak eratzen direla,<br />
irazkorrak bihurtu diren zeluletan ikusten diren ezaugarri (sekuentzia<br />
espezifikotasuna, solutuen tamaina zehatza eta egonkorra) berdinak<br />
dituztenak.
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.3.5. KARGA ELEKTRIKOAREN ERAGINA<br />
Infekzioaren prozesuan zehar, 2B proteina, mintz plasmatikoaren<br />
barneko monogeruzean txertatu behar dela iradokitzen da. Beraz, TM<br />
domeinuak, negatiboki kargatuta dagoen mintz-interfasera transferitu<br />
beharko lirateke. Hori dela eta, TM1 eta TM2-aren <strong>txertaketa</strong> eta poroeraketan<br />
fosfolipido anionikoek <strong>duten</strong> eragina aztertu zen baita.<br />
3.17. Irudia: TM1 eta TM2 peptidoen <strong>txertaketa</strong> monogeruza<br />
anionikoetan. TM1 eta TM2-k eragindako presioaren aldakuntzaren baloreak<br />
adierazten dira. Datuak, presioaren handipena saturaziora heldu diren zinetiketatik<br />
lortu dira. Erabili ziren TM1 eta TM2 kontzentrazioak 0.25 µM eta 0.5 µM izan ziren<br />
hurrenez-hurren.<br />
3.17 Irudian erakutsi den modura, bai TM1-ak, bai TM2-ak; PS,<br />
PI edota PG fosfolipido anionikozko lipido monogeruzetan txertatzeko<br />
gaitasuna erakutsi zuten. Gainera, biak, 30 mN/m baino presio<br />
altuagoetan konprimituta zeuden monogeruzetan txertatzeko gai ere<br />
baziren. Beraz, mintz zelularretan aurkitzen diren alboko presioak<br />
jasaten dituzten fosfolipido anionikozko geruzetan txertatzeko egokiak<br />
direla ondorioztatu daiteke.<br />
117
118<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.15. Irudia: PI besikula anionikoen irazkortasuna peptidoen funtziopean.<br />
Peptido:lipido erlazio ezberdinetan behatzen den ANTS (MW: 425, eskuinaldeko<br />
panela) eta FD-10 (MW: 10000, ezkerraldeko panela) solutuen askapenaren<br />
portzentajeak.<br />
Poro eraketaren prozesua aztertu zen ondoren. 2B proteinak PI-z<br />
osoturiko mintzak irazkortzeko ahalmena duela kontutan hartuta<br />
(Agirre, A., Barco, A. eta lank., 2002), fosfolipido anioniko bera aukeratu<br />
zen TM1 eta TM2-ren ahalmenak aztertzeko (3.18 irudia). TM2-k<br />
bigeruza anionikoak, 1:1000 baino baxuagoak ziren peptido:lipido<br />
erlazio molarretan, eraginkorki irazkortu zituen bai ANTS-rekiko, baita<br />
FD-10-rekiko. Horren aldean, dosi horietan TM1-k eragin eskasa<br />
erakutsi zuen. Hots, domeinu litiko modura definitutako sekuentzia<br />
anfipatikoak, txertaturik egonda ere, ez zuen mintz anionikoak<br />
poratzeko gaitasun handirik erakutsi. Aldiz TM2-a, mintz neutroak<br />
poratzeko ahalmen mugatua erakutsi zuena (3.14 eta 3.19 irudiak),<br />
sekuentzia eraginkor modura agertu zen fosfolipido anionikoez<br />
osoturiko mintzetan. Hala eta guztiz ere, ezberdintasun garrantzitsu bat<br />
nabaritu zitekeen bi domeinuen artean: TM2-ak PI mintzetan<br />
eragindako irazkortasun prozesuak ez zuen TM1-k PC-n azaldutako<br />
solutu tamainarekiko espezifikotasun bera erakutsi.
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.19. Irudia: Peptidoen sinergiaren azterketa. A) ANTS/DPX solutu urtsuen<br />
askapen zinetikak adierazten dira. PC eta PI besikulen presentzian eta 1:1000<br />
peptido:lipido erlazio molarrean. B) 30 minututara lortzen diren ANTS/DPX solutuen<br />
askapena kontzentrazio ezberdinetan. PC besikulen presentzian, TM1 peptidoa<br />
lipidoarekiko 1:3000 erlazioan finkatu zen eta TM2 peptidoa titulatu zen. Kontrara, PI<br />
besikulen presentzian, TM2 erlazio berdinean finkatu zen eta TM1-en titulaketa<br />
erakusten da. Erabili zen LUV kontzentrazioa kasu guztietan 50 µM izan zen eta<br />
saioak 37 ºC-tan burutu ziren. Marra bertikal ez jarraiak, bi peptidoen arteko erlazio<br />
ekimolarra adierazten du<br />
119
120<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
Behatutakoaren esangura funtzionalaren bila 3.19 irudian<br />
erakutsitako saioak burutu ziren. Bertan, TM domeinuek poro-eraketa<br />
sinergizatzeko ahalmena azaltzen da. TM1-ak, nabarmenki areagotu<br />
zuen TM2-ak eragindako ANTS askapena PI liposometan (3.19A irudia).<br />
Aldiz, TM2-k, sinergia negatibo ahula agertu zuen TM1-ek eragindako<br />
PC irazkortasunarekiko (3.19A irudia). Gainera, TM1-aren efektu<br />
sinergiko positiboa, TM1:TM2 1:1 erlazio molarrera heltzean saturatu<br />
zen (3.19B irudia). Emaitza horrek, 1:1 estekiometriadun TM1:TM2<br />
konplexuaren eraketari eman diezaioke euskarria. Konplexu horrek,<br />
negatiboki kargatuta dauden mintzetan eratzen baldin bada, modu<br />
eragingarri batean irazkortasuna bultzatuko luke.<br />
3.3.6. PEPTIDOEN AKTIBITATE ANTIMIKROBIANO<br />
ETA HEMOLITIKOA<br />
Azkenean, TM1 eta TM2-ek mintz naturalak irazkortzeko zuten<br />
ahalmena neurtu zen saio hemolitiko eta antimikrobianoen (AMP saioa)<br />
bidez (3.20 irudia). TM1-ek aktibitate hemolitiko altua ageri zuen.<br />
Kalkulatutako IC50 balioa 10 µM izan zen. Erle-pozoiaren osagaia den<br />
"melitina", ezagutzen den peptidorik hemolitikoena 0.16 µM-eko IC50-a<br />
aurkezten du (Perez-Paya, E., Dufourcq, J. eta lank., 1997). Bestalde,<br />
TM1-ek, Rana tagoi igelatik isolaturiko peptidoa (IC50= 8 µM,<br />
melitinarekin erlazionaturik dagoena) aurkezten duen IC50 antzekoa<br />
dauka (Conlon, J. M., Sonnevend, A. eta lank., 2003) eta zitolitikotzat jo<br />
izandako beste hainbat peptido baino IC50 baxuagoa: Magaininak<br />
adibidez 80 µM-eko IC50-a aurkezten du (Unger, T., Oren, Z. eta lank.,<br />
2001), parabutoporinak, 38 µM-tan %50-eko hemolisi baino gutxiago<br />
eragiten du eta opistoporinak 100 µM-tan %30-a baino gutxiagokoa<br />
(Moerman, L., Bosteels, S. eta lank., 2002).<br />
TM2-k, aldiz, ez zuen aktibitate hemolitikorik erakutsi saiatutako<br />
kontzentrazioetan. Bion nahasketaren laginean, TM2-k eragindako<br />
inhibizioa nahiko nabarmena izan zen.<br />
Ez batak, ez besteak, ez zuten aktibitate antimikrobiano<br />
esanguratsurik erakutsi kontrol moduan erabili zen "zekropina"-ren<br />
aldean (MIC=0.2-0.4 µM (Putsep, K., Normark, S. eta lank., 1999)).<br />
Halere, TM2 eta TM1+TM2 nahasketaz trataturiko laginek, bakterioen<br />
hazkuntza inhibitzeko joera mugatua azaldu zuten kontzentrazio<br />
altuenetan.
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.20. Irudia: Peptidoen aktibitate hemolitikoa eta antimikrobianoa.<br />
Ezkerraldeko panela: peptidoen aktibitate hemolitikoa aztertzeko mikrodiluzio test bat<br />
egin zen, hRBC-en hemoglobina irteera 412 nm-tan neurtuz. Zirkulu urdinekin TM1<br />
peptidoaren aktibitate hemolitikoa adierazi da, karratu berdeekin TM2 peptidoarena<br />
eta hiruki beltzekin bi peptidoen nahastura. Eskuinaldeko panela: peptidoen<br />
aktibitate antimikrobianoa E. Coli BL21 anduian mikrodiluzio test batekin aztertu zen<br />
ere, eta bakterioen hazkuntzaren xurgapena 620 nm-tan neurtuz. Hazkuntzaren<br />
inhibizioaren kontrol positibo modura zekropina peptido antimikrobianoa erabili zen.<br />
Aurreko panelean erabili diren koloreak eta sinboloak erabili dira, erronbo gorriak<br />
zekropina peptido antimikrobianoa aurkezten duen hazkuntzaren inhibizioari<br />
dagozkio.<br />
3.4. EZTABAIDA<br />
<strong>Mintzetan</strong> poroak eratzen dituzten proteinak mota ezberdinetako<br />
organismoek betidanik erabili izan <strong>duten</strong> defentsarako eta erasorako<br />
mekanismo bat dira (Ojcius, D. M. eta Young, J. D., 1991; Shai, Y.,<br />
1999). Oinarrizko motibo batean laburbildu daiteke poroak eratzeko<br />
gaitasunaren funtzioa: “hondar polarrak eta apolarrak aurkako<br />
aurpegietan banaturik dituzten transmintz helizeak” (Ojcius, D. M. eta<br />
121
122<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
Young, J. D., 1991; Epand, R. M. eta Vogel, H. J., 1999; Shai, Y., 1999;<br />
Gilbert, R. J., 2002; Panchal, R. G., Smart, M. L. eta lank., 2002;<br />
Parker, M. W. eta Feil, S. C., 2005; Huang, H. W., 2006). Egitura<br />
unitate hauek mintzaren gune hidrokarbonatua eta kanal urtsu baten<br />
lumena kontaktuan jartzeko ahalmena daukate.<br />
Eratzen den poroak, normalean lipido bigeruza zeharkatzeko<br />
ahalmenik ez daukaten molekulen difusioa baimentzen du. Animalia<br />
zelulen kasuan, mintz plasmatikoaren mailan erregulazio gabeko<br />
egitura hauen agerpenak, zelularen homeostasiaren galera eta bere<br />
hilketa eragin dezakete.<br />
Zenbait proteina eta peptidoek, toxina mikrobianoak edo pozoien<br />
osagai diren peptido zitolitikoak adibidez, egitura motibo arrunt hau<br />
erabiltzen dute eraso estrategia moduan, zelularen irazkortasun hesian<br />
kalteak eraginez (Gouaux, E., 1997; Gilbert, R. J., 2002; Panchal, R. G.,<br />
Smart, M. L. eta lank., 2002; Kuhn-Nentwig, L., 2003; Hecht, O., Van<br />
Nuland, N. A. eta lank., 2004; Parker, M. W. eta Feil, S. C., 2005).<br />
Poroak eratzeko gaitasuna daukaten proteinak, linfozito eta<br />
“natural killer” zelulek ere sekretatzen dituzte, defentsa erantzun<br />
moduan (Trapani, J. A. eta Smyth, M. J., 2002). Perforina,<br />
konplementoari atxekituriko azpiunitateak eta granulisina edo NKlisina<br />
moduko polipeptido txikiak, itu zelularen mintz plasmatikotik<br />
gertu granulo exozitikoetatik askatzen dira, bertan transmintz poroak<br />
eratuz (Ojcius, D. M. eta Young, J. D., 1991; Andersson, M., Gunne, H.<br />
eta lank., 1995; Liepinsh, E., Andersson, M. eta lank., 1997; Trapani, J.<br />
A. eta Smyth, M. J., 2002; Anderson, D. H., Sawaya, M. R. eta lank.,<br />
2003; Voskoboinik, I. eta Trapani, J. A., 2006). Perforinaren oinarrizko<br />
sekuentziatik eratorriak diren zenbait peptido motz, zein zatiki<br />
proteolisatuak, perforinaren aktibitate litikoa gordetzen dute;<br />
transmintz domeinu ezberdinak poro eraketan parte hartzen dutelaren<br />
adierazle (Ojcius, D. M. eta Young, J. D., 1991; Baran, K., Ciccone, A.<br />
eta lank., 2006). Honengatik ez da hain arraroa pentsatzea zenbait<br />
birusek, beraien efektu zitopatikoa burutu ahal izateko eboluzioan<br />
zehar poroak eratzeko motiboak berenganatu izana.<br />
Tesi honetan, birus biluzi baten proteina ez-egitural batek,<br />
poroak eratzeko domeinua azaltzen duenaren lehenengo ebidentzia<br />
esperimentala ematen da. Poliobirusaren 2B proteinaren domeinu<br />
honek, zelula monogeruzetan, poliobirusaren infekzioaren erdialdera<br />
ikusten den irazkortasun fenomenoa adierazten du zelula<br />
monogeruzetan, adibidez behatzen den solutu txikien difusioa mintz
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
plasmatikoan zehar (3.5 eta 3.6 irudiak). Peptidoetan oinarriturik<br />
erabili den analisia, TM1 sekuentzian aktibitatea kokatzeko balio izan<br />
du (3.8 irudia). Bigarren transmintz <strong>sekuentziak</strong>, TM2, lipido<br />
monogeruzetan eta zelulen mintz plasmatikoan txertatzeko gaitasuna<br />
aurkezten duen arren, ez da zelulak irazkortzeko gai.<br />
2B-tik eratorriak diren beste sekuentziek, SDS mizeletan egitura<br />
aurkezten dute (3.1 taula), honek iradokitzen du sekuentzia hauek<br />
mintzaren alderdi ez polarrean txertatu ahal direla. Sekuentzia hauek<br />
funtzio–eginkizun bat izan dezakete, batez ere irazkortasunean egituralaguntzaile<br />
moduan, mintzean ematen den <strong>txertaketa</strong>n edo prozesua<br />
erregulatzen.<br />
TM1 sekuentziaren potentzia (aktiboa dena nM<br />
kontzentrazioetan), zelula monogeruzak irazkortzeko behar duen<br />
denbora (peptidoa, lipido monogeruzetan txertatzeko behar duenaren<br />
antzekoa) eta irazkortasun prozesua, eraginkorki gertatzen dena garraio<br />
aktiboaren ezean, sustatzen <strong>duten</strong> ebidentziek, TM1 sekuentzia honen<br />
eraginez, mintz plasmatikoan transmintz poroen agerpena iradokitzen<br />
dute. Are gehiago, TM1 mintz-plasmatikoan kokatzen da, eta bere<br />
eragina estreptabidina kanpoaldetik botata inhibitu egiten da (3.13<br />
irudia). Peptidoak, lipido besikuletan poroak eratzen ditu dosi baxuetan<br />
(3.14 irudia). Hau dena, TM1-ek eragindako zelularen irazkortasuna,<br />
sekuentzia honek mintz plasmatikoan zuzenean eraturiko poroengatik<br />
dela ondoriozta lezake.<br />
Poro hauek diskretuak eta egitura egonkorrekoak dira, bai<br />
zeluletan, bai lipido besikuletan ere (solutuarentzat tamaina zehatz bat<br />
aurkezten dute eta behin poroa eratuta zabalik mantentzen dira).<br />
Agirre eta lankideek lortutako emaitzak kontutan hartuta, TM1<br />
eta TM2-ek eragindako karga elektrikoaren araberako efektu ezberdinek<br />
(3.18 eta 3.19 irudiak), 2B-ren <strong>txertaketa</strong> eta poro-eraketa<br />
mekanismoari buruzko informazioa eman dezakete (3.21 irudia). MBP-<br />
2B eraikuntzak negatiboki kargatuta dauden mintzak behar ditu<br />
<strong>txertaketa</strong>rako. Posiblea liteke eraikuntza horretan TM1 domeinuaren<br />
gune hidrofobikoak babestuak egotea. Beraz, agerian dauden karga<br />
positiboek bultzatuko lukete elkarrekintza elektrostatikoa negatiboki<br />
kargatuta dagoen mintz-azalerarekin. Poro-eraketak, TM2-ren ekintza<br />
beharko luke, TM1-ren translokazioa bultzatzeko hain zuzen ere.<br />
Negatiboki kargatuta dauden besikuletan beharrezkoa den sinergiak<br />
hala iradokitzen du (3.19 irudia). Mekanismo horrek, barneko mintz<br />
zelularretan translokoi ezean burutzen den poro-eraketa azalduko luke.<br />
123
124<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
3.21. Irudia: 2B mintz-domeinuen <strong>txertaketa</strong> eta poro eraketa azaltzen<br />
duen prozesuaren modeloa. MBP-2B eraikuntzak fosfolipido anionikoak behar ditu<br />
<strong>txertaketa</strong> bideratzeko. Prozesu honek, poro eraketa mugatzen du. TM1-a kargarekiko<br />
independientea den prozesu bat jarraituz txertatzen da. Poroa, aldiz, karga-gabeko<br />
mintzetan baino ez da eratzen. TM2-ak eraginkortasun handiarekin irazkortzen ditu<br />
fosfolipido anionikoez osoturiko mintzak, baina ez poro bat eratuz. Honek eragiten<br />
duen perturbazioa, TM1-ek translokazioa bultzatzeko erabil lezake.
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
Laburbilduz, 2B-ak bere baitan, egitura-motibo bat darama,<br />
zeinak transmintzak diren poro irazkorrak eratzeko ahalmena<br />
aurkezten duen. Erregio honek zelula-mintzak irazkortzeko aurkezten<br />
duen eraginkortasun altuak, mintzak poratzeko ahalmenaren funtzioa<br />
presio hautakor baten eraginez dela iradokitzen du.<br />
2B proteinaren funtzioa poliobirusaren ziklo-infektiboan oraindik<br />
ez dago oso argi. 2B-aren gainespresioak, erretikulu endoplasmikoan<br />
eta Golgi aparailuan metatzea eragiten du. Proteinaren metaketa honek<br />
mintz plasmatikora ematen den glikoproteinen garraioa eragozten du.<br />
Bestalde, zelula barneko mintzen birantolaketa, eta kaltzio eta beste ioi<br />
batzuen kontzentrazio aldaketa dakar (Barco, A. eta Carrasco, L.,<br />
1995; Aldabe, R., Barco, A. eta lank., 1996; Aldabe, R., Irurzun, A. eta<br />
lank., 1997; Sandoval, I. V. eta Carrasco, L., 1997; Van Kuppeveld, F.<br />
J., Hoenderop, J. G. eta lank., 1997; de Jong, A. S., Melchers, W. J. eta<br />
lank., 2004). Guztiak ez badira, hauetako zenbait efektu proteinak duen<br />
mintza irazkortzeko gaitasunagatik direla proposatu da (de Jong, A. S.,<br />
Visch, H. J. eta lank., 2006). Honengatik, 2B-ak eragindako solutuen<br />
desorekak zelularen barneko mintzen artean, organuluen funtzio<br />
normala arriskuan jartzen du eta birusaren erreplikaziorako aproposak<br />
diren baldintzak ezartzen ditu.<br />
125
126<br />
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I
3. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida I<br />
127
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
128
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
______________________________________________________________________<br />
AITZINSOLASA<br />
GIB-aren 2F5 eta 4E10 antigorputz neutralizatzaile, gp41<br />
proteinaren kanpo domeinuaren pretransmintz alderdira batzen dira.<br />
Antigorputz hauek mintzaren gainazalean ezagutzen dituzte beraien<br />
epitopoak. Orain dela gutxi kardiolipina fosfolipidoarekin<br />
erreakzionatzeko ahalmena dutela frogatu da. Tesi honetan,<br />
antigorputzak mintzari batuta daudenean edo soluzioan dispertsaturik<br />
daudenean mintzean murgildurik dauden epitopoak ezagutzeko<br />
aurkezten <strong>duten</strong> ahalmena ikertzen da.<br />
Egin diren in vitro saioetan, antigorputzak daukaten berezko<br />
ahalmenaren eraginez, mintzari baturik dauden epitopoak ezagutzen<br />
dituztela frogatzen da. Mab2F5-aren kasuan, mintzean ematen den<br />
ezagumendua afinitate baxukoa da, ostera kardiolipina fosfolipidoa<br />
espezifikoki ezagutzen du, epitopoa batzen deneko gunea erabiltzen<br />
baitu lipido hau ezagutzeko.<br />
Mintzen gainazalean ematen den ezagumendua, bi mekanismo<br />
mota ezberdinen menpe dagoela iradokitzen da. Hau oso garrantzitsua<br />
da, 2F5 eta 4E10-en erantzun humorala sortarazi dezaketen<br />
immunogeno berrien diseinu eta garapenerako.<br />
129
4.1. SARRERA<br />
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
4.1.1. 1 MOTATAKO GIZA IMMUNOESKASIAREN<br />
BIRUSA (GIB-1)<br />
XX. mendean zehar hegazti eta ugaztunek pairatzen dituzten<br />
gaixotasun ugarien eragileak erretrobirusak direla egiaztatu da. 1980an<br />
lehenengo erretrobirusa identifikatu zen, Linfozitoen leuzemia<br />
eragiten duen birusa (HTLV-1) hain zuzen, gizakietan neoplasia eta<br />
neuropatologiak sortarazten dituena. Erretrobirusak azido<br />
erribonukleikoz (RNA) osaturiko genoma konplexua <strong>duten</strong> birus familia<br />
bat dira. Birusaren RNA-a azido desoxirribonukleikora (DNA)<br />
transkribatzen dute alderantzizko transkriptasa baten laguntzaz (Coffin,<br />
J. M., 1996). HIESA, 1981-ean entitate kliniko modura onartu zen.<br />
Gaixotasun honen oinarrizko ezaugarria infekzio oportunistekin batera<br />
agertzen diren anormaltasun immunologikoak, desorden neurologikoak<br />
eta ez-ohiko minbizi motak dira (Levy, J. A., 1994) Gaixotasunaren<br />
eragilea 1983-an isolatu zen lehenengo giza erretrobirusa, Giza<br />
Immunoeskariaren Birusa (GIB) deitu zen (Gallo, R. C. eta Montagnier,<br />
L., 1988) (4.1 A irudia).<br />
GIB birusak, gizakietan erikortasun eta hilkortasun altua<br />
eragiten duen patogenoa bat da. Birus honek eragiten dituen kalteak<br />
direla eta, bere biologiaren azterketa zehatza, egitura molekularrean<br />
sakontzea eta kontrolerako eta tratamendurako aukera posibleen<br />
garapena sakonki ikertzeak eragin du.<br />
4.1.1.1. BIRIOIAREN EGITURA<br />
GIB-1 Erretrobiridae familiaren partaidea da eta Lentibirus<br />
moduan sailkatua dago. Lentibirus genero barnean, immunitate<br />
sistema eta nerbio-sistema zentralean infekzio kronikoak sortarazten<br />
dituzten patogenoak sailkatzen dira (Freed, E. O. eta Martin, M. M.,<br />
2001). Lentibirus guztiek morfologia eta morfogenesi komuna aurkezten<br />
dute (4.1 irudia); 110 nm-ko diametroa, itxura esferikoa, lipido bigeruza<br />
130
Mintz lipidikoa<br />
RNA<br />
Proteasa<br />
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
batez gaineztatuak daudelarik. Lipido bigeruza honen jatorria<br />
zelula ostalariaren mintz plasmatikoan dago.<br />
GIB-aren mintzak, espikula kopuru urria dauka, birioi bakoitzeko<br />
8-15 espikula gehienez daudelarik. Espikulak simetria triangeluarra<br />
aurkezten dute, gutxi gorabehera 10 nm-tako altuera eta itxura oboidea<br />
daukan 14-15 nm-tako mutur distal bat daukate bere luzera ardatzean<br />
(Zhu, P., Chertova, E. eta lank., 2003; Yuste, E., Reeves, J. D. eta lank.,<br />
2004; Zhu, P., Liu, J. eta lank., 2006). Datu morfologikoak determinazio<br />
biokimikoekin bat datoz eta egitura kuaternario gisa, heterodimeroez<br />
osoturiko trimero bat iradokitzen dute. Heterodimero bakoitzak,<br />
gainazaleko azpiunitate batez osoturik egongo litzateke (MW=120 kDa<br />
glikoproteina edo gp120) lotura ez kobalente baten bitartez transmintz<br />
azpiunitate batekin elkarregiten egongo zena (MW=41 kDa glikoproteina<br />
edo gp41).<br />
MA<br />
(p17)<br />
IN<br />
(p32)<br />
gp120<br />
CA gp41<br />
RT<br />
(p66 eta p51)<br />
Gp41<br />
NC p9<br />
4.1. Irudia: Giza immunoeskasiaren birusaren morfologia. A. GIB-1<br />
partikula extrazelulak. 110 nm-tako diametroa aurkezten dituzten birioiak ikus<br />
daitezke. Birioietan kono itxura daukan kapsidea bereizi daiteke. Partikula bakoitza<br />
lipido bigeruza batez inguraturik aurkitzen da. Bigeruzatik at glikoproteinaren<br />
espikulak kanpoalderantz proiektatzen dira. B. Birus-egituraren diagrama. Irudian<br />
glikoproteinak monomero moduan adierazten dira eskema errazteko, baina birioietan<br />
oligomerizatuta daude trimero moduan. MA: matrizearen proteina; CA: kapsidearen<br />
proteina; NC: nukleokapsidearen proteina; gp120: gainazaleko glikoproteinaren azalazpiunitatea;<br />
gp41: gainazaleko glikoproteinaren transmintz azpiunitatea; RT:<br />
131<br />
NC p6
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
alderantzizko transkriptasa; PR: proteasa; IN: integrasa. (Carrasco, L., 1996)tik<br />
egokituta.<br />
Birusaren gainazala kono itxura duen kapside bat inguratzen du<br />
(4.1 irudia). Kapsidearen ardatza birioiaren diametro osoa betetzen du<br />
eta aldi berean birusaren nukleokapsidea inguratzen du. Kapsidea p24<br />
(CA) proteinaz osaturik dago. Birusaren nukleokapsidea NCp9 eta NCp6<br />
(NC) proteinaz osaturik dago. Bi proteina hauek birusaren RNA-ri<br />
asoziaturik daude. Birusaren genoma harizpi bakarreko bi RNA<br />
molekulez osaturik dago. Nukleokapsidearen barnean, p66 eta p51 (RT)<br />
RNA-ren alderantzizko transkripzioan beharrezkoak diren entzimak eta<br />
birusaren genomaren integraziorako beharrezkoa den p32 (IN) entzima<br />
daude. Lipido-bigeruza eta nukleokapsidearen artean p17 (MA) matrizeproteina<br />
aurkitzen da. Proteina hau miristilatua dago amino<br />
muturrean, gantz azido hau lipido-mintzean txertatzeko erabiltzen<br />
duelarik (Luciw, P. A., 1996).<br />
4.1.1.2 BIZI ZIKLOA<br />
GIB-1-aren bizi-zikloa beste erretrobirusen bizi zikloaren<br />
antzekoa da (Weber, J. N. eta Weiss, R. A., 1988; Fields, G. B. eta<br />
Noble, R. L., 1990). Bi etapetan banatzen da, fase goiztiar batean eta<br />
fase berantiar batean (Coffin, J. M., 1996). Fase goiztiarra itu zelularen<br />
ezagupenarekin hasten da, mintzen fusioarekin jarraitzen du eta<br />
birusaren genoma zelula ostalariaren genoman integratzean bukatzen<br />
da. Fase honetan zehar ez da birusaren generik adierazten eta ematen<br />
diren urratsak birioiak daramatzan proteinekin burutzen dira. Fase hau<br />
latentzia aldi batekin osatzen da, kinada batek birusaren adierazpena<br />
eta erreplikazioa pizten duenenean bukatzen dena.<br />
Fase berantiarra, zelularen genoman integraturik dagoen<br />
birusaren RNA-ren transkripzio eta prozesamenduarekin hasten da eta<br />
zelula ostalaritik birioi berrien askapenarekin bukatzen da. Azken fase<br />
honetan birusak erreplikatu ahal izateko zelula ostalariaren tresneria<br />
metabolikoa bahitzen du (4.2 irudia).<br />
GIB-aren zoldura, CD4 errezeptorearen ezagumendu eta<br />
batuketarekin hasten da. Errezeptore hau immunoglobulinen<br />
superfamiliaren partaidea dena, T linfozito laguntzaileetan eta<br />
antigenoak aurkezten dituzten zeluletan (APC) adierazten da (Dalgleish,<br />
A. G., Beverley, P. C. eta lank., 1984; Sattentau, Q. J. eta Weiss, R. A.,<br />
132
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
1988). GIB-1, CD4 errezeptoreak aurkezten ez dituzten zelulak<br />
zoltzeko gaitasuna ere daukanez, birusaren sarrera eraginkorra izan<br />
dadin, ko-errezeptore moduan funtzionatuko <strong>duten</strong> giza faktore zelular<br />
espezifikoen presentzia beharrezkoa da (Kolchinsky, P., Mirzabekov, T.<br />
eta lank., 1999; Alvarez Losada, S., Canto-Nogues, C. eta lank., 2002).<br />
2<br />
1<br />
5<br />
3<br />
4<br />
6<br />
7<br />
4.2. Irudia: GIB-1-aren ziklo infektiboa. 1. Ezagumendu espezifikoa eta<br />
gp120-aren batuketa CD4 errezeptorera eta ko-errezeptoreetara (CXCR4, CCR5) 2.<br />
Birus eta zelula mintzen fusioa. Puntu honetan gp41 proteina paper garrantzitsu bat<br />
jokatzen du. 3. Kapsidearen sarrera zelularen zitoplasmara. 4. Dekapsidazioa eta<br />
birusaren material genetikoaren askapena. 5. Alderantzizko transkriptasaren eraginez<br />
birusaren RNA, harizpi bikoitzeko DNA-ra itzultzen da. 6. Integrasaren eraginez,<br />
probirusa sortzen da. 7. Probirusa zelularen genoma izango balitz bezala<br />
transkribatzen da, eta birusaren proteinen espresiorako erabiltzen da, birioi berrien<br />
sorrerarako beharrezkoak diren osagaiak eratuz. 8. Env proteinaren itzulpena eta<br />
garraioa zelula-mintzera. 9. Gag eta Gag-Pol proteinen itzulpena eta mihiztadura<br />
zelula mintzean. 10. Oraindik heldugabe dauden birioi berrien gemazio bidezko<br />
9<br />
8<br />
11<br />
10<br />
133
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
irteera. 11. Birus proteasen eraginez birioiaren heltze-prozesua. (Freed, E. O.<br />
eta Mouland, A. J., 2006)-etik egokitua.<br />
4.1.1.3. GIB-aren GLIKOPROTEINAREN EGITURA ETA<br />
FUNTZIOA<br />
Gainazaleko Env glikoproteina (gp160) 160 kDa-etako aitzindari<br />
moduan sintetizatzen da erretikulu endoplasmatikoan. Proteina hau<br />
Golgi aparailuraino garraiatzen da eta bertan glikosilatzen da. Aitzindari<br />
hau behin gainazalean dagoela, konbertasa zelular baten eraginez<br />
gp120 eta gp41 azpiunitateetan proteolizatzen da. Gainazaleko gp120<br />
azpiunitatea, tropismo zelularra determinatzen duena da (Choe, H.,<br />
Farzan, M. eta lank., 1996; Trkola, A., Purtscher, M. eta lank., 1996;<br />
Wu, L., Gerard, N. P. eta lank., 1996), eta gp41 transmintz azpiunitatea,<br />
zelula mintza eta birusaren mintzaren arteko fusioa sustatzen duena<br />
da. Bi azpiunitate hauek lotura ez-kobalenteen bitartez elkartzen dira<br />
eta heterodimeroen trimero moduan antolatzen dira (Freed, E. O., 2001)<br />
(4.3 irudia).<br />
Glikosilazio<br />
lekuak<br />
Gp120<br />
Fusio peptidoa<br />
zitoplasma<br />
Gp41<br />
Transmintz<br />
domeinua<br />
V3 bigizta<br />
CD4 batura<br />
lekua<br />
4.3 Irudia: Gainazaleko gp120 eta gp41 proteinen adierazpen grafikoa.<br />
Irudian gp120-gp41 konplexua zehaztasunez adierazten da. Gp41 proteinaren<br />
karboxilo terminala birusaren zitoplasman sarturik, eta fusio peptidoa proteinaren<br />
134
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
alderdi amino terminalean kokatua adierazten dira. Gp120-ak, CD4<br />
errezeptorea batzen duen tokia adierazten da. V3 bigizta ikusgai aurkitzen da, gp120<br />
proteina ko-errezeptoreekin elkartu ahal izateko.<br />
4.1.1.3.1. gp41: SUBUNITATE INTEGRALA<br />
Gp160 proteinaren aktibitate fusogenikoa gp41 transmintz<br />
azpiunitatearen baitan aurkitzen da. Proteina honen sekuentziaren<br />
alderdi amino terminala oso hidrofobikoa eta glizinetan aberatsa da,<br />
ezinbestekoa delarik fusio prozesua eman dadin (Gallaher, W. R., 1987;<br />
Chan, D. C. eta Kim, P. S., 1998). Honengatik “fusio peptidoa” deitua<br />
izan da (FP 4.4 irudian).<br />
Gp41 proteinak, bere sekuentzian birritan errepikatzen diren bi<br />
erregio aurkezten ditu. Erregio hauek birritan errepikatzen diren 7<br />
aminoazido zatikiz osaturik daude. Zatiki hauek lehenengo eta<br />
laugarren posizioetan hondar apolarrak aurkezten dituzte, helize<br />
superbiribilkatuak eratzeko gaitasuna dutelarik (Delwart, E. L.,<br />
Mosialos, G. eta lank., 1990). Sekuentziaren amino mutur terminaletik<br />
gertuen dagoen erregio errepikakorra (HN edo “leuzinen kremailera” ere<br />
deitu izan dena), fusio peptidotik hurbil aurkitzen den bitartean, Cterminaletik<br />
hurbil dagoena (HC) transmintz domeinuaren aurretik<br />
kokatzen da (4.4 irudia). Bi erregioak, bi zisteina dituen bigizta baten<br />
bidez konektaturik daude.<br />
Gp41 proteina, birioi askeetan bi konformazioetan existituko<br />
litzateke: zolduriko zelulatik gemazioaz askaturiko birioi askeetan<br />
dagoena, natiboa, eta fusioa eman ostean agertuko litzatekeena.<br />
Proteina honen konformazio natiboa metaegonkorra izango litzateke eta<br />
gp120 errezeptorearekin batu ostean bere konformazioa aldatuko luke,<br />
ikuspegi energetikotik egitura faboragarriago bat hartzeko. Fusioa<br />
birtolespen prozesuarekin batera eman behar dela postulatzen da.<br />
Gp41 kanpo domeinuaren egitura egonkorrena (fusioa eman ostekoa), X<br />
izpien bidezko kristalografiarekin zenbait taldek determinatu dute<br />
(Chan, D. C., Fass, D. eta lank., 1997; Weissenhorn, W., Dessen, A. eta<br />
lank., 1997). Analisi hauek, N peptidoek coiled-coil trimeriko bat eratzen<br />
<strong>duten</strong>arekin bat datoz. C peptidoek, coiled-coil trimerikoaren<br />
kanpoaldetik paketatzen dituzten hiru helize osatzen dituzte. HN eta HC<br />
helizeen orientazioa antiparaleloa denez beraien karboxilo eta amino<br />
muturrak konplexuaren alde berdinean aurkituko dira. C helizeak eta N<br />
helizeak hondar hidrofobikoen bitartez elkarrekiten dute. Hondar<br />
135
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
hidrofobiko hauek oso kontserbaturik daude eta coiled-coil<br />
trimeriko nagusian aurkitzen diren hiru ildasketetan kokatzen dira.<br />
Egitura hau beste birusen gainazaleko proteinen egiturarekin<br />
konparatzen badugu, adibidez Influenza birusaren hemaglutininarekin<br />
(Bullough, P. A., Hughson, F. M. eta lank., 1994), Moloney leuzemiaren<br />
birusaren gainazaleko proteinarekin (Fass, D., Harrison, S. C. eta lank.,<br />
1996) edo Ebola birusaren proteinarekin (Weissenhorn, W., Dessen, A.<br />
eta lank., 1997) antzekotasun ugari daudela ikus daiteke. Beraz, gp41<br />
proteinarentzat determinatu den egituran, mintzen fusioarekin<br />
zerikusia duen motibo orokor bat dagoela iradokitzen da.<br />
4.4. Irudia: gp41 proteinaren kanpo domeinuaren eskema eta X izpien<br />
difrakzioaren bidez lortu den nukleoaren egitura tridimentsionala. Egitura<br />
primarioan fusio peptidoa (FP), urkilaren parte den leuzina eta isoleuzinetan aberatsa<br />
den erregioa (HN), bigarren erregio helikoidala agertzen da (HC), pretransmintz<br />
erregioa (preTM) eta transmintz domeinuaren (TMD) kokapena adierazi dira.<br />
Azpialdeko irudian, X izpien difrakzioaren bidez ebatzia izan den gp41 proteinaren<br />
trimeroa. N helizeak coiled-coil batean taldekatzen dira eta C helizeak, antiparaleloki<br />
kokatuta, inguratzen dituzte, (Weissenhorn, W., Dessen, A. eta lank., 1997).<br />
4.1.1.3.2. TRANSMINTZ-AURREKO SEKUENTZIA<br />
136
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
transmintzaren aurreko erregioa (pretransmintza edo<br />
preTM) gp41 proteinaren 664-683 hondarren artean kokatua dago.<br />
Hasiera batean preTM sekuentzia Wimley eta White-k (1996) garaturiko<br />
hidrofobizitate eskalekin mugatu zen (Suarez, T., Nir, S. eta lank.,<br />
2000). Geroago esperimentalki frogatu zen: i) Konformazio helikoidala<br />
hartzen duela, mintzekin elkarrekiteko eta mintzak desegonkortzeko<br />
joera daukalarik (Nieva, J. L. eta Suarez, T., 2000; Suarez, T., Gallaher,<br />
W. R. eta lank., 2000; Suarez, T., Nir, S. eta lank., 2000; Schibli, D. J.,<br />
Montelaro, R. C. eta lank., 2001) ii) Aktibitate hau kolesterola eta<br />
esfingomielinaren eraginez modulatua dagoela (Saez-Cirion, A., Nir, S.<br />
eta lank., 2002; Epand, R. F., Sayer, B. G. eta lank., 2005) eta iii)<br />
Soluzioan eta mintzaren gainazalean oligomerizatzeko ahalmena<br />
aurkezten duela.<br />
PreTM alderdirako zenbait funtzio proposatu dira. Zenbait<br />
autorek, lotura bigizta malgu bat bezala ikusten dute, fusio prozesua<br />
egoki eman dadin, fusio proteina ondo orientatzeko ahalmena daukana<br />
(Dimitrov, A. S., Rawat, S. S. eta lank., 2003). Beste autore batzuk<br />
mintzak desengonkortzen eta barreiatzen funtzio aktiboak dituela<br />
proposatzen dute, mintzen arteko ainguraleku moduan jokatuz edo<br />
zelula-mintzaren eta birus-mintzaren arteko lipidoen elkartrukea<br />
baimenduz (Suarez, T., Gallaher, W. R. eta lank., 2000; Suarez, T., Nir,<br />
S. eta lank., 2000; Saez-Cirion, A. eta Nieva, J. L., 2002; Saez-Cirion,<br />
A., Nir, S. eta lank., 2002; Vincent, N., Genin, C. eta lank., 2002;<br />
Epand, R. M., Sayer, B. G. eta lank., 2003; Epand, R. F., Sayer, B. G.<br />
eta lank., 2005).<br />
Zenbait taldek SIV-arekin egindako ikasketetatik, preTM-ak<br />
coiled-coil-a luzatuko zuela ondorioztatzen dute, modu honetan helize<br />
sorta egonkortuko litzateke eta fusioa emateko beharrezkoa den energi<br />
transdukzioa egonkortuko zen ere (Lay, C. S., Wilson, K. A. eta lank.,<br />
2004). Salzwedel eta lankideek, Env trimeroen egitura mantentzeko<br />
balio duela defendatzen dute, modu honetan trimero kopia egonkor bat<br />
mantenduz eta birusaren gainazalaren egonkortasuna mantenduz<br />
(Salzwedel, K., West, J. T. eta lank., 1999). Azkenik, zenbait talde bere<br />
antigenizitate eta immunogeneizitate baxuek fusioan daukaten paper<br />
zuzenaren ebidentzia direla uste dute, hartzen duen<br />
antolamenduarekin, antigorputzek erregioa eskuratzeko zail daukate,<br />
antigorputz neutralizatzaileen sorrera murrizten delarik (Nyambi, P. N.,<br />
Mbah, H. A. eta lank., 2000; Zwick, M. B., Labrijn, A. F. eta lank., 2001;<br />
Burrer, R., Haessig-Einius, S. eta lank., 2005; Haynes, B. F., Fleming,<br />
J. eta lank., 2005; Sanchez-Martinez, S., Lorizate, M. eta lank., 2006).<br />
Badirudi preTM sekuentzia heltze prozesuan ez dela beharrezkoa, baina<br />
137
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
bai derrigorrezkoa, fusioa gertatzeko eta glikoproteina birioiaren<br />
gainazalean txertatzeko (Salzwedel, K., West, J. T. eta lank., 1999).<br />
PreTM sekuentziari egin zaizkion RMN azterketak<br />
dodezilfosfokolina mizelen presentzian, <strong>sekuentziak</strong> egitura αhelikoidala<br />
aurkezten duela ondorioztatzen dute (Schibli, D. J.,<br />
Montelaro, R. C. eta lank., 2001) (4.5 irudia). PreTM sekuentziaren<br />
karboxilo terminala transmintz domeinura loturik dagoenez α−helize<br />
egitura ere aurkeztu beharko luke, transmintz domeinuetara gertu<br />
dauden <strong>sekuentziak</strong> α-helize moduan egonkorragoak direla ikusi baita<br />
(Bechinger, B., 2000).<br />
Zenbait autoreek, bere baitan hartzen duen preTM sekuentziari<br />
eta alboan dagoen eta 2F5 antigorputza ezagutzen duen sekuentzia<br />
zatiari MPER (ingelesetik, “membrane-proximal external region”) deritze<br />
(4.5 irudia). Azken urteetan antigorputzei baturik luzera ezberdineko<br />
MPER sekuentzien egiturak ebatzi dira. Nahiz eta antigorputzek<br />
ezagutzen dituzten sekuentzia natiboak ezezagunak izan, antigorputzak<br />
molde moduan erabili daitezke, egitura tridimentsional garrantzitsuak<br />
hartzen dituzten epitopoei batzen baitira. Pai eta lankideek (2000), 2F5<br />
antigorputza ELDKWAS sekuentziari loturik kristalizatu zuten (Pai, E.<br />
F., Klein, M. H. eta lank., 2000). Geroago Ofek eta lankideek (2004) 2F5<br />
konplexua EKNEQELLELDKWASLW 17-meroari loturik kristalizatu<br />
zuten (Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004). Bi azterketa hauetan<br />
ezagutzera ematen da MPER-aren egitura ez dela α-helikoidal, baizik eta<br />
egitura luzatua dela, DKW korean mota 1-eko β-bira bat daukana (Pai,<br />
E. F., Klein, M. H. eta lank., 2000; Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004);<br />
gainera, DKW sekuentzia batura gunean ezkututa aurkitzen da, eta<br />
beraz, fusioa gertatu aurreko aldian eskuragarri egongo litzateke. Orain<br />
dela oso gutxi 4E10 antigorputza WNWFDITNW peptidoari lotuta<br />
kristalizatu da ere. Kasu honetan, <strong>sekuentziak</strong> bira txiki bat (N671-<br />
W672) duen α-helize konformazioa hartzen du (Cardoso, R. M., Zwick,<br />
M. B. eta lank., 2005). Kristalizatu zen egituraren arabera W672<br />
hondarra 4E10-ren paratopoaz estalirik aurkitzen da, beraz gp41-ean<br />
ezagutzen den egituran eskuragarri egon beharko litzateke. Kontuan<br />
izanik hondar hidrofobikoak ingurune urtsu bateri agerian egoteak<br />
gastu energetiko altuegia dakarrela, sekuentzia honek env-aren beste<br />
alderdiren batekin elkarrekiten egon beharko litzatekeela iradokitzen<br />
da.<br />
138
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
4.5. Irudia: MPER alderdiarekin gainezartzen diren zenbait erregioen<br />
egiturak. GIB-1 birusaren gp41 proteinaren adierazpen eskematikoa. Fusio peptidoa<br />
(FP), errepikatzen diren C eta N terminal heptadak (NHR eta CHR), MPER sekuentzia<br />
(gp160-ren 660-683 hondarrak), transmintz domeinua (TMD) eta zitoplasma aldeko<br />
domeinua adierazten dira. Sekuentzia ezberdinen lerrokadurak adierazten dira, “Los<br />
Alamos”-eko data basean agertzen diren moduan<br />
(http://www.hiv.lanl.gov/content/hivdb/CONSENSUS/CONSENSUS_TOOL/consensus.html).<br />
Asterisko baten bidez<br />
markaturik dauden hondarrak 2F5 eta 4E10 antigorputzen ezagumendurako<br />
beharrezkoak dira (Zwick, M. B., Jensen, R. eta lank., 2005). Irudi honetan HC<br />
erregioaren egitura aurkezten da (horiz margotuta) eta 2F5 epitopoaren N-terminaleko<br />
zenbait hondar baita ere (arrosaz). Beheko aldean, NMR-z eta dodezilfosfokolinaren<br />
presentzian ebatzi den, gp160 proteinaren 666-683 hondarrek mugaturiko erregioa<br />
azaltzen da (Schibli, D. J., Montelaro, R. C. eta lank., 2001). 2F5 eta 4E10 epitopoen<br />
hondarrak arrosaz eta urdinez, hurrenez-hurren, margoturik daude. X izpien<br />
139
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
difrakzioaren bidez ebatzi diren <strong>sekuentziak</strong> Fab 2F5 eta 4E10-ei baturik,<br />
(beheko aldean, ezkerraldean eta eskuinaldean, hurrenez-hurren (Ofek, G., Tang, M.<br />
eta lank., 2004; Cardoso, R. M., Zwick, M. B. eta lank., 2005). (irudia Zwick, M.B.,<br />
2005 hartua izan da).<br />
4.1.1.4. GIB-ZELULA FUSIO-MEKANISMOA<br />
Chan eta Kim (1998) gp41-ak induzituriko mintz fusiorentzat<br />
modelo bat iradokitzen dute (4.6 irudia), funtsezko aspektuetan<br />
gainazaladun beste birusei aplikatu daitekeena (Hughson, F. M., 1997;<br />
Tan, K., Liu, J. eta lank., 1997; Weissenhorn, W., Dessen, A. eta lank.,<br />
1997). Nagusitzen den dogmarekin ados, gp41 proteinaren konformazio<br />
natiboan fusio peptidoa env konplexuaren barnealdean ezkutaturik<br />
egongo litzateke (4.6 irudia). Gp41-ren fusio aurreko egitura gp120rekin<br />
elkarrekiterakoan egonkortzen da. Errezeptore eta koerrezeptorearekin<br />
batzerakoan gp120-ak aldaketa konformazional bat<br />
pairatzen du, gp120-gp41 konplexuaren arteko elkarrekintzetan<br />
eraginak dituena (4.1 irudia). Konplexuan gertatzen diren aldaketa<br />
hauek gp41 aktibatzen dute eta prehairpin deritzon bitartekaria eratzen<br />
da. Bitartekari honen izatea hipotetikoa da, baina bere existentzia<br />
ondorioztatu daiteke, gp41-a HC-tik eratorriak diren peptidoen<br />
inhibiziora sentikorra delako. Fusio peptidoaren aurkezpena eta<br />
jarraian itu mintzera ematen den <strong>txertaketa</strong>, bitartekari honen<br />
agerpenarekin lotuta gertatzen dela postulatu da. "Pre-hairpin" egoeran<br />
HC eta HN domeinuak disoziaturik mantentzen dira. Bi domeinu hauen<br />
elkarketa termodinamikoki egonkorra den “hairpin” egitura edo 6 helize<br />
sortaren (6-HB) sorrera dakar.<br />
Egitura honen agerpenak zelula-mintza eta birusaren mintzaren<br />
arteko fusioa dakar. Bi mintzen arteko aposizioa nola gertatzen den ez<br />
dago oso argi, baina proteinaren trimeroen elkarketak fusio poroaren<br />
eraketan zerikusia daukala uste da. Fusio prozesua gertatu denean,<br />
fusio peptidoa eta gp41-ren transmintz zatikia mintz berdinean<br />
kokatzen dira.<br />
140
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
4.6. Irudia: GIB-1-ak eragindako fusioaren eskema. Prozesua, zelula<br />
mintzeko CD4 errezeptorearen ezagumenduarekin hasten da. Geroago koerrezeptorearen<br />
ezagumendua ematen da eta birusaren gp41 proteinak bere fusio<br />
peptidoa mintz zelularrean txertatzen du. Prozesu honek birusak bi mintzak gertu<br />
izatea baimentzen du.<br />
4.1.1.5. ANTIGORPUTZ NEUTRALIZATZAILEAK<br />
Birioiaren gainazalean dauden espikulak funtzio bikoitza<br />
daukate: alde batetik, itu zelulan sarrera baimentzea eta bestetik, zelula<br />
ostalariaren erantzun immunetik ihes egiteko tresna izatea.<br />
Antigorputzek, birusaren funtzio-egiturei batzen direnean birusaren<br />
sarrera inhibitu dezakete. GIB-1 birusak bere eboluzioan zehar erregio<br />
kontserbatuenak eta sentikorrenak ezkutuan bi arrazoiengatik<br />
mantendu ditu: lehenengoa, epitopo kontserbatuenak antigorputzen<br />
garapena eragin ez dezaten (immunogeneizitate baxua), eta bigarrena,<br />
jadanik sorturiko antigorputzek epitopo kontserbatu hauek ezagutu ez<br />
ditzaten (antigenizitate baxua). GIB-1 birusak izan ditzazkeen etsairik<br />
eraginkorrenak antigorputz neutralizatzaileak dira, sistema immunetik<br />
ihes egiteko erregio kontserbatuetan mutazioak eragitea nahiko zaila<br />
baita.<br />
141
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
Gp41-ak hartzen duen egitura fusioa gertatu ostean egonkorra,<br />
errepikakorra eta oso immunogenikoa da. Baina azkenengo fase<br />
honetan fusio-bitartekariak aurkezten duen egitura ezberdina da, eta<br />
beraz eratzen diren antigorputzak ezin dira batu eta ezin dute fusioaren<br />
bitartekari hau inhibitu. Gp41 proteina antigeno moduan ezagutzen<br />
<strong>duten</strong> antigorputz neutralizatzaileak preTM-aren sekuentzian aurkitzen<br />
diren sekuentzia linealak ezagutzen dituzte (Binley, J. M., Ditzel, H. J.<br />
eta lank., 1996; Zwick, M. B., Bonnycastle, L. L. eta lank., 2001; Zwick,<br />
M. B., Labrijn, A. F. eta lank., 2001). Nahiz eta ikerketa asko egin diren<br />
gai honen inguruan, ez da aurkitu epitopo hauek imitatzen dituzten eta<br />
erantzun neutralizatzaile eraginkorra sortarazten <strong>duten</strong><br />
immunogenorik.<br />
Antza denez, infekzio naturalean zehar edo immunizazio baten<br />
ostean, sortarazten diren antigorputz gehienak ez-neutralizatzaileak<br />
dira, neutralizatzaileak direnak oso kantitate baxuetan aurkitzen<br />
direlarik (Xu, J. Y., Gorny, M. K. eta lank., 1991; Binley, J. M., Ditzel,<br />
H. J. eta lank., 1996; Earl, P. L., Broder, C. C. eta lank., 1997). Gainera<br />
birusaren gainazalaren alderdi immunogenikoen kontra sortzen diren<br />
antigorputzak oso aldakorrak dira eta gizabanako bakoitzaren seroa<br />
blokeatzeko eredua, beste gizabanako batenarekiko oso ezberdina izan<br />
daiteke. Patroi komun baten gabeziak, GIB-1-aren kontrako erantzun<br />
immunea sortaraziko lituzketen antigorputz neutralizatzaileen bilaketa<br />
zailtzen du (Ferrantelli, F., Rasmussen, R. A. eta lank., 2002; Klausner,<br />
R. D., Fauci, A. S. eta lank., 2003; Burton, D. R., Desrosiers, R. C. eta<br />
lank., 2004). Guztiz kontserbaturik mantentzen diren epitopoen kontra<br />
antigorputzak lortzeak, birus espektro oso handia neutralizatu ahal<br />
izatea baimenduko luke, aspektu hau txertoen diseinuan lehentasun<br />
bat delarik.<br />
Hovanessian eta lankideek (2004), emaitza oso positiboak<br />
publikatu dituzte. Beraien datuetan, gp41-ean kabeolina-1 proteinara<br />
(CBD1) batzeko domeinu bat dagoela frogatzen dute (Env-ren 623-631<br />
hondarren artean dagoen WNNMTWMEW sekuentzia). Sekuentzia hau,<br />
helize egitura daukaten bi domeinuak batzen dituen bigiztan aurkitzen<br />
da, eta bere azkenengo lau aminoazidoak C-terminalaren heptada<br />
errepikakorrarekin gainezartzen da. Sekuentzia hau immunogeno gisa<br />
erabiliz, untxietan espektro zabaleko antigorputz neutralizatzaileak<br />
sortzea lortu dute. Badirudi CBD1 eta kabeolina-1 proteinaren artean,<br />
142
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
ziklo birala betetzeko ezinbestekoa den elkarrekintza espezifiko<br />
bat ematen dela, antigorputz hauek elkarrekintza hori saihestuko<br />
lukete eta honen ondorioz infekzio birala (Hovanessian, A. G., Briand, J.<br />
P. eta lank., 2004).<br />
Birioi heldu batean, zelularen errezeptoreetara batu baino lehen,<br />
gp41 azpiunitatea gp120 proteinagatik ezkutaturik aurkitzen da<br />
(Sattentau, Q. J., Zolla-Pazner, S. eta lank., 1995; Zwick, M. B., Komori,<br />
H. K. eta lank., 2004). Behin glikoproteina errezeptoreetara eta koerrezeptoreetara<br />
batu denean zihur aski gp41-a zaurgarriagoa izango<br />
da; dena den, fusioaren bitartekari hau espazialki mugatua egongo da,<br />
bi mintzak oso gertu aurkitzen direlako.<br />
Tesi honetan erabili diren antigorputz monoklonal<br />
neutralizatzaileak 2F5 eta 4E10 izan dira. Katinger eta lankideek<br />
antigorputz hauek MPER erregioaren alboan kokatzen diren epitopo<br />
linealak ezagutzen dituztenaren ideia ezarri zuten. Epitopo hauen<br />
<strong>sekuentziak</strong> ELDKWA (2F5-erako) eta NWF(D/N)IT (4E10-erako) dira,<br />
eta preTM alderdian kokatzen dira. Antigorputz hauek, errezeptore<br />
zelularrarekin ematen den elkarrekintzan eragin gabe, fusioa<br />
inhibitzeko gai dira (Burton, D. R., Desrosiers, R. C. eta lank., 2004).<br />
Epitopoak atzemateko arazo esterikorik ez dagoela ematen du,<br />
antigorputz osoek (IgG-a) Fab-ak baino eraginkortasun handiagorekin<br />
blokeatzen dutelako fusioa (Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004; Zwick,<br />
M. B., Komori, H. K. eta lank., 2004).<br />
Antigorputzen ezagumenduaren testuinguruan, “birusaren<br />
mintzari gertu dagoen kanpoko alderdia” (ingelesetik, “membraneproximal<br />
external region”, MPER) terminoa, bi antigorputzen epitopoak<br />
daramatzan sekuentziarako proposatu da (Zwick, M. B., Wang, M. eta<br />
lank., 2001; Zwick, M. B., Jensen, R. eta lank., 2005).<br />
PreTM sekuentziarekin konparatuz (4.7 irudia), MPER<br />
(2F5preTM) sekuentzia bere amino terminalean luzatuagoa da, bere<br />
baitan Mab2F5-rekiko afinitatea indartzeko hondar gehiago<br />
daramatzalarik (Parker, C. E., Deterding, L. J. eta lank., 2001; Barbato,<br />
G., Bianchi, E. eta lank., 2003).<br />
Birusaren zoldura gainditzen bada antigorputzak MPER alderdira<br />
batzeak hiru gauza inplikatuko lituzke; (i) Gp41-aren aldaketa<br />
konformazionala gertatzen denean, bere pretransmintz alderdia<br />
partzialki agerian geratu beharko litzateke, (ii) beraz env konplexu<br />
natiboan Mab-entzat eskuragarri agertu beharko litzateke (Sattentau,<br />
Q. J., Zolla-Pazner, S. eta lank., 1995; Zwick, M. B., Wang, M. eta lank.,<br />
143
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
2001), eta (iii) mintzen arteko fusioa gertatzeko guztiz<br />
beharrezkoa den erregio bat dela (Salzwedel, K., West, J. T. eta lank.,<br />
1999; Suarez, T., Gallaher, W. R. eta lank., 2000; Zwick, M. B., Wang,<br />
M. eta lank., 2001; Saez-Cirion, A., Arrondo, J. L. eta lank., 2003).<br />
Gero eta ebidentzia gehiago daude, Mab2F5 eta Mab4E10-ak<br />
ekintza immunologikoa betetzeko, lipidoekin batu behar direla<br />
iradokitzen <strong>duten</strong>ak. Lehenengoa, gp41 errekonbinanteak lipido<br />
hutsezko mintzekin inkubatuz gero, Mab2F5 eta 4E10-ren ezagupena<br />
areagotzen duela ikusi da (Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004).<br />
Bigarrena, analisi molekularrak (Kunert, R., Ruker, F. eta lank., 1998;<br />
Kunert, R., Wolbank, S. eta lank., 2004), eta Mab 2F5 eta 4E10-en<br />
zatikiak (Fabs), epitopoekin loturik, lorturiko kristal egituraren<br />
erresoluzioak (Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004; Cardoso, R. M.,<br />
Zwick, M. B. eta lank., 2005) kate astunetan CDR3 bigizta luzeen<br />
presentzia adierazten dutela. CDR3 loop luze hauetan hondar<br />
aromatikoak eta hidrofobikoak aurkitzen dira, hondar hauek,<br />
epitopoekin ez dituzte kontaktu zuzenik ezartzen, beraz, mintzarekin<br />
kontaktuak ezarri beharko dituztenaren posibilitatea dago. Dena den,<br />
eta behintzat 2F5-aren kasuan, nahiz eta bigizta hauek antigenoarekin<br />
elkarrekintza espezifikoak ez izan, antigorputzaren aktibitaterako guztiz<br />
beharrezkoak direla ikusi da (Zwick, M. B., Komori, H. K. eta lank.,<br />
2004). Mab4E10-ren kasuan aldiz, bigizta honen funtzioa ez da<br />
determinatu, baina mutagenesi saioak egiten ari dira bigizta honen<br />
garrantzia aztertzeko (Cardoso, R. M., Zwick, M. B. eta lank., 2005).<br />
Hirugarrena, Haynes eta lankideek, (Haynes, B. F., Fleming, J. eta<br />
lank., 2005) orain dela gutxi ikusi dute Mab2F5 eta 4E10-ak<br />
kardiolipina (CL) fosfolipidoa espezifikoki ezagutzen dutela, MPER-eko<br />
epitopoak ezagutzeko erabiltzen dituzten gune berdinak erabiliz. Anti-<br />
CL antigorputzak gizakietan gaixotasun autoimmuneei lotuta daude,<br />
GIB-ak erantzun immuneari ihes egiteko estrategia moduan CL-a<br />
emulatzen <strong>duten</strong> MPER epitopoak garatu dituenaren posibilitatea<br />
handitzen delarik.<br />
Antigorputzak, beraien epitopoei baturik, datu konformazional<br />
ugari egon arren, frogatu diren immunogeno gehienak (kristal-egitura<br />
imitatzen zutenak ere frogatu direlarik), erantzun neutralizatzaileen<br />
sorreran kale egin dute (Muster, T., Guinea, R. eta lank., 1994; Liang,<br />
X., Munshi, S. eta lank., 1999; Coeffier, E., Clement, J. M. eta lank.,<br />
2000; Marusic, C., Rizza, P. eta lank., 2001; Joyce, J. G., Hurni, W. M.<br />
eta lank., 2002; Zhang, M. Y., Xiao, X. eta lank., 2004; Ho, J., Uger, R.<br />
A. eta lank., 2005). Kasu gehienetan immunogenoa ezagutzen <strong>duten</strong><br />
antigorputz ez neutralizatzaileak lortu direlarik. Zwick-en ustez, sortzen<br />
144
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
diren antigorputz ez-neutralizatzaile hauek, <strong>sekuentziak</strong><br />
pairatzen dituen aberrazioek eragindakoak dira (Zwick, M. B., Jensen,<br />
R. eta lank., 2005).<br />
Tesi honetan, liposometan oinarrituriko ELISA teknika berri bat<br />
erabiliz, MPER erregioa ordezkatzen duen peptidoa (2F5preTM, 2F5 eta<br />
4E10 antigorputzak ezagutzen dituzten epitopoen <strong>sekuentziak</strong> barne<br />
dituena), erregio honen kontrako Mab-ak, guztiak, fosfolipidoez<br />
osoturiko mintzen interfaseekin elkartzeko berezko ahalmena daukate.<br />
Are gehiago, emaitzek iradokitzen dute, Mab2F5-ak bere epitopoa<br />
afinitate gutxiagorekin ezagutzen duela mintzaren interfasean<br />
murgildurik dagoenean. Bestalde, Mab4E10-ak bere epitopoa bigeruza<br />
lipidikoaren ingurunearekin zerikusirik ez daukalarik batzen du.<br />
Mab4E10-ak eraginkorki fosfolipido osaketa ezberdineko bigeruzekin<br />
elkarrekiten duen bitartean, Mab2F5-ak CL-rekiko lehentasuna<br />
aurkezten du, bai mintzean murgildurik dauden espezieekiko, bai<br />
soluzioan dauden espezieekiko.<br />
Emaitza hauek, bi Mab-ak beraien epitopoak mintzaren<br />
interfasean ezagutzeko, bi moldaera mekanismo ezberdin garatu<br />
dituztela iradokitzen dute. Mintzak ere paper garrantzitsu bat jokatzen<br />
du antigorputz hauen erantzun neutralizatzailean, gp41-aren MPER<br />
erregio honen aurka.<br />
4.2. ERABILITAKO MATERIALAK, TEKNIKA<br />
ESPERIMENTALAK ETA PROTOKOLOEN<br />
SAILKAPENA<br />
4.2.1. PEPTIDO SEKUENTZIAK ETA<br />
ANTIGORPUTZAK<br />
NEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK (2F5preTM) sekuentzia,<br />
bere C karboxiamida terminaletik hasita, Fmoc fase solido sintesiaren<br />
bidez sintetizatua izan zen eta HPLC-z purifikatua, Pompeu-Fabra-ko<br />
Unibertsitatean (ikusi tesiaren 2.1.1 atala). Peptido soluzioak<br />
dimetilsulfoxidoan (DMSO, gradu espektroskopikoa) prestatuak izan<br />
ziren, eta kontzentrazioak azido bizintzoninikoaren mikrosaioarekin<br />
(BCA, Pierce, Rockford, IL, USA) determinatuak izan ziren.<br />
145
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
Hibridomak espresatzen dituzten Mab2F5 eta Mab4E10<br />
antigorputz neutralizatzaileak, IgG1 birkonbinatu gisa CHO zeluletan<br />
ekoiztu ziren (Kunert, R., Steinfellner, W. eta lank., 2000). Beroiek<br />
isolatzeko GIB-1-rekin infektaturik dauden, baina sintomarik aurkezten<br />
ez dituzten gaixoen odol-zelula mononuklearrak erabili ziren<br />
(Buchacher, A., Predl, R. eta lank., 1994).<br />
CHO-Env lerro zelularrak eta HeLaT4 + lerro zelularrak NIH AIDS<br />
Research and Reference Reagent Program-etik (ARRRP) lortu ziren.<br />
4.2.2. ELISA<br />
Kapitulu honetan erabili diren ELISA teknika guztiak 2.6 atalean<br />
adierazi den moduan burutu dira.<br />
4.2.2.1. ELISA PROTOKOLO OROKORRA<br />
-2F5preTM fosfato tanpoian (PBS) disolbatu zen eta C96 Maxisorp<br />
mikroplaterretan (100 µl/putzuko) (Nunc, Denmark), 1 µM-eko<br />
kontzentrazioan landatu zen.<br />
-Antigorputzekin inkubatu baino lehen, mikroplaterrak 2 orduz<br />
blokeatu ziren %3 BSA PBS-an disolbaturik.<br />
4.2.2.2. LIPOSOMETAN OINARRITURIKO ELISA<br />
PROTOKOLOA<br />
-100 µΜ PC besikulak estreptabidinaz gaineztaturiko<br />
mikroplaterretan (Nunc, Denmark) landatu ziren.<br />
-Liposomak eratzeko, lipidoak tanpoian barreiatu ziren, eta<br />
sonikatu egin ziren. Liposomak, %1 biotina-PE-z markatu ziren.<br />
4.2.2.3. LEHIAKETA ELISA PROTOKOLOA<br />
-Batura soluzioan eman zedin, antigorputzarekin lehiatu zuten<br />
epitopo edo besikulen bolumen zehatzak plaketara gehitu ziren.<br />
146
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
-Hiru protokoloetan, “background” balioak, aldiberean egindako<br />
mab gabeko saioekin lortu ziren.<br />
-Mab-en batura, fosfatasa alkalinoa konjugatua daukan giza<br />
kontrako ahuntz immunoglobulinarekin (Pierce, Rockford, IL, USA) lortu<br />
zen (1:10000 erlazioan).<br />
-P-nitrofenilo fosfatoak (Sigma, St. Louis, MO, USA) erreakzioa<br />
kolorea hartzeko erabili zen.<br />
-Xurgapena, 405 nm-tan neurtu zen Synergy HT microplate reader<br />
aparailuan (Bio-TEK Instruments Inc., VT, USA).<br />
Itxurazko afinitate konstatea (K) lortzeko, batura balore<br />
maximoen erdira estrapolatu ziren. Batura balore hauek, balio<br />
esperimentalak bigarren kapituluan agertzen den (10) ekuaziora doituz<br />
lortu ziren.<br />
Abs = Absmax=[MAb]/(K+[MAb])<br />
4.2.3. FLUORESZENTZIA BIDEZ EGINDAKO<br />
NEURKETAK<br />
Kapitulu honetan fluoreszentzia bidez bi saio burutu ziren,<br />
2.5.1.4 eta 2.5.1.3 ataletan adierazi direnak hurrenez-hurren.<br />
Triptofanoaren igorpen-fluoreszentziaren aldaketa jarraituz,<br />
peptidoen banaketa mintzetan aztertu zen. Espektro zuzenduak SLM<br />
Aminco espektrofluorimetro batean jaso ziren.<br />
-Espektrofluorimetroa irabiagailu magnetikoa eta kubeta berotzeko<br />
bainua darama.<br />
-Kitzikatzeko uhin luzera, 280 nm-tan finkatu zen eta igorpen uhin<br />
luzera 350 nm-tan. Slit-en zabalera 5 nm-tan finkatu zen bi kasutarako.<br />
-Banaketa-kurbak, lipido kontzentrazioaren titulazio bat eginez<br />
ematen den Trp-ren igorpen fluoreszentziaren aldaketarekin,<br />
zenbatetsiak izan ziren.<br />
147
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
-Seinalea diluzioarekin zuzendua izan zen eta barneko<br />
filtroaren zuzenketa NATA Trp-aren analogoarekin egin zen. NATA ez da<br />
mintzetara banatzen.<br />
-Mol frakzioaren itxurazko banaketa koefizientea, Kx-a, balio<br />
esperimentalak bigarren kapituluko (4) ekuaziora doituz kalkulatua izan<br />
zen.<br />
[(Fmax/F0)-1]x[L]<br />
F/F0 = 1 + --------------------<br />
K+[L]<br />
Mintzaren interfasera ematen den barneraketa aztertzeko,<br />
peptidoaren Trp-tik, gainazalean dagoen d-DHPE zundara ematen den<br />
energi transferentzia erabili zen (Ruiz-Arguello, M. B., Goni, F. M. eta<br />
lank., 1998) erreferentzian egiten den moduan.<br />
-Laburbilduz, %6 d-DHPE mol zunda, besikulen osaketan gehitu<br />
zen eta zundaren igorpen espektroak jaso ziren (igorpen uhin luzera<br />
maximoa 510 nm izanik).<br />
-Kitzikatzeko erabili zen uhin-luzera Trp-arena izan zen (280 nm).<br />
-Lipido-peptido nahasturak 30 minutuz eta 37 ºC-tan inkubatu<br />
ziren espektroak jaso baino lehen.<br />
-Energi transferentziaren eraginkortasuna (E) bigarren kapituluko<br />
(3)-en ekuazioaren bitartez kalkulatu zen.<br />
E = 1- (QT / Q0)<br />
4.2.4. SINTZITIO-ERAKETAREN INHIBIZIOA<br />
Sintzitioen inhibizio saioa (Muster, T., Steindl, F. eta lank., 1993)<br />
antigorputzen batura gp41 natiboa gainazalean espresatzen dituzten<br />
zelulekin egin zen.<br />
-Saioa CHO-Env zelulekin (GIB HXB2 env genea espresatzen<br />
dituzte) eta HeLaT4 + zelulak (zelula hauek CXCR4 espresatzen dituzte<br />
gainazalean) egin zen<br />
148
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
-CHO-Env eta HeLaT4 + zelulak batera erein ziren, mota<br />
bakoitzetik 35.000 zelula/putzu 96 putzuetako plaketan.<br />
-MSX gabeko GMEM gehitzen zaie eta 6 orduz inkubatu ziren 37<br />
ºC-tan eta CO2 inkubadore batean.<br />
-Camedia C-5050 kamara digital batez (Olympus-Europe,<br />
Hamburg, Germany) ekipatuta dagoen Olympus CKX41 mikroskopio<br />
alderantzikatu (Olympus-Europe, Hamburg, Germany) batekin eta fase<br />
kontrastea erabiliz sintzitioak zenbatu ziren.<br />
-Sintzitioen inhibizio saioan, Mab-ak CHO-Env zelulekin 90 minutuz<br />
inkubatuz ziren. Inkubazioa CHO-Env zelulak, HeLaT4 + zelulekin<br />
nahastu baino lehen egin zen.<br />
-Ondoren, lehen bezala, HeLaT4 zelulak erein ziren eta 6 orduz<br />
elkarrekin inkubatu ziren.<br />
-Inhibizio efektuaren itzulpena ikusteko, CHO-Env zelulei Mab-ak<br />
gehitu baino lehen, hauek peptido edo fosfolipidoekin 90 minutuz<br />
inkubatu ziren giro tenperaturan.<br />
-Ondoren HelaT4 zelulak gehitu ziren eta CHO-Env zelulekin 6<br />
orduz inkubatu ziren.<br />
4.3. EMAITZAK<br />
4.3.1. IGARPENAK MINTZ-BANAKETARAKO<br />
<strong>Mintzetan</strong> txertatzeko joera aurkezten <strong>duten</strong> gp41 erregioak<br />
detektatzeko eta mintzaren interfasean ematen den proteinaren<br />
tolesduraren karakterizazioa (Suarez, T., Gallaher, W. R. eta lank.,<br />
2000; Saez-Cirion, A., Nir, S. eta lank., 2002; Saez-Cirion, A., Arrondo,<br />
J. L. eta lank., 2003) aztertzeko aurreikuspen tresna berriak proposatu<br />
dira. Tresna hauek, aminoazido bakoitza, ura-oktanolera eta ura–<br />
mintzaren interfasera, transferitzean askatzen den energi askean<br />
oinarriturik daude (Wimley, W. C. eta White, S. H., 1996; Hessa, T.,<br />
Kim, H. eta lank., 2005).<br />
Interfaseko hidrofobizitate-banaketaren analisiek eta mintzbanaketa<br />
esperimentuek, energi baxuko konfigurazioan preTM erregioa<br />
mintz-interfasearen mailan murgildurik dagoela iradokitzen dute<br />
(Suarez, T., Gallaher, W. R. eta lank., 2000; Saez-Cirion, A., Arrondo, J.<br />
L. eta lank., 2003). 2F5 eta 4E10 epitopo <strong>sekuentziak</strong>, preTM<br />
149
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
erregioaren amino muturrean eta erdialderantz kokaturik daude,<br />
hurrenez-hurren (4.7 irudia). Beraz, Mab2F5 eta Mab4E10<br />
antigorputzek mintzaren interfasean murgilduta egon behar diren<br />
<strong>sekuentziak</strong> ezagutzeko ahalmena dutela pentsa liteke.<br />
4.7. Irudia: 2F5 eta 4E10 epitopo sekuentzien afinitatea mintzinterfaseekiko.<br />
GIB-1 birusaren gp41 proteinan, birusaren mintzetik gertu dagoen<br />
sekuentziaren eta transmintz sekuentziaren interfaseko hidropatia (Ploteatu diren<br />
hondarrak, gp160-aren 656-711 bitartekoak izan dira). Wimley eta White<br />
hidrofobizitate eskalaz hamaika aminoazidotako leihoa erabili da (Suarez, T., Gallaher,<br />
W. R. eta lank., 2000; Cardoso, R. M., Zwick, M. B. eta lank., 2005). Azaltzen den<br />
sekuentzia MPER sekuentzia errepresentatzen duen 2F5preTM peptidoarena da. 2F5<br />
eta 4E10 epitopoen kokapen erlatiboak eta aminoazido <strong>sekuentziak</strong>, gorriz eta berdez<br />
adierazten dira, hurrenez-hurren. Urdinez azaltzen diren hondarrak Suarez eta<br />
150
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
lankideek definituriko preTM domeinuari dagozkie (Suarez, T., Gallaher, W.<br />
R. eta lank., 2000).<br />
4.8. Irudia: 2F5 eta 4E10 antigorputz monoklonalen mintz-interfaseekiko<br />
afinitatea. A) Mab2F5 (gorriz) eta Mab4E10 (berdez) kate astunen batez-besteko<br />
interfaseko hidropatia (balorea zenbat hondar leihorako kalkulatu den erakusten da).<br />
Azalera grisak, CDR-en kokapena erakusteko erabili dira. Kalkuluak 4.7 irudian<br />
azaldu bezala burutu dira. B) Agerian eta mintzarekiko elkarrekintza faboragarriak<br />
151
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
erakusten <strong>duten</strong> hondarren kokapena (urdinez beteriko atomoen espazioak),<br />
2F5 eta 4E10 antigorputzen Fab-etan (bigizta grisak). Baturiko epitopoen Cα<br />
eskeletoak erakutsi dira gorriz (2F5) eta berdez (4E10).<br />
4.8 irudian eta 4.1 taulan erakutsi diren emaitzek, mintzetan<br />
bertan epitopo-ezagumendua burutzeko 4E10 eta 2F5 antigorputzek<br />
jaso dituzten adaptazioak sustatzen dituzte. Bertan kate astunak eta<br />
arinak konparatu dira berauen mintzarekiko afinitatea kontuan<br />
hartuta. Mab-en CDR-H3 bigiztetan mintzaren afinitatea aurkeztu<br />
dezaketen <strong>sekuentziak</strong> somatu daitezke. Mab4E10-aren kasuan<br />
mintzarekiko afinitatea Mab2F5-rena baino altuagoa dela ikusten da<br />
(4.8A irudia). Horretaz gain, Mab4E10-ren CDR-H1-k afinitate<br />
esanguratsua azaltzen du. B panelean, molekularen azalean dauden<br />
(hots, ur-soluzioari begira) eta mintzarekiko afinitatea <strong>duten</strong><br />
aminoazidoen alboko-kateak erakutsi dira. Mab4E10-aren kasuan<br />
mintzarekin kontaktuan jartzeko erabilgarri litekeen paratopoaren<br />
azala, Mab2F5-arena baino handiagoa dela behatu daiteke halaber<br />
(ikusi ere 4.1 taula).<br />
4.1 taula: Mab 2F5 eta Mab 4E10 antigorputzen kate astunen joera mintzetan<br />
txertatzeko.<br />
CDR-H1<br />
CDR-H2<br />
CDR-H3<br />
2F5 4E10<br />
Sekuentzia 1 ∆G (Kcal/mol) 2 Sekuentzia 1 ∆G (Kcal/mol) 2<br />
Gly 26 -Gly 35 -1.23 Gly 26 -Ser 35 -1.91<br />
Leu 29 -Phe 32 -0.33 Phe 29 -Tyr 32 -1.80<br />
Leu 48 -Lys 57 2.86 Gly 50 -Asn 58 -0.53<br />
Ile 51 -Asp 54 0.11 Pro 52 -Thr 55 -0.51<br />
Pro 98 -Ala 100g -0.57 Gly 96 -Lys 100e -2.95<br />
Leu 100a -Val 100d -1.69 Gly 99 -Trp 100b -3.68<br />
1: Sekuentziek 4 eta 10 aminoazido hondarreko luzera dituzte (Goiko eta<br />
beheko baloreak hurrenez-hurren)<br />
2: Sekuentziek fase urtsutik, mintz interfasera banatzeko behar <strong>duten</strong> energi<br />
askearen balioak adierazten dira (Wimley, W. C. eta White, S. H., 1996; Suarez, T.,<br />
Gallaher, W. R. eta lank., 2000).<br />
152
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
153
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
Azkenean, 4.9 irudia, kapitulu honetan buruturiko lan<br />
esperimentala erantzuten saiatu diren galderak planteatzeko erabili da:<br />
(a) antigorputzak, mintzekin elkar daitezke? (b) mintzetan barreiatutako<br />
epitopo-<strong>sekuentziak</strong> ezagutzeko gai al dira?; eta azkenik, (c)<br />
fosfolipidoekin modu espezifikoaz elkarrekiteko gai al dira?<br />
4.9. Irudia: Mintz-elkarrekintza igarpenetatik datozen galderak. (a) 2F5 eta<br />
4E10 epitopoak mintz-interfasean (MI) kokaturik egon daitezke, energi baxuko<br />
egoeran; (b) mintzari baturik dauden epitopoek antigorputzengatik ezagutuak izan<br />
daitezkeen posibilitatea dago; (c) Mab hauek mintzeko fosfolipidoek espezifikoki<br />
ezagutu ahal dituzte. (HC) Gune hidrokarbonatua.<br />
154
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
4.3.2. Mab-MINTZA BANAKETAREN AZTERKETA<br />
LIPOSOMETAN OINARRITUTAKO ELISA BAT ERABILIZ<br />
Aurreikusiriko mintzarekin elkartzeko ahalmena egiaztatzeko<br />
asmoz, lehenik eta behin liposometan oinarritutako ELISA saioa garatu<br />
zen (4.10 irudia). Biot-PE-k, estreptabidinaz gaineztaturiko plakaazalean<br />
liposomak itsastea ahalbidetu zuen (A panela). Estreptabidinaz<br />
gaineztaturik dauden plaketara gehitu behar zen liposoma kopurua 100<br />
µM zela zehazki jakiteko, %5 Rho-PE zunda fluoreszenteaz markaturiko<br />
liposomekin saioa kalibratu zen (4.10A irudia, eskuineko panela). PC<br />
besikulei gehitu izan zitzaien biot-PE kopurua 99:1 izan zen.<br />
Kontrol esperimentuetan, liposoma biotinilatuak ez ziren<br />
detektatu plaka arruntetara gehitzen zirenean (estreptabidina<br />
gabekoak), eta bestalde, biot-PE-z markaturik ez zeuden liposomak,<br />
hots, liposoma zuriak, estreptabidinaz gaineztaturik zeuden plaketara<br />
gaineratu zirenean, ez ziren itsatsi. Honen arabera, liposomen batuketa<br />
plaketara estreptabidinarekiko batura espezifikoagatik zela<br />
ondorioztatu daiteke.<br />
Antigorputza-liposoma elkarketa buruzko emaitzak Mab4E10-ren<br />
afinitate altuagoarekin bat datoz (4.10B irudia eta 4.2 taula). Beraz,<br />
emaitza horiek, Wimley-White analisiak aurreikusitakoa baieztatzen<br />
dute (4.9 irudia). Mab2F5 eta Mab4E10-en itxurazko disoziazio batura<br />
konstanteak baxuagoak dira CL-rekiko, PC-arekiko baino. Honek<br />
adieraz lezake bi antigorputzek CL-rekiko afinitate altuagoa aurkezten<br />
dutela (4.2. taula). Azpimarratzekoa da, 2F5 eta 4E10-ek epitopoak<br />
batzen <strong>duten</strong> guneen inguruan karga positibodun azalerak egotea,<br />
Mab4E10-ren kasuan askoz ere nabarmenagoa delarik (Ofek, G., Tang,<br />
M. eta lank., 2004; Cardoso, R. M., Zwick, M. B. eta lank., 2005).<br />
Analisi kuantitatiboek Mab4E10-ak fosfolipido anionikoez osoturiko<br />
bigeruzekiko, fosfolipido neutroez osaturiko bigeruzekiko baino afinitate<br />
altuagoa aurkezten duela baieztatu dute. Bestalde, Mab2F5-a<br />
fosfolipido anionikoz osaturiko bigeruzetara batzen da, PC bigeruza<br />
neutroetara batzen den afinitate berdinarekin edo/eta baxuagorekin.<br />
Beraz, Mab4E10-ren kasuan, CL-z osaturiko bigeruzekiko afinitatea,<br />
aldeko elkarrekintza elektrostatikoengatik izan badaiteke ere, Mab2F5aren<br />
kasuan derrigorrez beste faktore batzuk hartu beharko dute parte.<br />
155
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
4.2. Taula: Epitopoen (peptidoa zuzenean batu denean plakara edo<br />
liposometan lotuta) eta fosfolipido bigeruzen batuketarako lortzen diren antigorputz<br />
kontzentrazioak (nM) maximoaren erdira.<br />
Mab2F5 1 Mab4E10 1<br />
PC (+1/-1) 2 113±19 16±3.3<br />
CL (-2) 31±8.0 4.5±0.8<br />
PG (-1) 173±38 2.7±0.4<br />
PS (+1/-2) 327±113 2.5±0.4<br />
PI (-1) 613±110 Ez deter.<br />
2F5preTM 3 0.4±0.03 1.47±0.03<br />
2F5preTM-PC 4 4.7±2.4 1.67±0.03<br />
1: Batura balioak funtzio hiperbolikoetara doitutako adsortzio-kurbetatik atera<br />
dira. Erroreak doipenaren kalitatea adierazteko eman dira.<br />
2: Plakara batuta dagoen lipido kontzentrazioa kasu guztietan 100 µM izan<br />
zen. Buru polarraren karga parentesi artean adierazi da.<br />
3: Peptido-epitopoa (1 µM) ELISA arruntera zuzenean aplikatu zen.<br />
4: Peptido-epitopoa PC liposometara gehitu zen. PC liposomak lehendabizi<br />
estreptabidinaz gaineztaturik zeuden plaketara gehitu ziren. Bolumena 100 µl izan<br />
zen. Baldintza esperimentalak erabaki ziren, azkenean peptido:lipido erlazioa<br />
besikuletan 1:100 izateko eta erabili zen plakara batuta dagoen lipido kontzentrazioa,<br />
100 µM izateko ere.<br />
156
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
4.10. Irudia: Mintz-antigorputz elkarketaren azterketa liposometan<br />
oinarrituriko ELISA-ren bitartez. A) Ezkerreko panela: Liposometan oinarrituriko<br />
ELISA-ren eskema. Eskuinaldeko panela: Saioaren kalibrazioa. Rho-PE-z markaturiko<br />
PC:biot-PE (99:1 mol:mol erlazioa) besikulak estreptabidinaz gaineztaturiko plaketara<br />
gaineratuak izan ziren (zirkuluak). Itsatsirik geratu ez zen frakzioa garbitu ostean,<br />
plakara baturik geratu ziren besikulak kuantifikatzeko rodaminaren fluoreszentzia<br />
neurtu zen, besikulak Triton X-100 ekin (%0.5 vol/vol) solubilizatu eta gero. Laukiak<br />
biot-PE gabeko besikulei dagozkie, eta hirukiak biot-PE-z markaturiko besikulei,<br />
baina estreptabidina gabeko, hots plaka arruntetara gehituak izan zirenak. B) Mab2F5<br />
(ezkerrean) eta Mab4E10-en (eskuinean) elkarketa PC (zirkuluak), PG (triangeluak) eta<br />
CL (laukiak) liposomekin. Batez besteko baloreak erakutsi dira.<br />
157
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
4.3.3. PEPTIDO-EPITOPOAREN EZAGUMENDUA<br />
MINTZAREN INTERFASEAN<br />
Gp41-aren eraginez gertatzen den fusio prozesua ematen denean,<br />
proteina honen pretransmintz erregioa mintzaren interfasean<br />
murgiltzen dela iradokitu da. (Munoz-Barroso, I., Salzwedel, K. eta<br />
lank., 1999; Salzwedel, K., West, J. T. eta lank., 1999; Suarez, T.,<br />
Gallaher, W. R. eta lank., 2000; Saez-Cirion, A., Arrondo, J. L. eta lank.,<br />
2003; Shnaper, S., Sackett, K. eta lank., 2004). Honengatik, gp41-aren<br />
erregio hau bi modu ezberdinetan existitu behar da: (1) Fusio aurreko<br />
kanpo domeinu globular eta solugarriaren parte bezala. (2) Mintzean<br />
murgilduta, fusio prozesua ematen denean. Beraz, aipatu bezala (4.7<br />
eta 4.8 irudiak) Mab2F5 eta Mab4E10 antigorputzek beraien epitopoak,<br />
bai soluzioan, bai mintzaren ingurunean ere ezagutzeko ahalmena<br />
izateak bidezkoa dirudi.<br />
Aukera hori baieztatzeko, 2F5preTM peptidoa erabili zen. Peptido<br />
hau MPER erregioaren ordezkoa da (4.7 irudia). 2F5 preTM-a mintzinterfaseetara<br />
eraginkorki banatzen da (4.11.irudia). Peptido honek<br />
Mab2F5 eta Mab4E10-ak ezagutzen dituzten epitopo <strong>sekuentziak</strong> bere<br />
baitan daramatza. Beraz, peptido honen erabilpenak bi epitopoen<br />
ezagumendua aztertzea bidera dezake (4.12. irudia).<br />
Peptidoak bigeruzan hartzen duen kokapena Trp-ren espektrotik<br />
ondorioztatu daiteke, dDHPE-ra energi transferentzia saioa erabiliz<br />
(Ruiz-Arguello, M. B., Goni, F. M. eta lank., 1998) (4.11. irudia). Trparen<br />
igorpenaren jaitsiera 333 nm-tan (besikulen presentzian igorpen<br />
uhin-luzeraren maximoa) eta dDHPE zundaren emisioaren igoera 520<br />
nm-tan, energi erresonantziaren transferentzia mintzari asoziatuta<br />
dagoen indol taldetik zundaren dansilo taldera ematen dela adierazten<br />
du. Dansilo taldea besikulen lipido-ur interfasean kokatzen da, dansilo-<br />
Trp bikotearen R0 distantzia 17 Å-ekoa da (Vaz, W. L. eta Schoellmann,<br />
G., 1976). Beraz, behatzen den Trp-ren indargabetzeak, Trp hondarren<br />
gehiengoa, mintzaren interfaseari edo/eta kate azilikoen erregioari<br />
asoziatua egon behar dela iradokitzen du. Honengatik 4.7C irudian<br />
irudikatuta dagoen topologia 2F5preTM-a uratik mintzera banatzean<br />
dagokio.<br />
158
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
4.11. Irudia: 2F5preTM peptidoaren fluoreszentzia intrintsekoaren<br />
igorpen espektroa. 2F5preTM (kitzikatze uhin-luzera 280 nm), PC (lerro marraduna)<br />
eta PC:dDHPE (9.4:0.6) besikulekin inkubatua (lerro solidoa) izan zen. Lipido<br />
kontzentrazioa 0.25 mM izan zen, eta gehitutako peptido:lipido erlazioa 1:100.<br />
Barnealdeko irudia: 2F5preTM-aren banatze kurba mintzarekin. Kurbak, PC<br />
besikulen presentzian Trp-ak jasaten dituen fluoreszentziaren aldaketak PC besikulen<br />
kantitatea handituz neurtzen lortu ziren. Marra solidoa, funtzio hiperboliko batera<br />
balore esperimentalak doituz lortu da. Banaketa konstantea 2.5.1.4 atalean<br />
deskribatzen den modura kalkulatua dago.<br />
Kx (app) ≈ 2.5x10 6 balorea duen itxurazko batura konstantea<br />
lortu zen 2F5preTM peptidoa PC besikulen presentzian titulatzerakoan<br />
(4.11. irudian, barnealdeko irudia).<br />
4.11. Irudian agertzen den itxurazko banaketatik, aintzat har<br />
daiteke, 100 µM lipido besikula, 1.2 µM 2F5preTM-rekin inkubatuz gero<br />
100:1 lipido:peptido (mol:mol) erlazioa egongo dela mintzean edo,<br />
hobeto esanda, 1 µM peptido egongo dela putzu bakoitzeko. ELISA<br />
kontrolean ikus daiteke, emaitza berdinak lortzen direla lipido<br />
besikulak peptidoarekin soluzioan pre-inkubatzen direnean eta gero<br />
plaketara gehitzen direnean, edo besikulak lehenbizi plaketara batzen<br />
direnean eta gero peptidoarekin inkubatzen direnean.<br />
159
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
4.12 irudian, 2F5preTM peptidoaren ezagumendua<br />
2F5preTM plaketan aplikatutakoan (ELISA arrunta), eta liposomekin<br />
gaineztaturik zeuden plaketara aurkeztutakoan (liposometan<br />
oinarrituriko ELISA) konparatzen dira. Bi saioen arteko erkaketa<br />
egiteko, bi ELISA motetan erabili zen peptido kantitatea berdina izan<br />
zen. Beraz, 4.10A irudian dagoen kurbari dagokionez (eskuin aldeko<br />
panela) 530 µM lipido gehitu behar zaio plakari, 100 µM lipido batu<br />
dadin. Besikula kantitate hau estreptabidina gaineztatzen duen<br />
putzuaren azalera guztia estaltzeko modukoa da.<br />
4.12. Irudia: Mintzari baturik dauden epitopoen ezagumendua 2F5 eta<br />
4E10 antigorputzengatik. Mab2F5 (ezkerrean) eta Mab4E10-en (eskuinean)<br />
itxurazko afinitateak 2F5preTM-rekiko: hirukiak, peptidoa zuzenean plaketan<br />
itsatsirik; zirkuluak, PC-ra baturiko peptidoa; karratuak, CL-ra baturiko peptidoa. Bi<br />
kasuetan erabili zen 2F5preTM kontzentrazioa 1 µM-eko izan zen. Balore<br />
esperimentalak adsortzio kurbetara doitu ziren (marra solidoak). Plot guztietan balore<br />
bikoitzen batez bestekoa azaltzen da.<br />
160
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
4.12 Irudian eta 4.2. taulan agertzen diren datuek, liposometara<br />
baturik dauden epitopoekiko, bi antigorputzek afinitate altuagoa<br />
aurkezten dutela adierazten dute. Izatez, liposometara lotuta dagoen<br />
epitopoaren ezagumendua ematen deneko antigorputz kontzentrazioan,<br />
besikulekiko elkarrekintza oso mugatua da (4.2 taula). Mab2F5-ren<br />
itxurazko afinitatea liposometara batuta dagoen epitopoarekiko<br />
baxuagoa da, plakara zuzenean batuta dagoen epitopoarekin<br />
konparatzen badugu. Aitzitik, badirudi MAb4E10-ak antzeko afinitateaz<br />
ezagutzen duela epitopoa bi modu horietan aurkezten zaionean. Beraz,<br />
2F5preTM lipido bigeruzan murgiltzen denean, Mab2F5-aren<br />
ezagumendua eragotzi egiten duela, baina ostera Mab4E10-aren<br />
ezagumendua ez, ondorioztatu dezakegu.<br />
4.3.4. FOSFOLIPIDO-Mab ELKARREKINTZAREN<br />
ESPEZIFIZITATEA: FOSFOLIPIDOAREN EZAGUMENDUA<br />
SOLUZIOAN ETA MINTZETAN<br />
Liposometan oinarrituriko ELISA sistemak, fosfolipido-Mab arteko<br />
batuketa prozesuaren oinarri estrukturaletan ezagumendu gehiago<br />
lortzeko balio izan du. Lehen azaldu den bezala, Mab2F5-ak CL-rekiko<br />
erakusten duen afinitate altua, ezin da adierazi elkarrekintza<br />
elektrostatikoa kontuan hartuta. Beraz, prozesua ezagumendu<br />
espefizifiko batean oinarritzen dela pentsa liteke. Printzipioz, bi egituraosagai<br />
aintzat hartu behar dira fosfolipido-Mab arteko elkarrekintza<br />
gertatzeko: CDR H3 bigizta duen interfasearekiko hidrofobizitatea eta<br />
antigorputzak epitopoa batzen dueneko gunea (4.8 irudia). Lehenengo<br />
osagaiak CDR H3 bigiztaren mintz banaketa inespezifikoa zuzendu<br />
dezake (4.8 irudia eta (Wimley, W. C. eta White, S. H., 1996; Ofek, G.,<br />
Tang, M. eta lank., 2004; Cardoso, R. M., Zwick, M. B. eta lank., 2005;<br />
Hessa, T., Kim, H. eta lank., 2005)), bigarrenak, ezagumendu<br />
espezifikoagoak ahalbidetu, adibidez Haynes eta kolaboratzaileek<br />
deskribatu dituzten modukoak (Haynes, B. F., Fleming, J. eta lank.,<br />
2005).<br />
161
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
CL-a, beraien artean erlazionaturik ez dauden mota askotako<br />
proteinekin espezifikoki elkartzen da, adibidez, arnasa-kateko<br />
osagaiekin edo Bax eta cBid apoptosian parte hartzen <strong>duten</strong> osagaiekin<br />
(Lutter, M., Fang, M. eta lank., 2000; Esposti, M. D., Cristea, I. M. eta<br />
lank., 2003). Nahiz eta mekanismoa oraindik oso ulertua ez izan, cBidek<br />
ez du soilik CL-z osaturiko lipido bigeruzekin elkarrekiten, CL-ren<br />
lisoeratorri solugarriekin ere elkarrekiten baitu (Esposti, M. D., Cristea,<br />
I. M. eta lank., 2003).<br />
Mab eta fosfolipidoen elkarrekintzaren espezifizitatea ikertzeko,<br />
lisoeratorri ezberdinekiko batuketa ere aztertu zen, besteak beste<br />
dilisokardiolipinarekiko (4.13-4.15. irudiak).<br />
Mab2F5-ren batuketa mintz bigeruzetan, mihiztaturik edo<br />
soluzioan dispertsaturik dauden fosfolipidoetara, konparatiboki<br />
aztertua izan zen inhibizio ELISA arruntekin (4.13A irudia). 2F5preTM<br />
ELISA plaka arruntetan landatu zen. Mab2F5-a PC besikulekin<br />
inkubatzen denean, 2F5preTM-arekiko elkarrekintza inhibitua ikusten<br />
da (4.13A irudia, ezkerreko panelean, marra jarraia). Baldintza<br />
berdinak erabiliz, CL-rekin inkubatzerakoan, inhibizioa nabarmenagoa<br />
da (erdiko panela, marra jarraia). Bestalde ez zen inhibizio nabarmenik<br />
ikusi Mab2F5 lysoPC-rekin inkubatu zenean (ezkerreko panela, marra<br />
ez jarraiak). DilysoCL-rekin preinkubatzerakoan ostera, 2F5preTM<br />
elkarrekintzarekiko inhibizio bat ikusi zen, baina CL-ak eragiten duena<br />
baino txikiagoa (erdiko panela marra ez-jarraiak).<br />
Fosfatidilglizerolaren (PG) izaera kimikoa oso estuki erlazionatua<br />
dago kardiolipinaren izaera kimikoarekin (ikus 4.13B irudia). Mab2F5,<br />
PG besikulekin inkubatuz gero, MAb2F5-aren elkarrekintza 2F5preTMarekiko<br />
gutxitu egiten da, baina ez da inhibiziorik ikusten lysoPGarekin<br />
inkubatzerakoan. Honengatik, CL-aren elkarrekintzak Mab2F5aren<br />
epitopo-batuketa gunearekin glizerolak dauzkan bi ester fosfato<br />
beharrezkoak dituela ondorioztatzen da (Fig. 4.13B).<br />
162
A<br />
B<br />
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
4.13. Irudia: Fosfolipidoen ezagumendua, soluzioan eta mintzean. A)<br />
Mab2F5-2F5preTM batuketaren inhibizioa, antigorputza lipido bigeruzekin (zirkuluak<br />
eta marra jarraiak) eta lisolipido monomerikoekin (karratuak eta marra ez jarraiak),<br />
soluzioan pre-inkubatuz eta 2F5preTM ELISA plaka arruntetan itsastean. Azaltzen<br />
diren datuetan, PC eta lysoPC (ezkerreko panela), CL eta lysoCL (erdiko panela) eta,<br />
PG eta lysoPG (eskuineko panela) lipidoek eragindako inhibizioa konparatzen dira.<br />
2F5preTM eta Mab2F5-a saio hauetan 5 µgr/ml eta 0.1 µgr/ml-tan, hurrenez-hurren,<br />
erabili ziren. Agertzen diren baloreak hiru esperimentuetako baloreen batez bestekoei<br />
gehi desbiazio estandarra dagokie. B) CL eta dilysoCL (ezkerrean), eta PG eta lysoPGari<br />
(eskuinean) dagozkien egiturak.<br />
163
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
CL Mab2F5-aren lotugaia izan daitekeela aztertzeko, ELDKWA<br />
epitopo gune-sekuentzia eta dilisokardiolipina, plaketan batuta dagoen<br />
2F5preTM (4.14 irudia) eta gp41 natiboa gainazalean espresatuta<br />
daukaten zelulen ezagumenduarekin saihesteko erabili ziren (4.15<br />
irudia). ELDKWA eta dilisokardiolipinak Mab-ekin inkubatuz gero,<br />
2F5preTM-z gaineztaturik zeuden plaken ezagumendua inhibitzen da<br />
eta gainera antzera inhibitzen dute (4.14 irudia). Ikusten dugun<br />
inhibizio hau, luzeagoa den 2F5 epitopo lineala<br />
(NEQELLELDKWASLWN) erabiliz ikusten dena baino txikiagoa da<br />
(Parker, C. E., Deterding, L. J. eta lank., 2001).<br />
4.14. Irudia: Mab2F5-aren afinitatea fosfolipido solugarri eta<br />
peptidoekiko, ELISA plaketan. Mab2F5-2F5preTM batuketaren inhibizioa dilysoCL<br />
(zirkuluak), ELDKWA epitopoa (Laukiak) eta NEQELLELDKWASLWN epitopo<br />
luzearekin preinkubatuz gero (hirukiak). 2F5preTM 5 µgr/ml ELISA-plaka arruntetan<br />
landatu zen. Mab2F5-aren kontzentrazioa kasu guztietan 0.1 µgr/ml izan zen.<br />
164
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
ELDKWA eta dilysoCL, Mab2F5-ak eragiten duen sintzitioeraketaren<br />
inhibizioa itzultzen edo blokeatzen dute (4.15A panelean<br />
agertzen diren mikrografiak). Inhibizio efektuaren itzulpenaren edo<br />
blokeoaren kuantifikazioa kontzentrazioaren funtziopean, bi<br />
konposatuetarako inhibizioaren itzulpen ahalmen berdina adierazten<br />
digu (B panela). Berriz ere, peptido lineal luzeenak eraginik altuena<br />
aurkezten du, batez ere antigorputzarekiko afinitate altuagoa aurkezten<br />
duelako. Laburbilduz, emaitza hauek zera iradokitzen dute: ELDKWA<br />
eta dilysoCL-aren ezagumendua Mab2F5-aren aldetik, afinitate<br />
konparagarriekin gertatzen dela. Datu hauek, peptidoaren sekuentzian<br />
epitopo gunearen inguruan kokatzen diren hondarrak (Parker, C. E.,<br />
Deterding, L. J. eta lank., 2001), antigorputzarekin ere kontaktuan<br />
daudenak (Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004) oso lagungarriak direla<br />
Mab2F5 bere epitopoa ezagutu ahal izateko ideiarekin bat datoz halaber<br />
(Barbato, G., Bianchi, E. eta lank., 2003).<br />
165
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
4.15. Irudia: Mab2F5-ren afinitatea fosfolipido solugarri eta peptidoekiko<br />
saio zelularretan. A) Zelula-fusioaren gp41 aktibitatea. Goiko aldean: Zelulak 96<br />
putzuetako plaketan hazi ziren eta Mab2F5 (5 µgr/putzuko) bakarrik (ezkerreko<br />
mikrografia), Mab2F5-a ELDKWA epitopo sekuentziarekin (50 µM) preinkubatuz<br />
(erdiko panela) eta Mab2F5-a dilisoCL-rekin (50 µM) preinkubatuz (eskuinaldeko<br />
panela). B) Mab2F5-ak (5 µgr/putzuko) eragiten duen sintzitio-eraketaren<br />
inhibizioaren blokeoa, dilysoCL-rekin (zirkuluak), ELDKWA-rekin (laukiak) eta<br />
NEQELLELDKWASLWN epitopo luzearekin preinkubatuz (hirukiak). Inhibizio balore<br />
osoa, eremu bakoitzeko sintzitioetan agertzen direneko nukleo fusionatu kopuruari<br />
dagokio (4 edo nukleo gehiago dauzkaten zelula fusionatuak), Mab2F5-aren gabezian.<br />
Bi esperimentuen baloreen batez bestekoak ploteatu dira B paneletan, marra ezjarraiarekin<br />
irudikatu dira, erkaketa hobeagoa egiteko eta NEQELLELDKWASLWN-ren<br />
balioen doipena saturazio kurbetara adierazteko.<br />
166
4.4. EZTABAIDA<br />
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
Anti-GIB-1 antigorputz monoklonal neutralizatzaile oso gutxi<br />
isolatu dira. Hiru bakarrik dira gp41-aren transmintz<br />
azpiunitatearekin erreakzionatzen <strong>duten</strong>ak: 2F5-a, 4E10-a eta Z13-a<br />
(Zwick, M. B., Wang, M. eta lank., 2001; Binley, J. M., Wrin, T. eta<br />
lank., 2004; Zwick, M. B., Komori, H. K. eta lank., 2004; Zwick, M. B.,<br />
Jensen, R. eta lank., 2005). Hiru antigorputz hauek gp41-aren MPER<br />
edo aroma domeinuan kokaturik dauden epitopoak ezagutzen dituzte.<br />
Beste birusen fusio proteinekin konparatuz GIB-aren gp41-aren preTM<br />
erregioa hidrofobizitate oso nabarmena aurkezten du interfaseekiko<br />
(Suarez, T., Gallaher, W. R. eta lank., 2000). Honengatik, mintzaren<br />
interfaseak gp41-aren kanpo domeinuaren birtolestapenaren prozesuan<br />
(fusioaren aktibazioa ematen denean gertatzen dena) paper garrantzitsu<br />
bat jokatzen duela iradoki da (Saez-Cirion, A., Arrondo, J. L. eta lank.,<br />
2003). Beste aukera bat izan daiteke <strong>sekuentziak</strong> dauzkan hondar<br />
aromatiko anitzek, gp41-ren kanpo domeinuak ezagutzen dituzten<br />
antigorputz neutralizatzaileengatik ihes egiteko garaturiko mekanismo<br />
adaptatibo bat izatea.<br />
Transmintz-aurreko sekuentzia mintzaren gainazalean murgiltzen<br />
bada, antigorputzari zailagoa izango zaio berarekin elkarrekitea.<br />
Kalkulu teorikoetan oinarrituz, gutxi gorabehera -16 kcal/mol behar<br />
dira preTM-aren alderdi α-helikoidala mintzaren interfasean txertatzeko<br />
( 664 -DKWASLWNWFNITNWLWYK- 683 ) (Saez-Cirion, A., Arrondo, J. L. eta<br />
lank., 2003). 1 nM antigorputz-peptido disoziazio konstanterako, -15<br />
Kcal/mol-etako energi librekoa da (mol frakzioaren banaketa<br />
koefizientean oinarrituta (White, S. H. eta Wimley, W. C., 1999)).<br />
Antigorputzek mintzera banatzeko aurkezten <strong>duten</strong> tendentzia<br />
ezagutzen <strong>duten</strong> preTM erregioarekin lehiatzen duela sinesgarria izan<br />
daiteke beraz. Egoera hipotetiko honen barnean, Mab2F5 eta Mab4E10<br />
mintzaren interfasean murgildurik dauden epitopoak ezagutzeko<br />
ahalmena daukaten antigorputz bereziak izan daitezke (4.7 eta 4.8<br />
irudiak).<br />
Liposometan oinarrituriko ELISA teknika, mintz-elkarrekintza<br />
hauek karakterizatzeko tresna moduan erabili da (4.10 irudia).<br />
Fosfolipido besikulak lipido bigeruzaren azaleraren ezaugarriak modu<br />
homogeneo batean adierazten dituzte; guztiz kontrakoa gertatzen da<br />
orain arte erabili den, disolbatzaile organikoetan fosfolipidoaren<br />
aplikazioa zuzenki plakara. Besikulek interfasearen erregio konplexua<br />
167
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
imitatzen dute, alderdi hau ura eta fosfolipidoen talde kimiko<br />
hetereogeneoen nahasturaz osatua dago (buru polarra, glizeriloak,<br />
fosforiloak, karboniloak eta metilenoak) eta bertan, maila txikian,<br />
gertatzen diren polaritatearen aldaketak (White, S. H. eta Wimley, W.<br />
C., 1999; Granseth, E., von Heijne, G. eta lank., 2005). Are gehiago,<br />
alderdi honek paper garrantzitsu bat jokatzen du mintzetan proteinak<br />
txertatzen direnean gertatzen diren birtolestapen jazoeratan (White, S.<br />
H., Ladokhin, A. S. eta lank., 2001). Liposometan oinarrituriko ELISA<br />
emaitzetatik esan dezakegu, Mab2F5 eta Mab4E10 mintz ingurunean<br />
dauden epitopoak eta fosfolipidoak ezagutzeko aurkezten dituzten<br />
ahalmenak, bi adaptazio mekanismo ezberdinetan oinarriturik daudela.<br />
Fab4E10 eta bere epitopo konplexuaren egitura kristalinoren<br />
ebazpenak, antigorputz honek ezagutzen duen egitura helikoidala dela<br />
adierazten digu (Cardoso, R. M., Zwick, M. B. eta lank., 2005). Egituran,<br />
indol taldeen alboko kateen interdigitazioak, antigorputzera batuta ez<br />
dauden bi aurpegien bitartez elkarrekiten dutela aurkezten da ere.<br />
Hondar aromatikoetan oso aberatsa den preTM erregioak mintzetan<br />
(Suarez, T., Nir, S. eta lank., 2000; Schibli, D. J., Montelaro, R. C. eta<br />
lank., 2001; Saez-Cirion, A., Arrondo, J. L. eta lank., 2003) eta<br />
soluzioan (Saez-Cirion, A., Arrondo, J. L. eta lank., 2003) konformazio<br />
helikoidala aurkezten duela frogatu da. Mab4E10, bere epitopoa<br />
soluzioan eta mintzetan murgildurik dagoenean, berdin ezagutzearen<br />
arrazoi bat, epitopoaren sekuentzia honek bi medio hauetan<br />
konformazio eta orientazio berdina aurkeztea izan daiteke (4.11 eta 4.12<br />
irudia). Honengatik Mab4E10-aren moldaera, mintz-interfaseetan<br />
txertatzeko, eta bertan murgildurik dauden pretransmintz egitura<br />
helikoidalak batzeko ahalmenean oinarriturik egon daiteke (4.12<br />
irudia).<br />
Hala eta guztiz ere, MAb4E10-aren elkarrekintza mintzekin ezespezifikoa<br />
dela dirudi (4.10 irudia B panela eta 4.2 taula). Zelulamintzetara<br />
modu ez espezifikoan banatzea, birusaren barreiaketa<br />
geldiarazteko ahalmenarekin bat etor daiteke.<br />
168
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
4.16. Irudia: 2F5 (ezkerraldean) eta 4E10 (eskuinaldean), mintzinterfasean<br />
ezagumendurako adaptazio mekanismo ezberdinak. A) 4E10 (Fab<br />
berdea) mintzean murgildurik dauden gp41 epitopo <strong>sekuentziak</strong> ezagutzeko gai da.<br />
Kontrara 2F5-a (Fab gorria) mintzean murgildurik dauden <strong>sekuentziak</strong> afinitate<br />
baxuagorekin ezagutzen ditu. Lehenengo kasuan CDR H3 loop-a (oin beltza)<br />
<strong>txertaketa</strong>n inplikatua dago, bigarren kasuan aldiz, loop-a antigorputzak baturik duen<br />
epitopo natiboa ez askatzen laguntzen du (gorri argia). B) Mab4E10-ren elkarrekintza<br />
fosfolipido bigeruzekin (irudian kardiolipina azaltzen da), CDR H3 bigiztaren mintzeko<br />
banaketa inespezifikoagatik zuzendua dago. Mab2F5-ren elkarrekintza CL<br />
bigeruzekin, bigizta-mintz banaketagatik gertatzen da, epitopoaren batuketa gunea<br />
okupatuta geratzen delarik.<br />
169
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
Hala ere, ezin daiteke aldean utzi, seroko osagaiek<br />
domeinu hidrofobikoak egonkortzeko ahalmena dutela, eta honek<br />
antigorputz kontzentrazio eraginkor bat mantentzen laguntzea. Lipido<br />
bigeruzetan txertatzeko ahalmen baxua aurkezten <strong>duten</strong> antigorputzek<br />
(solugarriagoak diren espezieak) epitopoa mintzean murgilduta<br />
dagoenean ezagutzeko ahalmen hori ez dute aurkezten. Zentzu honetan<br />
4E10 antigorputza aparta da, mintzera banaketa ez espezifikoa eta<br />
ezagumenduaren artean proportzio ezin hobea lortu baitu.<br />
Fab2F5-ak bere epitopo sekuentziaren β bira +-ko konformazioa<br />
ezagutzen du (Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004). 2F5 epitopoan<br />
dauden ondoz-ondoko I-motatako β-birak, DKWA eta WASL Cmuturreko<br />
hondarrak barne dituztenak, konformazio helikoidala eta<br />
orientazio ezberdina hartzen dute mintzari batzen direnean (Schibli, D.<br />
J., Montelaro, R. C. eta lank., 2001; Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004).<br />
Beraz, 2F5-aren epitopoaren kasuan, mintzarekin banatzen denean<br />
konformazioa aldatzen du (White, S. H., Ladokhin, A. S. eta lank.,<br />
2001). Bere konformazio natiboa aldatzen denez, Mab-peptido afinitatea<br />
gutxitu egiten da (4.12 irudia eta 4.16 irudiak). Hala ere,<br />
antigorputzaren banaketa mintzera oraindik garrantzitsua da, kasu<br />
honetan, epitopoaren disoziazio joera aurre egiteko, pretransmintzak<br />
interfasean barneratzen delako. Leu hondarren aldaketak (660, 661 eta<br />
663 posizioak) Ala hondarrengatik (banaketaren energi askeak -0.56 eta<br />
+0.17 Kcal/mol, hurrenez-hurren), birusak Mab2F5-gatik<br />
sentikorragoak bihurtzen ditu (Zwick, M. B., Jensen, R. eta lank.,<br />
2005), beraz mintzarekiko banaketan eta 2F5-aren batuketaren artean<br />
lehia bat egon daiteke.<br />
Mab2F5-aren izaera aparta, epitopo sekuentzia heldu eta<br />
mantentzeko ahalmenarekin bat etor daiteke, sekuentziaren joera<br />
mintzaren interfasearekin banatzeko den bitartean. CDR H3 loop-aren<br />
elkarrekintzak mintz gainazalarekin, efektu honekin zerikusia izan<br />
dezake (Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004). Epitopoaren amino mutur<br />
zatiak antigorputzarekin batzean energi aske nahikoa eman dezake,<br />
karboxilo muturraren joera mintzekin banatzea eragingo duena.<br />
4.13-4.15 irudietako emaitzetatik ondorioztatu daiteke,<br />
fosfolipidoen ezagupena Mab2F5-agatik, mekanismo ezberdin baten<br />
ondorioz gertatu daitekeela. Mab2F5-ren elkarrekintza PC eta PG-rekin,<br />
Mab-bigeruza banaketa inespezifikoan hertsiki oinarrituta dago,<br />
lisoeratorriak ez baitira antigorputzaren batuketa gunean batzen.<br />
DilysoCL-arekin guztiz kontrakoa gertatzen da, Mab2F5-an, 2F5preTMaren<br />
batuketa gunean batzen dela dirudielako. Are gehiago konposatu<br />
170
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
lipidiko honek eta ELDKWA epitopoak antzeko afinitatea<br />
aurkezten dute MAb2F5-arekiko (4.11. irudia). Datu guzti hauetatik<br />
ondorioztatu daiteke 2F5 eta CL-en artean elkarrekintza espezifiko bat<br />
dagoela, Mab2F5 eta ELDKWA epitopoaren artean dagoen<br />
elkarrekintzaren antzeko izaera kimikoa duena (4.12. irudia<br />
behealdean). PreTM proteinan dauden zenbait hondar auto-antigeno<br />
moduan jokatu dezakete. Gure sistema immuneak antigorputz autoimmuneak<br />
deuseztatzeko programaturik egoteak, azaldu lezake zergatik<br />
antigorputz neutralizante hain gutxi sortzen diren, ez neutralizanteekin<br />
konparatuz. Gainera baita azalduko luke, zergatik Eritematosoa eta<br />
sistemikoa den Lupusa (SLE) daukaten gaixoen artean GIB-1-aren<br />
infekzioa hain baxua izatea. Gaixotasun auto-immune honen infekzioan<br />
zehar anti-kardiolipina antigorputzak sortarazten dira (Petrovas, C.,<br />
Vlachoyiannopoulos, P. G. eta lank., 1999; Haynes, B. F., Fleming, J.<br />
eta lank., 2005).<br />
171
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
172
4. Kapitulua: Emaitzak eta eztabaida II<br />
173
5. kapitulua: Laburpena eta ondorioak<br />
______________________________________________________________________<br />
5.1. LABURPENA<br />
5.1.1. ZELULA-MINTZEAN POROAK ERAGITEKO<br />
AHALMENA AURKEZTEN DUEN 2B PROTEINAREN<br />
DOMEINUA<br />
Tesi honetan, 2B proteinak zelula mintzean poro ez-selektibo eta<br />
egonkorrak eratzeko daukan berezko ahalmenari buruz ebidentzia<br />
sendoak ematen dira.<br />
TMD (transmintz domeinuak, ingelesetik transmembrane<br />
domains) helizeak ordezkatzen dituzten peptido sintetikoek (oinarrizko<br />
sekuentzia polipeptidikoak) proteinak mintzetan ioi-kanalak eta poroak<br />
eratzeko duen ahalmena mantentzen dutela frogatu da (Ojcius, D. M.<br />
eta Young, J. D., 1991; Shai, Y., 1995; Gazit, E., La Rocca, P. eta lank.,<br />
1998; Stouffer, A. L., Nanda, V. eta lank., 2005). Bi peptido solugarri<br />
sintetizatu ziren, TM1-a eta TM2-a, 2B proteinaren bi transmintz<br />
domeinuak ordezkatzen dituztenak. Peptido hauek, kultiboan hazten ari<br />
diren zelulen mintzak irazkortzeko daukaten ahalmena aztertu da.<br />
TM1 peptidoa solutu txikietarako, aktiboa eta espezifikoa da.<br />
Analisi zehatzago bat eginez, zelula-monogeruza irazkortzeko ahalmena:<br />
i) TM1 domeinuan mugatua dago, ii) nM kontzentrazio mailan<br />
eraginkorra da, iii) erabat erdietsi egiten du bere aktibitatea 15 minutu<br />
baino gutxiagoko denboretan iv) aktiboa da bai 4 ºC bai 37 ºC-tan ere<br />
eta v) peptidoaren aktibitatea inhibitzen da estreptabidina molekula<br />
kanpoaldetik botaz gero.<br />
174
5. kapitulua: Laburpena eta ondorioak<br />
<strong>Mintzetan</strong> ematen den poroaren eraketa lipido hutsezko<br />
besikulak erabiliz frogatu da. Mikroskopia konfokaleko datuak<br />
kontuan hartuz peptidoa zelularen azalean kokatzen dela ondorioztatu<br />
daiteke. Datu orok demostratzen dute 2B-ren TM1 domeinua dela<br />
zelularen mintz plasmatikoan poroak eratzeko berezko ahalmena<br />
daramana.<br />
Beraz, infekzioaren fase berantiarrean zelula barnean<br />
sintetizatzen den 2B proteina, poroak eratzeko gaitasuna duen jatorri<br />
biraleko toxinatzat jo dezakegu. Poroak eratzeko gaitasuna daukaten<br />
sekuentzia biralek (biroporinak) (Gonzalez, M. E. eta Carrasco, L.,<br />
2003), peptido bioaktiboen garapenerako edo/eta konposatu antibiralak<br />
isolatzeko itu moduan erabil litezke potentzialki.<br />
5.1.2. GIB-1 BIRUSA NEUTRALIZATZEKO AHALMENA<br />
DUTEN ANTI-GP41 2F5 ETA 4E10 ANTIGORPUTZEK<br />
BURUTUTAKO FOSFOLIPIDO ETA EPITOPOEN<br />
EZAGUMENDUA MINTZ-GAINAZALEAN<br />
Tesi honetan aurkeztu diren emaitzen arabera, 4E10 epitopoa<br />
mintzean murgildurik dagoenean immunogeno modura erabili daiteke,<br />
Mab4E10 antigorputz neutralizanteak epitopoa soluzioan zein mintzean<br />
txertaturik berdin ezagutzen baitu. Badirudi epitopoaren egitura bi<br />
egoeretan berdina dela, hots, bi kasutan α-helikoidala.<br />
Fosfolipido-Mab2F5 elkarrekintza eman dadin bi egitura elementu<br />
beharrezkoak dira: alde batetik CDR-bigizta (interfasearekiko<br />
hidrofobizitatea aurkezten duena) eta epitopoa batzen deneko gunea<br />
(4.16B irudia). CDR-bigiztak mintz-interfaseetarako banaketa<br />
zuzenduko luke (Ofek, G., Tang, M. eta lank., 2004; Zwick, M. B., 2005)<br />
eta epitopoa batzen deneko gunea ezagupen espezifikoarekin<br />
erlazionaturik egongo litzateke, azken hau Haynes eta lankideek<br />
deskribatzen <strong>duten</strong>ari dagokiolarik (Haynes, B. F., Fleming, J. eta lank.,<br />
2005).<br />
Tesian lortu diren emaitzen arabera, Mab2F5-a interfase<br />
neutroetara eta negatiboki kargaturik dauden interfaseetara ezespezifikoki<br />
batzen da. Bigiztan aurkitzen diren hondar hidrofobikoek<br />
batura ez-espezifiko hau zuzendu dezakete fase urtsuan agertzen<br />
direnean (4.16 irudia).<br />
175
5. kapitulua: Laburpena eta ondorioak<br />
Bestela gertatzen omen da kardiolipinaren kasuan.<br />
Badirudi CL-ak epitopoa batzen deneko gunea betetzen duela, horrela<br />
bere batuketa eragotziz. CL-ren ezaugarri bakarra erlazionaturik ez<br />
dauden proteinekin espezifikoki elkarrekitea da. Proteina hauen artean<br />
adibidez, arnas katearen zenbait proteina daude eta kate-erreakzio<br />
apoptotikoan parte hartzen <strong>duten</strong> BAX eta cBID (Lutter, M., Fang, M.<br />
eta lank., 2000; Esposti, M. D., Cristea, I. M. eta lank., 2003; Terrones,<br />
O., Antonsson, B. eta lank., 2004). Mekanismo molekularrean<br />
sakontzeko garrantzia duelako, ikusi da cBID proteinak ez duela soilik<br />
CL-rekin espezifikoki elkarrekiten, beraren lisoeratorriarekin ere<br />
elkarrekiten duela (Esposti, M. D., Cristea, I. M. eta lank., 2003). Tesian<br />
ematen diren datuek iradokitzen dute Mab2F5 antigorputzak<br />
mekanismo espezifiko baten bidez CL batu behar duela. MPER<br />
epitopoak, autoantigorputz epitopoak imitatzen dituenaren oinarrian,<br />
ebidentzia molekularrak ematen dira (Haynes, B. F., Fleming, J. eta<br />
lank., 2005).<br />
Azkenik, GIB-1-erako negatiboak diren baina eritasun<br />
autoimmuneak dituzten gaixoetan antigorputz neutralizanteak<br />
deskribatu dira (Douvas, A., Takehana, Y. eta lank., 1996). Bestalde,<br />
antikardiolipina antigorputzak zenbait birus infekzio ezberdin, GIB-1<br />
barne, pairatu dituzten gaixoetan aurkitu dira (Guglielmone, H., Vitozzi,<br />
S. eta lank., 2001). 2F5 antigorputza GIB-arekin infektaturik zegoen<br />
gaixo batetik isolatu zen, eta beraz ezin daiteke jakin gaixo honek beste<br />
antigorputz autoimmunerik bazuen. Ondorioz, ere ezin daiteke jakin<br />
Mab2F5-a, gp41 ELDKWA epitopoaren eraginaren ondorioz sortu zen<br />
edo CL-ren eraginez sortu zen.<br />
176
5.2. ONDORIOAK<br />
5. kapitulua: Laburpena eta ondorioak<br />
1- Biroporina, zelularen mintz plasmatikoan poroak eratzeko<br />
berezko ahalmena daraman toxina biriko eta intrazelularra da.<br />
2- TM1 domeinua 2B-ren bertsio minimoa da, beraz, domeinu<br />
honetan oinarritutako in vitro saioak antibiral berrien isolamenduan<br />
erabilgarri suertatu litezke.<br />
3- Mab2F5 eta Mab4E10-ak mintz ingurunean dauden epitopo<br />
eta fosfolipidoak, adaptazio mekanismo ezberdinen bidez ezagutzen<br />
dituzte.<br />
3.1- Mab4E10 antigorputza mintzari batuta egoteak,<br />
mintzari jadanik loturik dagoen epitopoaren ezagumenduan<br />
laguntzen du.<br />
3.2-Mab2F5 mintzari batuta egoteak, epitopoa bigeruzan<br />
murgiltzea ekiditen du.<br />
3.3- CL fosfolipidoa Mab2F5-ren epitopoaren batura gunean<br />
espezifikoki batzen da, epitopoaren batura eragotziz.<br />
177
5. kapitulua: Laburpena eta ondorioak<br />
178
5. kapitulua: Laburpena eta ondorioak<br />
179
6. kapitulua: Bibliografia<br />
_____________________________________________________________________<br />
Agirre, A., Barco, A., Carrasco, L. eta Nieva, J. L. (2002). "Viroporinmediated<br />
membrane permeabilization. Pore formation by<br />
nonstructural poliovirus 2B protein." J Biol Chem 277(43):<br />
40434-41.<br />
Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H. eta Kinosita, K., Jr. (1996). "Preparation<br />
of giant liposomes in physiological conditions and their<br />
characterization under an optical microscope." Biophys J 71(6):<br />
3242-50.<br />
Akiyama, S. K., Nagata, K. eta Yamada, K. M. (1990). "Cell surface<br />
receptors for extracellular matrix components." Biochim Biophys<br />
Acta 1031(1): 91-110.<br />
Aldabe, R. eta Carrasco, L. (1995). "Induction of membrane proliferation<br />
by poliovirus proteins 2C and 2BC." Biochem Biophys Res<br />
Commun 206(1): 64-76.<br />
Aldabe, R., Barco, A. eta Carrasco, L. (1996). "Membrane<br />
permeabilization by poliovirus proteins 2B and 2BC." J Biol Chem<br />
271(38): 23134-7.<br />
Aldabe, R., Irurzun, A. eta Carrasco, L. (1997). "Poliovirus protein 2BC<br />
increases cytosolic free calcium concentrations." J Virol 71(8):<br />
6214-7.<br />
Alvarez Losada, S., Canto-Nogues, C. eta Munoz-Fernandez, M. A.<br />
(2002). "A new possible mechanism of human immunodeficiency<br />
virus type 1 infection of neural cells." Neurobiol Dis 11(3): 469-78.<br />
Anderson, D. H., Sawaya, M. R., Cascio, D., Ernst, W., Modlin, R.,<br />
Krensky, A. eta Eisenberg, D. (2003). "Granulysin crystal<br />
structure and a structure-derived lytic mechanism." J Mol Biol<br />
325(2): 355-65.<br />
Andersson, M., Gunne, H., Agerberth, B., Boman, A., Bergman, T.,<br />
Sillard, R., Jornvall, H., Mutt, V., Olsson, B., Wigzell, H. eta et al.<br />
(1995). "NK-lysin, a novel effector peptide of cytotoxic T and NK<br />
cells. Structure and cDNA cloning of the porcine form, induction<br />
by interleukin 2, antibacterial and antitumour activity." Embo J<br />
14(8): 1615-25.<br />
Andreu, D., Merrifield, R. B., Steiner, H. eta Boman, H. G. (1983).<br />
"Solid-phase synthesis of cecropin A and related peptides." Proc<br />
Natl Acad Sci U S A 80(21): 6475-9.<br />
Arroyo, J., Boceta, M., Gonzalez, M. E., Michel, M. eta Carrasco, L.<br />
(1995). "Membrane permeabilization by different regions of the<br />
human immunodeficiency virus type 1 transmembrane<br />
glycoprotein gp41." J Virol 69(7): 4095-102.<br />
180
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Baran, K., Ciccone, A., Peters, C., Yagita, H., Bird, P. I., Villadangos, J.<br />
A. eta Trapani, J. A. (2006). "Cytotoxic T lymphocytes from<br />
cathepsin B-deficient mice survive normally in vitro and in vivo<br />
after encountering and killing target cells." J Biol Chem 281(41):<br />
30485-91.<br />
Barbato, G., Bianchi, E., Ingallinella, P., Hurni, W. H., Miller, M. D.,<br />
Ciliberto, G., Cortese, R., Bazzo, R., Shiver, J. W. eta Pessi, A.<br />
(2003). "Structural analysis of the epitope of the anti-HIV<br />
antibody 2F5 sheds light into its mechanism of neutralization and<br />
HIV fusion." J Mol Biol 330(5): 1101-15.<br />
Barco, A. eta Carrasco, L. (1995). "A human virus protein, poliovirus<br />
protein 2BC, induces membrane proliferation and blocks the<br />
exocytic pathway in the yeast Saccharomyces cerevisiae." Embo J<br />
14(14): 3349-64.<br />
Barco, A. eta Carrasco, L. (1998). "Identification of regions of poliovirus<br />
2BC protein that are involved in cytotoxicity." J Virol 72(5): 3560-<br />
70.<br />
Bartlett, G. R. (1959). "Phosphorus assay in column chromatography." J<br />
Biol Chem 234(3): 466-8.<br />
Bechinger, B. (1997). "Structure and functions of channel-forming<br />
peptides: magainins, cecropins, melittin and alamethicin." J<br />
Membr Biol 156(3): 197-211.<br />
Bechinger, B. (2000). "Understanding peptide interactions with the lipid<br />
bilayer: a guide to membrane protein engineering." Curr Opin<br />
Chem Biol 4(6): 639-44.<br />
Belmonte, G., Cescatti, L., Ferrari, B., Nicolussi, T., Ropele, M. eta<br />
Menestrina, G. (1987). "Pore formation by Staphylococcus aureus<br />
alpha-toxin in lipid bilayers. Dependence upon temperature and<br />
toxin concentration." Eur Biophys J 14(6): 349-58.<br />
Bennett, V. (1985). "The membrane skeleton of human erythrocytes and<br />
its implications for more complex cells." Annu Rev Biochem 54:<br />
273-304.<br />
Bernheimer, A. W. eta Rudy, B. (1986). "Interactions between<br />
membranes and cytolytic peptides." Biochim Biophys Acta 864(1):<br />
123-41.<br />
Berridge, M. J. (1987). "Inositol trisphosphate and diacylglycerol: two<br />
interacting second messengers." Annu Rev Biochem 56: 159-93.<br />
Berridge, M. J. (1993). "Inositol trisphosphate and calcium signalling."<br />
Nature 361(6410): 315-25.<br />
Bhakdi, S. eta Tranum-Jensen, J. (1991). "Alpha-toxin of<br />
Staphylococcus aureus." Microbiol Rev 55(4): 733-51.<br />
Bienz, K., Egger, D. eta Pasamontes, L. (1987). "Association of polioviral<br />
proteins of the P2 genomic region with the viral replication<br />
complex and virus-induced membrane synthesis as visualized by<br />
electron microscopic immunocytochemistry and<br />
autoradiography." Virology 160(1): 220-6.<br />
181
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Bienz, K., Egger, D., Pfister, T. eta Troxler, M. (1992). "Structural<br />
and functional characterization of the poliovirus replication<br />
complex." J Virol 66(5): 2740-7.<br />
Binley, J. M., Ditzel, H. J., Barbas, C. F., 3rd, Sullivan, N., Sodroski, J.,<br />
Parren, P. W. eta Burton, D. R. (1996). "Human antibody<br />
responses to HIV type 1 glycoprotein 41 cloned in phage display<br />
libraries suggest three major epitopes are recognized and give<br />
evidence for conserved antibody motifs in antigen binding." AIDS<br />
Res Hum Retroviruses 12(10): 911-24.<br />
Binley, J. M., Wrin, T., Korber, B., Zwick, M. B., Wang, M., Chappey, C.,<br />
Stiegler, G., Kunert, R., Zolla-Pazner, S., Katinger, H.,<br />
Petropoulos, C. J. eta Burton, D. R. (2004). "Comprehensive<br />
cross-clade neutralization analysis of a panel of anti-human<br />
immunodeficiency virus type 1 monoclonal antibodies." J Virol<br />
78(23): 13232-52.<br />
Blanco, R., Carrasco, L. eta Ventoso, I. (2003). "Cell killing by HIV-1<br />
protease." J Biol Chem 278(2): 1086-93.<br />
Bloom, M., Evans, E. eta Mouritsen, O. G. (1991). "Physical properties<br />
of the fluid lipid-bilayer component of cell membranes: a<br />
perspective." Q Rev Biophys 24(3): 293-397.<br />
Boon, J. M. eta Smith, B. D. (2002). "Chemical control of phospholipid<br />
distribution across bilayer membranes." Med Res Rev 22(3): 251-<br />
81.<br />
Bottcher, G. J. F., Van Gent, C. M. eta Pries, C. (1961). "A rapid and<br />
sensitive submicro<br />
phosphorus determination." Anal. Chim. Acta 24: 203-204.<br />
Buchacher, A., Predl, R., Strutzenberger, K., Steinfellner, W., Trkola, A.,<br />
Purtscher, M., Gruber, G., Tauer, C., Steindl, F., Jungbauer, A.<br />
eta et al. (1994). "Generation of human monoclonal antibodies<br />
against HIV-1 proteins; electrofusion and Epstein-Barr virus<br />
transformation for peripheral blood lymphocyte immortalization."<br />
AIDS Res Hum Retroviruses 10(4): 359-69.<br />
Bullough, P. A., Hughson, F. M., Skehel, J. J. eta Wiley, D. C. (1994).<br />
"Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane<br />
fusion." Nature 371(6492): 37-43.<br />
Burrer, R., Haessig-Einius, S., Aubertin, A. M. eta Moog, C. (2005).<br />
"Neutralizing as well as non-neutralizing polyclonal<br />
immunoglobulin (Ig)G from infected patients capture HIV-1 via<br />
antibodies directed against the principal immunodominant<br />
domain of gp41." Virology 333(1): 102-13.<br />
Burton, D. R., Desrosiers, R. C., Doms, R. W., Koff, W. C., Kwong, P. D.,<br />
Moore, J. P., Nabel, G. J., Sodroski, J., Wilson, I. A. eta Wyatt, R.<br />
T. (2004). "HIV vaccine design and the neutralizing antibody<br />
problem." Nat Immunol 5(3): 233-6.<br />
Buser, C. A., Kim, J., McLaughlin, S. eta Peitzsch, R. M. (1995). "Does<br />
the binding of clusters of basic residues to acidic lipids induce<br />
domain formation in membranes?" Mol Membr Biol 12(1): 69-75.<br />
Cafiso, D. S. (1991). "Lipid bilayers: Membrane-protein electrostatic<br />
interactions." Curr. Opin. Struct. Biol. 1: 185-190.<br />
182
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Cafiso, D. S. (1994). "Alamethicin: a peptide model for voltage gating<br />
and protein-membrane interactions." Annu Rev Biophys Biomol<br />
Struct 23: 141-65.<br />
Cajal, Y., Boggs, J. M. eta Jain, M. K. (1997). "Salt-triggered<br />
intermembrane exchange of phospholipids and hemifusion by<br />
myelin basic protein." Biochemistry 36(9): 2566-76.<br />
Campanella, M., de Jong, A. S., Lanke, K. W., Melchers, W. J., Willems,<br />
P. H., Pinton, P., Rizzuto, R. eta van Kuppeveld, F. J. (2004). "The<br />
coxsackievirus 2B protein suppresses apoptotic host cell<br />
responses by manipulating intracellular Ca2+ homeostasis." J<br />
Biol Chem 279(18): 18440-50.<br />
Cardoso, R. M., Zwick, M. B., Stanfield, R. L., Kunert, R., Binley, J. M.,<br />
Katinger, H., Burton, D. R. eta Wilson, I. A. (2005). "Broadly<br />
neutralizing anti-HIV antibody 4E10 recognizes a helical<br />
conformation of a highly conserved fusion-associated motif in<br />
gp41." Immunity 22(2): 163-73.<br />
Carrasco, L. (1978). "Membrane leakiness after viral infection and a new<br />
approach to the development of antiviral agents." Nature<br />
272(5655): 694-9.<br />
Carrasco, L. (1981). "Modification of membrane permeability induced by<br />
animal viruses early in infection." Virology 113(2): 623-9.<br />
Carrasco, L. (1994). "Entry of animal viruses and macromolecules into<br />
cells." FEBS Lett 350(2-3): 151-4.<br />
Carrasco, L. (1995). "Modification of membrane permeability by animal<br />
viruses." Adv Virus Res 45: 61-112.<br />
Carrasco, L. (1996). El virus de la inmunodeficiencia humana. El virus<br />
del SIDA, Un desafío pendiente. E. Hélice: 91-111.<br />
Carrasco, L. eta Smith, A. E. (1976). "Sodium ions and the shut-off of<br />
host cell protein synthesis by picornaviruses." Nature 264(5588):<br />
807-9.<br />
Carrasco, L., Guinea, R., Irurzun, A. eta Barco, A. (2002). Effects of viral<br />
replication on cellular membrane metabolism and function.<br />
Molecular biology of picornavirus. B. L. Semler and E. Wimmer.<br />
Washington, ASM Press: 337-354.<br />
Carrasco, L., Guinea, R., Irurzun, A. eta Barco, A. (2002). Effects of viral<br />
replication on cellular membrane metabolism and function.<br />
Molecular biology of picornavirus. B. L. Semler and E. Wimmer.<br />
Washington, ASM Press: 337-354.<br />
Carrasco, L., Guinea, R., Irurzun, A. y Barco, A. (2002). Molecular<br />
Biology of Picornavirus. B. L. Semler, y Wimmer, E. Washington,<br />
DC., ASM Press: 337-354.<br />
Castrillo, J. L. eta Carrasco, L. (1985). "Increased inhibition of cellular<br />
RNA synthesis by α-amanitin during entry of viruses into animal<br />
cells." FEMS Microbiol. Lett. 26: 221-225.<br />
Castrillo, J. L., Vanden Berghe, D. eta Carrasco, L. (1986). "3-<br />
Methylquercetin is a potent and selective inhibitor of poliovirus<br />
RNA synthesis." Virology 152(1): 219-27.<br />
183
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Ciccaglione, A. R., Marcantonio, C., Costantino, A., Equestre, M.,<br />
Geraci, A. eta Rapicetta, M. (1998). "Hepatitis C virus E1 protein<br />
induces modification of membrane permeability in E. coli cells."<br />
Virology 250(1): 1-8.<br />
Ciccaglione, A. R., Costantino, A., Marcantonio, C., Equestre, M.,<br />
Geraci, A. eta Rapicetta, M. (2001). "Mutagenesis of hepatitis C<br />
virus E1 protein affects its membrane-permeabilizing activity." J<br />
Gen Virol 82(Pt 9): 2243-50.<br />
Coeffier, E., Clement, J. M., Cussac, V., Khodaei-Boorane, N., Jehanno,<br />
M., Rojas, M., Dridi, A., Latour, M., El Habib, R., Barre-Sinoussi,<br />
F., Hofnung, M. eta Leclerc, C. (2000). "Antigenicity and<br />
immunogenicity of the HIV-1 gp41 epitope ELDKWA inserted into<br />
permissive sites of the MalE protein." Vaccine 19(7-8): 684-93.<br />
Coffin, J. M. (1996). Retroviridae: the virus and their replication.<br />
Fundamental Virology. P. M. H. D.M. Knipe. Philadelphia,<br />
Lippincott-Raven Publishers: 763-843.<br />
Conlon, J. M., Sonnevend, A., Patel, M., Camasamudram, V., Nowotny,<br />
N., Zilahi, E., Iwamuro, S., Nielsen, P. F. eta Pal, T. (2003). "A<br />
melittin-related peptide from the skin of the Japanese frog, Rana<br />
tagoi, with antimicrobial and cytolytic properties." Biochem<br />
Biophys Res Commun 306(2): 496-500.<br />
Connor, J., Pak, C. C. eta Schroit, A. J. (1994). "Exposure of<br />
phosphatidylserine in the outer leaflet of human red blood cells.<br />
Relationship to cell density, cell age, and clearance by<br />
mononuclear cells." J Biol Chem 269(4): 2399-404.<br />
Cramer, W. A., Heymann, J. B., Schendel, S. L., Deriy, B. N., Cohen, F.<br />
S., Elkins, P. A. eta Stauffacher, C. V. (1995). "Structure-function<br />
of the channel-forming colicins." Annu Rev Biophys Biomol Struct<br />
24: 611-41.<br />
Cross, G. A. (1987). "Eukaryotic protein modification and membrane<br />
attachment via phosphatidylinositol." Cell 48(2): 179-81.<br />
Chan, D. C. eta Kim, P. S. (1998). "HIV entry and its inhibition." Cell<br />
93(5): 681-4.<br />
Chan, D. C., Fass, D., Berger, J. M. eta Kim, P. S. (1997). "Core<br />
structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein." Cell 89(2):<br />
263-73.<br />
Chang, Y. S., Liao, C. L., Tsao, C. H., Chen, M. C., Liu, C. I., Chen, L. K.<br />
eta Lin, Y. L. (1999). "Membrane permeabilization by small<br />
hydrophobic nonstructural proteins of Japanese encephalitis<br />
virus." J Virol 73(8): 6257-64.<br />
Chapman, D. (1984). Physicochemical properties of phospholipids and<br />
lipid-water systems. liposome technology. G. Gregoriadis, Boca<br />
Raton, CRC Press.: 1-18.<br />
Charpilienne, A., Abad, M. J., Michelangeli, F., Alvarado, F., Vasseur,<br />
M., Cohen, J. eta Ruiz, M. C. (1997). "Solubilized and cleaved<br />
VP7, the outer glycoprotein of rotavirus, induces permeabilization<br />
of cell membrane vesicles." J Gen Virol 78 (Pt 6): 1367-71.<br />
184
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Chen, H. M., Clayton, A. H., Wang, W. eta Sawyer, W. H. (2001).<br />
"Kinetics of membrane lysis by custom lytic peptides and peptide<br />
orientations in membrane." Eur J Biochem 268(6): 1659-69.<br />
Cho, M. W., Teterina, N., Egger, D., Bienz, K. eta Ehrenfeld, E. (1994).<br />
"Membrane rearrangement and vesicle induction by recombinant<br />
poliovirus 2C and 2BC in human cells." Virology 202(1): 129-45.<br />
Choe, H., Farzan, M., Sun, Y., Sullivan, N., Rollins, B., Ponath, P. D.,<br />
Wu, L., Mackay, C. R., LaRosa, G., Newman, W., Gerard, N.,<br />
Gerard, C. eta Sodroski, J. (1996). "The beta-chemokine receptors<br />
CCR3 and CCR5 facilitate infection by primary HIV-1 isolates."<br />
Cell 85(7): 1135-48.<br />
Dalgleish, A. G., Beverley, P. C., Clapham, P. R., Crawford, D. H.,<br />
Greaves, M. F. eta Weiss, R. A. (1984). "The CD4 (T4) antigen is<br />
an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus."<br />
Nature 312(5996): 763-7.<br />
Davies, J. T. eta Rideal, E. K. (1963). Interfacial phenomena. Londres,<br />
Academic Press.<br />
de Jong, A. S., Melchers, W. J., Glaudemans, D. H., Willems, P. H. eta<br />
van Kuppeveld, F. J. (2004). "Mutational analysis of different<br />
regions in the coxsackievirus 2B protein: requirements for homomultimerization,<br />
membrane permeabilization, subcellular<br />
localization, and virus replication." J Biol Chem 279(19): 19924-<br />
35.<br />
de Jong, A. S., Wessels, E., Dijkman, H. B., Galama, J. M., Melchers, W.<br />
J., Willems, P. H. eta van Kuppeveld, F. J. (2003). "Determinants<br />
for membrane association and permeabilization of the<br />
coxsackievirus 2B protein and the identification of the Golgi<br />
complex as the target organelle." J Biol Chem 278(2): 1012-21.<br />
de Jong, A. S., Visch, H. J., de Mattia, F., van Dommelen, M. M.,<br />
Swarts, H. G., Luyten, T., Callewaert, G., Melchers, W. J.,<br />
Willems, P. H. eta van Kuppeveld, F. J. (2006). "The<br />
coxsackievirus 2B protein increases efflux of ions from the<br />
endoplasmic reticulum and Golgi, thereby inhibiting protein<br />
trafficking through the Golgi." J Biol Chem 281(20): 14144-50.<br />
Delwart, E. L., Mosialos, G. eta Gilmore, T. (1990). "Retroviral envelope<br />
glycoproteins contain a "leucine zipper"-like repeat." AIDS Res<br />
Hum Retroviruses 6(6): 703-6.<br />
Diaz, C. eta Schroit, A. J. (1996). "Role of translocases in the generation<br />
of phosphatidylserine asymmetry." J Membr Biol 151(1): 1-9.<br />
Dimitrov, A. S., Rawat, S. S., Jiang, S. eta Blumenthal, R. (2003). "Role<br />
of the fusion peptide and membrane-proximal domain in HIV-1<br />
envelope glycoprotein-mediated membrane fusion." Biochemistry<br />
42(48): 14150-8.<br />
Doedens, J., Maynell, L. A., Klymkowsky, M. W. eta Kirkegaard, K.<br />
(1994). "Secretory pathway function, but not cytoskeletal<br />
integrity, is required in poliovirus infection." Arch Virol Suppl 9:<br />
159-72.<br />
185
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Doedens, J., Maynell, L. A., Klymkowsky, M. W. eta Kirkegaard, K.<br />
(1994). "Secretory pathway function, but not cytoskeletal<br />
integrity, is required in poliovirus infection." Arch. Virol 136: 159-<br />
172.<br />
Doedens, J. R. eta Kirkegaard, K. (1995). "Inhibition of cellular protein<br />
secretion by poliovirus proteins 2B and 3A." Embo J 14(5): 894-<br />
907.<br />
Doedens, J. R., Giddings, T. H., Jr. eta Kirkegaard, K. (1997).<br />
"Inhibition of endoplasmic reticulum-to-Golgi traffic by poliovirus<br />
protein 3A: genetic and ultrastructural analysis." J Virol 71(12):<br />
9054-64.<br />
Doms, R. W. eta Moore, J. P. (2000). "HIV-1 membrane fusion: targets of<br />
opportunity." J Cell Biol 151(2): F9-14.<br />
Dong, Y., Zeng, C. Q., Ball, J. M., Estes, M. K. eta Morris, A. P. (1997).<br />
"The rotavirus enterotoxin NSP4 mobilizes intracellular calcium in<br />
human intestinal cells by stimulating phospholipase C-mediated<br />
inositol 1,4,5-trisphosphate production." Proc Natl Acad Sci U S A<br />
94(8): 3960-5.<br />
Douvas, A., Takehana, Y., Ehresmann, G., Chernyovskiy, T. eta Daar,<br />
E. S. (1996). "Neutralization of HIV type 1 infectivity by serum<br />
antibodies from a subset of autoimmune patients with mixed<br />
connective tissue disease." AIDS Res Hum Retroviruses 12(16):<br />
1509-17.<br />
Dowhan, W. (1997). "Molecular basis for membrane phospholipid<br />
diversity: why are there so many lipids?" Annu Rev Biochem 66:<br />
199-232.<br />
Dulbecco, R. eta Freeman, G. (1959). "Plaque production by the<br />
polyoma virus." Virology 8(3): 396-7.<br />
Earl, P. L., Broder, C. C., Doms, R. W. eta Moss, B. (1997). "Epitope<br />
map of human immunodeficiency virus type 1 gp41 derived from<br />
47 monoclonal antibodies produced by immunization with<br />
oligomeric envelope protein." J Virol 71(4): 2674-84.<br />
Eckert, D. M. eta Kim, P. S. (2001). "Mechanisms of viral membrane<br />
fusion and its inhibition." Annu Rev Biochem 70: 777-810.<br />
Egger, D., Gosert, R. y Bienz, K. (2002). Molecular Biology of<br />
Picornavirus. B. L. y. W. Semler, E. Washington, DC, ASM Press:<br />
247-253.<br />
Eisenberg, D., Schwarz, E., Komaromy, M. eta Wall, R. (1984). "Analysis<br />
of membrane and surface protein sequences with the hydrophobic<br />
moment plot." J Mol Biol 179(1): 125-42.<br />
Eisenberg, M., Hall, J. E. eta Mead, C. A. (1973). "The nature of the<br />
voltage-dependent conductance induced by alamethicin in black<br />
lipid membranes." J Membr Biol 14(2): 143-76.<br />
Eklund, K. K., Vuorinen, J., Mikkola, J., Virtanen, J. A. eta Kinnunen,<br />
P. K. (1988). "Ca2+-induced lateral phase separation in<br />
phosphatidic acid/phosphatidylcholine monolayers as revealed by<br />
fluorescence microscopy." Biochemistry 27(9): 3433-7.<br />
186
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Ellens, H., Bentz, J. eta Szoka, F. C. (1985). "H+- and Ca2+-induced<br />
fusion and destabilization of liposomes." Biochemistry 24(13):<br />
3099-106.<br />
Engelman, D. M. (1996). "Crossing the hydrophobic barrier: insertion of<br />
membrane proteins." Science 274(5294): 1850-1.<br />
Engelman, D. M. (2005). "Membranes are more mosaic than fluid."<br />
Nature 438(7068): 578-80.<br />
Epand, R. F., Sayer, B. G. eta Epand, R. M. (2005). "The tryptophanrich<br />
region of HIV gp41 and the promotion of cholesterol-rich<br />
domains." Biochemistry 44(14): 5525-31.<br />
Epand, R. M. eta Vogel, H. J. (1999). "Diversity of antimicrobial peptides<br />
and their mechanisms of action." Biochim Biophys Acta 1462(1-<br />
2): 11-28.<br />
Epand, R. M., Sayer, B. G. eta Epand, R. F. (2003). "Peptide-induced<br />
formation of cholesterol-rich domains." Biochemistry 42(49):<br />
14677-89.<br />
Esposti, M. D., Cristea, I. M., Gaskell, S. J., Nakao, Y. eta Dive, C.<br />
(2003). "Proapoptotic Bid binds to monolysocardiolipin, a new<br />
molecular connection between mitochondrial membranes and cell<br />
death." Cell Death Differ 10(12): 1300-9.<br />
Evans, W. H. (1989). Membrane structure and function., Oxford, IRL<br />
Press at Oxford University Press.<br />
Fass, D., Harrison, S. C. eta Kim, P. S. (1996). "Retrovirus envelope<br />
domain at 1.7 angstrom resolution." Nat Struct Biol 3(5): 465-9.<br />
Fernandez-Puentes, C. eta Carrasco, L. (1980). "Viral infection<br />
permeabilizes mammalian cells to protein toxins." Cell 20(3): 769-<br />
75.<br />
Ferrantelli, F., Rasmussen, R. A., Hofmann-Lehmann, R., Xu, W.,<br />
McClure, H. M. eta Ruprecht, R. M. (2002). "Do not underestimate<br />
the power of antibodies--lessons from adoptive transfer of<br />
antibodies against HIV." Vaccine 20 Suppl 4: A61-5.<br />
Fidelio, G. D., Maggio, B. eta Cumar, F. A. (1986). "Stability and<br />
penetration of soluble and membrane proteins in interfaces." An.<br />
Asoc. Quim. Argent. 74: 801-813.<br />
Fields, G. B. eta Noble, R. L. (1990). "Solid phase peptide synthesis<br />
utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids." Int J Pept<br />
Protein Res 35(3): 161-214.<br />
Freed, E. O. (2001). "HIV-1 replication." Somat Cell Mol Genet 26(1-6):<br />
13-33.<br />
Freed, E. O. eta Martin, M. M. (2001). HIVs and their replication. Fields<br />
Virology. K. e. Holley. Philadelphia, Lippincott and Wilkins: 1971-<br />
2041.<br />
Freed, E. O. eta Mouland, A. J. (2006). "The cell biology of HIV-1 and<br />
other retroviruses." Retrovirology 3: 77.<br />
Gallaher, W. R. (1987). "Detection of a fusion peptide sequence in the<br />
transmembrane protein of human immunodeficiency virus." Cell<br />
50(3): 327-8.<br />
187
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Gallo, R. C. eta Montagnier, L. (1988). "AIDS in 1988." Sci Am<br />
259(4): 41-8.<br />
Ganz, T. eta Lehrer, R. I. (1995). "Defensins." Pharmacol Ther 66(2):<br />
191-205.<br />
Garidel, P., Johann, C. eta Blume, A. (1997). "Nonideal mixing and<br />
phase separation in phosphatidylcholine-phosphatidic acid<br />
mixtures as a function of acyl chain length and pH." Biophys J<br />
72(5): 2196-210.<br />
Garry, R. F. eta Dash, S. (2003). "Proteomics computational analyses<br />
suggest that hepatitis C virus E1 and pestivirus E2 envelope<br />
glycoproteins are truncated class II fusion proteins." Virology<br />
307(2): 255-65.<br />
Gawrisch, K., Ruston, D., Zimmerberg, J., Parsegian, V. A., Rand, R. P.<br />
eta Fuller, N. (1992). "Membrane dipole potentials, hydration<br />
forces, and the ordering of water at membrane surfaces." Biophys<br />
J 61(5): 1213-23.<br />
Gazit, E., La Rocca, P., Sansom, M. S. eta Shai, Y. (1998). "The<br />
structure and organization within the membrane of the helices<br />
composing the pore-forming domain of Bacillus thuringiensis<br />
delta-endotoxin are consistent with an "umbrella-like" structure<br />
of the pore." Proc Natl Acad Sci U S A 95(21): 12289-94.<br />
Gennis, R. B. (1989). Biomembranes. Molecular structure and<br />
function., New York, Springer-Verlag.<br />
Gilbert, R. J. (2002). "Pore-forming toxins." Cell Mol Life Sci 59(5): 832-<br />
44.<br />
Gonzalez, M. E. eta Carrasco, L. (2003). "Viroporins." FEBS Lett 552(1):<br />
28-34.<br />
Gouaux, E. (1997). "Channel-forming toxins: tales of transformation."<br />
Curr Opin Struct Biol 7(4): 566-73.<br />
Gouaux, E. (1998). "alpha-Hemolysin from Staphylococcus aureus: an<br />
archetype of beta-barrel, channel-forming toxins." J Struct Biol<br />
121(2): 110-22.<br />
Granseth, E., von Heijne, G. eta Elofsson, A. (2005). "A study of the<br />
membrane-water interface region of membrane proteins." J Mol<br />
Biol 346(1): 377-85.<br />
Grice, A. L., Kerr, I. D. eta Sansom, M. S. (1997). "Ion channels formed<br />
by HIV-1 Vpu: a modelling and simulation study." FEBS Lett<br />
405(3): 299-304.<br />
Guglielmone, H., Vitozzi, S., Elbarcha, O. eta Fernandez, E. (2001).<br />
"Cofactor dependence and isotype distribution of anticardiolipin<br />
antibodies in viral infections." Ann Rheum Dis 60(5): 500-4.<br />
Guinea, R. eta Carrasco, L. (1990). "Phospholipid biosynthesis and<br />
poliovirus genome replication, two coupled phenomena." Embo J<br />
9(6): 2011-6.<br />
Hakomori, S. eta Igarashi, Y. (1993). "Gangliosides and<br />
glycosphingolipids as modulators of cell growth, adhesion, and<br />
transmembrane signaling." Adv Lipid Res 25: 147-62.<br />
188
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Hakomori, S. eta Igarashi, Y. (1995). "Functional role of<br />
glycosphingolipids in cell recognition and signaling." J Biochem<br />
(Tokyo) 118(6): 1091-103.<br />
Hall, J. E., Vodyanoy, I., Balasubramanian, T. M. eta Marshall, G. R.<br />
(1984). "Alamethicin. A rich model for channel behavior." Biophys<br />
J 45(1): 233-47.<br />
Han, Z. eta Harty, R. N. (2004). "The NS3 protein of bluetongue virus<br />
exhibits viroporin-like properties." J Biol Chem 279(41): 43092-7.<br />
Hansen, J. C., Skalak, R., Chien, S. eta Hoger, A. (1997). "Influence of<br />
network topology on the elasticity of the red blood cell membrane<br />
skeleton." Biophys J 72(5): 2369-81.<br />
Harada, T., Tautz, N. eta Thiel, H. J. (2000). "E2-p7 region of the bovine<br />
viral diarrhea virus polyprotein: processing and functional<br />
studies." J Virol 74(20): 9498-506.<br />
Hatta, M. eta Kawaoka, Y. (2003). "The NB protein of influenza B virus<br />
is not necessary for virus replication in vitro." J Virol 77(10):<br />
6050-4.<br />
Haynes, B. F., Fleming, J., St Clair, E. W., Katinger, H., Stiegler, G.,<br />
Kunert, R., Robinson, J., Scearce, R. M., Plonk, K., Staats, H. F.,<br />
Ortel, T. L., Liao, H. X. eta Alam, S. M. (2005). "Cardiolipin<br />
polyspecific autoreactivity in two broadly neutralizing HIV-1<br />
antibodies." Science 308(5730): 1906-8.<br />
He, K., Ludtke, S. J., Heller, W. T. eta Huang, H. W. (1996). "Mechanism<br />
of alamethicin insertion into lipid bilayers." Biophys J 71(5):<br />
2669-79.<br />
Hecht, O., Van Nuland, N. A., Schleinkofer, K., Dingley, A. J., Bruhn,<br />
H., Leippe, M. eta Grotzinger, J. (2004). "Solution structure of the<br />
pore-forming protein of Entamoeba histolytica." J Biol Chem<br />
279(17): 17834-41.<br />
Heimburg, T. eta Marsh, D. (1995). "Protein surface-distribution and<br />
protein-protein interactions in the binding of peripheral proteins<br />
to charged lipid membranes." Biophys J 68(2): 536-46.<br />
Hessa, T., Kim, H., Bihlmaier, K., Lundin, C., Boekel, J., Andersson, H.,<br />
Nilsson, I., White, S. H. eta von Heijne, G. (2005). "Recognition of<br />
transmembrane helices by the endoplasmic reticulum<br />
translocon." Nature 433(7024): 377-81.<br />
Heymann, J. B., Zakharov, S. D., Zhang, Y. L. eta Cramer, W. A. (1996).<br />
"Characterization of electrostatic and nonelectrostatic<br />
components of protein--membrane binding interactions."<br />
Biochemistry 35(8): 2717-25.<br />
Ho, J., Uger, R. A., Zwick, M. B., Luscher, M. A., Barber, B. H. eta<br />
MacDonald, K. S. (2005). "Conformational constraints imposed on<br />
a pan-neutralizing HIV-1 antibody epitope result in increased<br />
antigenicity but not neutralizing response." Vaccine 23(13): 1559-<br />
73.<br />
189
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Holak, T. A., Engstrom, A., Kraulis, P. J., Lindeberg, G., Bennich, H.,<br />
Jones, T. A., Gronenborn, A. M. eta Clore, G. M. (1988). "The<br />
solution conformation of the antibacterial peptide cecropin A: a<br />
nuclear magnetic resonance and dynamical simulated annealing<br />
study." Biochemistry 27(20): 7620-9.<br />
Honig, B. H., Hubbell, W. L. eta Flewelling, R. F. (1986). "Electrostatic<br />
interactions in membranes and proteins." Annu Rev Biophys<br />
Biophys Chem 15: 163-93.<br />
Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G. eta Cullis, P. R. (1985). "Production<br />
of large unilamellar<br />
vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size<br />
distribution,<br />
trapped volume and ability to maintain a membrane potential." Biochim.<br />
Biophys. Acta 812: 55-65.<br />
Hormaeche, I., Iloro, I., Arrondo, J. L., Goni, F. M., de la Cruz, F. eta<br />
Alkorta, I. (2004). "Role of the transmembrane domain in the<br />
stability of TrwB, an integral protein involved in bacterial<br />
conjugation." J Biol Chem 279(12): 10955-61.<br />
Hovanessian, A. G., Briand, J. P., Said, E. A., Svab, J., Ferris, S., Dali,<br />
H., Muller, S., Desgranges, C. eta Krust, B. (2004). "The caveolin-<br />
1 binding domain of HIV-1 glycoprotein gp41 is an efficient B cell<br />
epitope vaccine candidate against virus infection." Immunity<br />
21(5): 617-27.<br />
Huang, H. W. (2006). "Molecular mechanism of antimicrobial peptides:<br />
The origin of cooperativity." Biochim Biophys Acta 1758(9): 1292-<br />
302.<br />
Huang, J., Swanson, J. E., Dibble, A. R., Hinderliter, A. K. eta<br />
Feigenson, G. W. (1993). "Nonideal mixing of phosphatidylserine<br />
and phosphatidylcholine in the fluid lamellar phase." Biophys J<br />
64(2): 413-25.<br />
Hughson, F. M. (1997). "Enveloped viruses: a common mode of<br />
membrane fusion?" Curr Biol 7(9): R565-9.<br />
Hultmark, D., Steiner, H., Rasmuson, T. eta Boman, H. G. (1980).<br />
"Insect immunity. Purification and properties of three inducible<br />
bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of<br />
Hyalophora cecropia." Eur J Biochem 106(1): 7-16.<br />
Hultmark, D., Engstrom, A., Bennich, H., Kapur, R. eta Boman, H. G.<br />
(1982). "Insect immunity: isolation and structure of cecropin D<br />
and four minor antibacterial components from Cecropia pupae."<br />
Eur J Biochem 127(1): 207-17.<br />
Hunter, D. G. eta Frisken, B. J. (1998). "Effect of extrusion pressure<br />
and lipid properties on the size and polydispersity of lipid<br />
vesicles." Biophys J 74(6): 2996-3002.<br />
Jain, M. K. (1988). Introduction to biological membranes., New York,<br />
John Wiley & Sons.<br />
Joyce, J. G., Hurni, W. M., Bogusky, M. J., Garsky, V. M., Liang, X.,<br />
Citron, M. P., Danzeisen, R. C., Miller, M. D., Shiver, J. W. eta<br />
Keller, P. M. (2002). "Enhancement of alpha -helicity in the HIV-1<br />
190
6. kapitulua: Bibliografia<br />
inhibitory peptide DP178 leads to an increased affinity for<br />
human monoclonal antibody 2F5 but does not elicit neutralizing<br />
responses in vitro. Implications for vaccine design." J Biol Chem<br />
277(48): 45811-20.<br />
Kaiser, E. T. eta Kezdy, F. J. (1987). "Peptides with affinity for<br />
membranes." Annu Rev Biophys Biophys Chem 16: 561-81.<br />
Keenan, T. W. eta Morre, D. J. (1970). "Phospholipid class and fatty acid<br />
composition of golgi apparatus isolated from rat liver and<br />
comparison with other cell fractions." Biochemistry 9(1): 19-25.<br />
Kim, Y., Valentine, K., Opella, S. J., Schendel, S. L. eta Cramer, W. A.<br />
(1998). "Solid-state NMR studies of the membrane-bound closed<br />
state of the colicin E1 channel domain in lipid bilayers." Protein<br />
Sci 7(2): 342-8.<br />
Klausner, R. D., Fauci, A. S., Corey, L., Nabel, G. J., Gayle, H., Berkley,<br />
S., Haynes, B. F., Baltimore, D., Collins, C., Douglas, R. G.,<br />
Esparza, J., Francis, D. P., Ganguly, N. K., Gerberding, J. L.,<br />
Johnston, M. I., Kazatchkine, M. D., McMichael, A. J., Makgoba,<br />
M. W., Pantaleo, G., Piot, P., Shao, Y., Tramont, E., Varmus, H.<br />
eta Wasserheit, J. N. (2003). "Medicine. The need for a global HIV<br />
vaccine enterprise." Science 300(5628): 2036-9.<br />
Klimkait, T., Strebel, K., Hoggan, M. D., Martin, M. A. eta Orenstein, J.<br />
M. (1990). "The human immunodeficiency virus type 1-specific<br />
protein vpu is required for efficient virus maturation and release."<br />
J Virol 64(2): 621-9.<br />
Koch, F. eta Koch, G. (1985). Morphological alterations of the host cell<br />
as an essential<br />
basis for poliovirus replication. The Molecular Biology of Poliovirus.<br />
Viena, Springer Verlag: 227-266.<br />
Kolchinsky, P., Mirzabekov, T., Farzan, M., Kiprilov, E., Cayabyab, M.,<br />
Mooney, L. J., Choe, H. eta Sodroski, J. (1999). "Adaptation of a<br />
CCR5-using, primary human immunodeficiency virus type 1<br />
isolate for CD4-independent replication." J Virol 73(10): 8120-6.<br />
Kuhn-Nentwig, L. (2003). "Antimicrobial and cytolytic peptides of<br />
venomous arthropods." Cell Mol Life Sci 60(12): 2651-68.<br />
Kunert, R., Ruker, F. eta Katinger, H. (1998). "Molecular<br />
characterization of five neutralizing anti-HIV type 1 antibodies:<br />
identification of nonconventional D segments in the human<br />
monoclonal antibodies 2G12 and 2F5." AIDS Res Hum<br />
Retroviruses 14(13): 1115-28.<br />
Kunert, R., Steinfellner, W., Purtscher, M., Assadian, A. eta Katinger, H.<br />
(2000). "Stable recombinant expression of the anti HIV-1<br />
monoclonal antibody 2F5 after IgG3/IgG1 subclass switch in<br />
CHO cells." Biotechnol Bioeng 67(1): 97-103.<br />
Kunert, R., Wolbank, S., Stiegler, G., Weik, R. eta Katinger, H. (2004).<br />
"Characterization of molecular features, antigen-binding, and in<br />
vitro properties of IgG and IgM variants of 4E10, an anti-HIV type<br />
1 neutralizing monoclonal antibody." AIDS Res Hum Retroviruses<br />
20(7): 755-62.<br />
191
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Kuo, L. eta Masters, P. S. (2003). "The small envelope protein E<br />
is not essential for murine coronavirus replication." J Virol 77(8):<br />
4597-608.<br />
Kyte, J. eta Doolittle, R. F. (1982). "A simple method for displaying the<br />
hydropathic character of a protein." J Mol Biol 157(1): 105-32.<br />
Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S. eta White, S. H. (2000). "How to<br />
measure and analyze<br />
tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother?"<br />
Analytical<br />
Biochemistry 285: 235-245.<br />
Lakey, J. H., Parker, M. W., Gonzalez-Manas, J. M., Duche, D., Vriend,<br />
G., Baty, D. eta Pattus, F. (1994). "The role of electrostatic charge<br />
in the membrane insertion of colicin A. Calculation and<br />
mutation." Eur J Biochem 220(1): 155-63.<br />
Lakowicz, J. R. (1983). Principles of fluorescence spectroscopy. New<br />
York, Plenum Press.<br />
Lama, J. eta Carrasco, L. (1992). "Expression of poliovirus<br />
nonstructural proteins in Escherichia coli cells. Modification of<br />
membrane permeability induced by 2B and 3A." J Biol Chem<br />
267(22): 15932-7.<br />
Lay, C. S., Wilson, K. A., Kobe, B., Kemp, B. E., Drummer, H. E. eta<br />
Poumbourios, P. (2004). "Expression and biochemical analysis of<br />
the entire HIV-2 gp41 ectodomain: determinants of stability map<br />
to N- and C-terminal sequences outside the 6-helix bundle core."<br />
FEBS Lett 567(2-3): 183-8.<br />
Lee, J. Y., Boman, A., Sun, C. X., Andersson, M., Jornvall, H., Mutt, V.<br />
eta Boman, H. G. (1989). "Antibacterial peptides from pig<br />
intestine: isolation of a mammalian cecropin." Proc Natl Acad Sci<br />
U S A 86(23): 9159-62.<br />
Leenhouts, J. M., van den Wijngaard, P. W., de Kroon, A. I. eta de<br />
Kruijff, B. (1995). "Anionic phospholipids can mediate membrane<br />
insertion of the anionic part of a bound peptide." FEBS Lett<br />
370(3): 189-92.<br />
Leontiadou, H., Mark, A. E. eta Marrink, S. J. (2006). "Antimicrobial<br />
peptides in action." J Am Chem Soc 128(37): 12156-61.<br />
Lesieur, C., Vecsey-Semjen, B., Abrami, L., Fivaz, M. eta Gisou van der<br />
Goot, F. (1997). "Membrane insertion: The strategies of toxins<br />
(review)." Mol Membr Biol 14(2): 45-64.<br />
Levy, J. A. (1994). HIV and AIDS pathogenesis. Washington,DC, ASM<br />
Press.<br />
Liang, X., Munshi, S., Shendure, J., Mark, G., 3rd, Davies, M. E., Freed,<br />
D. C., Montefiori, D. C. eta Shiver, J. W. (1999). "Epitope insertion<br />
into variable loops of HIV-1 gp120 as a potential means to<br />
improve immunogenicity of viral envelope protein." Vaccine<br />
17(22): 2862-72.<br />
Liepinsh, E., Andersson, M., Ruysschaert, J. M. eta Otting, G. (1997).<br />
"Saposin fold revealed by the NMR structure of NK-lysin." Nat<br />
Struct Biol 4(10): 793-5.<br />
192
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Liljestrom, P. eta Garoff, H. (1991). "Internally located cleavable<br />
signal sequences direct the formation of Semliki Forest virus<br />
membrane proteins from a polyprotein precursor." J Virol 65(1):<br />
147-54.<br />
Loewy, A., Smyth, J., von Bonsdorff, C. H., Liljestrom, P. eta<br />
Schlesinger, M. J. (1995). "The 6-kilodalton membrane protein of<br />
Semliki Forest virus is involved in the budding process." J Virol<br />
69(1): 469-75.<br />
Low, M. G. (1987). "Biochemistry of the glycosyl-phosphatidylinositol<br />
membrane protein anchors." Biochem J 244(1): 1-13.<br />
Luciw, P. A. (1996). Human immunodeficiency viruses and their<br />
replication. Fundamental Virology. P. M. H. D.M. Knipe.<br />
Philadelphia, Lippincott-Raven Publishers: 845-916.<br />
Lutter, M., Fang, M., Luo, X., Nishijima, M., Xie, X. eta Wang, X. (2000).<br />
"Cardiolipin provides specificity for targeting of tBid to<br />
mitochondria." Nat Cell Biol 2(10): 754-61.<br />
Madan, V., Garcia Mde, J., Sanz, M. A. eta Carrasco, L. (2005).<br />
"Viroporin activity of murine hepatitis virus E protein." FEBS Lett<br />
579(17): 3607-12.<br />
Maget-Dana, R. (1999). "The monolayer technique: a potent tool for<br />
studying the interfacial properties of antimicrobial and<br />
membrane-lytic peptides and their interactions with lipid<br />
membranes." Biochim Biophys Acta 1462(1-2): 109-40.<br />
Maidji, E., Tugizov, S., Jones, T., Zheng, Z. eta Pereira, L. (1996).<br />
"Accessory human cytomegalovirus glycoprotein US9 in the<br />
unique short component of the viral genome promotes cell-to-cell<br />
transmission of virus in polarized epithelial cells." J Virol 70(12):<br />
8402-10.<br />
Maloy, W. L. eta Kari, U. P. (1995). "Structure-activity studies on<br />
magainins and other host defense peptides." Biopolymers 37(2):<br />
105-22.<br />
Marusic, C., Rizza, P., Lattanzi, L., Mancini, C., Spada, M., Belardelli,<br />
F., Benvenuto, E. eta Capone, I. (2001). "Chimeric plant virus<br />
particles as immunogens for inducing murine and human<br />
immune responses against human immunodeficiency virus type<br />
1." J Virol 75(18): 8434-9.<br />
Matsuzaki, K. (1998). "Magainins as paradigm for the mode of action of<br />
pore forming polypeptides." Biochim Biophys Acta 1376(3): 391-<br />
400.<br />
Mayer, L. D., Hope, M. J. eta Cullis, P. R. (1986). "Vesicles of variable<br />
sizes produced by a rapid extrusion procedure." Biochim Biophys<br />
Acta 858(1): 161-8.<br />
McInerney, G. M., Smit, J. M., Liljestrom, P. eta Wilschut, J. (2004).<br />
"Semliki Forest virus produced in the absence of the 6K protein<br />
has an altered spike structure as revealed by decreased<br />
membrane fusion capacity." Virology 325(2): 200-6.<br />
McIntosh, T. J., Magid, A. D. eta Simon, S. A. (1989). "Repulsive<br />
interactions between uncharged bilayers. Hydration and<br />
193
6. kapitulua: Bibliografia<br />
fluctuation pressures for monoglycerides." Biophys J 55(5): 897-<br />
904.<br />
McIntyre, J. C. eta Sleight, R. G. (1991). "Fluorescence assay for<br />
phospholipid membrane asymmetry." Biochemistry 30(51):<br />
11819-27.<br />
Melnyk, R. A., Partridge, A. W., Yip, J., Wu, Y., Goto, N. K. eta Deber, C.<br />
M. (2003). "Polar residue tagging of transmembrane peptides."<br />
Biopolymers 71(6): 675-85.<br />
Melton, J. V., Ewart, G. D., Weir, R. C., Board, P. G., Lee, E. eta Gage,<br />
P. W. (2002). "Alphavirus 6K proteins form ion channels." J Biol<br />
Chem 277(49): 46923-31.<br />
Menestrina, G. (1986). "Ionic channels formed by Staphylococcus<br />
aureus alpha-toxin: voltage-dependent inhibition by divalent and<br />
trivalent cations." J Membr Biol 90(2): 177-90.<br />
Meyer, P. eta Reusser, F. (1967). "A polypeptide antibacterial agent<br />
isolated from Trichoderma viride." Experientia 23: 85-86.<br />
Micol, V., Sanchez-Pinera, P., Villalain, J., de Godos, A. eta Gomez-<br />
Fernandez, J. C. (1999). "Correlation between protein kinase C<br />
alpha activity and membrane phase behavior." Biophys J 76(2):<br />
916-27.<br />
Moerman, L., Bosteels, S., Noppe, W., Willems, J., Clynen, E., Schoofs,<br />
L., Thevissen, K., Tytgat, J., Van Eldere, J., Van Der Walt, J. eta<br />
Verdonck, F. (2002). "Antibacterial and antifungal properties of<br />
alpha-helical, cationic peptides in the venom of scorpions from<br />
southern Africa." Eur J Biochem 269(19): 4799-810.<br />
Moll, G. N., Clark, J., Chan, W. C., Bycroft, B. W., Roberts, G. C.,<br />
Konings, W. N. eta Driessen, A. J. (1997). "Role of transmembrane<br />
pH gradient and membrane binding in nisin pore formation." J<br />
Bacteriol 179(1): 135-40.<br />
Montoya, M. eta Gouaux, E. (2003). "Beta-barrel membrane protein<br />
folding and structure viewed through the lens of alphahemolysin."<br />
Biochim Biophys Acta 1609(1): 19-27.<br />
Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P. eta Zare, R. N. (1996).<br />
"Rapid preparation of giant unilamellar vesicles." Proc Natl Acad<br />
Sci U S A 93(21): 11443-7.<br />
Mosior, M. eta McLaughlin, S. (1992). "Electrostatics and reduction of<br />
dimensionality produce apparent cooperativity when basic<br />
peptides bind to acidic lipids in membranes." Biochim Biophys<br />
Acta 1105(1): 185-7.<br />
Munoz-Barroso, I., Salzwedel, K., Hunter, E. eta Blumenthal, R. (1999).<br />
"Role of the membrane-proximal domain in the initial stages of<br />
human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoproteinmediated<br />
membrane fusion." J Virol 73(7): 6089-92.<br />
Muster, T., Steindl, F., Purtscher, M., Trkola, A., Klima, A., Himmler,<br />
G., Ruker, F. eta Katinger, H. (1993). "A conserved neutralizing<br />
epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type 1." J Virol<br />
67(11): 6642-7.<br />
Muster, T., Guinea, R., Trkola, A., Purtscher, M., Klima, A., Steindl, F.,<br />
Palese, P. eta Katinger, H. (1994). "Cross-neutralizing activity<br />
194
6. kapitulua: Bibliografia<br />
against divergent human immunodeficiency virus type 1 isolates<br />
induced by the gp41 sequence ELDKWAS." J Virol 68(6): 4031-4.<br />
Nelson, D. L. eta Cox, M. M. (2005). Lehninger Principles of<br />
Biochemistry, W. Freeman.<br />
New, R. R. C. (1990). Liposomes, a practical approach. Oxford, IRL<br />
Press.<br />
Newton, K., Meyer, J. C., Bellamy, A. R. eta Taylor, J. A. (1997).<br />
"Rotavirus nonstructural glycoprotein NSP4 alters plasma<br />
membrane permeability in mammalian cells." J Virol 71(12):<br />
9458-65.<br />
Nicholls, D. G. (1982). Bioenergetics, Academic Press, New York.<br />
Nieva, J. L. eta Suarez, T. (2000). "Hydrophobic-at-interface regions in<br />
viral fusion protein ectodomains." Biosci Rep 20(6): 519-33.<br />
Nieva, J. L., Sanz, M. A. eta Carrasco, L. (2004). "Membranepermeabilizing<br />
motif in Semliki forest virus E1 glycoprotein."<br />
FEBS Lett 576(3): 417-22.<br />
Nieva, J. L., Agirre, A., Nir, S. eta Carrasco, L. (2003). "Mechanisms of<br />
membrane permeabilization by picornavirus 2B viroporin." FEBS<br />
Lett 552(1): 68-73.<br />
Nishizuka, Y. (1992). "Intracellular signaling by hydrolysis of<br />
phospholipids and activation of protein kinase C." Science<br />
258(5082): 607-14.<br />
Nyambi, P. N., Mbah, H. A., Burda, S., Williams, C., Gorny, M. K.,<br />
Nadas, A. eta Zolla-Pazner, S. (2000). "Conserved and exposed<br />
epitopes on intact, native, primary human immunodeficiency<br />
virus type 1 virions of group M." J Virol 74(15): 7096-107.<br />
Nyfeler, S., Senn, K. eta Kempf, C. (2001). "Expression of Semliki Forest<br />
virus E1 protein in Escherichia coli. Low pH-induced pore<br />
formation." J Biol Chem 276(18): 15453-7.<br />
Ofek, G., Tang, M., Sambor, A., Katinger, H., Mascola, J. R., Wyatt, R.<br />
eta Kwong, P. D. (2004). "Structure and mechanistic analysis of<br />
the anti-human immunodeficiency virus type 1 antibody 2F5 in<br />
complex with its gp41 epitope." J Virol 78(19): 10724-37.<br />
Ojcius, D. M. eta Young, J. D. (1991). "Cytolytic pore-forming proteins<br />
and peptides: is there a common structural motif?" Trends<br />
Biochem Sci 16(6): 225-9.<br />
Oren, Z., Hong, J. eta Shai, Y. (1999). "A comparative study on the<br />
structure and function of a cytolytic alpha-helical peptide and its<br />
antimicrobial beta-sheet diastereomer." Eur J Biochem 259(1-2):<br />
360-9.<br />
Oren, Z., Lerman, J. C., Gudmundsson, G. H., Agerberth, B. eta Shai,<br />
Y. (1999). "Structure and organization of the human antimicrobial<br />
peptide LL-37 in phospholipid membranes: relevance to the<br />
molecular basis for its non-cell-selective activity." Biochem J 341<br />
(Pt 3): 501-13.<br />
Ovchinnikov, Y. A. (1979). "Physico-chemical basis of ion transport<br />
through biological membranes: ionophores and ion channels." Eur<br />
J Biochem 94(2): 321-36.<br />
195
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Pai, E. F., Klein, M. H., Chong, P. eta Pedyczak, A. (2000). W. I.<br />
P. O. Patent. WO-00/61618.<br />
Panchal, R. G., Smart, M. L., Bowser, D. N., Williams, D. A. eta Petrou,<br />
S. (2002). "Pore-forming proteins and their application in<br />
biotechnology." Curr Pharm Biotechnol 3(2): 99-115.<br />
Parker, C. E., Deterding, L. J., Hager-Braun, C., Binley, J. M., Schulke,<br />
N., Katinger, H., Moore, J. P. eta Tomer, K. B. (2001). "Fine<br />
definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human<br />
immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal<br />
antibody 2F5." J Virol 75(22): 10906-11.<br />
Parker, M. W. eta Feil, S. C. (2005). "Pore-forming protein toxins: from<br />
structure to function." Prog Biophys Mol Biol 88(1): 91-142.<br />
Parker, M. W., Pattus, F., Tucker, A. D. eta Tsernoglou, D. (1989).<br />
"Structure of the membrane-pore-forming fragment of colicin A."<br />
Nature 337(6202): 93-6.<br />
Partridge, A. W., Melnyk, R. A., Yang, D., Bowie, J. U. eta Deber, C. M.<br />
(2003). "A transmembrane segment mimic derived from<br />
Escherichia coli diacylglycerol kinase inhibits protein activity." J<br />
Biol Chem 278(24): 22056-60.<br />
Pedersen, P. L. eta Carafoli, E. (1987). "Ion motive ATPases. I. Ubiquity,<br />
properties and significance to cell function." Trends Biol. Sci. 12:<br />
146-150.<br />
Penman, S. (1965). "Stimulation Of The Incorporation Of Choline In<br />
Poliovirus-Infected Cells." Virology 25: 149-52.<br />
Penman, S. (1965). "Stimulation of the incorporation of choline in<br />
poliovirus-infected cells." Virology 25(148-152).<br />
Penman, S. eta Summers, D. (1965). "Effects on host cell metabolism<br />
following synchronous infection with poliovirus." Virology 27(4):<br />
614-20.<br />
Perczel, A. eta Hollósi, M. (1996). Turns. Circular Dichroism and the<br />
Conformational Analysis of Biomolecules. G. D. Fasman. New<br />
York, Plenum Press.<br />
Perez-Paya, E., Dufourcq, J., Braco, L. eta Abad, C. (1997). "Structural<br />
characterisation of the natural membrane-bound state of melittin:<br />
a fluorescence study of a dansylated analogue." Biochim Biophys<br />
Acta 1329(2): 223-36.<br />
Petrovas, C., Vlachoyiannopoulos, P. G., Kordossis, T. eta<br />
Moutsopoulos, H. M. (1999). "Anti-phospholipid antibodies in HIV<br />
infection and SLE with or without anti-phospholipid syndrome:<br />
comparisons of phospholipid specificity, avidity and reactivity<br />
with beta2-GPI." J Autoimmun 13(3): 347-55.<br />
Pinto, L. H., Dieckmann, G. R., Gandhi, C. S., Papworth, C. G.,<br />
Braman, J., Shaughnessy, M. A., Lear, J. D., Lamb, R. A. eta<br />
DeGrado, W. F. (1997). "A functionally defined model for the M2<br />
proton channel of influenza A virus suggests a mechanism for its<br />
ion selectivity." Proc Natl Acad Sci U S A 94(21): 11301-6.<br />
Porter, A. G. (1993). "Picornavirus nonstructural proteins: emerging<br />
roles in virus replication and inhibition of host cell functions." J<br />
Virol 67(12): 6917-21.<br />
196
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Putsep, K., Normark, S. eta Boman, H. G. (1999). "The origin of<br />
cecropins; implications from synthetic peptides derived from<br />
ribosomal protein L1." FEBS Lett 451(3): 249-52.<br />
Rapaport, D. eta Shai, Y. (1991). "Interaction of fluorescently labeled<br />
pardaxin and its analogues with lipid bilayers." J Biol Chem<br />
266(35): 23769-75.<br />
Resh, M. D. (1994). "Myristylation and palmitylation of Src family<br />
members: the fats of the matter." Cell 76(3): 411-3.<br />
Ruiz-Arguello, M. B., Goni, F. M., Pereira, F. B. eta Nieva, J. L. (1998).<br />
"Phosphatidylinositol-dependent membrane fusion induced by a<br />
putative fusogenic sequence of Ebola virus." J Virol 72(3): 1775-<br />
81.<br />
Rust, R. C., Landmann, L., Gosert, R., Tang, B. L., Hong, W., Hauri, H.<br />
P., Egger, D. eta Bienz, K. (2001). "Cellular COPII proteins are<br />
involved in production of the vesicles that form the poliovirus<br />
replication complex." J Virol 75(20): 9808-18.<br />
Saez-Cirion, A. eta Nieva, J. L. (2002). "Conformational transitions of<br />
membrane-bound HIV-1 fusion peptide." Biochim Biophys Acta<br />
1564(1): 57-65.<br />
Saez-Cirion, A., Gomara, M. J., Agirre, A. eta Nieva, J. L. (2003). "Pretransmembrane<br />
sequence of Ebola glycoprotein. Interfacial<br />
hydrophobicity distribution and interaction with membranes."<br />
FEBS Lett 533(1-3): 47-53.<br />
Saez-Cirion, A., Nir, S., Lorizate, M., Agirre, A., Cruz, A., Perez-Gil, J.<br />
eta Nieva, J. L. (2002). "Sphingomyelin and cholesterol promote<br />
HIV-1 gp41 pretransmembrane sequence surface aggregation and<br />
membrane restructuring." J Biol Chem 277(24): 21776-85.<br />
Saez-Cirion, A., Arrondo, J. L., Gomara, M. J., Lorizate, M., Iloro, I.,<br />
Melikyan, G. eta Nieva, J. L. (2003). "Structural and functional<br />
roles of HIV-1 gp41 pretransmembrane sequence segmentation."<br />
Biophys J 85(6): 3769-80.<br />
Salzwedel, K., West, J. T. eta Hunter, E. (1999). "A conserved<br />
tryptophan-rich motif in the membrane-proximal region of the<br />
human immunodeficiency virus type 1 gp41 ectodomain is<br />
important for Env-mediated fusion and virus infectivity." J Virol<br />
73(3): 2469-80.<br />
Sambrook, J., Fritsch, E. R. eta Maniatis, T. (2001). Molecular Cloning:<br />
A Laboratory Manual. New York, NY, Cold Spring Harbor<br />
Laboratory Press.<br />
Sanchez-Magraner, L., Cortajarena, A. L., Goni, F. M. eta Ostolaza, H.<br />
(2006). "Membrane insertion of Escherichia coli alpha-hemolysin<br />
is independent from membrane lysis." J Biol Chem 281(9): 5461-<br />
7.<br />
Sanchez-Martinez, S., Lorizate, M., Hermann, K., Kunert, R., Basanez,<br />
G. eta Nieva, J. L. (2006). "Specific phospholipid recognition by<br />
human immunodeficiency virus type-1 neutralizing anti-gp41 2F5<br />
antibody." FEBS Lett 580(9): 2395-99.<br />
197
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Sanderson, C. M., Parkinson, J. E., Hollinshead, M. eta Smith, G. L.<br />
(1996). "Overexpression of the vaccinia virus A38L integral<br />
membrane protein promotes Ca2+ influx into infected cells." J<br />
Virol 70(2): 905-14.<br />
Sandoval, I. V. eta Carrasco, L. (1997). "Poliovirus infection and<br />
expression of the poliovirus protein 2B provoke the disassembly<br />
of the Golgi complex, the organelle target for the antipoliovirus<br />
drug Ro-090179." J Virol 71(6): 4679-93.<br />
Sankaram, M. B., Marsh, D., Gierasch, L. M. eta Thompson, T. E.<br />
(1994). "Reorganization of lipid domain structure in membranes<br />
by a transmembrane peptide: an ESR spin label study on the<br />
effect of the Escherichia coli outer membrane protein A signal<br />
peptide on the fluid lipid domain connectivity in binary mixtures<br />
of dimyristoyl phosphatidylcholine and distearoyl<br />
phosphatidylcholine." Biophys J 66(6): 1959-68.<br />
Sanz, M. A., Madan, V., Carrasco, L. eta Nieva, J. L. (2003). "Interfacial<br />
domains in Sindbis virus 6K protein. Detection and functional<br />
characterization." J Biol Chem 278(3): 2051-7.<br />
Saslowsky, D. E., Lawrence, J., Ren, X., Brown, D. A., Henderson, R. M.<br />
eta Edwardson, J. M. (2002). "Placental alkaline phosphatase is<br />
efficiently targeted to rafts in supported lipid bilayers." J Biol<br />
Chem 277(30): 26966-70.<br />
Sato, H. eta Feix, J. B. (2006). "Peptide-membrane interactions and<br />
mechanisms of membrane destruction by amphipathic alphahelical<br />
antimicrobial peptides." Biochim Biophys Acta 1758(9):<br />
1245-56.<br />
Sattentau, Q. J. eta Weiss, R. A. (1988). "The CD4 antigen: physiological<br />
ligand and HIV receptor." Cell 52(5): 631-3.<br />
Sattentau, Q. J., Zolla-Pazner, S. eta Poignard, P. (1995). "Epitope<br />
exposure on functional, oligomeric HIV-1 gp41 molecules."<br />
Virology 206(1): 713-7.<br />
Schibli, D. J., Montelaro, R. C. eta Vogel, H. J. (2001). "The membraneproximal<br />
tryptophan-rich region of the HIV glycoprotein, gp41,<br />
forms a well-defined helix in dodecylphosphocholine micelles."<br />
Biochemistry 40(32): 9570-8.<br />
Schlegel, A., Giddings, T. H., Jr., Ladinsky, M. S. eta Kirkegaard, K.<br />
(1996). "Cellular origin and ultrastructure of membranes induced<br />
during poliovirus infection." J Virol 70(10): 6576-88.<br />
Shai, Y. (1995). "Molecular recognition between membrane-spanning<br />
polypeptides." Trends Biochem Sci 20(11): 460-4.<br />
Shai, Y. (1999). "Mechanism of the binding, insertion and<br />
destabilization of phospholipid bilayer membranes by alphahelical<br />
antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic<br />
peptides." Biochim Biophys Acta 1462(1-2): 55-70.<br />
Shatursky, O., Heuck, A. P., Shepard, L. A., Rossjohn, J., Parker, M.<br />
W., Johnson, A. E. eta Tweten, R. K. (1999). "The mechanism of<br />
membrane insertion for a cholesterol-dependent cytolysin: a novel<br />
paradigm for pore-forming toxins." Cell 99(3): 293-9.<br />
198
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Shnaper, S., Sackett, K., Gallo, S. A., Blumenthal, R. eta Shai, Y.<br />
(2004). "The C- and the N-terminal regions of glycoprotein 41<br />
ectodomain fuse membranes enriched and not enriched with<br />
cholesterol, respectively." J Biol Chem 279(18): 18526-34.<br />
Silvestro, L., Weiser, J. N. eta Axelsen, P. H. (2000). "Antibacterial and<br />
antimembrane activities of cecropin A in Escherichia coli."<br />
Antimicrob Agents Chemother 44(3): 602-7.<br />
Simon, S. A. eta McIntosh, T. J. (1989). "Magnitude of the solvation<br />
pressure depends on dipole potential." Proc Natl Acad Sci U S A<br />
86(23): 9263-7.<br />
Simons, K. eta Ikonen, E. (1997). "Functional rafts in cell membranes."<br />
Nature 387(6633): 569-72.<br />
Singer, S. J. eta Nicolson, G. L. (1972). "The fluid mosaic model of the<br />
structure of cell membranes." Science 175(23): 720-31.<br />
Sipos, D., Andersson, M. eta Ehrenberg, A. (1992). "The structure of the<br />
mammalian antibacterial peptide cecropin P1 in solution,<br />
determined by proton-NMR." Eur J Biochem 209(1): 163-9.<br />
Slatin, S. L., Qiu, X. Q., Jakes, K. S. eta Finkelstein, A. (1994).<br />
"Identification of a translocated protein segment in a voltagedependent<br />
channel." Nature 371(6493): 158-61.<br />
Song, L., Hobaugh, M. R., Shustak, C., Cheley, S., Bayley, H. eta<br />
Gouaux, J. E. (1996). "Structure of staphylococcal alphahemolysin,<br />
a heptameric transmembrane pore." Science<br />
274(5294): 1859-66.<br />
Steiner, H., Hultmark, D., Engstrom, A., Bennich, H. eta Boman, H. G.<br />
(1981). "Sequence and specificity of two antibacterial proteins<br />
involved in insect immunity." Nature 292(5820): 246-8.<br />
Stouffer, A. L., Nanda, V., Lear, J. D. eta DeGrado, W. F. (2005).<br />
"Sequence determinants of a transmembrane proton channel: an<br />
inverse relationship between stability and function." J Mol Biol<br />
347(1): 169-79.<br />
Stroud, R. (1995). "Ion channel forming colicins." Curr Opin Struct Biol<br />
5(4): 514-20.<br />
Struck, D. K., Hoekstra, D. eta Pagano, R. E. (1981). "Use of resonance<br />
energy transfer to monitor membrane fusion." Biochemistry<br />
20(14): 4093-9.<br />
Stryer, L. (1978). "Fluorescence energy transfer as a spectroscopic<br />
ruler." Annu Rev Biochem 47: 819-46.<br />
Suarez, T., Gallaher, W. R., Agirre, A., Goni, F. M. eta Nieva, J. L.<br />
(2000). "Membrane interface-interacting sequences within the<br />
ectodomain of the human immunodeficiency virus type 1 envelope<br />
glycoprotein: putative role during viral fusion." J Virol 74(17):<br />
8038-47.<br />
Suarez, T., Nir, S., Goni, F. M., Saez-Cirion, A. eta Nieva, J. L. (2000).<br />
"The pre-transmembrane region of the human immunodeficiency<br />
virus type-1 glycoprotein: a novel fusogenic sequence." FEBS Lett<br />
477(1-2): 145-9.<br />
199
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Suhy, D. A., Giddings, T. H., Jr. eta Kirkegaard, K. (2000).<br />
"Remodeling the endoplasmic reticulum by poliovirus infection<br />
and by individual viral proteins: an autophagy-like origin for<br />
virus-induced vesicles." J Virol 74(19): 8953-65.<br />
Takagaki, Y., Radhakrishnan, R., Wirtz, K. W. eta Khorana, H. G.<br />
(1983). "The membrane-embedded segment of cytochrome b5 as<br />
studied by cross-linking with photoactivatable phospholipids. II.<br />
The nontransferable form." J Biol Chem 258(15): 9136-42.<br />
Takeda, M., Pekosz, A., Shuck, K., Pinto, L. H. eta Lamb, R. A. (2002).<br />
"Influenza a virus M2 ion channel activity is essential for efficient<br />
replication in tissue culture." J Virol 76(3): 1391-9.<br />
Tan, K., Liu, J., Wang, J., Shen, S. eta Lu, M. (1997). "Atomic structure<br />
of a thermostable subdomain of HIV-1 gp41." Proc Natl Acad Sci U<br />
S A 94(23): 12303-8.<br />
Tanner, M. J. A. "Isolation of integral membrane proteins and criteria<br />
for identifying carrier proteins." Curr. Topics Memb. Transp. 12: 1-<br />
51.<br />
Terrones, O., Antonsson, B., Yamaguchi, H., Wang, H. G., Liu, J., Lee,<br />
R. M., Herrmann, A. eta Basanez, G. (2004). "Lipidic pore<br />
formation by the concerted action of proapoptotic BAX and tBID."<br />
J Biol Chem 279(29): 30081-91.<br />
Tian, P., Ball, J. M., Zeng, C. Q. eta Estes, M. K. (1996). "The rotavirus<br />
nonstructural glycoprotein NSP4 possesses membrane<br />
destabilization activity." J Virol 70(10): 6973-81.<br />
Tian, P., Estes, M. K., Hu, Y., Ball, J. M., Zeng, C. Q. eta Schilling, W. P.<br />
(1995). "The rotavirus nonstructural glycoprotein NSP4 mobilizes<br />
Ca2+ from the endoplasmic reticulum." J Virol 69(9): 5763-72.<br />
Tieleman, D. P., Sansom, M. S. eta Berendsen, H. J. (1999).<br />
"Alamethicin helices in a bilayer and in solution: molecular<br />
dynamics simulations." Biophys J 76(1 Pt 1): 40-9.<br />
Tilley, S. J. eta Saibil, H. R. (2006). "The mechanism of pore formation<br />
by bacterial toxins." Curr Opin Struct Biol 16(2): 230-6.<br />
Trapani, J. A. eta Smyth, M. J. (2002). "Functional significance of the<br />
perforin/granzyme cell death pathway." Nat Rev Immunol 2(10):<br />
735-47.<br />
Trkola, A., Purtscher, M., Muster, T., Ballaun, C., Buchacher, A.,<br />
Sullivan, N., Srinivasan, K., Sodroski, J., Moore, J. P. eta<br />
Katinger, H. (1996). "Human monoclonal antibody 2G12 defines a<br />
distinctive neutralization epitope on the gp120 glycoprotein of<br />
human immunodeficiency virus type 1." J Virol 70(2): 1100-8.<br />
Unger, T., Oren, Z. eta Shai, Y. (2001). "The effect of cyclization of<br />
magainin 2 and melittin analogues on structure, function, and<br />
model membrane interactions: implication to their mode of<br />
action." Biochemistry 40(21): 6388-97.<br />
Van der Goot, F. G., Gonzalez-Manas, J. M., Lakey, J. H. eta Pattus, F.<br />
(1991). "A 'molten-globule' membrane-insertion intermediate of<br />
the pore-forming domain of colicin A." Nature 354(6352): 408-10.<br />
200
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Van der Goot, F. G., Didat, N., Pattus, F., Dowhan, W. eta<br />
Letellier, L. (1993). "Role of acidic lipids in the translocation and<br />
channel activity of colicins A and N in Escherichia coli cells." Eur<br />
J Biochem 213(1): 217-21.<br />
Van Kuppeveld, F. J., Melchers, W. J., Kirkegaard, K. eta Doedens, J. R.<br />
(1997). "Structure-function analysis of coxsackie B3 virus protein<br />
2B." Virology 227(1): 111-8.<br />
Van Kuppeveld, F. J., de Jong, A. S., Melchers, W. J. eta Willems, P. H.<br />
(2005). "Enterovirus protein 2B po(u)res out the calcium: a viral<br />
strategy to survive?" Trends Microbiol 13(2): 41-4.<br />
Van Kuppeveld, F. J., Galama, J. M., Zoll, J., van den Hurk, P. J. eta<br />
Melchers, W. J. (1996). "Coxsackie B3 virus protein 2B contains<br />
cationic amphipathic helix that is required for viral RNA<br />
replication." J Virol 70(6): 3876-86.<br />
Van Kuppeveld, F. J., Hoenderop, J. G., Smeets, R. L., Willems, P. H.,<br />
Dijkman, H. B., Galama, J. M. eta Melchers, W. J. (1997).<br />
"Coxsackievirus protein 2B modifies endoplasmic reticulum<br />
membrane and plasma membrane permeability and facilitates<br />
virus release." Embo J 16(12): 3519-32.<br />
Van Meer, G. (1989). "Lipid traffic in animal cells." Annu Rev Cell Biol 5:<br />
247-75.<br />
Vaz, W. L. eta Schoellmann, G. (1976). "Specific fluorescent derivatives<br />
of macromolecules. A fluorescence study of some specifically<br />
modified derivatives of chymotrypsin, trypsin and subtilisin."<br />
Biochim Biophys Acta 439(1): 206-18.<br />
Vincent, N., Genin, C. eta Malvoisin, E. (2002). "Identification of a<br />
conserved domain of the HIV-1 transmembrane protein gp41<br />
which interacts with cholesteryl groups." Biochim Biophys Acta<br />
1567(1-2): 157-64.<br />
Voet, D. eta Voet, J. G. (1992). En "Bioquímica", Omega, Barcelona.<br />
Voskoboinik, I. eta Trapani, J. A. (2006). "Addressing the mysteries of<br />
perforin function." Immunol Cell Biol 84(1): 66-71.<br />
Wallace, B. A. (1998). "Recent Advances in the High Resolution<br />
Structures of Bacterial Channels: Gramicidin A." J Struct Biol<br />
121(2): 123-41.<br />
Watanabe, T., Watanabe, S., Ito, H., Kida, H. eta Kawaoka, Y. (2001).<br />
"Influenza A virus can undergo multiple cycles of replication<br />
without M2 ion channel activity." J Virol 75(12): 5656-62.<br />
Weber, J. N. eta Weiss, R. A. (1988). "HIV infection: the cellular picture."<br />
Sci Am 259(4): 100-9.<br />
Weissenhorn, W., Dessen, A., Harrison, S. C., Skehel, J. J. eta Wiley, D.<br />
C. (1997). "Atomic structure of the ectodomain from HIV-1 gp41."<br />
Nature 387(6631): 426-30.<br />
White, S. H. eta Wimley, W. C. (1998). "Hydrophobic interactions of<br />
peptides with membrane interfaces." Biochim Biophys Acta<br />
1376(3): 339-52.<br />
White, S. H. eta Wimley, W. C. (1999). "Membrane protein folding and<br />
stability: physical principles." Annu Rev Biophys Biomol Struct 28:<br />
319-65.<br />
201
6. kapitulua: Bibliografia<br />
White, S. H., Wimley, W. C. eta Selsted, M. E. (1995). "Structure,<br />
function, and membrane integration of defensins." Curr Opin<br />
Struct Biol 5(4): 521-7.<br />
White, S. H., Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S. eta Hristova, K. (2001).<br />
"How membranes shape protein structure." J Biol Chem 276(35):<br />
32395-8.<br />
Wiener, M. C. eta White, S. H. (1991). "Fluid bilayer structure<br />
determination by the combined use of x-ray and neutron<br />
diffraction. II. "Composition-space" refinement method." Biophys J<br />
59(1): 174-85.<br />
Wiener, M. C. eta White, S. H. (1991). "Fluid bilayer structure<br />
determination by the combined use of x-ray and neutron<br />
diffraction. I. Fluid bilayer models and the limits of resolution."<br />
Biophys J 59(1): 162-73.<br />
Wiener, M. C. eta White, S. H. (1992). "Structure of a fluid<br />
dioleoylphosphatidylcholine bilayer determined by joint<br />
refinement of x-ray and neutron diffraction data. III. Complete<br />
structure." Biophys J 61(2): 434-47.<br />
Wilschut, J. (1991). Membrane fusion., New York, Marcel Dekker.<br />
Wilson, L., McKinlay, C., Gage, P. eta Ewart, G. (2004). "SARS<br />
coronavirus E protein forms cation-selective ion channels."<br />
Virology 330(1): 322-31.<br />
Wimley, W. C. eta White, S. H. (1996). "Experimentally determined<br />
hydrophobicity scale for proteins at membrane interfaces." Nat<br />
Struct Biol 3(10): 842-8.<br />
Wimley, W. C., Creamer, T. P. eta White, S. H. (1996). "Solvation<br />
energies of amino acid side chains and backbone in a family of<br />
host-guest pentapeptides." Biochemistry 35(16): 5109-24.<br />
Wimmer, E. eta Nomoto, A. (1993). "Molecular biology and cell-free<br />
synthesis of poliovirus." Biologicals 21(4): 349-56.<br />
Wu, L., Gerard, N. P., Wyatt, R., Choe, H., Parolin, C., Ruffing, N.,<br />
Borsetti, A., Cardoso, A. A., Desjardin, E., Newman, W., Gerard,<br />
C. eta Sodroski, J. (1996). "CD4-induced interaction of primary<br />
HIV-1 gp120 glycoproteins with the chemokine receptor CCR-5."<br />
Nature 384(6605): 179-83.<br />
Wu, Y., He, K., Ludtke, S. J. eta Huang, H. W. (1995). "X-ray diffraction<br />
study of lipid bilayer membranes interacting with amphiphilic<br />
helical peptides: diphytanoyl phosphatidylcholine with<br />
alamethicin at low concentrations." Biophys J 68(6): 2361-9.<br />
Xu, J. Y., Gorny, M. K., Palker, T., Karwowska, S. eta Zolla-Pazner, S.<br />
(1991). "Epitope mapping of two immunodominant domains of<br />
gp41, the transmembrane protein of human immunodeficiency<br />
virus type 1, using ten human monoclonal antibodies." J Virol<br />
65(9): 4832-8.<br />
Yang, Z. Y., Duckers, H. J., Sullivan, N. J., Sanchez, A., Nabel, E. G. eta<br />
Nabel, G. J. (2000). "Identification of the Ebola virus glycoprotein<br />
as the main viral determinant of vascular cell cytotoxicity and<br />
injury." Nat Med 6(8): 886-9.<br />
202
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Young, R. (1992). "Bacteriophage lysis: mechanism and<br />
regulation." Microbiol Rev 56(3): 430-81.<br />
Yuste, E., Reeves, J. D., Doms, R. W. eta Desrosiers, R. C. (2004).<br />
"Modulation of Env content in virions of simian immunodeficiency<br />
virus: correlation with cell surface expression and virion<br />
infectivity." J Virol 78(13): 6775-85.<br />
Zachowski, A. (1993). "Phospholipids in animal eukaryotic membranes:<br />
transverse asymmetry and movement." Biochem J 294 (Pt 1): 1-<br />
14.<br />
Zelezetsky, I., Pacor, S., Pag, U., Papo, N., Shai, Y., Sahl, H. G. eta<br />
Tossi, A. (2005). "Controlled alteration of the shape and<br />
conformational stability of alpha-helical cell-lytic peptides: effect<br />
on mode of action and cell specificity." Biochem J 390(Pt 1): 177-<br />
88.<br />
Zhang, M. Y., Xiao, X., Sidorov, I. A., Choudhry, V., Cham, F., Zhang, P.<br />
F., Bouma, P., Zwick, M., Choudhary, A., Montefiori, D. C.,<br />
Broder, C. C., Burton, D. R., Quinnan, G. V., Jr. eta Dimitrov, D.<br />
S. (2004). "Identification and characterization of a new crossreactive<br />
human immunodeficiency virus type 1-neutralizing<br />
human monoclonal antibody." J Virol 78(17): 9233-42.<br />
Zhu, P., Chertova, E., Bess, J., Jr., Lifson, J. D., Arthur, L. O., Liu, J.,<br />
Taylor, K. A. eta Roux, K. H. (2003). "Electron tomography<br />
analysis of envelope glycoprotein trimers on HIV and simian<br />
immunodeficiency virus virions." Proc Natl Acad Sci U S A<br />
100(26): 15812-7.<br />
Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Jr., Chertova, E., Lifson, J. D., Grise, H., Ofek,<br />
G. A., Taylor, K. A. eta Roux, K. H. (2006). "Distribution and<br />
three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes."<br />
Nature 441(7095): 847-52.<br />
Zwick, M. B. (2005). "The membrane-proximal external region of HIV-1<br />
gp41: a vaccine target worth exploring." Aids 19(16): 1725-37.<br />
Zwick, M. B., Wang, M., Poignard, P., Stiegler, G., Katinger, H., Burton,<br />
D. R. eta Parren, P. W. (2001). "Neutralization synergy of human<br />
immunodeficiency virus type 1 primary isolates by cocktails of<br />
broadly neutralizing antibodies." J Virol 75(24): 12198-208.<br />
Zwick, M. B., Bonnycastle, L. L., Menendez, A., Irving, M. B., Barbas, C.<br />
F., 3rd, Parren, P. W., Burton, D. R. eta Scott, J. K. (2001).<br />
"Identification and characterization of a peptide that specifically<br />
binds the human, broadly neutralizing anti-human<br />
immunodeficiency virus type 1 antibody b12." J Virol 75(14):<br />
6692-9.<br />
Zwick, M. B., Jensen, R., Church, S., Wang, M., Stiegler, G., Kunert, R.,<br />
Katinger, H. eta Burton, D. R. (2005). "Anti-human<br />
immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) antibodies 2F5 and 4E10<br />
require surprisingly few crucial residues in the membraneproximal<br />
external region of glycoprotein gp41 to neutralize HIV-1."<br />
J Virol 79(2): 1252-61.<br />
203
6. kapitulua: Bibliografia<br />
Zwick, M. B., Komori, H. K., Stanfield, R. L., Church, S., Wang, M.,<br />
Parren, P. W., Kunert, R., Katinger, H., Wilson, I. A. eta Burton,<br />
D. R. (2004). "The long third complementarity-determining region<br />
of the heavy chain is important in the activity of the broadly<br />
neutralizing anti-human immunodeficiency virus type 1 antibody<br />
2F5." J Virol 78(6): 3155-61.<br />
Zwick, M. B., Labrijn, A. F., Wang, M., Spenlehauer, C., Saphire, E. O.,<br />
Binley, J. M., Moore, J. P., Stiegler, G., Katinger, H., Burton, D.<br />
R. eta Parren, P. W. (2001). "Broadly neutralizing antibodies<br />
targeted to the membrane-proximal external region of human<br />
immunodeficiency virus type 1 glycoprotein gp41." J Virol 75(22):<br />
10892-905.<br />
204
6. kapitulua: Bibliografia<br />
205
6. kapitulua: Bibliografia<br />
206
6. kapitulua: Bibliografia<br />
AUTOREAREN ARGITALPENAK<br />
______________________________________________________________________<br />
Sanchez-Martinez, S., Lorizate, M., Hermann, K., Kunert, R., Basanez, G.<br />
eta Nieva, J. L. (2006). "Specific phospholipid recognition by<br />
human immunodeficiency virus type-1 neutralizing anti-gp41 2F5<br />
antibody." FEBS Lett 580(9): 2395-99.<br />
Sanchez-Martinez, S., Lorizate, M., Katinger, H., Kunert, R. eta Nieva, J.<br />
L. (2006). "Membrane association and epitope recognition by HIV-1<br />
neutralizing anti-gp41 2F5 and 4E10 antibodies." AIDS Res Hum<br />
Retroviruses 22(10): 998-1006.<br />
Lorizate, M., de la Arada, I., Huarte, N., Sanchez-Martinez, S., de la<br />
Torre, B. G., Andreu, D., Arrondo, J. L. eta Nieva, J. L. (2006).<br />
"Structural analysis and assembly of the HIV-1 Gp41 aminoterminal<br />
fusion peptide and the pretransmembrane amphipathicat-interface<br />
sequence." Biochemistry 45(48): 14337-46.<br />
Madan, V., Sanchez-Martinez, S., Vedovato, N., Rispoli, G., Carrasco, L.,<br />
eta Nieva, J.L. (2007). "Plasma cell membrane-porating domain in<br />
non-structural 2B viral protein." (PNAS-ra bidalia)<br />
207
6. kapitulua: Bibliografia<br />
208
Change language