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ruolo dei microrganismi nella produzione di biocombustibili

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DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA CELLULARE E DELLO SVILUPPO<br />

UNIVERSITA’ DI PALERMO<br />

RUOLO DEI MICRORGANISMI<br />

NELLA PRODUZIONE DI BIOCOMBUSTIBILI<br />

PAOLA QUATRINI<br />

LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA MOLECOLARE ED APPLICATA<br />

DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA CELLULARE E DELLO SVILUPPO


COSA SONO I MICRORGANISMI<br />

c. algae<br />

a. bacteria<br />

1 μm<br />

d. protozoa<br />

b. fungi: yeasts and molds<br />

e. viruses


Cellula procariotica Cellula eucariotica


L’ALBERO DELLA VITA<br />

MONERA<br />

MONERA<br />

PROTISTA<br />

FUNGI<br />

PLANTAE<br />

ANIMALIA


NONSOLOPATOGENI


NONSOLOPATOGENI


PROPRIETÀ CATABOLICHE DEI MICRORGANISMI<br />

“bioreme<strong>di</strong>ation”<br />

Menu<br />

Idrocarburi (n-alcani)<br />

Idrocarburi (aromatici e poliaromatici)<br />

Esplosivi (Trinitrotoluene TNT)<br />

Bifenili policlorurati<br />

organoclorurati<br />

Pestici<strong>di</strong> (organofosfati)<br />

Erbici<strong>di</strong> (atrazina)<br />

Alcaloi<strong>di</strong> (nicotina)


DIVERSITA’ METABOLICA DEI MICRORGANISMI<br />

O 2<br />

RESPIRAZIONE AEROBIA<br />

CO 2 , H 2 O, BIOMASSA, ENERGIA<br />

ATP<br />

FERMENTAZIONI<br />

ACIDI ORGANICI<br />

ETANOLO<br />

H 2<br />

O 2<br />

RESPIRAZIONE ANAEROBIA<br />

NO3<br />

SO4<br />

CO2 N2<br />

H2S<br />

CH4


METABOLISMO ENERGETICO


METABOLISMO ANAEROBIO:<br />

FERMETAZIONE ALCOLICA


La fermentazione alcolica<br />

Alcol <strong>dei</strong>drogenasi


AGENTI DELLA FERMENTAZIONE ALCOLICA:<br />

I LIEVITI<br />

Funghi unicellulari che si riproducono<br />

principalmente per via vegetativa<br />

(gemmazione o fissione)<br />

Basi<strong>di</strong>omiceti, Ascomiceti e<br />

Deuteromiceti<br />

Metabolismo: Aerobi obbligati o<br />

anaerobi facoltativi<br />

Osmofili e alofili. Su frutti e vegetali.<br />

Agenti della fermentazione alcolica<br />

(vino, birra pane).<br />

Eucarioti modello<br />

Saccharomyces cerevisiae


CONVERSIONE DELLE<br />

BIOMASSE IN BIOCARBURANTI<br />

• Fattori geopolitici<br />

• Ambiente<br />

• tecnologie


PRODUZIONE DI ETANOLO DA AMIDO DI<br />

MAIS<br />

AMIDO saccarificazione GLUCOSIO fermentazione ETANOLO<br />

α-amylasi<br />

• Tecnologia matura<br />

Saccharomyces<br />

• Efficienza (amilasi a basso pH, attive su amido grezzo e crudo)


OCCORRONO ALTRE BIOMASSE<br />

• L’incremento <strong>nella</strong> <strong>produzione</strong> <strong>di</strong> etanolo<br />

(che non competa con l’alimentazione<br />

umana ed animale) può derivare solo<br />

dall’uso <strong>di</strong> altri substrati<br />

• Tali substrati alternativi sono definiti<br />

“biomasse” ed includono residui<br />

dell’agricoltura, legno, rifiuti soli<strong>di</strong> urbani e<br />

colture de<strong>di</strong>cate<br />

•…E DOBBIAMO LIBERARCI DEI RIFIUTI!


BIOETANOLO DA BIOMASSE LIGNOCELLULOSICHE<br />

Più equa <strong>di</strong>stribuzione geografica<br />

delle risorse. Risorse domestiche<br />

Il materiale lignocellulosico non<br />

compete con le risorse alimentari,<br />

costa meno e richiede minori input<br />

energetici e fertilizzanti/pestici<strong>di</strong><br />

Basso effetto serra<br />

Impiego in aree rurali<br />

Hahn-Hagerdal et al., Trends Biotech. 2006


BIOMASSE<br />

Key global biomass resources from agricultural residues, wood, and herbaceous<br />

energy crops.


Component<br />

Cellulose<br />

Hemicellulose<br />

& pectin<br />

Lignin<br />

Extractives<br />

COMPOSIZIONE DEL LEGNO<br />

% w/w approx<br />

40-50<br />

20-35<br />

15-25<br />

5<br />

State<br />

Crystalline<br />

Semicrystalline<br />

Amorphous<br />

Monomeric<br />

Made of<br />

Glucose<br />

Galactose<br />

Mannose<br />

Xylose<br />

Phenylpropane<br />

Terpenes<br />

Phenolics<br />

Functions<br />

Microfibre<br />

Matrix<br />

Matrix<br />

Toxicity


STRUTTURA DELLE PRINCIPALI MOLECOLE<br />

CELLULOSA<br />

Polimero Po cristallino del<br />

glucosio<br />

LIGNINA<br />

etropolimero degli<br />

alcol del fenilpropano<br />

(sinapyl, coumaryl,<br />

coniferyl)<br />

EMICELLULOSE E PECTINE<br />

Polimeri <strong>di</strong> galattosio, pentosi (xilosio e mannosio)e altre molecole<br />

G, galactose A, arabinose; FeA, ferulic acid;; Glc, glucuronic acid; X, xylose


overall conversion process of an energy crop to ethanol


SCHEMA DI PROCESSO DI UNA<br />

BIORAFFINERIA<br />

GRAY ET AL.2006


INTEGRAZIONE DEI PROCESSI<br />

Resa in zuccheri ed etanolo <strong>di</strong> materiale lignocellulosico <strong>di</strong> abete pre-trattato con<br />

vapore .<br />

EH, resa in zucchero dopo idrolisi enzimatica<br />

SSF, resa in etanolo dopo saccarificazione e fermentazione simultanea;


ATTACCO ENZIMATICO<br />

DEI POLIMERI LIGNO-CELLULOSICI<br />

.<br />

White = glucose, green = xylose, yellow =<br />

glucuronic acid, red = arabinose,.<br />

Acetate groups are shown as triangles,<br />

phenolic groups as <strong>di</strong>agonals, and methyl<br />

groups as rombs.<br />

CELLULOSA<br />

XILANO<br />

ENDOGLUCANASI: taglio casuale del legame<br />

Β-1,4 glicosi<strong>di</strong>co interno alla molecola<br />

EXOGLUCANASI: taglio alle estremità <strong>di</strong> residui<br />

oligosaccari<strong>di</strong>ci corti solubili (es cellobiosio)<br />

Β-GLUCOSIDASI: idrolizzano gli oligosaccari<strong>di</strong> a<br />

glucosio


PRODUTTORI DI ENZIMI<br />

DEGRADATORI<br />

• Representative Cellulase-producing Microorganisms<br />

• Fungi<br />

Acremonium cellulolyticus Aspergillus acculeatus Aspergillus niger<br />

Aspergillus fumigatus<br />

Irpex lacteus Penicillium funmiculosum<br />

Phanerochaete Fusarium solani<br />

Schizophyllum commune<br />

Sclerotium rolfsii Sporotrichum cellulophilum Talaromyces emersonii<br />

Thielavia terrestris Trichoderma koningii Trichoderma reesei Trichoderma<br />

viride<br />

Bacteria<br />

Clostri<strong>di</strong>um thermocellum Ruminococcus albus<br />

• (Actinomycetes) Streptomyces sp. Thermoactinomyces Thermomonospora<br />

curvata


PRODUTTORI DI ENZIMI<br />

DEGRADATORI<br />

• Fungo (ascomicete) filamentoso<br />

cellulosolitico<br />

• Secerne enzimi cellulosolitici<br />

(cellobioidrolasi e endoglucanasi) ed<br />

emicellulosolitici nel mezzo <strong>di</strong> coltura.<br />

• Prodotti commerciali<br />

• Genoma 7 cromosomi, 33Mb<br />

• Geneticamente manipolabile<br />

• Vari mutanti termostabili ed efficienti<br />

Tricoderma reesei


Impianti attivi


ETANOLO DA MATERIALE LIGNOCELLULOSICO:<br />

QUALI OSTACOLI<br />

1. Effciente depolimerizzazione <strong>di</strong> cellulosa ed emicellulose in zuccheri<br />

solubili<br />

2. Efficiente fermentazione dell’idrolizzato composto da esosi e pentosi in<br />

presenza <strong>di</strong> inibitori (es composti fenolici)<br />

3. Riduzione dell’input energetico<br />

4. Utilizzazione della lignina


Produzione <strong>di</strong> biomasse<br />

Overview of plant traits that can be targeted by accelerated domestication<br />

for enhanced plant biomass production and processing


ETANOLO DA MATERIALE LIGNOCELLULOSICO:<br />

NUOVE STRATEGIE<br />

• NUOVI CEPPI MICROBICI<br />

• INGEGNERIA GENETICA<br />

DNA ricombinante<br />

• INGEGNERIA METABOLICA<br />

Approccio multi<strong>di</strong>sciplinare. Mo<strong>di</strong>fica del metabolismo me<strong>di</strong>ante<br />

utilizzazione <strong>di</strong> tecniche ricombinanti include: inserimento <strong>di</strong> nuovi<br />

pathway, Miglioramento efficienza <strong>dei</strong> pathway esistenti.


ETANOLO DA MATERIALE LIGNOCELLULOSICO:<br />

NUOVE STRATEGIE<br />

• NUOVI CEPPI MICROBICI<br />

• INGEGNERIA GENETICA<br />

DNA ricombinante<br />

• INGEGNERIA METABOLICA<br />

Approccio multi<strong>di</strong>sciplinare. Mo<strong>di</strong>fica del metabolismo me<strong>di</strong>ante<br />

utilizzazione <strong>di</strong> tecniche ricombinanti include: inserimento <strong>di</strong> nuovi<br />

pathway, Miglioramento efficienza <strong>dei</strong> pathway esistenti.


Clostri<strong>di</strong>um CLOSTRIDIUM thermocellum<br />

• anaerobio<br />

• sporigeno<br />

• termofilo (60°c)<br />

• Ridotta biomassa<br />

• Bilancio energetico<br />

• elevata crescita su<br />

cellulosa cristallina<br />

• Assimila cellodestrine<br />

(non cellobiosio) me<strong>di</strong>ante<br />

sistemi trasporto ABC<br />

•sistemi celulosolitici complessi (Cellulosomi)


SCHEMA DI PROCESSO SSF<br />

PER LA CONVERSIONE DI BIOMASSE AD ETANOLO


Cellulosomes<br />

. Transmission electron micrographs of Clostri<strong>di</strong>um thermocellum cells<br />

showing cellulosome aggregates on cell surfaces (in<strong>di</strong>cated by<br />

arrows; A), and, at higher magnification, in<strong>di</strong>vidual cellulosomes of<br />

Clostri<strong>di</strong>um papyrosolvens (B). Also shown is a model of C.<br />

thermocellum cellulosomes and an associated cell-surface anchoring<br />

protein.


IL CELLULOSOMA DI<br />

• Cellulosomes are cell protuberances<br />

which tightly bind to crystalline<br />

cellulose<br />

CLOSTRIDIUM<br />

• They me<strong>di</strong>ate a close neighborhood<br />

between cell and substrate and thus<br />

minimize <strong>di</strong>ffusion losses of hydrolytic<br />

products,<br />

• A cellulosome preparation contains a<br />

number of <strong>di</strong>fferent proteins, most of<br />

them having enzymatic activity<br />

• This dockerin module binds<br />

specifically to the cohesin modules,<br />

located in a non-catalytic cellulosome<br />

component, for which the term<br />

"scaffol<strong>di</strong>n" was coined (cellulosome<br />

structure).


The clostri<strong>di</strong>al coculture process<br />

•The clostri<strong>di</strong>al coculture process in which C. thermocellum serves as the<br />

cellulase and hemicellulase producer. The hemicellulose-derived pentoses<br />

can be utilized by C. thermosaccharolyticum but not C. thermocellum.<br />

•C. thermosaccharolyticum uses cellobiose faster and is a better ethanol<br />

producer. In ad<strong>di</strong>tion to cellobiose, cellodextrins are also produced from<br />

cellulose and can be utilized <strong>di</strong>rectly.<br />

Demain et al., 2005


ETANOLO DA MATERIALE LIGNOCELLULOSICO:<br />

NUOVE STRATEGIE<br />

• NUOVI CEPPI MICROBICI<br />

• INGEGNERIA GENETICA<br />

DNA ricombinante<br />

• INGEGNERIA METABOLICA<br />

Approccio multi<strong>di</strong>sciplinare. Mo<strong>di</strong>fica del metabolismo me<strong>di</strong>ante<br />

utilizzazione <strong>di</strong> tecniche ricombinanti include: inserimento <strong>di</strong> nuovi<br />

pathway, Miglioramento efficienza <strong>dei</strong> pathway esistenti.


L’INFORMAZIONE GENETICA<br />

Un Gene è una sequenza <strong>di</strong> DNA<br />

che co<strong>di</strong>fica per una proteina, un<br />

tRNA o un rRNA


DNA<br />

ricombinante


Clonaggio <strong>di</strong> <strong>di</strong>versi<br />

frammenti <strong>di</strong> DNA<br />

in un vettore<br />

Analisi del gene<br />

Espressione eterologa e recupero della proteina


Screening <strong>dei</strong> cloni ricombinanti<br />

Attività betaglicosidasica<br />

Attività cellobioidrolasica


ETANOLO DA MATERIALE LIGNOCELLULOSICO:<br />

NUOVE STRATEGIE<br />

• NUOVI CEPPI MICROBICI<br />

• INGEGNERIA GENETICA<br />

DNA ricombinante<br />

• INGEGNERIA METABOLICA<br />

Approccio multi<strong>di</strong>sciplinare. Mo<strong>di</strong>fica del metabolismo me<strong>di</strong>ante<br />

utilizzazione <strong>di</strong> tecniche ricombinanti include: inserimento <strong>di</strong> nuovi<br />

pathway, Miglioramento efficienza <strong>dei</strong> pathway esistenti.


CEPPI METABOLICAMENTE INGEGNERIZZATI PER<br />

L’UTILIZZAZIONE DI PENTOSI<br />

Either the tail end, as in Escherichia coli and Klebsiella oxytoca, or the front end<br />

of metabolism, as for Saccharomyces cerevisiae and Zymomonas mobilis, have<br />

been engineered. Abbreviation: rec, recombinant.


Zymomonas mobilis, a metabolically<br />

engineered bacteria used for fermenting both<br />

glucose and xylose to ethanol.<br />

Science, February 2007<br />

applicazioni<br />

An 8000-liter fermentation tank<br />

used to start the process of<br />

turning cellulosic material into<br />

ethanol.


FERMENTAZIONE IN CLOSTRIDIUM<br />

• Ethanol, lactate, and acetate fermentation<br />

by C. thermocellum.<br />

• 1, enzymes of Embden-Meyerhof<br />

pathway;<br />

• 2, lactate dehydrogenase;<br />

• 3, pyruvate-ferredoxin oxidoreductase;<br />

• 4, acetaldehyde dehydrogenase;<br />

• 5, alcohol dehydrogenase;<br />

• 6, phosphotransacetylase;<br />

• 7, acetate kinase.


CBP: consolidated bioprocessing<br />

STRATEGIE<br />

Lynd et al., Current opinion in Biotechnology 2005


Obiettivi della ricerca<br />

• migliorare l’idrolisi enzimatica e ridurre i costi.<br />

• sviluppare <strong>microrganismi</strong> “robusti” più tolleranti agli inibitori che<br />

fermentano tutti gli zuccheri con alte rese in etanolo.<br />

• estendere l’integrazione <strong>dei</strong> processi riducendo gli steps, ridurre gli<br />

input, eliminare l’uso <strong>di</strong> acqua, riutilizzare gli scarti


Figure 5. Biorefinery – integration of a combined heat and<br />

power plant with an ethanol production plant.


metanogenesi<br />

La bioconversione del materiale organico<br />

complesso richiede 4 fasi e cinque gruppi<br />

fisiologici <strong>di</strong> <strong>microrganismi</strong><br />

a. Idrolisi delle macromolecole a monomeri e<br />

fermentazione (m. fermentanti)<br />

b. Ossidazione degli aci<strong>di</strong> organici a acetato<br />

e idrogeno. Acetogenesi (batteri<br />

acetogenici)<br />

c. Produzione <strong>di</strong> acetato da H 2 e CO 2<br />

(acetogeni e omoacetogeni)<br />

d. Conversione dell’acetato a metano e<br />

anidride carbonica (Metanogeni<br />

Idrogenotrofi)<br />

e. Metanogenesi (Metanogeni acetoclasti)


La terra: il pianeta <strong>dei</strong> <strong>microrganismi</strong>

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