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uomini, microrganismi e virus Relazione interattiva Ernesto Burgio

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Microbi, <strong>virus</strong>, genomi<br />

e e malattie: malattie: verso un<br />

paradigma co co‐evolutivo evolutivo<br />

<strong>Ernesto</strong> <strong>Burgio</strong><br />

Comitato Scientifico<br />

ISDE Italia


1<br />

• Siamo abituati ad affrontare il problema delle relazioni tra<br />

uomo, <strong>microrganismi</strong> e <strong>virus</strong> in modo antropocentrico,<br />

antagonistico e riduttivo. Partendo, in pratica,<br />

dalle tradizionali domande (come cercherò di dimostrare<br />

ffuorvianti i tie pericolose): i l )<br />

‐ quali sono i batteri, i <strong>virus</strong> e i parassiti patogeni per<br />

l’uomo? l uomo? come agiscono ?<br />

‐ come possiamo difenderci ? O addirittura: come dobbiamo<br />

“ combatterli ”?


UN APPROCCIO DIVERSO<br />

Uomini, batteri, protozoi e <strong>virus</strong><br />

Sarebbe urgente e necessario (e non soltanto per motivi di ordine<br />

astratto, concettuale)<br />

partire i dda domande d d differenti: diff i<br />

‐ quale ruolo hanno batteri, protozoi e <strong>virus</strong> nell’ambito della<br />

biosfera ?<br />

‐ come e perché si vanno continuamente trasformando ?<br />

come cambia il loro rapporto con l’uomo e, più in generale, con<br />

gli organismi pluricellulari/eucarioti ?<br />

Mi Microrganismi i i essenza dll della bi biosfera f<br />

Cicli bio bio‐geochimici geochimici naturali ee… innaturali<br />

il “Ciclo degli Estrogeni”


• Bisognerebbe g in primis p ricordare come i <strong>microrganismi</strong> g<br />

rappresentino l’essenza stessa della biosfera:<br />

ne sono infatti di gran lunga la componente fondamentale<br />

sul l piano i sia i quantitativo i i (60 (60‐90% 90% ddella ll bi biomassa a seconda d<br />

che vi si includa o meno la cellulosa) che qualitativo.<br />

• Senza “organismi superiori” la biosfera potrebbe sopravvivere<br />

sopravvivere,<br />

mentre senza <strong>microrganismi</strong> l’intera ecosfera collasserebbe:<br />

è sufficiente ricordare il ruolo centrale svolto dai<br />

batteri nei cicli bio‐geochimici e in particolare nel ciclo<br />

dell’azoto


Molecular nitrogen (N2 ) is the most abundant element in the air we<br />

breathe. Yet, large quantities of this nitrogen are not available to<br />

organisms. Why is this the case? One reason molecular nitrogen is in<br />

short supply is because it takes a large amount of energy to break<br />

the triple bond that holds the two nitrogen elements together.<br />

Nitrogen fixation is accomplished by nitrifying bacteria in soil and<br />

water. These organisms are capable of breaking this bond and<br />

converting the nitrogen into ammonia (NH3) and nitrate (NO3). The resulting nitrogen is termed fixed nitrogen nitrogen. Such a scenario allows<br />

nitrifying bacteria living in conjunction with certain plants to<br />

convert atmospheric nitrogen into a form that plants can use which<br />

is ultimately passed up the food chain. When organisms break down<br />

proteins during respiration, they release their nitrogen as ammonia<br />

(fish) (fish), urea (mammals) (mammals), or uric acid (birds (birds, reptiles and<br />

insects). Decomposers obtain nourishment from these products by<br />

converting them back into ammonia, which plants can then use again,<br />

completing the cycle. Finally, denitrification, accomplished again by<br />

bacteria, converts nitrate back into nitrogen gas<br />

The Steroid Cycle<br />

In light of the genetic and functional similarities between<br />

ER ERa and d NodD, N dD EDC EDCs th that t are able bl to t bind bi d ER ERs and d<br />

modulate signaling may employ the same mechanism to<br />

modulate the ability of S. Meliloti NodD to respond to the<br />

phytoestrogen signal, luteolin …<br />

These results raise the possibility that endocrine<br />

disruption may be seen in symbiotic environmental<br />

signaling systems that exist between organisms rather<br />

than within them.<br />

http://www.citruscollege.edu/apps/pub.asp?Q=847


the “Steroid Cycle”…<br />

IN 1958, Dr. Roy Hertz described the “steroid cycle,” anticipating what we now call endocrine disrupter<br />

research, , as follows: “. . . we have to consider that the introduction of . . . [hormones [ into cattle feed lots] ]<br />

leads to the exposure . . . of individuals who might otherwise not ever in their lives come in contact with<br />

such materials . . . . This is not a theoretical consideration because we . . . now have encountered two<br />

families, each with two children, who presented with simultaneously developing gynecomastia<br />

attributable to the accidental contamination of vitamin capsules p by y estrogens g during g manufacture. If such<br />

estrogens can, by stray handling, get into such pharmaceutical preparations, can they not very readily get<br />

where they are not wanted on the farm? There is one additional consideration in this regard . . . . The<br />

fecal excretion of these materials . . . will be dropped on the soil and . . . over generations there will be<br />

constant replenishment p of the soil surface with steroidal substances of this kind.<br />

This in turn has its effect potentially on surface water‐supply contamination and also potentially on the<br />

vegetable content of steroids in crops raised on such soil . . . . I think that we are now actually setting up<br />

a steroid cycle in our environment, and we have to give very serious consideration to its implications for<br />

our subsequent q development p and ggrowth and ppossibly yreproductive p functions“ (taken ( from the<br />

discussion following Ref. 1).


• Altrettanto importante è ricordare come i <strong>microrganismi</strong><br />

svolgano l il lloro prezioso i ruolo l su questo pianeta i<br />

da miliardi di anni e come tutte le forme attualmente<br />

viventi derivino da essi essi, ne siano in larga parte costituiti costituiti, ne<br />

traggano immensi benefici.<br />

• Per quanto concerne più direttamente l’uomo luomo occorre<br />

ribadire come spesso ci si dimentichi che senza batteri,<br />

parassiti e <strong>virus</strong> non potremmo sopravvivere:<br />

dimenticanza a cui si riconnette il suaccennato<br />

atteggiamento antagonistico, che rischiamo<br />

di pagare a carissimo prezzo


Self/Non Self or Danger Signals ?


https://www.msu.edu/course/lbs/148h/fall2007/0920prokaryotes&<strong>virus</strong>es.pdf<br />

WHERE DO WE COME FROM ?


http://www.life.uiuc.edu/Micro/woese.html<br />

Carl R. Woese<br />

Professor of Microbiology<br />

B.A. (Math & Physics), Amherst College, 1950<br />

Ph.D. (Biophysics), Yale University, 1953<br />

Postdoc. (Biophysics), Yale University, 1953‐1960<br />

Biophysicist, General Electric Research Laboratory, 1960‐1963<br />

My evolutionary concerns center on the bacteria and<br />

the archea, whose evolutions cover most of the planet's<br />

4.5‐billion‐year history.<br />

Using ribosomal RNA sequence as an evolutionary measure, my laboratory<br />

has reconstructed the phylogeny of both groups, and thereby provided<br />

a phylogenetically valid system of classification for prokaryotes.<br />

prokaryotes<br />

The discovery of the archaea was in fact a product of these studies.


htttp://www.uccmp.berkeleyy.edu/alllife/<br />

/threedomaiins.html<br />

3 Domains<br />

(see Fig 27.2)<br />

Woese's Proposed Classification of Lifeforms<br />

(see C&R Fig 26.1 & 26.16)<br />

http://whyfiles.org/022critters/archaea.html<br />

1998.<br />

The pretty picture we've shown you<br />

turns out to be a simplification of reality reality.<br />

Now that the complete genomes<br />

of more than a dozen microbes are known,<br />

it seems that Eukarya ‐ the higher organisms ‐<br />

may not have sprouted off the Archaea,<br />

as Woese supposed.<br />

Genetic information from organisms<br />

on the three branches of life<br />

seem contradictory at this point.<br />

As Woese said…<br />

"Each picture is different,<br />

so there's tremendous confusion."<br />

The problem could be rooted in the ability<br />

HGT of organisms like bacteria to transfer groups<br />

of genes among themselves, themselves or even to engulf<br />

other organisms and incorporate their genes.<br />

That kind of transfer would make MARGULISS<br />

a tree metaphor, with everything<br />

tracing back to a common ancestor,<br />

less appropriate than<br />

a network metaphor, with myriad connections<br />

between what we we've ve been calling branches<br />

on the tree of life.


Ipotesi – endosimbionti (Lynn Margulis)<br />

un batterio dotato di metabolismo anaerobico avrebbe inglobato un battere a<br />

metabolismo aerobico (dal quale si sarebbero prodotti i mitocondri mentre il<br />

battere ospite avrebbe fornito il nucleo) – ecc.. ecc..


4<br />

3<br />

2<br />

1


Percentage of non‐coding DNA during evolution


A small fraction of the chromosomal DNA codes for proteins


Using Mice


Il genoma dello scimpanzé è per il 98.77% identico a quello umano.<br />

In media, un gene codificante una proteina in un uomo differisce dal<br />

suo ortologo nello scimpanzé<br />

per ddue sole l sostituzioni i i i<br />

aminoacidiche<br />

..quasi un terzo<br />

dei geni umani<br />

hanno esattamente<br />

la stessa traduzione<br />

proteica dei loro<br />

ortologhi l hi<br />

nello<br />

scimpanzé<br />

Evo<br />

Species phylogeny<br />

..piuttosto stabili<br />

da milioni di anni<br />

sul piano genetico<br />

e fenotipico... p<br />

From the Tree of the Life Website,<br />

University y of f Arizona<br />

Orangutan Gorilla Chimpanzee Human<br />

Orangutan Gorilla Chimpanzee<br />

Sanger Institute


Evo<br />

6‐8<br />

million<br />

years<br />

Chimpanzee‐human<br />

divergence<br />

Chimpanzees Humans<br />

Hominids or hominins<br />

Brain:<br />

a rapidly<br />

evolving<br />

Organ ?


(OLOCENE)<br />

31 DICEMBRE ‐ ULTIMO MINUTO<br />

• ore 23,59'15" ‐‐> i Sumeri in Mesopotamia<br />

• ore 23,59'43" ‐‐>Alessandro Magno ‐ Primo “Impero”<br />

• ore 23,59'46" ‐‐> Gesù Cristo<br />

• ore 23 23,59 59'49" 49 ‐‐>Caduta Impero Romano d'Occidente d Occidente<br />

• ore 23,59'57" ‐‐> Scoperta dell'America<br />

• ore 23,59'59" ‐‐> Rivoluz. Industriale * e Francese ‐<br />

Colonialismo‐ Guerre Mondiali‐ Globalizzazione<br />

*“Antropocene”: con la I (Carbone/Macchine) e soprattutto con<br />

la II (Chimica/Petrolio) Rivoluz. Industriale l’Homo S. Sapiens<br />

si è trasformato in potenza tellurica (Stoppani1873‐Crutzen 1995)


• Ma in qualcosa homo sapiens sapiens si è realmente<br />

diff differenziato i dl dal resto dll della NNatura:<br />

• a differenza di tutte le altre specie viventi anziché<br />

cercare di adattarsi all’ambiente<br />

all’ambiente,<br />

ha infatti cercato di trasformare/adattare il pianeta<br />

alle proprie esigenze … con risultati brillanti quanto<br />

pericolosi


Milioni di anni<br />

“Ambiente” Ambiente<br />

Challenge “naturale”<br />

I processi<br />

filo‐genetici<br />

1<br />

Agenti Fisici<br />

Adattamento<br />

Co‐evoluzione<br />

durano<br />

milioni<br />

di anni<br />

>100mila molecole “nuove”<br />

non portato di una di co‐evoluzione<br />

Fall‐Out Chimico<br />

2<br />

Antigeni g<br />

Danger Signals<br />

Non self<br />

Tolleranza<br />

Self<br />

MHC<br />

Evo<br />

Genoma<br />

Sistemi<br />

Neuro‐endocrino<br />

Immunocompetente<br />

(Epi)‐genoma<br />

Fetal<br />

Programming<br />

<strong>virus</strong> HERVs Onco‐géni<br />

(Retro‐<strong>virus</strong>es)<br />

3 Agenti Biologici VV‐onc<br />

C‐onc<br />

(Retro)Trasposons)<br />

Genosfera<br />

IXX‐XX SECOLO<br />

Drammatica<br />

Biosfera<br />

Trasformazione<br />

Ambientale<br />

e Climatica<br />

Lo sviluppo onto‐genetico<br />

dura 9 mesi‐una vita Devo


Scientific American Magazine<br />

August 2009<br />

.. circa 10mila anni fa (rivoluzione<br />

neolitica), la grande svolta:<br />

.. da allora a differenza di tutte le<br />

altre specie viventi l'uomo<br />

non è più evoluto adattandosi<br />

all'ambiente, ma ha cominciato<br />

a trasformare l'ambiente stesso,<br />

in modo via, via più rapido e<br />

radicale .. I vantaggi di quella<br />

scelta sono evidenti.. Ma c’è<br />

sempre anche un prezzo da<br />

pagare … e non devono essere i<br />

nostri figli a pagarlo


Under physiologic circumstances the intestinal epithelium is for the most part impermeable to gluten and gliadin;<br />

Under physiologic circumstances, the intestinal epithelium is, for the most part, impermeable to gluten and gliadin;<br />

however, patients with celiac disease have been found to have compromised TJ integrity and enhanced paracellular<br />

permeability, which could allow gliadin to cross the intestinal barrier and activate the immune system.<br />

Gliadin regulates intestinal barrier function in part through the upregulation of zonulin, and gliadin has been found to bind to the<br />

CXCR3 receptor on intestinal epithelial and initiate a MyD88-dependent release of zonulin.


1 GLIADIN<br />

2 DQ2 –DQ8<br />

3 GUT PERMEABILITY<br />

4 GUT ECOSYSTEM


Epidemiologic<br />

Triad<br />

Disease is the result<br />

of forces within a<br />

dynamic system<br />

consisting of:<br />

M. Tevfik DORAK<br />

Armi, acciaio e malattie<br />

Einaudi 1997<br />

Jared d Diamond i d<br />

GGuns, germs and d steel t l<br />

The fates of human societies<br />

8‐10mila anni fa…<br />

Il “dono fatale del bestiame”<br />

.. l'allevamento e quindi il contatto continuo<br />

con gli animali ebbe anche come conseguenza<br />

il passaggio p gg all'uomo di malattie di origine g animale<br />

(praticamente tutte le principali malattie contagiose)…<br />

che sarebbero diventata… l’arma più potente<br />

nelle mani dei colonizzatori europei !


1934<br />

most epidemic human infectious diseases are<br />

caused by y recently y introduced pathogens, p g<br />

cospeciation of parasite and host is commonplace..<br />

Occasional host infidelity, however, provides the<br />

endemic parasite with an opportunity to<br />

survive the potential extinction of its host.


of David Reed and colleagues and of Mark Stoneking's group who, on the basis of phylogenetic<br />

analysis, have speculated that we may have acquired a clade of head lice from another hominid<br />

species and pubic lice from gorillas; they have also suggested that lice might help determine the<br />

date when humans adopted clothing….


Kittler R, Kayser M, Stoneking M: Molecular evolution of Pediculus humanus and the origin of clothing. Curr Biol 2003, 13:1414-1417.<br />

Reed DL DL, Smith VS, VS Hammond SL, SL Rogers AR AR, Clayton DH: Genetic analysis of lice supports direct contact between modern and archaic humans humans. PLoS<br />

Biol 2004, 2:e340.<br />

Weiss RA, McMichael AJ: Social and environmental risk factors in the emergence of infectious diseases. Nat Med 2004, 10:S70-S76.<br />

Reed DL, Light JE, Allen JM, Kirchman JJ: Pair of lice lost or parasites regained: the evolutionary history of anthropoid primate lice. BMC Biol 2007,<br />

5 7


Il rapporto tra organismi.. <strong>microrganismi</strong> .. <strong>virus</strong>.. e ambiente muta continuamente<br />

es.: il caso dello Streptoccocus Pyogenes:<br />

fine 800 800-primo primo 900 scarlattina (malattia con alta letalità)..<br />

1930-40 malattia reumatica<br />

anni 70 quasi-scomparsa della m reumatica<br />

anni 90 gangrena streptococcica (battere killer): SUPERANTIGEN CYTOKINES +++<br />

M. Tevfik DORAK<br />

No infection Clinical Sub-clinical Carrier<br />

Death Carrier Immunity No immunity<br />

Spesso si dimentica che per la gran parte di <strong>microrganismi</strong> anche potenzialmente virulenti ++<br />

la condizione di equilibrio tra ospite e microrganismo è quella più comune/naturale.<br />

Lo spostamento da colonizzazione a malattia indica la rottura di un equilibrio … al livello individuale<br />

(trasformazione del microrganismo o indebolimento/iper‐reazione dell’ospite) o collettivo ( un fattore<br />

estremamente importante è il salto di specie: cfr. orthomyxo<strong>virus</strong>; cfr . sconvolgimento del ciclo vitale del T.<br />

Gondii in caso di trasferimento dall’ospite naturale (da milioni di anni: il gatto) ad altro animale !!<br />

(www)<br />

Outcome


MOLECULAR<br />

COMPATIBILITY<br />

Factors Influencing g Disease<br />

Transmission<br />

Agent Environment<br />

• Infectivity<br />

• Pathogenicity<br />

• Virulence<br />

• Immunogenicity<br />

• Antigenic stability<br />

• Survival<br />

H5N1<br />

..la trasformazione di un microrganismo in patogeno<br />

è in genere indice di uno stress (ambientale )<br />

(indotto) (indotto). Esempi: ll’acquisizione acquisizione e<br />

l’accelerata trasmissione (HGT)<br />

di resistenze ad antibiotici<br />

( sequenze mobili ecc..) ..<br />

sequenze codificanti<br />

per tossine,<br />

provenienti da<br />

batteriofagi<br />

• Age<br />

• Sex<br />

• Genotype<br />

Host<br />

• Behaviour<br />

• Nutritional status<br />

MOLECULAR<br />

CO-EVOLUTION<br />

• Health status<br />

• Weather<br />

• Housing<br />

• Geography<br />

• Occupational setting<br />

• Air quality<br />

• Food<br />

M. Tevfik DORAK<br />

HIV


Replication of influenza A <strong>virus</strong>. After binding (1) to sialic acid-containing receptors, influenza is<br />

endocytosed and fuses (2) with the vesicle membrane. Unlike for most other RNA <strong>virus</strong>es, transcription (3) and<br />

replication (5) of the genome occur in the nucleus. Viral proteins are synthesized (4), helical nucleocapsids<br />

form and associate (6) with M1M2, and the protein-lined membranes containing HA and NA glycoproteins<br />

(7) The <strong>virus</strong> buds from the plasma membrane. (+)=Positive sense; ER=endoplasmic reticulum<br />

(From Medical Microbiology, 4 th ed., Murray, Rosenthal, Kobayashi & Pfaller, Mosby Inc., 2002, Figure 56-2.)


“salto di specie”<br />

Il passaggio a germe patogeno è spesso collegabile ad un<br />

recente “salto di specie” p<br />

• es.: Toxoplasma Gondi: simbionte dei felini, diventa patogeno<br />

in altre specie tra cui l’uomo (feto!)<br />

• es.: Orthomyxo<strong>virus</strong> influenzali (RESERVOIR: ucelli)<br />

uomo… generalmente infezioni non gravi (tranne che<br />

anziani/immunocompromessi) anziani/immunocompromessi). Periodicamente: H1N1(1918);<br />

H2N2(1957); H5N1(1997)(drift/shift/reassortment..)<br />

Species‐jump may be on the increase because of changes in human<br />

behavior, including increased travel, changing climate, and higher rates<br />

of urbanization…<br />

L’agente patogeno mutato viene riconosciuto come PERICOLOSO..<br />

DANGER SIGNAL Th Theory (Matzinger) (M t i ) cytokines t ki storm t<br />

Nuovi Virus (Ebola;Corona Virus; H1N1/1918‐H5N1/1997‐2003)


http://www.eol.ucar.edu/projects/milagro/


Ecosystem ??<br />

http://chge.med.harvard.edu/programs/education/course_2007/topics/02_07/documents/wilson_2007.pdf


…an arms race in which the immune<br />

armoury of the human has evolved to<br />

deal with potential pathogens<br />

and the pathogen has evolved<br />

strategies to evade, and in some cases<br />

use, the immune system of the human<br />

host. Recently, there have been marked<br />

changes in the exposure of individuals in<br />

the developed world to both<br />

microorganisms and metazoan parasites..<br />

and the absence of the associated<br />

immunomodulation might have led to the<br />

increased emergence of autoimmune<br />

diseases<br />

"in this place it takes all the running you can do, to keep in the same place."


… commensal bacteria and the host immune system constitute an<br />

integrated defense system. This symbiotic association has evolved to<br />

optimize its robustness against pathogen attacks and nutrient<br />

perturbations p by y harboring g a broad range g of microorganisms g<br />

Owing to the inherent propensity of a host immune system toward<br />

hyperactivity.. bacterial flora homeostasis might be particularly important<br />

in the development p of ppreventive strategies g against g immune disorders<br />

such as autoimmune diseases.


O’Keefe SJD. Curr Opin Gastroenterol 2008;24(1):51-58<br />

Gut Ecosystem


Il feto è sterile, ma già nel canale vaginale si contamina<br />

con i batteri vaginali vaginali, con l’ambiente l’ambiente, con le feci della<br />

madre;<br />

si osserva anche una significativa differenza tra i nati col<br />

parto cesareo o col parto naturale naturale.<br />

In particolare si ha una maggiore presenza del<br />

Bacteroides fragilis nei neonati partoriti per via<br />

naturale naturale, rispetto a quelli nati con parto cesareo cesareo.<br />

[Grönlund et al. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1999;<br />

28:19‐25]


L’alimentazione nelle prime fasi di vita svolge un ruolo fondamentale nella<br />

composizione del microbiota microbiota; infatti si osserva una significativa differenza<br />

nei neonati allattati al seno rispetto a quelli allattati con formula.<br />

Il conseguimento di un microbiota stabile richiede circa 2 anni.<br />

Come si evince dal grafico riportato più in basso, basso nei primi mesi di vita diventano<br />

specie predominanti i Bifidobatteri, subito dopo i Lactobacilli,<br />

successivamente i Bacteroides e altre specie. I Clostridi rappresentano<br />

numericamente la minoranza e nel bambino molto piccolo non sono presenti presenti.<br />

Nell’adulto, si rileva una composizione<br />

caratterizzata da stabilità, mentre nell’ultima epoca<br />

della vita si hanno di nuovo delle variazioni.<br />

Nell’anziano infatti, è stata descritta una riduzione<br />

della peristalsi. Ciò può determinare un effetto<br />

negativo sulla digestione digestione, come pure l’insorgenza l insorgenza di<br />

stipsi e può associarsi a frequenti alterazioni nella<br />

composizione del microbiota<br />

van Tongeren SP et al. Appl Environ Microbiol<br />

2005; 71(10);6438-6442].<br />

Lactobacilli,<br />

Bacteroides<br />

Bifidobatteri<br />

[Mitsuoka T & Hayakawa K, ZentralBlatt Bakteriol ParasitenKund<br />

Infektionskrank Hyg 1973;A223:333‐342]


1<br />

2<br />

Environmental Regulation<br />

off GGene EExpression i<br />

3


• One of the most interesting symbioses, from a<br />

medical point of view, is that between mammals<br />

and d their h gut microbes. i b Recent evidence d shows h<br />

that the gut bacteria actually regulate some of<br />

our intestinal genes. Moreover, this regulation<br />

is part of normal mammalian development,<br />

and d these h microbes i b are expected d to bbe<br />

present<br />

if our gut is to be properly formed.<br />

• The polymerase chain reaction (which is able to<br />

identify bacterial species that cannot be<br />

cultured) has revealed that bacteria have<br />

particular geographic distributions within us,<br />

such that the 400 bacterial species of the<br />

human colon are stratified into specific regions<br />

along the length and diameter of the gut tube.<br />

Here, they can attain densities of 1011 cells per<br />

milliliter.<br />

• Moreover, we have co‐evolved to share our<br />

spaces with them, and we have even co‐<br />

developed such that our cells are primed for<br />

their docking, and their prokaryotic cells are<br />

primed to induce gene expression from our<br />

nuclei.<br />

Bry L, Falk P G, Midtvedt T and Gordon J I 1996 A model<br />

of host‐microbial interactions in an open mammalian ecosystem<br />

Science 273 1380–1383<br />

• Una delle simbiosi più interessanti, da un punto di<br />

vista bio‐medico, è quella q fra i mammiferi ed i loro<br />

microbi dell'intestino. Ricerche recenti dimostrano<br />

che i batteri dell'intestino regolano alcuni nostri<br />

geni intestinali e che questa regolazione fa parte<br />

del normale sviluppo pp dei mammiferi<br />

e che in assenza di questi microbi lo sviluppo<br />

stesso del nostro intestino non avverrebbe in<br />

modo corretto.<br />

• La reazione a catena della polimerasi (che<br />

permette di identificare anche le specie<br />

batteriche che non si sviluppano nei terreni<br />

di coltura) ha rivelato che i batteri hanno<br />

distribuzioni particolari, nel nostro intestino,<br />

cosicché le ca. 400 specie batteriche presenti nel<br />

nostro colon sono “stratificate” in regioni<br />

specifiche. Qui, possono raggiungere una densità<br />

di 1011 0 cellule/ml.<br />

• Inoltre, siamo co‐evoluti con essi, in modo<br />

da con‐dividere i nostri spazi con loro<br />

e in modo tale che le nostre cellule presentano<br />

recettori specifici per i nostri simbionti simbionti, che a loro<br />

volta sono in grado di indurre e modulare<br />

l'espressione genica<br />

delle nostre cellule intestinali


• We never lack these microbial<br />

components; we pick them up from the<br />

reproductive tract of our mother as<br />

soon as the amnion bursts (scoppia).<br />

• Non possiamo p fare a meno dei nostri<br />

“simbionti”: li acquisiamo alla nascita<br />

dall’apparato riproduttivo di nostra madre<br />

(non appena l’amnios si rompe).<br />

•<br />

•<br />

XXu and d Gordon G d ddescribe ib our microbiota i bi t<br />

as a “multifunctional organ whose<br />

component cell lineages provide<br />

metabolic traits that we have not fully<br />

evolved in our own genome”. genome”<br />

These traits include the ability to digest<br />

plant polysaccharides, the<br />

biotransformation of conjugated bile<br />

acids, d the h synthesis h of f vitamins K and d<br />

B12, and the regulation of fat storage.<br />

•<br />

•<br />

Xu e Gordon descrivono il nostro<br />

ecosistema microbico nei termini di un<br />

"organo multifunzionale in cui le varie linee<br />

cellulari procariotiche (microbiche ) ci<br />

forniscono di funzioni e competenze<br />

metaboliche che non sono, per così dire,<br />

implementate dal nostro stesso genoma ".<br />

Tali funzioni includono la capacità<br />

di digerire i polisaccaridi di origine<br />

vegetale, la bioconversione degli<br />

acidi biliari coniugati, la sintesi delle<br />

vitamine K e B12 e la regolazione<br />

dell’accumulo dell accumulo dei grassi. grassi<br />

Xu J and Gordon J I 2004 Honor thy symbionts; Proc Proc.<br />

Natl. Acad. Sci. USA 100 10452–10459<br />

Bäckhed F, Ding H, Wang T, Hooper L V, Koh G Y, Nagy A,<br />

Semenkovitch C F and Gordon J I 2004 The gut microbiota<br />

as an environmental i lf factor that h regulates l fat f storage; PProc.Natl. N l<br />

Acad. Sci. USA 101 15718–15723


Gli acidi grassi a catena corta sono molto importanti per il trofismo dei<br />

colonociti, in quanto sono in grado di stimolare la proliferazione e la<br />

differenziazione delle cellule epiteliali… promuovono l’assorbimento<br />

di Ca, Mg, Fe; infine, intervengono nel metabolismo energetico<br />

dell’ospite, fornendo il 10% del fabbisogno energetico giornaliero.<br />

Il microbiota esercita una sorta di “cross cross‐talk talk” , come è stato recentemente dimostrato dimostrato, con le cellule epiteliali:<br />

si realizza cioè un dialogo con il sistema immunitario intestinale, il più grande organo di difesa dell’organismo; in questo<br />

modo il microbiota è in grado di modulare la risposta immunitaria.<br />

Guarner F et al. Lancet 2003; 361: 512–19


Hooper L V, Bry L, Falk P G and Gordon J I 1998 Hostmicrobial<br />

symbiosis in the mammalian intestine: exploring an internal<br />

ecosystem; BioEssays 20 336 336–343 343<br />

• Moreover, our symbiotic microbes also are<br />

involved with the differentiation of our gut<br />

and its associated immune system system.<br />

• Bacteria are able to induce gene expression in<br />

mammalian intestines, and this gene expression<br />

is important for normal intestinal<br />

ddevelopment… l recent studies di hhave shown h that h<br />

the intestines of germ‐free mice can initiate, but<br />

not complete, their differentiation.<br />

• To complete development, the microbial<br />

symbionts of the gut are needed.<br />

• Another set of bacteria – Bacteroides fragilis<br />

and Bacillus subtilis – appear to be needed<br />

together g in order to induce the formation of the<br />

gut‐associated lymphoid tissue (GALT).<br />

• GALT mediates mucosal immunity and oral<br />

immune tolerance, and its malfunction has<br />

been associated with allergies and with Crohn’s Crohn s<br />

disease<br />

Rook G A and Stanford J L 1998 Give us this day our daily germs<br />

Immunol. Today 19 113–116<br />

Hooper L V, Wong M H, Thelin A, Hansson L, Falk P G and<br />

Gordon J I 2001 Molecular analysis of commensal host–<br />

microbial relationships in the intestine; Science 291 881–884<br />

• I simbionti collaborano inoltre alla differenziazione<br />

del nostro intestino<br />

e del relativo sistema immune.<br />

• Come detto i batteri possono indurre l'espressione<br />

genica nelle cellule degli intestini di mammiferi e<br />

questo è importante per lo sviluppo intestinale<br />

normale. ..<br />

• Studi recenti hanno dimostrato che nei topi germ‐<br />

free l’intestino può iniziare, ma non portare a<br />

termine correttamente il proprio sviluppo.<br />

Per completare lo sviluppo sviluppo, i simbionti microbici<br />

dell'intestino sono necessari.<br />

• Un altro set di batteri ‐ Bacteroides fragilis e bacillus<br />

subtilis ‐ sembra essere necessario per indurre<br />

lla fformazione i dlt del tessuto t linfoide li f id associato it<br />

all’intestino (GALT).<br />

• Il GALT media l'immunità delle mucose e la<br />

tolleranza immune orale,<br />

la cui disfunzione è stata associata<br />

con allergie e con la malattia di Crohn.<br />

Steidler L 2001 Microbiological and immunological<br />

strategies for treatment of inflammatory bowel disease;<br />

Microbes Infect. 3 1157–1166


• Therefore, mammals have co‐evolved<br />

with bacteria such that our bodily<br />

phenotypes do not develop properly<br />

without them them.<br />

• Moreover, just as differentiating cells<br />

provide different development functions<br />

in the body,<br />

so do the different species of bacteria.<br />

• Our distinction between inside and<br />

outside, between ecology and<br />

development may have to be altered ,<br />

and Paul Weiss’ description of the<br />

developing p gbody y as an ecosystem y of<br />

interacting genes, cells, tissues, and<br />

environments seems very appropriate<br />

Gilbert S F and Bolker J 2003 Ecological developmental biology:<br />

Preface to the symposium; Evol. Dev. 5 3–8<br />

• I mammiferi sono dunque co‐evoluti con i<br />

batteri, al punto tale che i nostri fenotipi<br />

corporei non si sviluppano correttamente<br />

senza di loro.<br />

• Inoltre, come le cellule differenziate forniscono<br />

l’organismo di differenti funzioni, così fanno le<br />

differenti specie batteriche batteriche.<br />

• E’ la stessa distinzione tra interno ed esterno, fra<br />

ecologia e sviluppo che deve cambiare; e la<br />

ddescrizione ddi Paul l Weiss<br />

del nostro organismo in sviluppo come<br />

ecosistema di geni, cellule, tessuti ed ambienti<br />

in continua interazione sembra assolutamente<br />

adeguata. d<br />

Gilbert S F 2002 The genome in its ecological<br />

context: Philosophical perspectives on interspecies epigenesis<br />

Ann. N.Y. Acad. Sci. 981 202–218


Guarner F et al. Lancet 2003;361:512-519<br />

gli animali allevati in condizioni “germ free” hanno una<br />

forte predisposizione alle infezioni.


C. difficile is the most significant cause of<br />

pseudomembranous colitis. It is a severe<br />

infection of the colon, often happening after<br />

normal gut flora is eradicated by use of<br />

antibiotics. The C. difficile bacteria, which<br />

naturally reside in the body, become<br />

overgrown: The overgrowth is harmful<br />

because the bacterium releases toxins<br />

that can cause bloating, constipation,<br />

and diarrhea with abdominal pain,<br />

which may become severe.


Guarner F et al. Lancet 2003;361:512-519


L’interazione tra microbi, epitelio e tessuto linfatico intestinale (GALT) contribuisce allo sviluppo della memoria<br />

immunitaria, cruciale nelle prime fasi di vita come nell’adulto e consente il continuo rimodellamento dell’immunità<br />

Guarner F et al. Lancet 2003;361:512-519<br />

Gasbarrini A et al. Ann Ital Med Int 2004; 19 (Suppl 3): 27S-45S


Le relazioni che l’imponente<br />

massa batterica del<br />

microbiota intrattiene con<br />

l’organismo ospite sono<br />

complesse.<br />

Il microbiota è infatti<br />

composto da batteri che<br />

determinano effetti<br />

benefici<br />

e<br />

da altri che determinano<br />

effetti nocivi, in quanto<br />

putrefattivi e<br />

potenzialmente patogeni.<br />

Esistono infine batteri ad<br />

azione protettiva che<br />

diventano nocivi in<br />

particolari condizioni<br />

e/o a concentrazioni<br />

elevate.


*<br />

Pseudomonas, Proteus,<br />

Stafilococcus, Veillonella,<br />

Clostridia sono in grado<br />

di produrre nitrosamine,<br />

fenoli, cresoli e altre amine<br />

potenzialmente<br />

carcinogene. i<br />

*<br />

Sono nocivi in<br />

particolari condizioni<br />

i generi E. Coli,<br />

enterococchi,<br />

streptococchi<br />

e batteroidi


Bifidobacterium, ,<br />

Lactobacillus<br />

Effetti benefici sono determinati principalmente dai generi Lactobacillus e<br />

Bifidobacterium Bifidobacterium, che stimolano le funzioni immunitarie e favoriscono la digestione digestione,<br />

l’assorbimento di alimenti e minerali e la sintesi di vitamine.<br />

In condizioni fisiologiche, questi due generi occupano circa un terzo<br />

del microbiota intestinale dell’adulto, dell adulto, causando un’inibizione un inibizione competitiva della<br />

crescita dei batteri patogeni.<br />

Alcuni autori non considerano del tutto giustificata una separazione netta tra<br />

batteri patogeni e benefici, nell’ambito della composizione del microbiota .<br />

In ridotte concentrazioni concentrazioni, infatti infatti, patogeni potenziali, potenziali come ad esempio il<br />

Coli, sono in grado di svolgere un effetto benefico, contribuendo alla<br />

maturazione del sistema immunitario.<br />

Isolauri E et al, Best Practice & Research Clinical<br />

Gastroenterology 2004; 18(2):299-213


ABUSO SISTEMATICO (IN MEDICINA e ZOOTECNIA) di ANTIBIOTICI E CHEMIOTERAPICI


IBD: Colite ulcerosa;<br />

Malattia di Crohn.<br />

[Gasbarrini A. XXX International Congress on Microbial Ecology and Disease (SOMED). Roma, 2007].<br />

favorita dalla presenza di<br />

un’atrofia gastrica e/o di<br />

una modificazione del pH<br />

locale, come avviene<br />

durante le terapie<br />

prolungate con<br />

antisecretori.<br />

Una tipica<br />

manifestazione if t i di<br />

dismicrobismo gastrico è<br />

l’infezione da<br />

Helicobacter pylori.<br />

SIBO (Small Intestinal Bacterial<br />

Overgrowth): sindrome da malassorbimento<br />

prevalentemente della quota proteica;<br />

un’eccessiva un eccessiva produzione di gas, conseguente<br />

alla fermentazione prodotta dal metabolismo<br />

di un elevato numero di <strong>microrganismi</strong>


More than 50% of the world's population<br />

harbour H. pylori in their upper<br />

gastrointestinal tract. Infection is more<br />

prevalent in developing countries.


GUT ECOSYSTEM<br />

(CO)EVO DEVO<br />

The mucosal immune system has developed specialised regulatory, anti‐inflammatory mechanisms for<br />

eliminating g or tolerating g non‐dangerous, g , food, , airborne antigens g and commensal micro‐organisms g<br />

This is achieved in part, by an evolutionary‐conserved family of cell surface and cytosolic receptors,<br />

referred to as toll‐like receptors (TLRs) . The number of bacteria colonising mucosal and skin<br />

surfaces exceeds the number of cells forming human body.<br />

Commensal bacteria co‐evolved with their hosts.. Certain gut bacteria are also recognised to suppress<br />

unnecessary iinflammatory fl t responses, th thereby b hhelping l i tto maintain i t i iimmune hhomeostasis t i hhowever,<br />

under specific conditions , they are able to overcome protective host responses and exert pathologic effects.<br />

Tolerance<br />

Tlaskalová‐Hogenová H, Stepánková R, Hudcovic T, Tucková L, Cukrowska B, Lodinová‐Zádníková R, Kozáková H, Rossmann P, Bártová J,<br />

Sokol D, Funda DP, Borovská D, Reháková Z, Sinkora J, Hofman J, Drastich P, Kokesová A.<br />

Commensal bacteria normal microflora mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune<br />

diseases.Immunol Lett. 2004 May 15;93(2‐3):97‐108. Review.


• Hygiene, microbial diversity and immune regulation.<br />

• Guarner F.<br />

• Digestive System Research Unit, Ciberehd, University Hospital Vall d'Hebron, Barcelona, Spain. fguarner@vhebron.net<br />

Curr Opin p Gastroenterol. 2007 Nov;23(6):667‐72.<br />

; ( )<br />

• PURPOSE OF REVIEW: Sanitation, antibiotics and vaccines have done more to extend life expectancy than any<br />

other medical innovation. Concern exists, however, about the link between hygiene and increased incidence of<br />

immune‐mediated disorders.<br />

RECENT FINDINGS: Studies confirm higher prevalence of asthma and allergic diseases in urban areas and<br />

developed countries rather than rural areas and developing countries. There is an inverse association between<br />

family size and disease. The debate over whether infection precipitates or prevents immune dysregulation<br />

remains a contentious one.<br />

Our knowledge about the microbial composition of the intestinal ecosystem is expanding rapidly with the<br />

introduction of molecular techniques. Differences in gut bacteria between health and atopy or inflammatory<br />

bowel disease are repeatedly reported. Recent data in inflammatory bowel disease<br />

suggest reduced species diversity and temporal instability of the gut microecosystem.<br />

The gut is a major site for induction of regulatory T cells, which secrete immunosuppressive cytokines.<br />

Not only infections, but also some commensals induce regulatory pathways, which seem to be<br />

functionally deficient in multiple sclerosis, allergies and inflammatory bowel disease.<br />

SUMMARY: Changes in lifestyle leading to decreased exposure to certain nonpathogenic species that are<br />

important for the development of immunoregulatory mechanisms are probably<br />

associated with increased incidence of some immune‐mediated diseases, such as allergies<br />

and inflammatory bowel disease.


Contradictions: increasing TH1 dependent autoimmunity.<br />

TH2 skewed helminth infection are not associated with allergy<br />

Reduced overall microbial<br />

burden results in<br />

weak Th1 and<br />

unrestrained t i d Th2 response.


*<br />

* Hepatitis B ‐C<br />

!


The intestinal epithelium is a single‐cell layer that<br />

constitutes the largest and most important barrier<br />

against the external environment. It acts as a<br />

selectively permeable barrier..<br />

The protein networks connecting epithelial cells form<br />

3 adhesive complexes: desmosomes, adherens<br />

junctions, and tight junctions. .. transmembrane<br />

proteins that interact extracellularly with adjacent<br />

cells and intracellularly with adaptor proteins that<br />

link to the cytoskeleton...<br />

we summarize clinical and experimental evidence<br />

demonstrating intestinal epithelial barrier<br />

dysfunction as a major factor contributing to the<br />

predisposition to inflammatory diseases, including<br />

food allergy, inflammatory bowel diseases, and celiac<br />

disease.


Recent experimental studies have identified a role for a number of exogenous factors, factors<br />

including bacterial pathogens and components of innate and adaptive immunity,<br />

in the regulation of intestinal barrier function. Understanding the interactions between<br />

innate and adaptive p immunity y and intestinal barrier function will provide p important p<br />

insight into the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases.


Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol. 2005 Sep;2(9):416‐22.<br />

… the role of a ‘leaky gut’ in the pathogenesis of<br />

intestinal and extraintestinal autoimmune disorders<br />

.. (an) extremely important function of this organ is its ability to<br />

regulate the trafficking of macromolecules between the<br />

environment and the host through a barrier mechanism …<br />

Together with the gut‐associated lymphoid tissue and the<br />

neuroendocrine network, the intestinal epithelial barrier,<br />

with its intercellular tight junctions, controls the equilibrium between<br />

tolerance and immunity to nonself nonself‐antigens antigens …<br />

When the finely tuned trafficking of macromolecules<br />

is dysregulated in genetically susceptible individuals, both<br />

intestinal and extraintestinal autoimmune disorders can occur.


Gliadin and its immunomodulatory/inflammatory fragments<br />

are present in the intestinal lumen (1)<br />

AGA, anti-gliadin<br />

antibodies;<br />

AEA, anti-endomysium<br />

antibodies;<br />

α tTG, anti-tissue<br />

transglutaminase ABs<br />

… inducing MyD88-dependent<br />

zonulin release (2).<br />

Zonulin release causes opening of tight junctions<br />

and gliadin passage across the tight junction barriers<br />

in subjects with dysregulation of the zonulin system (3)<br />

After tissue<br />

transglutamina<br />

se de-amidation<br />

(4), gliadin<br />

peptides bind to<br />

human<br />

leukocyte<br />

antigen<br />

receptors<br />

present on the<br />

surface of<br />

APCs (5).<br />

Alternatively,<br />

gliadin can act<br />

directly on APCs (6),<br />

Gliadin peptides are then presented to T lymphocytes (8), which process is<br />

followed by an aberrant immune response response, both humoral (9) and<br />

causing MyD88-<br />

cell-mediated (10), in genetically susceptible individuals (MHC: DQ2-DQ8)<br />

dependent release<br />

of both zonulin<br />

This interplay between innate and adaptive immunity is ultimately responsible for the autoimmune process and cytokines (7)<br />

targeting intestinal epithelial cells, leading to the intestinal damage typical of celiac disease (11).


Considerable evidence has accumulated to suggest that innate immune defense<br />

mechanisms might interact with proinflammatory pathways and exacerbate or<br />

perhaps even initiate development of arterial plaques<br />

d d l l l b ll lk d h<br />

Recent data now directly implicate signaling by toll‐like receptor 4 and the common<br />

adaptor molecule MyD88 in the pathogenesis of atherosclerosis establishing a key link<br />

between atherosclerosis and defense against both foreign pathogens and<br />

endogenously generated inflammatory ligands


INFECTIONS PREVENT/REDUCE DIABETES I INCIDENCE<br />

ANIMAL MODELS<br />

(FREE GERM CONDITIONS ++ AUTOIMMUNITY)


In ambito bio‐evolutivo un ruolo enormemente sottovalutato<br />

è svolto dai (retro)<strong>virus</strong> e dal trasferimento orizzontale di<br />

sequenze geniche mobili.. le maggiori acquisizioni e trasformazioni sono<br />

il prodotto di inserimenti genici..


I RETROVIRUS SONO I NOSTRI + INTIMI SIMBIONTI<br />

• CCertamente t t meno nota, t ma altrettanto lt tt t iimportante t t a ancor più iù<br />

“intima” è la relazione che intratteniamo con i “nostri” retro<strong>virus</strong>,<br />

alcuni dei quali, da milioni di anni inseriti nel genoma dei primati,<br />

svolgono un ruolo di grande rilievo tanto in ambito ontogenetico<br />

che filogenetico.<br />

• L’8% del nostro genoma è costituito da sequenze retro‐virali<br />

endogene (HERVs) e oltre il 50% opera in stretto collegamento con<br />

esse. Inoltre è stato recentemente dimostrato che i retro<strong>virus</strong><br />

hanno svolto e svolgono un ruolo chiave per la sopravvivenza e<br />

l’evoluzione levoluzione degli organismi che li ospitano: forse la scoperta più<br />

eclatante è stata la dimostrazione del ruolo svolto da una proteina<br />

codificata e prodotta da un retro<strong>virus</strong> (la sincizina) nella genesi di<br />

un organo g essenziale pper la stessa origine g dei mammiferi: la<br />

placenta……..


… un esempio per tutti: la placentazione. è infatti ormai dimostrato che il<br />

sinciziotrofoblasto è il prodotto di una proteina codificata da un retro<strong>virus</strong>:<br />

quindi i mammiferi sono "figli" dell'inserimento di un retro<strong>virus</strong> in genomi<br />

di d oga organismi s pecede<br />

precedenti...


Here .. a viral gene has been sequestered to<br />

serve an important function in the physiology of<br />

a mammalian host. This gene, encoding a<br />

protein p that we have called syncytin, y y , is the<br />

envelope gene of a recently identified human<br />

endogenous defective retro<strong>virus</strong>, HERV‐W. We<br />

find that the major sites of syncytin expression<br />

are placental p syncytiotrophoblasts,<br />

y y p ,<br />

multinucleated cells that originate from fetal<br />

trophoblasts. …syncytin may mediate placental<br />

cytotrophoblast fusion in vivo, and thus may be<br />

important p in human pplacental morphogenesis. p g


A child in the womb carries foreign<br />

antigens from the father as well as<br />

immunologically<br />

compatible self‐antigens<br />

ffrom th the mother.<br />

th<br />

Simplified drawing of the human placental villous structure, showing<br />

the cytotrophoblast at different stages of differentiation, syncytial<br />

fusion, syncytiotrophoblast differentiation and shedding.


il fatto che il genoma dei primati e, in particolare, dell'uomo sia costituito per l'8% da HERVs..<br />

cioè da retro<strong>virus</strong> endogeni e per oltre la metà da retrosequenze mobili (che hanno struttura<br />

simil‐retrovirale)…<br />

Events following endogenization of a retro<strong>virus</strong>.<br />

I RETROVIRUS SONO I NOSTRI + INTIMI SIMBIONTI


… che svolgono un ruolo continuo di trasformazione/ingegnerizzazione reattivo‐adattativa<br />

dell’intero genoma è un dato estremamente importante (Natural Genetic Engineering)<br />

Activation of an ERV through mutation<br />

I RETROVIRUS SONO I NOSTRI + INTIMI SIMBIONTI


..<strong>virus</strong>es have played a major role at different stages of biological evolution,<br />

such as the RNA to DNA transition, the origin of the eukaryotic nucleus,<br />

or, alternatively, the origin of unique features in multicellular macrobes…


I examine the origin of the adaptive immune system from the perspective of a <strong>virus</strong> addiction<br />

module. The likely role of both endogenous and exogenous retro<strong>virus</strong>es, DNA <strong>virus</strong>es, and<br />

their defective elements is considered in the origin of all the basal components of adaptive<br />

immunity (T (T-cell cell receptor receptor, RAG RAG-mediated mediated gene rearrangement rearrangement, clonal lymphocyte proliferation<br />

proliferation,<br />

antigen surface presentation, apoptosis, and education of immune cells).


In the early 1970s, scientists scanning baboon placentas with the electronmicroscope were<br />

startled to discover endogenous retro<strong>virus</strong>es budding from the syncytiotrophoblast. Similar<br />

<strong>virus</strong>es were subsequently detected in the placentas of healthy cats, mice, guineapigs and<br />

humans… Genome sequencing reveals that 8% of the human genome consists of human<br />

endogenous retro<strong>virus</strong>es, or HERVs, and,<br />

if we extend this to HERV fragments g and derivatives, , the retroviral legacy g yamounts to roughly g y<br />

half our DNA. Although many HERVs have been degraded into fragments, they are still readily<br />

identifiable from the presence of any of three pathognomonic genes, gag, pol and env, and their<br />

flanking long terminal repeats or LTRs …


L1s account directly or indirectly for about one‐third of the human genome<br />

RETROTRANSPOSITION IN THE ORGANISM LIKELY OCCURS IN BOTH MALE AND FEMALE GERM CELLS AND MAY ALSO OCCUR VERY<br />

EARLY IN EMBRYONIC DEVELOPMENT. THERE IS STRONG EVIDENCE THAT L1 RETROTRANSPOSITION IS SUPPRESSED IN SOMATIC<br />

CELLS BY MECHANISMS NOT CLEARLY UNDERSTOOD, ALTHOUGH PROMOTER REPRESSION, METHYLATION, AND RNA INTERFERENCE<br />

ARE AMONG THE USUAL SUSPECTS


Transposable elements can be seen as a natural genetic engineering system<br />

capable of acting not just on one location at a time but on the genome as a whole ..<br />

This dynamic view of the genome has been illustrated most impressively<br />

by Shapiro who stated that the genome is composed of modular units arranged<br />

in a “Lego‐like” manner that can be altered under certain circumstances


A small fraction of the chromosomal DNA codes for proteins


• .. anche nel mondo dei <strong>microrganismi</strong> le sequenze mobili<br />

incorporate e trasmesse da <strong>virus</strong> (batteriofagi) e plasmidi<br />

rappresentano i principali agenti di trasformazione/bio‐<br />

evoluzione: tanto per ciò che concerne l’acquisizione di<br />

nuove tossine, , qquanto pper la trasmissione e ppropagazione p g<br />

della resistenza ad antibiotici e chemioterapici.<br />

• A differenza di quanto avviene nel mondo dei <strong>virus</strong>, dove<br />

le principali trasformazioni evolutive derivano da<br />

modifiche genetiche (mutazioni, riassortimenti e<br />

ricombinazioni, connesse a pressioni selettive e a<br />

modifiche difi h ambientali bi t li i in genere), ) lle principali i i li<br />

trasformazioni bio‐evolutive dei <strong>microrganismi</strong><br />

sembrerebbero poter essere il prodotto del trasferimento<br />

genetico laterale di sequenze mobili/virali esogene..


Upon p starvation some E. coli cells<br />

undergo a transient,<br />

genome‐wide hypermutation<br />

(called adaptive mutation) that<br />

is recombination‐dependent p and<br />

appears to be a response to a<br />

stressful environment.<br />

.. adaptive mutation is regulated by<br />

the SOS response, a complex, graded<br />

response to DNA damage<br />

that includes induction of gene<br />

products blocking cell division<br />

and promoting mutation,<br />

recombination, and DNA repair.


J.A. Shapiro, Genome organization, natural<br />

genetic engineering and adaptive mutation,<br />

Trends Genet<br />

13 (1997), pp. 98–104<br />

S.M. Rosenberg, Evolving responsively:<br />

adaptive mutation, Nat Rev Genet 2<br />

(2001), pp. 504–515<br />

Hauptmann S, Schmitt WD. Transposable elements‐‐is there a link between evolution<br />

and cancer ? Med Hypotheses. 2006;66(3):580‐91.<br />

G.J. McKenzie, R.S. Harris, P.L. Lee<br />

and S.M. Rosenberg, The SOS<br />

response regulates adaptive<br />

mutation, Proc Natl Acad Sci USA 97<br />

(2000),<br />

pp. 6646–6651<br />

John Cairns e i suoi collaboratori di Harvard scoprirono che batteri geneticamente incapaci di<br />

metabolizzare uno zucchero, il lattosio, possono diventare consumatori di lattosio<br />

quando vengono posti in un ambiente dove il lattosio è la loro unica fonte di cibo. Per<br />

poter consumare lo zucchero evitando così di morire di fame, i batteri devono mutare a un<br />

tasso di velocità di gran g lunga g superiore p a quanto q avviene casualmente. Così i batteri<br />

acquisirono rapidamente una nuova caratteristica e la trasmisero alle future generazioni,<br />

violando gli attuali principi biologici secondo cui ciò non potrebbe verificarsi…<br />

J.W. Roberts, C.W. Roberts, N.L. Craig and<br />

E.M. Phizicky, y Activityy of the Escherichia<br />

coli recA-gene product, Cold Spring Harb<br />

Symp Quant Biol 43 (1979), pp. 917–920<br />

!<br />

!!<br />

H.M. Temin, The proto<strong>virus</strong> hypothesis:<br />

speculations on the significance of<br />

RNA-directed DNA synthesis for normal<br />

development and for carcinogenesis,<br />

J Natl Cancer Inst 46 (1971), pp. 3–7.


In un esperimento analogo, Barry Hall dell'Università del Connecticut sottopose dei<br />

batteri a un compito ancora più difficile: per poter metabolizzare il nuovo zucchero<br />

che era il loro unico principio nutritivo, dovettero effettuare due mutazioni, una<br />

delle quali era un'eliminazione di istruzioni genetiche esistenti. Le probabilità che<br />

due mutazioni avvengano a caso, nello stesso periodo di tempo sono poco più<br />

di una su un miliardo. Come nell'esperimento di Cairns, i batteri trasmisero poi la<br />

capacità capac tà appe appena a acqu acquisita s ta aalle e success successive e ge generazioni... e a o<br />

These experiments suggested that mutations in bacteria are<br />

influenced by the selective pressures that the bacteria are placed<br />

under.<br />

In other words words, it seems that the environment can sometimes affect<br />

the genotype as suggested by Lamarck.<br />

This hypothesis, hypothesis if true, true would modify the central dogma of<br />

molecular biology, which states that DNA defines protein<br />

expression, and that protein expression creates function in a<br />

physical environment.<br />

If the environment provides feedback to DNA to mutate in a given<br />

way, y, such a pprocess<br />

would involve an information transfer from the<br />

environment to the DNA.


HGT<br />

Neo‐Darwinistic<br />

Neo Darwinistic<br />

Paradigm<br />

Neo‐Lamarckian<br />

Paradigm


Antibiotic Resistance: An Ecological Perspective


It is ironic, and tragic, that the<br />

bacterium SS. aureus that<br />

opened the antibiotic era with<br />

Fleming's original discovery of<br />

1929 could also be the first to<br />

become non‐treatable with<br />

the huge battery of antibiotics<br />

discovered and developed<br />

over the last 60 years


Antibiotics


Morbosità, mortalità (cifre proporzionali a 1.000.000 di abitanti) e letalità per poliomielite,<br />

in Italia. Dal 1899 al 1949.


Antibiotics<br />

Figura 3. Morbosità, mortalità (cifre proporzionali a 1.000.000 di abitanti) e letalità per<br />

meningite cerebro‐spinale epidemica, in Italia. Dal 1888 al 1949.


Antibiotics


Figura 5. Morbosità, mortalità (cifre proporzionali a 1.000.000 di abitanti) e letalità per<br />

pertosse, in Italia. Dal 1888 al 1949.


Figura 4. Morbosità, mortalità (cifre<br />

proporzionali a 1.000.000 di abitanti) e<br />

letalità per scarlattina, in Italia. Dal 1888<br />

al 1949 1949.<br />

Antibiotics


Figura 6. Sviluppo ed efficicacia della chemioterapia antimicrobica negli scorsi sessant’anni.<br />

da: Periti P. e Noselli A. Farmaci e Terapia 1996; 13:3‐28


• Exotoxins<br />

O157:H7 Toxicity<br />

– Stx: shigella‐like toxins no protein synthesis<br />

• Cell adhesion<br />

– Type III secretory system: exploits structural support of host cells<br />

– Eff Effacing i of f bbrush hbborder d<br />

• Recruitment of immune system<br />

– Toxins induce release of cytokines: TNF‐α, TNF α, ILs<br />

This is a real<br />

problem.<br />

Le relazioni tra batteri e <strong>virus</strong> <strong>virus</strong>.. ma anche<br />

tra organismi superiori e <strong>virus</strong> sono complessi<br />

.. Il “Mistero delle Tossine”: è stato dimostrato che la produzione di<br />

Tossine NON è in genere vantaggiosa per i batteri stessi (il che va<br />

probabilmente ricollegato al fatto che la gran parte delle tossine sono<br />

codificate da sequenze virali, trasportate da batteriofagi )<br />

Non di rado un <strong>virus</strong> diventa un simbionte e addirittura un parassita o<br />

simbionte genomico (HERVs e placenta !!)


Why is E.coli a good pathogen?<br />

• Versatility in growth<br />

environment<br />

environment.<br />

• Easily Transmissible<br />

• Persistence in Nature<br />

‐ ability to adapt itself to<br />

environmental factors such as pH,<br />

osmolarity osmolarity, temperature temperature, etc etc.<br />

‐ ability to evolve into a more fit<br />

bacterium through genetic<br />

recombination via conjugation<br />

conjugation


>><br />

>>


Cambiamenti dell’industria zootecnica<br />

Cambiamenti strutturali allevamenti meno numerosi e più affollati<br />

Cambiamenti nelle pratiche di allevamento ruolo dell’alimentazione?<br />

Cambiamenti delle procedure di trasformazione<br />

Produzione odu o e di d massa assa de della a carne ca e ttritata tata<br />

Cambiamenti delle abitudini dei consumatori<br />

Non c’è stato un aumento del consumo di carne tritata negli USA negli ultimi 20<br />

anni, ma è aumentata la porzione consumata fuori casa.<br />

t il 1967 il 1982 l ti ti i f t f d è t t li<br />

tra il 1967 e il 1982 la spesa per pasti consumati nei fast-food è aumentata negli<br />

USA del 224%.


1982<br />

Epidemia multi-Stato da hamburger<br />

Causa più comune di enterite<br />

emorragica negli USA<br />

Epidemia veicolata<br />

da acqua potabile<br />

Negli USA più<br />

comune di Shigella Shigella<br />

1983<br />

1984<br />

1986<br />

1985<br />

Epidemia<br />

da sidro di<br />

mela<br />

1987<br />

1988<br />

1989<br />

1990<br />

1991<br />

1992<br />

AAssociato i t con la l SEU<br />

Epidemia in un reparto<br />

pediatrico<br />

1993<br />

Escherichia coli<br />

O157:H7<br />

Riconosciuto per la prima volta come patogeno


12 Steps to Prevent Antimicrobial Resistance: Hospitalized Adults<br />

Methicillin‐Resistant Staphylococcus p y aureus<br />

(MRSA) Among Intensive Care Unit Patients,<br />

1995‐2004 1995 2004<br />

Perccent<br />

Ressistancce<br />

70<br />

60<br />

50<br />

40<br />

30<br />

20<br />

10<br />

0<br />

1995<br />

1996<br />

1997<br />

1998<br />

1999<br />

2000<br />

2001<br />

2002<br />

2003<br />

2004<br />

YYear<br />

Source: National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System<br />

Link to: NNIS Online at CDC


12 Steps to Prevent Antimicrobial Resistance: Hospitalized Adults<br />

VVancomycin‐Resistant i R i t tEEnterococci t i(VRE) (VRE) AAmong<br />

Intensive Care Unit Patients,1995‐2004<br />

esistannce<br />

Perrcent<br />

R<br />

35<br />

30<br />

25<br />

20<br />

15<br />

10<br />

5<br />

0<br />

19955<br />

19966<br />

19977<br />

19988<br />

19999<br />

20000<br />

20011<br />

20022<br />

20033<br />

20044<br />

Year<br />

Source: National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System<br />

Link to: NNIS Online at CDC


12 Steps to Prevent Antimicrobial Resistance: Hospitalized Adults<br />

Step 9: Know when to say “no” to vanco<br />

Evolution of Drug Resistance in SS.<br />

S. aureus<br />

Vancomycin‐<br />

resistant<br />

S. aureus<br />

Penicillin<br />

aureus<br />

Methicillin<br />

Penicillin‐resistant<br />

Methicillin‐resistant<br />

[1950s] [ ] S. aureus [1970s] [ ] S. aureus (MRSA)<br />

[ 2002 ]<br />

Link to: CDC Facts about VRE<br />

Vancomycin<br />

intermediate‐<br />

resistant<br />

S. aureus<br />

(VISA)<br />

[1997]<br />

Vancomycin<br />

[1990s]<br />

Vancomycin‐resistant<br />

enterococci (VRE)<br />

Link to: MMWR on VRSA<br />

Link to: CDC Facts about VISA


12 Steps to Prevent Antimicrobial Resistance: Hospitalized Adults<br />

3rd Generation Cephalosporin‐Resistant p p<br />

Klebsiella<br />

pneumoniae Among Intensive Care Unit Patients,<br />

1995‐2004 1995 2004<br />

Perccent<br />

Ressistancce<br />

30<br />

25<br />

20<br />

15<br />

10<br />

5<br />

0<br />

1995<br />

1996<br />

1997<br />

1998<br />

1999<br />

2000<br />

2001<br />

2002<br />

2003<br />

2004<br />

YYear<br />

Source: National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System<br />

Link to: NNIS Online at CDC


• the A<br />

subunit is<br />

blue.<br />

• the B<br />

subunit is<br />

red and<br />

orange<br />

This structure is similar in<br />

shape, h mechanism, h i<br />

and sequence to the heat‐<br />

labile enterotoxin secreted<br />

by some strains of<br />

Escherichia coli .<br />

Cholera toxin.<br />

The gene encoding the cholera toxin is introduced into V. cholerae<br />

The gene encoding the cholera toxin is introduced into V. cholerae<br />

by horizontal gene transfer. Virulent strains of V. cholerae carry<br />

a variant of lysogenic bacteriophage called CTXf or CTXφ


3 162 33/csra//index php?option=com content&task=view&id=89&Itemid=222


12 Steps to Prevent Antimicrobial Resistance: Hospitalized Adults<br />

12 Steps to Prevent Antimicrobial<br />

RResistance: i t HHospitalized it li dAd Adults lt<br />

Clinicians hold the solution… solution<br />

Take steps NOW to prevent antimicrobial resistance!<br />

12 Break the chain<br />

11 Isolate the pathogen<br />

10 Stop treatment when cured<br />

9 Know when to say “no” to vanco<br />

8 Treat infection, not colonization<br />

7 Treat infection, , not contamination<br />

6 Use local data<br />

5 Practice antimicrobial control<br />

4 Access the experts<br />

3 Target the pathogen<br />

2 Gtth Get the catheters th t out t<br />

11 Isolate the pathogen PPrevent tTTransmission i i<br />

Use Antimicrobials Wisely<br />

1 Vaccinate Diagnose & Treat Effectively<br />

Prevent Infections


Twenty years ago, HIV was three logs further down the scale, whereas polio was three logs higher. Fifty years<br />

ago, malaria was finally eradicated from Europe, where it had formerly been widespread, including in England<br />

(Shakespeare’s (Shakespeare s ‘ague’) ague )… and and, despite concern over multi multi-resistance resistance to antibiotics the situation is<br />

considerably better than in the era before… Thanks to effective immunization policies of the WHO, smallpox<br />

was eradicated in 1977; polio and measles <strong>virus</strong>es, which have no animal reservoir, may soon be<br />

eliminated in the same way (?)


Uomini e VIRUS


About two thirds of the new human pathogens are<br />

About two thirds of the new human pathogens are<br />

RNA <strong>virus</strong>es, which have a small number of genes,<br />

making them more susceptible to mutation…


Il Mistero Influenza e gli Allarmi attuali<br />

(da H5N1/1997‐2003 a H1N1‐(S‐OIV) 2009)<br />

<strong>Ernesto</strong> <strong>Burgio</strong><br />

Comitato Scientifico<br />

ISDE Italia


Influenza <strong>virus</strong> was first isolated<br />

from pigs in 1931 by Shope.


(HA) (NA), and M2 ion‐channel protein<br />

embedded in the viral envelope, derived from the<br />

host plasma membrane<br />

Matrix (M1) protein<br />

Non‐Structural proteins 1‐2<br />

Ribonucleoprotein complex : viral RNA + nucleoprotein (NP)<br />

+ 3 polymerase proteins (PA, PB1 and PB2).<br />

890<br />

aa<br />

2341(33)<br />

1027<br />

1778<br />

1565<br />

1413<br />

13.550n 4450aa


Replication of influenza A <strong>virus</strong>. After binding (1) to sialic acid-containing receptors, influenza is<br />

endocytosed and fuses (2) with the vesicle membrane. Unlike for most other RNA <strong>virus</strong>es, transcription (3) and<br />

replication (5) of the genome occur in the nucleus. Viral proteins are synthesized (4), helical nucleocapsids<br />

form and associate (6) with M1M2, and the protein-lined membranes containing HA and NA glycoproteins<br />

(7) The <strong>virus</strong> buds from the plasma membrane. (+)=Positive sense; ER=endoplasmic reticulum<br />

(From Medical Microbiology, 4 th ed., Murray, Rosenthal, Kobayashi & Pfaller, Mosby Inc., 2002, Figure 56-2.)


• Il serbatoio naturale degli orthomyxo<strong>virus</strong> influenzali<br />

sono gli uccelli selvatici acquatici.<br />

• Il <strong>virus</strong> non dovrebbe dare malattia in questi, ma<br />

continua a circolare da un soggetto all'altro senza un<br />

sostanziale rimaneggiamento genetico genetico.<br />

• La trasmissione diretta dagli uccelli selvatici all'uomo<br />

non è dimostrata<br />

• ma quando il <strong>virus</strong> passa dagli uccelli selvatici a quelli<br />

domestici come i polli, questo cambia, e diviene<br />

possibile la trasmissione tra polli, uomo, maiali o altri<br />

mammiferi.


Human trachea expresses sialyl 2-6 Gal significantly, while duck intestinal mucosa<br />

express 2-3. In contrast, pig trachea expresses both 2-3 and 2-6 linkages.<br />

Due to their abilityy to support pp replication p of both avian and human influenza <strong>virus</strong>es,<br />

pigs have been implicated as intermediate hosts, serving as mixing vessels<br />

for avian and human <strong>virus</strong>es.


A1<br />

A2


When AA Leu 226, located in<br />

the receptor binding pocket *<br />

is substituted to Gln, a dramatic<br />

change g in receptor p binding g<br />

specificity from 2‐6 to 2‐3 occurs…


Alignment and comparison of complete HA coding sequence<br />

for the A/Hong g Kong/156/97 g <strong>virus</strong> isolate<br />

Bold peptides describe the location of the receptor binding site The boxed amino acids indicate<br />

potential glycosylation sites Subarrao et al Science. 1998 Jan 16;279(5349):393‐6


PB2 E627K<br />

Cytokines’ storm<br />

Changes in HA and<br />

PB1 (1957/1968 (1957/1968…) )


1918/1997‐2003 1918/1997 2003 > 1957…1968<br />

(avian)<br />

• Ma è sempre più evidente che è la costellazione<br />

genico‐antigenica genico antigenica complessiva a determinare<br />

le potenzialità patogenetiche<br />

e pandemiche di un ceppo<br />

• difficilmente un “nuovo ceppo”<br />

(frutto di trasformazioni radicali recenti)<br />

presenta caratteristiche di stabilità<br />

e buon adattamento al nuovo ospite


Transmission electron micrograph of influenza<br />

A HPAI <strong>virus</strong> ( pleomorphism)


H5N1/97‐03… H1N1/09<br />

Prepararsi alla prossima pandemia ?<br />

?<br />

?<br />

Michael Osterholm Direttore del Centro per la ricerca e la gestione delle malattie infettive .<br />

Ufficio affari esteri, Usa da Foreign Affairs, luglio/agosto 2005


“L’influenza L influenza segue due modelli epidemici, epidemici piuttosto<br />

atipici:<br />

il primo attraversa aree geografiche circoscritte con<br />

cadenza annuale e recrudescenze irregolari<br />

(epidemie stagionali);<br />

il secondo interessa, con cadenza ancor meno regolare<br />

( (periodi i diiintercritici i i idi di 10‐50 anni), i) l’i l’intero pianeta i<br />

(pandemie)”<br />

Cambiamenti strutturali importanti dell’HA (emagglutinina)<br />

e/o della NA (neuraminidasi) : Shift antigenico…<br />

Levine A. J. Virus Zanichelli, Bologna, 1994


swine ?<br />

H1N1/1918 ??<br />

H5N1/1997‐2003


H2N2<br />

H2N2 AVIAN<br />

+<br />

H1N1 HOMO<br />

H1N1<br />

Esempio<br />

1957<br />

H2N2 HOMO


?!<br />

Si scoprì che A/USSR/90/77<br />

era identico, sul piano<br />

molecolare e antigenico,<br />

all’H1N1 all H1N1 circolante negli anni<br />

’50, che era stato sostituito<br />

dall’H2N2 dell’asiatica.<br />

Era però evidente che, se nei<br />

venti anni precedenti p avesse<br />

circolato tra <strong>uomini</strong> o (altri)<br />

animali, H1N1 si sarebbe<br />

trasformato: il <strong>virus</strong> era<br />

dunque q rimasto, , con ogni g<br />

probabilità, per tutto quel<br />

tempo, nel freezer di un<br />

laboratorio.<br />

Ma chi lo aveva conservato<br />

aveva forse continuato a<br />

lavorare sperimentalmente<br />

su quello che comunque era<br />

il più p diretto discendente del<br />

<strong>virus</strong> della spagnola ?<br />

E come mai il <strong>virus</strong> era<br />

tornato improvvisamente in<br />

circolazione ?<br />

With co-circulation of two<br />

influenza A subtypes and two<br />

antigenically distinct lineages..<br />

genetic reassortment also has an<br />

important role in antigenic drift,


Timeline of emergence of Influenza A <strong>virus</strong>es in humans. The <strong>virus</strong>es isolated from pandemics in the last<br />

century are indicated by time of origin and subtype. Virus subtypes with pandemic potential are circled.


Dire che l’H1N1/2009 proviene dal <strong>virus</strong> della<br />

Dire che l H1N1/2009 proviene dal <strong>virus</strong> della<br />

Spagnola dovrebbe quindi, paradossalmente,<br />

rassicurare, perché significa che è l’ennesima<br />

metamorfosi di un <strong>virus</strong> che il nostro sistema<br />

immunocompetente conosce da quasi un secolo


• Alcune pandemie sono più invasive e letali di altre …<br />

questa q diversità dipende p dal patrimonio p ggenetico<br />

virale e dalla presenza o meno di alcuni specifici fattori<br />

di virulenza<br />

• Recenti studi epidemiologici suggeriscono che<br />

l'impatto limpatto causato da una pandemia da H5N1 potrebbe<br />

essere simile a quello della pandemia del 1918. (In<br />

quel caso più del 50% dei morti furono soggetti in<br />

buono stato di salute tra i 18 e i 40 anni)**<br />

Michael Osterholm Direttore del Centro per la ricerca e la gestione delle malattie infettive .<br />

Ufficio affari esteri, Usa da Foreign Affairs, luglio/agosto 2005<br />

** Il non avere un’immunità stabile e consolidata, non<br />

significa soltanto essere incapaci di sviluppare una<br />

risposta sufficientemente energica, ma anche essere a<br />

rischio di rispondere in modo eccessivo …


Three pandemic waves: weekly combined influenza and<br />

pneumonia mortality mortality, United Kingdom


U‐ and W‐ shaped combined influenza and pneumonia<br />

mortality mortality, by age at death


A/Sidney/5/97<br />

H3N2 has mutated many times since<br />

its emergence in 1968.


…The fact that this novel H1N1 influenza A <strong>virus</strong> has become a<br />

pandemic <strong>virus</strong> expands the previous definition of the term….


..Alcuni mesi dopo la comunità internazionale dei virologi, in parte forse irritata, in parte affascinata dall’impresa di<br />

Taubenberger fu sconvolta da un secondo evento epocale. A Hong Kong, allora ancora colonia inglese, un<br />

bimbo di tre anni, che fino a quel momento aveva goduto di buona salute, era stato ricoverato per sindrome<br />

influenzale complicata da insufficienza respiratoria ed era morto in pochi giorni, ucciso da una devastante<br />

polmonite virale.. Dopo alcuni mesi di tregua il <strong>virus</strong> tornò a farsi vivo: 17 casi e 5 altri decessi<br />

.. a uccidere era stato un H5N1: un <strong>virus</strong> pericoloso che nei mesi precedenti aveva ucciso migliaia di polli negli<br />

allevamenti di Hong Kong; un <strong>virus</strong> .. verosimilmente passato direttamente dagli uccelli selvatici all’uomo,<br />

con la sola intermediazione degli uccelli di allevamento e senza il “fatidico passaggio” nel maiale …


H5N1<br />

Furono questi i prodromi del primo allarme pandemico del terzo millennio:<br />

di quella cha ancor oggi, piuttosto impropriamente, viene definita l’aviaria<br />

e descritta, altrettanto superficialmente, come “lo scampato pericolo<br />

dell’aviaria” o, ancor peggio, e irresponsabilmente, come Avian Hoax<br />

(come a dire: la bufala aviaria). ..


The H5N1 bird flu <strong>virus</strong> that<br />

infected humans in 1997<br />

acquired all eight gene<br />

segments from Eurasian avian<br />

sources and retained<br />

a preference for binding to (2,3)<br />

sialic acid receptors, a feature<br />

typical yp<br />

of avian influenza <strong>virus</strong>es


Warning! Do not give aspirin (acetylsalicylic acid) to children or teenagers<br />

ho have the flu; this can cause a rare but serious illness called Reye’s syndrome.<br />

Reye's syndrome is a potentially fatal<br />

disease that causes numerous<br />

detrimental effects to many organs,<br />

especially the brain and liver,<br />

ECCESSO DI MORTI NEI MINORI<br />

IN USA E UK 2003 2003-2004: 2004 un<br />

ceppo virale atipico FUJAIAN<br />

determinò 93 decessi in USA, e 12<br />

in UK (anche tra i vaccinati).


Proposed Mechanism of the Cytokine Storm Evoked by Influenza<strong>virus</strong><br />

Osterholm, M. T. N Engl J Med 2005;352:1839-1842


Chest Radiographs from the Three Patients<br />

with Avian Influenza A (H5N1).


H5N1 Wild Bird Flu Outbreaks<br />

February 2006


5<br />

4<br />

La trasformazione di H5N1 continuò negli anni successivi: lenta, progressiva, imprevedibile. Dal 2003 al 2006 i casi umani furono<br />

La trasformazione di H5N1 continuò negli anni successivi: lenta, progressiva, imprevedibile. Dal 2003 al 2006 i casi umani furono<br />

centinaia e i tassi di letalità altissimi in vari paesi: Vietnam, Thailandia, Indonesia … Veramente sembrava che H5N1 potesse<br />

cambiare da un giorno all’altro uno o due aminoacidi della propria HA, trasformandosi definitivamente in un pandemico altrettanto<br />

virulento dell’H1N1 del 1918. E a quanti seguivano con apprensione la lenta progressione del <strong>virus</strong> non potevano che<br />

apparire sciocche e irresponsabili le polemiche di quanti parlavano di un allarme inventato.<br />

1<br />

3<br />

2


The potential impact of pandemic influenza on the safety of the blood supply should be small because of the<br />

The potential impact of pandemic influenza on the safety of the blood supply should be small because of the<br />

limited viremia and the nature of respiratory tract infection of influenza <strong>virus</strong>es. However, the potential impact<br />

of pandemic influenza on the availability of the blood supply could be significant because of reduced<br />

donation from blood donors and reduced staff capacity at blood centers during a pandemic


Infection control: special<br />

flow strategy and area<br />

for sick (potentially<br />

(p y<br />

contagious) patients.<br />

Dis Mon 2007;53:348-387


Il problema fondamentale, del quale tutto sommato si parla poco, è dato proprio dagli allevamenti<br />

intensivi, aviari e, in questo caso, suini che sono diventati un immenso laboratorio globale, nel<br />

quale l’utilizzo di farmaci e vaccini e la promiscuità innaturale tra <strong>uomini</strong> e altri animali rischiano di<br />

creare un’enorme pressione p selettiva su <strong>microrganismi</strong> g e <strong>virus</strong>.<br />

Vedremo come, dal 1997 a questa parte. l’H1N1 “classico” che, ricordiamolo<br />

è presente nei maiali (come nell’uomo) da oltre ottanta anni, senza cerare<br />

grandi problemi, ha subito almeno otto modifiche significative …


Perhaps the most mysterious feature<br />

of epidemic influenza is its remarkable<br />

and recurrent seasonality<br />

– wintertime surfeit and summertime<br />

scarcity – a feature first explored in detail<br />

by R. Edgar Hope-Simpson….<br />

Vitamin D deficiency predisposes children to respiratory infections. Ultraviolet radiation (either from<br />

artificial tifi i l sources or ffrom sunlight) li ht) reduces d the th incidence i id of f viral i l respiratory i t infections, i f ti as ddoes cod dli liver oil il<br />

(which contains vitamin D). An interventional study showed that vitamin D reduces the incidence of respiratory<br />

infections in children. We conclude that vitamin D, or lack of it, may be Hope-Simpson’s ‘seasonal stimulus


On 26 April, with 20 cases and no deaths in the US, the<br />

Department of Health and Human Services declared a<br />

nationwide public p health emergency. g y


PANDEMIA: Epidemia diffusa in tutto il<br />

mondo,con un enorme numero di<br />

malati e di morti, a causa della<br />

comparsa di un nuovo <strong>virus</strong> contro il<br />

quale la popolazione non ha nessuna<br />

immunità ..<br />

Da Maggio 2009 ,dopo l’arrivo del <strong>virus</strong><br />

H1N1 scompare la condizione “con<br />

un enorme numero di morti”, e viene<br />

modificata in senso più possibilista la<br />

mancanza di immunità…<br />

Since the emergence of novel A/H1N1,<br />

descriptions p of pandemic p flu (both ( its<br />

causes and its effect) have changed to<br />

such a degree that the difference<br />

between seasonal flu and pandemic<br />

flu is now unclear…


There seems to be a protective affect<br />

with increase in age, suggesting past<br />

exposure and immunity ..


Highest % Case-Fatality (77.5%) was<br />

observed in the 20-54 year age group


The outbreak in Mexico started<br />

in March or perhaps even<br />

earlier, , peaked p during g the<br />

last week of April and seems<br />

to have burned out !!


Cases* Deaths<br />

Total Over 399232 At least 4735


FluTracker map data current as of 11:25 EST 08 November<br />

http://flutracker.rhizalabs.com/


Except for the classical<br />

swine H1N1 <strong>virus</strong>es, most<br />

of these contemporary H1<br />

and d H3 strains are triple l<br />

reassortant <strong>virus</strong>es,<br />

containing genes of avian,<br />

human, and swine<br />

influenza <strong>virus</strong> origin. g


Appearing at approximately the same time in Minnesota, Iowa, and Texas were additional H3N2 isolates<br />

that had triple reassortants .. with genetic material from an avian influenza <strong>virus</strong> (two genes), from human<br />

(three genes) and swine (three genes) <strong>virus</strong>es as well. The emergence of these H3N2 <strong>virus</strong>es .. a<br />

remarkable occurrence, as it was the first time reported that the genome of an influenza <strong>virus</strong> consisted of<br />

gene segments from three different viral lineages


Subsequent to the emergence of the H3N2 <strong>virus</strong>es, genetic changes in both H1 and H3<br />

SIV subtypes were detected with increasing frequency in the US. US The dynamics of<br />

clinical disease and prevention of outbreaks also changed dramatically. Reassortant<br />

H1N1 <strong>virus</strong>es (reassortants contain genes from swine, avian, and/or human influenza<br />

<strong>virus</strong>es) <strong>virus</strong>es), for example example, were reported to infect and cause disease in herds that had<br />

been routinely vaccinated with commercial vaccines containing cH1N1 SIV.<br />

Such findings raised concerns among some investigators that vaccines in swine may<br />

need to be continually updated as in human medicine<br />

Antigenic and genetic studies conducted with SIV field isolates since the dramatic<br />

appearance of the H3N2 subtype in 1998 have confirmed that<br />

the H1N1 subtype, which had remained essentially stable in US swine for<br />

80 years, was now evolving through antigenic drift and reassortment.<br />

As the timeline in Figure 4 illustrates, four new variant H1 strains emerged<br />

in rapid succession in the US during the years 1999 through 2003.


From when it was first isolated in 1930 until 1998, the classical H1N1 (cH1N1) subtype of SIV was essentially the only SIV<br />

lineage circulating in the US swine population. Genetically and antigenically, the cH1N1 SIV and the human influenza<br />

<strong>virus</strong> implicated in the 1918 Spanish Flu pandemic are similar.<br />

classical H1N1<br />

Beginning in 1998, however, clinical disease caused by H3N2 subtypes was recognized in a few states and<br />

soon spread throughout the entire country. Described as reassortant <strong>virus</strong>es, the original H3N2 strain had<br />

three genes from a human H3N2 influenza <strong>virus</strong> that circulated in the human population during 1995, as<br />

well as five genes from the cH1N1 SIV. The initial outbreak of influenza attributed to H3N2 occurred during<br />

August of 1998 in a North Carolina pig farm


cH1N1 SIV<br />

**<br />

It is significant that<br />

one of the North<br />

American H1N2 **<br />

‘triple reassortants’<br />

closest to S-OIV is<br />

probably used in<br />

commercial<br />

multivalent pig<br />

vaccines in North<br />

America


Using data from the Immune Epitope Database, we<br />

found that only 31% (8/26) of B-cell epitopes present<br />

in recently circulating H1N1 strains are conserved in<br />

the S-OIV, with only 17% (1/6) conserved in the<br />

HA and NA surface proteins.<br />

In contrast, 69% (54/78) of the epitopes recognized<br />

by CD8 T cells are completely invariant. ..some<br />

memory T-cell immunity against S-OIV is present in<br />

the adult population .. of similar magnitude as the preexisting<br />

memory against seasonal H1N1 influenza…<br />

the conservation of a large fraction of T-cell epitopes<br />

suggests that the severity of an S-OIV infection, as<br />

far as it is determined by susceptibility of the <strong>virus</strong> to<br />

immune attack, would not differ much from that of<br />

seasonal flu.


Recently, an in vivo study using genome wide microarray analysis compared the<br />

effect of MF59, alum and CpG after i.m. injection in mice. All of these adjuvants<br />

modulated a cluster of common genes named “adjuvant core response<br />

genes” genes characterized by the up-regulation up regulation of cytokines, chemokines and<br />

adhesion molecules


EFFICACIA nei bambini al di sopra dei 2 a. a = 28%<br />

nei bambini sotto i 2 anni = PLACEBO (revisioni di Cochrane-Lancet 2005)<br />

IInfluenza fl vaccines i (especially ( i ll two-dose t d live li attenuated tt t d vaccines) i ) are<br />

efficacious in children older than 2 years. Efficacy and effectiveness of the<br />

vaccines differed strikingly. Only two small studies assessed the effects of<br />

influenza vaccines on hospital admissions and no studies assessed reductions<br />

in mortality, serious complications, and community transmission of influenza.


DUE VACCINI CON ADIUVANTE IN ITALIA:<br />

o Focetria Novartis che contiene MF59<br />

o Pandemrix Glaxo Smith Kline che contiene AS03<br />

Entrambi contengono Squalene come adiuvante<br />

VACCINO SENZA ADIUVANTE:<br />

o Celvapan Baxter a <strong>virus</strong> intero, inattivato, propagato in<br />

cellule VERO (linea cellulare continua di origine<br />

mammifera)<br />

Sulla scheda tecnica di Focetria si riportano i dati di<br />

immunogenicità e sicurezza di un altro vaccino anti-<br />

H5N1 che contiene MF59, ma non lo stesso <strong>virus</strong><br />

Anche per il Pandemrix gli studi si<br />

riferiscono ad un vaccino anti-H5N1<br />

L’adiuvante ad u a te serve se e ad au aumentare e ta e la a risposta sposta immunitaria u ta a pe per rendere e de e ppiù ù<br />

efficace l’antigene, con la possibilità di utilizzare minori quantità<br />

di antigene per ogni singola dose<br />

Gli adiuvanti possono però interferire in modo<br />

indesiderato sui meccanismi del sistema immunitario<br />

favorendo, in soggetti predisposti, risposte<br />

paradosso di tipo autoimmune.(Morgan Stanley<br />

Reserch Europe maggio 2008)<br />

Daniela Zangara (ACP)<br />

daniela.zangara@virgilio.it<br />

265


Efficacia del vaccino: il Focetria<br />

21 giorni g dopo p una dose di vaccino di 7.5 µg<br />

con<br />

l’adiuvante MF59, il tasso di sieroconversione,<br />

misurato con un test di inibizione dell’emoagglutinazione e<br />

un test di microneutralizzazione microneutralizzazione, è stato rispettivamente del<br />

76% e nel 92%<br />

Dati preliminari in un gruppo molto piccolo (70) di<br />

bambini (età compresa tra i 6 mesi ed i 17 anni):<br />

sieroconversione dopo 8-10 giorni dalla prima dose:<br />

76% nel gruppo 10-17 anni; 36% nel gruppo 3-9<br />

anni; nni; 25% nel n l gruppo upp 66-35 35 mmesi si<br />

Utilizzo in gravidanza<br />

… sulle schede tecniche di entrambi i<br />

prodotti si dichiara che “attualmente non si<br />

dispone di dati sull’uso in gravidanza”.<br />

Daniela Zangara (ACP)<br />

daniela.zangara@virgilio.it


Focetria Novartis<br />

• CConfezioni f i i multidose lid da d 10 0 dosi, d i dda somministrare i i entro 224 h<br />

‐rischio infettivo, per cui l’Australia ha chiesto le dosi singole<br />

‐presenza di thiomersal, un sale di mercurio usato come disinfettante, già oggetto di<br />

contestazioni t t i inel l 2000 per lla neuro‐tossicità t i ità<br />

• Dal 25% al 50% dei medici rifiuterebbe la vaccinazione per paura degli effetti<br />

collaterali (Kmietowicz Z BMJ 2009 339:b3461); 1:2 ad Hong Kong (BMJ2009<br />

339 339:3391); 3391) 13i 1:3 in FFrancia i (l’E (l’Express 09/ 09/set/2009); t/2009) 13i 1:3 infermieri f i idlR del Regno UUnito it<br />

• Sulle schede tecniche di entrambi i vaccini si dichiara che “non si dispone<br />

attualmente di dati sull’uso in gravidanza” . Vi si afferma che ” i dati sulle donne<br />

gravide vaccinate con diversi vaccini non adiuvati contro l’influenza stagionale, non<br />

suggeriscono malformazioni, o tossicità neonatale”,<br />

I dati di sicurezza ed efficacia sono<br />

garantiti dalla Novartis, che comunque<br />

non li ha resi ancora accessibili.<br />

Daniela Zangara (ACP)<br />

daniela.zangara@virgilio.it


Currently, H5N1 influenza vaccines with nonaluminium<br />

adjuvants might represent the best<br />

available option in a pandemic. Large-scale studies<br />

are needed to verify the high immunogenicity<br />

of nonaluminium-adjuvanted vaccines<br />

that use very low doses of antigen.<br />

Rimane il dubbio che gli adiuvanti possano interferire sui meccanismi del sistema immunitario favorendo<br />

risposte paradosse di tipo autoimmune.Questo sarebbe il motivo delle resistenze dell’FDA, stando a<br />

quanto scrive la Morgan Stanley Research Europe in un documento del maggio 2008. 2008 I dubbi sulla<br />

sicurezza a distanza degli adiuvanti vengono in effetti sollevati da diversi autori (Vaccine 2009; 27: 3331–3334,<br />

FDA meeting December 2008, Drug Discovery Today 2009; 14: 541-551, BioPharm International, August 2007).<br />

Sarà quindi necessario che la sorveglianza tenga conto anche di questa ipotetica reazione, tutt’altro che facile<br />

da monitorare monitorare. E viene da chiedersi se sia il caso di somministrare vaccini adiuvati a bambini e gravide gravide,<br />

senza un’adeguata sperimentazione clinica che riguardi anche questo aspetto.<br />

(Luisella Grandori ACP-ISDE Italia)


Most of the concerns raised almost 30 years ago still remain<br />

valid today, today although perhaps we now know a little more<br />

about how the adjuvants work. Even back in 1980, it was<br />

highlighted that there were concerns that potent immune<br />

stimulators could potentially trigger autoimmune diseases,


MF59 stimulates human macrophages<br />

macrophages,<br />

monocytes and granulocytes to release monocyte<br />

and granulocyte attracting chemokines like<br />

CCL2, CCL3 and CCL4 and CXCL8<br />

… recent work on alum and on the squalene-based emulsion MF59, has demonstrated that besides antigen<br />

delivery functions, these classes of adjuvants can also activate innate immunity pathways in vivo, generating<br />

an immunocompetent environment at injection site. Interestingly, it has been demonstrated that alum adjuvanticity<br />

depends on the activation of a protein complex called NLPR3/inflammasome, which whichisrequired is required for the<br />

correct processing of a number of pro-inflammatory cytokines, including IL1. More work needs to be<br />

performed to investigate if the inflammasome is also required for the activity of MF59 and of other particulate<br />

vaccine adjuvants.


EFFICACIA<br />

Poco sappiamo<br />

La quantità di anticorpi evocati da prodotti simil-H1N1 sarà la stessa?<br />

La produzione di anticorpi significherà che il vaccino proteggerà dalle<br />

complicanze, o dalla morte?<br />

Servono studi più approfonditi che non abbiamo neppure per la vaccinazione<br />

antinfluenzale stagionale. (Tom Jefferson BMJ 2006 333 912-915)<br />

CO -SOMMINISTRAZIONE COL VACCINO ANTINFLUENZALE STAGIONALE<br />

Non si sa nulla<br />

E’ certo che non si possono somministrare contemporaneamente, anche se in sedi<br />

diverse, 2 vaccini che contengono adiuvante<br />

Non si sono mai testati gli effetti della somministrazione di 2 vaccini contro 2<br />

diversi H1N1 (Anthony Fauci - Nature )<br />

Ci può essere potenziamento, competizione o interferenza tra i due vaccini..<br />

Dal punto di vista immunologico e’ impossibile fare previsioni<br />

L’uso indiscriminato di vaccini e di<br />

antivirali potrebbe esercitare su H1N1<br />

un’indebita pressione selettiva<br />

Daniela Zangara (ACP)<br />

271<br />

daniela.zangara@virgilio.it


The persistence mechanism induced by enviromental transmission raises novel<br />

problems of epidemic control since traditional strategies may prove ineffective in the<br />

presence of an environmental viral reservoir


…the similarity of gene segments of A/Swine/Guangdong/z5/2003 was closer to<br />

M Moscow/99-like /99 lik hhuman H3N2 <strong>virus</strong> i th than EEurope swine i H3N2 <strong>virus</strong>es i during d i 1999–2002.<br />

1999 2002<br />

These results suggest that A/Swine/Guangdong/z5/2003 may be porcine in origin,<br />

possibly being driven by human immune pressure induced by either natural H3N2<br />

<strong>virus</strong> infection or use of A/Moscow/10/99 (H3N2)-based human influenza vaccine.


The first isolation and characterization of the novel<br />

subtype H3N1 in Europe was described.<br />

The complete HA gene presented the highest identity to three Italian H3N2 SIVs isolated in 2001 and<br />

2004, whereas the NA gene was instead closely related to three Italian H1N1 SIVs isolated in 2004.<br />

The deduced aa sequence of the HA gene showed the aa residues (L226 and S228) responsible for the<br />

receptor specificity typical of swine and human influenza <strong>virus</strong>es… This suggested that the novel SIV<br />

was a reassortant between the H3N2 and H1N1 SIVs circulating in Italy.


Il rischio maggiore che corriamo è che a forza di<br />

gridare “al lupo, al lupo” se e quando verrà<br />

veramente il lupo nessuno ci crederà..

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