E. Testai - Istituto Superiore di Sanità
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Metabolismo e tossicocinetica<br />
degli xenobiotici durante la<br />
gravidanza e<br />
nelle varie fasi dello sviluppo<br />
Emanuela <strong>Testai</strong><br />
<strong>Istituto</strong> <strong>Superiore</strong> <strong>di</strong> <strong>Sanità</strong> -Dipartimento Ambiente<br />
e Connessa Prevenzione Primaria- Roma (Italy)<br />
testai@iss.it
XENOBIOTICO: Chi è costui?<br />
Ogni sostanza chimica estranea all’organismo è<br />
definita uno xenobiotico.<br />
Ad<strong>di</strong>tivi alimentari, aromatizzanti, coloranti, emollienti,<br />
emulsificanti, pestici<strong>di</strong>, sottoprodotti della combustione e della<br />
clorazione delle acque, inquinanti ambientali, farmaci, prodotti<br />
‘naturali’ e voluttuari sono xenobiotici.<br />
Che cosa accade quando<br />
un organismo viene<br />
esposto ad uno<br />
xenobiotico?<br />
Assorbimento<br />
Distribuzione<br />
Metabolismo<br />
Escrezione<br />
La fase<br />
tossicocinetica
Assorbimento<br />
Distribuzione<br />
Avviene attraverso membrane biologiche<br />
Quasi tutti gli xenobiotici sono liposolubili<br />
Gli xenobiotici sono <strong>di</strong>stribuiti ai <strong>di</strong>versi organi<br />
attraverso il circolo sanguigno (essenzialmente<br />
legati alle proteine plasmatiche). Nei vari <strong>di</strong>stretti<br />
possono accumularsi (membrane e tessuto a<strong>di</strong>poso)<br />
⇒ EFFETTI TOSSICI se si supera la soglia <strong>di</strong><br />
tossicità<br />
Durante la gravidanza possono raggiungere il<br />
prodotto del concepimento attraverso la placenta,<br />
entrando sia per <strong>di</strong>ffusione passiva che in alcuni<br />
casi per trasporto attivo ⇒ Aborti, effetti<br />
teratogeni, effetti sullo sviluppo post-natale .<br />
Escrezione Avviene principalmente attraverso soluzioni<br />
acquose
La funzione delle reazioni <strong>di</strong> biotrasformazione è<br />
quella <strong>di</strong> aumentare la idrosolubilità degli<br />
xenobiotici, evitandone l’accumulo negli organismi<br />
favorendone l’escrezione in<br />
ambiente acquoso<br />
Reazioni <strong>di</strong> fase I: inseriscono o smascherano<br />
gruppi funzionali (-OH, -NH 2 )<br />
Reazioni <strong>di</strong> fase II: coniugano al parentale o al<br />
prodotto <strong>di</strong> reazione della fase I molecole<br />
endogene altamente solubili
Metabolismo degli xenobiotici<br />
Gli enzimi coinvolti nel metabolismo degli xenobiotici (CYP,<br />
GST, UDPGT, idrolasi, esterasi) li trasforma in:<br />
• Metaboliti con attività < o nulla rispetto al parentale<br />
(Es: OPT, triazine): detossificazione<br />
• Metaboliti con attività biologica > del composto<br />
parentale (Es: OPT, carbammati): bioattivazione<br />
TOXIC CHEMICAL<br />
---------------------------------------------------------------------<br />
X X*<br />
---------------------------------------------------------------------<br />
METABOLISM TOXICITY TOXICITY<br />
high<br />
low
Variabilità indotta da<br />
fattori socioambientali<br />
Dieta<br />
Fumo<br />
Bevande alcoliche<br />
Farmaci<br />
Inquinanti<br />
Stati patologici<br />
Induzione<br />
Inibizione<br />
Xenobiotico<br />
ORGANISMO<br />
Farmaco/tossicocinetica<br />
RISPOSTA<br />
Effetto Terapeutico<br />
Tumore<br />
Tossicità<br />
Variabilità indotta<br />
da fattori genetici<br />
Recettori<br />
Mo<strong>di</strong>ficati<br />
Variazioni geniche<br />
Espressione<br />
Polimorfica <strong>di</strong><br />
enzimi del<br />
metabolismo<br />
Sistemi <strong>di</strong> <strong>di</strong>fesa<br />
Mo<strong>di</strong>ficati<br />
(DNA-Repair)
Nessuna esposizione<br />
a tossici<br />
Sviluppo embriofetale<br />
buono<br />
Esposizione materna a<br />
xenobiotici tossici<br />
Possibilità <strong>di</strong>:<br />
aborto, <strong>di</strong>fetti alla<br />
nascita, <strong>di</strong>sfunzioni<br />
funzionali
DEVELOPING ORGANISMS ADULT ORGANISMS<br />
Rodents Humans Rodents<br />
Humans<br />
N° + ++ +++++++<br />
++++<br />
Levels -/+ ++<br />
+++++ ++++<br />
of activity<br />
Gran<strong>di</strong> <strong>di</strong>fferenze <strong>di</strong> specie nell’ontogenesi dei sistemi<br />
enzimatici<br />
la specie umana ha capacità metaboliche relativamente<br />
buone a livello epatico nel periodo perinatale, al contrario<br />
dei ro<strong>di</strong>tori<br />
Il profilo metabolico del concepito varia <strong>di</strong>namicamente<br />
durante lo sviluppo<br />
L’identificazione dello sta<strong>di</strong>o gestionale in stu<strong>di</strong>o è<br />
cruciale per la produzione <strong>di</strong> dati scientificamente vali<strong>di</strong>
La maggioranza delle reazione <strong>di</strong> biotrasformazione<br />
degli xenobiotici avviene nel fegato dell’adulto<br />
Gli stu<strong>di</strong> sugli organismi in via <strong>di</strong> sviluppo si sono<br />
concentrati per analogia sullo stesso organo e tra i<br />
sistemi enzimatici il più stu<strong>di</strong>ato è quello del<br />
citocromo P450.
Il citocromo P450<br />
Il P450 è una famiglia multigenica <strong>di</strong><br />
emoproteine che catalizzano la monoossigenazione<br />
<strong>di</strong> substrati endogeni ed esogeni<br />
Cytochrome P450<br />
CYP 2 E 1<br />
Gene number<br />
Gene subfamily<br />
Gene family<br />
Same gene family : sequence similarity >40%<br />
Same subfamily : sequence similarity >55%<br />
Same gene n° in <strong>di</strong>fferent species: orthologous enzymes
Il citocromo P450<br />
Co-substrates NADPH, O 2<br />
Coupled enzymes Cytochrome b 5 , Cyt.P450-reductases<br />
Isoforms >500<br />
Substrates organic compounds with/without<br />
eteroatoms (N,S,Se,P)<br />
Localization microsomes, mitochondria<br />
Tissues-Organs Liver, Kidney, Lung, Adrenal, Skin, Brain,<br />
Placenta, Reproductive organs<br />
Inductors Many (PB,TCDD, EtOH)<br />
Inhibitors Competitive Substrates, Inactivators<br />
I CYP che metabolizzano gli xenobiotici appartengono alle<br />
famiglie. 1-4<br />
Un singolo CYP può metabolizzare substrati <strong>di</strong>fferenti e<br />
lo stesso xenobiotico può essere metabolizzato da vari<br />
CYP con affinità <strong>di</strong>versa.
METODI PER DETERMINARE LA PRESENZA DI CYP E LORO<br />
ATTIVITA’ NEGLI ORGANISMI IN VIA DI SVILUPPO<br />
A) Detection of specific enzymatic activities with model (probe)<br />
substrates (Substances which are specifically metabolized by one CYP<br />
lea<strong>di</strong>ng to a easily detectable product)<br />
CYP1A1<br />
Ethoxyresorufin Resorufin (Fluorescent)<br />
CYP3A4<br />
Eritrhromycin Demethylated product + HCHO<br />
LIMITS: Low activities (below limit of detection) Overlapping in substrate<br />
specificity, Probe substrates suitable for adult CYPs.<br />
A) Enzyme localization by means of immunoblotting or immunohysto-<br />
chemical tecniques<br />
LIMITS: Cross-reactivity of antibo<strong>di</strong>es towards rat/mouse CYP(s) with more<br />
than one human CYP.<br />
A) Use of PCR and reverse-transcriptase (RT)-PCR to detect even small<br />
quantities of specific mRNA<br />
ADVANTAGES: increase in sensitivity and specificity.
FAMIGLIA 1<br />
Isoforme CYP1A1 CYP 1A2 (CYP 1B1)<br />
Ortologhi nei ro<strong>di</strong>tori e nell’uomo<br />
Substrati: idrocarburi policiclici aromatici (IPA) bifenili<br />
policlorurati (PCBs -procarcinogens) , ammine aromatiche<br />
RODENTS<br />
CYP1A1<br />
Non espresso costitutivamente in alcun tessuto e sta<strong>di</strong>o <strong>di</strong> sviluppo<br />
prenatale<br />
Altamente inducibile per esposizione transplacentare da induttori<br />
noti <strong>di</strong> CYP1A1 (PAH, TCDD, PCBs)<br />
CYP 1A2<br />
Non espresse in tessuti prenatali<br />
Esperrso dopo la nascita nel fegato e nel tratto GI
HUMANS<br />
CYP1A1 e CYP1A2<br />
Presente nel fegato <strong>di</strong> embrione/feto<br />
Le evidenze per una sua espressione costitutiva sono comunque<br />
contrastanti per l’impossibilità <strong>di</strong> escludere induzione<br />
transplacentare<br />
Per esposizione significativa della gestante a fumo <strong>di</strong> sigaretta,<br />
caffeina, IPA, flavoni, indoli.<br />
CYP1A1 è espresso nell’adulto in tessuti extraepatici<br />
CYP 1A2 si esprime dopo la nascita a livelli gradualmente più elevati<br />
fino a raggiungere i livelli tipici dell’adulto a 1 anno <strong>di</strong> vita postnatale
FAMIGLIA 2<br />
Famiglia molto eterogenea con molto sottofamiglie <strong>di</strong>verse<br />
Rappresenta una gran percentaule del contenuto totale del<br />
fegato adulto .<br />
RODENTS<br />
Principali isoforme nel ratto CYP2A, CYP2B1/2, CYP2C11,<br />
CYP2E1 (ortologa a quella umana)<br />
CYP2B1: la più stu<strong>di</strong>ata; non espressa nei tessuti prenatali <strong>di</strong><br />
ratto. Espressione imme<strong>di</strong>ata dopo la nascita. Massimi<br />
livelli: 24h post natali<br />
CYP2A1: espressa subito dopo la nascita Massimi livelli: 1<br />
settimana dopo la nascita<br />
CYP2A2: espresss alla pubertà solo nei maschi
HUMANS<br />
Principali isoforme nell’uomo : CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8, 9, 19<br />
CYP2D6 CYP2E1<br />
CYP2E1<br />
Substrati: etanolo, alcooli, solventi, composti a basso peso<br />
molecolare ( i.e. benzene, nitrosoammine)<br />
Dati contrad<strong>di</strong>tori sulla presenza <strong>di</strong> 2E1 cataliticamente attivo nel<br />
fegato durante la vita prenatale ma<br />
2E1mRNA è presente nel fegato fetale a 16 settimane <strong>di</strong> gestazione<br />
e determinazione <strong>di</strong> attività <strong>di</strong> ossidazione <strong>di</strong> etanolo inibita da<br />
anticorpi anti-2E1
Presenza <strong>di</strong> 2E1mRNA e della relativa attività enzimatica<br />
nel tessuto cerebrale embrionale al 45-53° giorno <strong>di</strong><br />
gestazione, sovrapponibile alla organogenesi (giorni 50-<br />
60)<br />
Livelli massimi nel cervello : 80-84° giorno <strong>di</strong> gestazione.<br />
I livelli <strong>di</strong> CYP2E1 nel feto possono essere indotti dal<br />
consumo <strong>di</strong> etanolo, da inadeguqti apporti nutrizionali<br />
(elevati intake <strong>di</strong> grassi o bassi livelli <strong>di</strong> Vit. E e A)<br />
durante la gravidanza<br />
La presenza <strong>di</strong> CYP2E1 nel cervello fetale (organo<br />
bersaglio della teratogenesi indotta da etanolo è stata<br />
considerata una delle possibili cause della FAS (Fetal<br />
Alcohol Syndrome)
CYP2E1<br />
Etanolo Acetaldeide, ra<strong>di</strong>cali liberi <strong>di</strong> O2 Ra<strong>di</strong>cali liberi derivati da etanolo<br />
Effetti sulla sintesi proteica e degli aci<strong>di</strong> nucleici<br />
Perossidazione lipi<strong>di</strong>ca delle membrane cerebrali,<br />
ricche in aci<strong>di</strong> polinsaturi )<br />
Danno ossidativo sul DNA (Single strend breaks)<br />
Disfunzioni postnatali<br />
del SNC
I danni nei neonati correlati al consumo <strong>di</strong> alcol durante la<br />
gravidanza includono:<br />
aborti spontanei<br />
ridotta crescita fetale<br />
anomalie nello sviluppo cranio facciale<br />
ritar<strong>di</strong> nello sviluppo neurologico<br />
L’ alcol altera fattori nutrizionali e ormonali cruciali nello<br />
sviluppo cellulare negli stati embrionali<br />
Possibile ruolo dei polimormismi degli enzimi del metabolismo<br />
nella insorgenza della FAS ⇒ il picco ematico <strong>di</strong> alcol nel<br />
circolo della madre <strong>di</strong>pende dalle sue capacità metaboliche e<br />
regola la esposizione del feto.<br />
Metabolismo <strong>di</strong>verso ⇒ <strong>di</strong>versa esposizione fetale
FAMIGLIA 3<br />
Le principali isoforme del ratto sono 3A1 and 3A2.<br />
Nell’uomo gli enzimi corrispondenti sono 3A4 and 3A5, che<br />
rappresentano il 40% circa del contenuto totale <strong>di</strong> P450 epatico<br />
nell’adulto e nell’intestino. Molti farmaci e anche molti ormoni<br />
steroidei sono metabolizzati dalla famiglia 3A<br />
RODENTS<br />
Le isoforme del 3A sono assenti nelle varie fasi dello sviluppo<br />
prenatale dei ro<strong>di</strong>tori e si esprimono solo dopo la nascita.
HUMAN<br />
Il contenuto fetale <strong>di</strong> CYP 3A oscilla tra il 30 e il 100% del<br />
contenuto <strong>di</strong> 3A tipico della vita adulta.<br />
3A7è il solo CYP conosciuto finora che si esprime specificamente<br />
durante il periodo perinatale. Nell’adulto è presente<br />
nell’endometrio e nella placenta delle donne in gravidanza.<br />
Rappresenta il CYP principale presente nei tessuti epatici umani<br />
embrionali e fetali (30% del totale). Non è mai stato<br />
identificato in altri organi (days 50-60).<br />
Metabolizza sostanze esogene ma soprattutto ormoni steroidei.<br />
Alla nascita la sua espressione cessa e viene imme<strong>di</strong>atamente<br />
rimpiazzato dal 3A4.
Rodents<br />
L’esposizione fetale è dovuta al passaggio <strong>di</strong><br />
OPT attraverso la placenta, dopo<br />
somministrazione orale alla femmina gravida<br />
Humans<br />
Arch. Toxicol. 76: 452-459 (2002)<br />
OPT e i loro metaboliti presenti nel meconio<br />
post-partum (contenuto intestinale del feto)<br />
Esposizione prenatale dovuta a :<br />
•absorption across the umbilical cord<br />
•<strong>di</strong>ffusion across the placenta surface<br />
•swallowing of amniotic fluid<br />
Environm. Health Perspec. 109: 417-420 (2001)
Nessuna informazione <strong>di</strong>sponibile sul ruolo del<br />
3A7 umano nella bioattivazione <strong>di</strong> OPT<br />
Caratterizzazione della bioattivazione <strong>di</strong> chlorpyrifos (CPF),<br />
parathion (PAR), malathion (MAL) e fenthion (FEN) con CYP<br />
3A7 ricombinante<br />
Fornire dati sul metabolismo fetale per la stima della tossicità<br />
durante lo sviluppo neurologico consguente alla esposizione agli<br />
OPT in utero
Intrinsic Clearence (CLi) della formazione <strong>di</strong><br />
oxons/sulfoxide da CYP3A4, 3A5 and 3A7<br />
3A4<br />
3A5<br />
3A7<br />
CPF<br />
33 ± 2<br />
18.8 ± 0.9<br />
8.4 ± 0.2<br />
PAR<br />
32.7 ± 0.7<br />
0.88 ± 0.02<br />
6.6 ± 0.1<br />
MAL<br />
22.6 ± 0.6<br />
2.1 ± 0.1<br />
9.9 ± 0.3<br />
FEN<br />
19 ± 2<br />
(49 ± 5) a<br />
Nd<br />
(28 ± 8) a<br />
Nd<br />
(2 ± 1) a<br />
(pmol oxon • (nmolP450 •min •μM) -1 ) a = sulfoxide CLi value<br />
Il feto può bioattivare <strong>di</strong>versi OPT in situ se esposto in utero a<br />
questa classe <strong>di</strong> pestici<strong>di</strong>.<br />
Sebbene <strong>di</strong>versa in <strong>di</strong>pendenza del singolo OPT, l’efficienza della<br />
forma fetale in vitro è solo leggeremnte più bassa ma dello stesso<br />
or<strong>di</strong>ne <strong>di</strong> grandezza del 3A4, la forma principale dell’adulto, e simile<br />
se non più elevata del CYP3A5.
Durante la gravidanza le capacità metaboliche della madre <strong>di</strong>minuscono,<br />
ma l’aumento <strong>di</strong> circa il 30% del peso del fegato compensa questo calo.<br />
La placenta, placenta organo primario <strong>di</strong> comunicazione madre - feto non è una<br />
barriera protettiva che impe<strong>di</strong>sce l’esposizione del feto. Gli xenobiotici<br />
attraversano la barriera placentare (passivamente e/o attivamente)<br />
entrando nella circolazione fetale.<br />
La placenta contiene enzimi del metabolismo e biotrasforma gli<br />
xenobiotici, sia detossificandoli che bioattivandoli. Il profilo enzimatico<br />
placentare cambia durante la gravidanza (> espressione nel 1° trimestre)<br />
Gli enzimi placentari possono essere indotti/inibiti durante la<br />
gravidanza per l’esposizione della madre (es:fumo <strong>di</strong> sigaretta).<br />
Il livello <strong>di</strong> attività degli enzimi placentari è basso rispetto a quelli della<br />
madre e del feto (ruolo nel metabolismo degli ormoni steroidei).<br />
E’ importante considerare l’intero sistema<br />
madre-placenta-feto
Table 3<br />
Ontogenesis of main human alcohol metabolizing enzymes<br />
Gene Placenta Fetal<br />
Brain<br />
CYP2E1<br />
+<br />
+<br />
Liver<br />
Prenatal trimester<br />
1<br />
?<br />
2<br />
+?<br />
3<br />
+?<br />
Liver<br />
Neonate<br />
+<br />
Liver<br />
1 month to 1 year<br />
ADH1 + - + + + + -<br />
ADH2 + - - + + + +<br />
ADH3 + - - - + + +<br />
+: activity or protein detectable;<br />
-: activity or protein not detectable<br />
?: unclear results<br />
+
Ontogenesi degli enzimi <strong>di</strong> Fase I<br />
Fasce d’età Attività enzimatica<br />
CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B CYP2D6 CYP3A4 CYP3A7<br />
Neonato +/- + ? ? +/- +/- +++<br />
Prima infanzia + + + ++ + ++ +<br />
Bambino +++ + ++ ? + +++ -<br />
Adulto +++ + ++ + + +++ -<br />
Attività uguale<br />
al livello adulto 5-6 mesi ? 6-13a > I a 3-5*a 1 anno calo nel<br />
* 20% del livello adulto a 1 mese<br />
infanzia I anno**<br />
** Attività alta nel feto, con un picco nella prima settimana dalla nascita. Sostituito<br />
successivamente dal CYP3A4
Ontogenesi degli enzimi <strong>di</strong> Fase II<br />
Fasce d’età Attività enzimatica<br />
UGT1A1 NAT Sulfotransferasi<br />
Neonato +/- +/- +<br />
Prima infanzia + +/- +<br />
Bambino + + +<br />
Adulto + + +<br />
Attività uguale<br />
al livello adulto 3-6 mesi 10-12 mesi dalla nascita
L’età in cui il metabolismo del<br />
bambino è simile all’adulto<br />
<strong>di</strong>pende dagli enzimi coinvolti e<br />
cambia con la sostanza