La somministrazione di Lactobacillus paracasei subsp paracasei ...

siffra.it

La somministrazione di Lactobacillus paracasei subsp paracasei ...

La somministrazione di Lactobacillus paracasei ssp. ceppo paracasei F19

ai neonati durante lo svezzamento

Effetti sull’Immunità Adattativa e sulla Funzione della Flora Batterica Intestinale

Christina West

1


TAVOLA DEI CONTENUTI

ABSTRACT………………………………………………………………………………………….7

ARTICOLI ORIGINALI…………………………………………………………………………….9

ABBREVIAZIONI NELLA SELEZIONE…………………………………………………………10

PREFAZIONE………………………………………………………………………………………11

PREMESSE........……………………………………………………………………………………12

FORMAZIONE DELLA FLORA BATTERICA INTESTINALE ……….............……………………………………12

Effetti dei fattori esogeni……………………………………………………………12

Gli acidi grassi a catena corta………………………………………………..…….14

LA FLORA BATTERICA INTESTINALE ED IL SISTEMA IMMUNITARIO…………………………….15

Il sistema immunitario intestinale…………………………………………………..15

La difesa immunitaria……………..……………..………………………………………….15

La tollerabilità orale…..…….……..………………………………………………………..16

L’influenza dell’immunità sulla colonizzazione intestinale..………....………………17

LA MALATTIA ALLERGICA……………………………………….………………………….18

Nomenclatura…………………………………………….………………………….18

Il concetto Th1/Th2, cellule T regolatorie ed attivazione delle cellule T……..…….19

La reazione di ipersensibilità IgE-mediata………….……………………………....22

La manifestazione atopica…………………………………………………………..22

La permeabilità intestinale nei soggetti allergici…………………………………...24

ALTERAZIONI DELLA FLORA BATTERICA INTESTINALE E MALATTIE…………………………...24

L’ipotesi delle condizioni igieniche…………………………………………………24

La flora batterica intestinale e l’allergia………………………………………...….24

I PROBIOTICI…………………………………………………………………………...…….25

Cenni storici e definizione…………………………………………………………..25

Sicurezza e linee guida………………………………………………………………26

Meccanismi d’azione proposti dei probiotici………………………………….……27

I probiotici nel trattamento delle malattie infettive……………………………...….28

I probiotici nel trattamento e nella prevenzione della malattia allergica…………..29

Lactobacillus F19.......................................................................................................29

Isolamento, colonizzazione e sicurezza.....................................................................29

Effetti immunologici in vitro e nei modelli animali....................................................30

OBIETTIVI........................................................................................................................................31

PAZIENTI E METODI......................................................................................................................32

DISEGNO DELLO STUDIO.........................................................................................................32

RISULTATI.......................................................................................................................................33

CARATTERISTICHE DEI PARTECIPANTI...................................................................................33

EFFETTI DELL’ASSUNZIONE DEI PROBIOTICI DURANTE LO SVEZZAMENTO SULLO STATO

FUNZIONALE DELLA FLORA BATTERICA INTESTINALE NEI NEONATI (PROTOCOLLO I)..........34

2


ABSTRACT

Introduzione: La composizione della flora batterica intestinale è stata associata a patologie

immuno-mediate. Il latte materno contiene una flora ricca di bifidobatteri e promuove la

colonizzazione da parte dei lattobacilli. I bifidobatteri ed i lattobacilli sono considerati salutari e

vengono utilizzati come probiotici, ossia integratori alimentari contenenti batteri vivi che, quando

ingeriti in quantità adeguate, esercitano sull’ospite benefici effetti. Nel corso dello svezzamento, il

sistema immunitario intestinale in via di sviluppo è esposto ad una varietà crescente di antigeni sia

di origine alimentare sia derivanti dalla flora batterica intestinale.

Scopi: Il nostro scopo era di valutare se l’assunzione giornaliera di 1x10 8 UFC del probiotico

Lactobacillus paracasei ssp. ceppo paracasei F19 (LF19) da parte di neonati definiti in buone

condizioni di salute dall’età di 4 mesi fino ai 13 mesi di età fosse in grado di mantenere alcuni dei

benefici effetti esercitati dall’allattamento materno sulla composizione della flora batterica

intestinale, con possibili effetti sulla funzione della flora intestinale, sull’attività’ delle cellule T,

sull’equilibrio immunitario tra risposta di tipo Th1 e di tipo Th2, e sull’incidenza di eczema.

Disegno dello studio: I neonati sono stati randomizzati all’assunzione giornaliera di cereali con

(n=89) o senza l’aggiunta di LF19 (n=90) dall’età di 4 mesi fino ai 13 mesi di età. La valutazione

dei risultati clinici è stata monitorizzata mediante diarie ed un questionario. Campioni fecali ed

ematici sono stati prelevati a 4, 6½, 9, 13 mesi ed a 5½, 6½, 12 e 13 mesi, rispettivamente. I

campioni fecali sono stati analizzati al fine di quantificare la presenza dei lattobacilli mediante

convenzionali metodi di coltura, mentre la presenza di LF19 è stata verificata mediante l’utilizzo

random della polymerase chain reaction (RAPD-PCR). La composizione degli acidi grassi a catena

corta (SCFA) fecali, che rappresenta un indice della funzionalità della flora batterica intestinale, è

stata determinata mediante cromatografia gas-liquido. In seguito all’attivazione policlonale o

specifica delle cellule T, i livelli di espressione dell’mRNA delle citochine [interleuchina 2 (IL2),

IFN-γ, IL4 ed IL10] sono stati valutati su mRNA isolato mediante real time reverse transcriptase-

PCR. Le concentrazioni sieriche degli anticorpi IgE totali e specifici, degli anticorpi specifici IgG

verso Haemophilus influenzae tipo b, la tossina difterica e quella tetanica sono state analizzate

mediante immunofissazione enzimatica.

Risultati: L’assunzione di LF19 ha mantenuto elevate conte fecali di lattobacilli durante lo

svezzamento. La persistente colonizzazione di LF19 ha determinato differenze nella composizione

degli SCFA fecali. L’incidenza cumulativa di eczema è risultata inferiore nel gruppo dei probiotici,

in associazione con un rapporto più elevato di mRNA per IFN-γ/IL4 nelle cellule T attivate in

maniera policlonale. Anche se è stato riscontrato un effetto da parte dell’LF19 sull’equilibrio

immunitario Th1/Th2, non è stato osservato alcun effetto sulla sensibilizzazione IgE. I neonati di

entrambi i gruppi hanno presentato un incremento della loro capacità di esprimere sia citochine di

tipo Th1 che Th2 nella seconda fase dell’infanzia, ma l’espressione risultava essere comunque

inferiore rispetto a quella degli adulti. I neonati appartenenti al gruppo dei probiotici hanno

mostrato a 13 mesi livelli di IL2 inferiori dopo l’attivazione policlonale delle cellule T rispetto ai

neonati appartenenti al gruppo placebo. I neonati che avevano assunto LF19 non hanno mostrato un

minor numero di infezioni, ma la durata del trattamento antibiotico e’ risultata inferiore rispetto a

quella nei neonati nel gruppo placebo. Inoltre, rispetto al gruppo placebo, la persistente

colonizzazione di LF19 migliorava la risposta vaccino-specifica verso gli antigeni proteici nel corso

delle vaccinazioni.

Conclusioni: L’assunzione di LF19 e’ risultata sicura, sulla base della mancata osservazione di

effetti avversi nel corso dello studio. I neonati di entrambi i gruppi hanno sviluppato una

maturazione della risposta immunitaria adattativa nel corso dello svezzamento. Integrare

l’alimentazione con i probiotici nel corso dello svezzamento riduce il rischio di sviluppo di eczema

di circa il 50% con un concomitante incremento del rapporto Th1/Th2. La riduzione dell’eczema

potrebbe essere spiegata dagli effetti dei probiotici sulla risposta immunitaria T cellulo-mediata e da

una rafforzata funzione della flora batterica intestinale.

3


PREMESSE

Formazione della flora batterica intestinale

La colonizzazione dell’intestino, in principio sterile, avviene immediatamente dopo la nascita e

dipende dai microrganismi che derivano dall’intestino della madre, dai microrganismi vaginali e

cutanei in associazione con alcune specie ambientali. E’ un processo complesso e multifattoriale

che si basa sulle interazioni tra l’ambiente, la dieta, fattori associati ai batteri ed all’ospite.

L’intestino di un neonato non è un ambiente anaerobio (assolutamente privo di ossigeno) e di

conseguenza la quota di batteri aerobi è superiore rispetto al resto della vita. I batteri aerobi

rappresentano una parte della normale flora batterica intestinale ma possono essere causa di

infezioni se traslocano in altre parti dell’organismo. La colonizzazione dell’intestino nelle prime

settimane di vita è dominata da batteri aerobi e da batteri anaerobi facoltativi. Nel momento in cui

l’ossigeno viene consumato, possono stabilirsi i batteri anaerobi. Molti batteri anaerobi sono

innocui e lottano per lo spazio ed i nutrienti contenendo il numero dei batteri aerobi ed anaerobi

facoltativi. Escherichia coli (E. coli) si ritrova tipicamente nelle feci ed è uno dei più frequenti

batteri anaerobi facoltativi presenti nell’intestino. Decenni fa, si riteneva che i batteri intestinali,

ossia E. coli, e gli enterococchi fossero i colonizzatori iniziali dell’intestino, seguiti dai batteri

anaerobi ossia i bifidobatteri, i Bacteroides e gli streptococchi (1). Dati recenti forniti da uno studio

prospettivo multicentrico europeo su una coorte di neonati, lo studio AllergyFlora, hanno

dimostrato che tra i batteri anaerobi facoltativi, gli stafilococchi coagulasi-negativi sono i primi

colonizzatori, seguiti dagli enterococchi. E. coli ed altri batteri intestinali, tradizionalmente

considerati colonizzatori precoci, compaiono tardivamente, e la maggior parte dei neonati vengono

colonizzati da E. coli non prima dei 6 mesi di vita. Infatti, lo Staphylococcus aureus (S. aureus) è

spesso di più frequente riscontro nei campioni fecali rispetto a E. coli durante i primi 2 mesi di vita.

Tra i batteri anaerobi, i bifidobatteri compaiono prima, seguiti dai clostridi e dai Bacteroides.

Questo indica che la colonizzazione da parte dei batteri fecali tipici, ossia E. coli, avviene

lentamente nelle società sviluppate, suggerendo una diffusione molto limitata dei batteri. In loro

assenza, i batteri che colonizzano la cute come gli stafilococchi e altri batteri che normalmente non

risultano essere dominanti nella flora batterica intestinale diventano i primi colonizzatori, indicando

una minor competizione da parte degli altri batteri intestinali (2, 3).

Effetti dei fattori esogeni

I fattori esogeni, ossia i fattori ambientali, le misure igieniche, il parto prematuro, il tipo di parto, le

terapie antibiotiche somministrate alla madre prima del parto o al neonato e la dieta, modulano le

dinamiche e l’esito della colonizzazione (4). Nei paesi in via di sviluppo, la colonizzazione

intestinale avviene precocemente e la flora batterica intestinale comprende un’ampia variabilità di

batteri con un più rapido ricambio dei ceppi batterici rispetto a quello che avviene nelle aree

industrializzate (5). La colonizzazione ad opera di E. coli, bifidobatteri e Bacteroides avviene

tardivamente nei bambini nati da parto cesareo, con un incremento della colonizzazione da parte dei

clostridi, della Klebsiella e dei batteri intestinali diversi da E. coli (2, 6). La somministrazione di

antibiotici alla madre in corso di gravidanza o al neonato nei primi 6 mesi di vita è legata ad un

ridotto rapporto dei batteri obbligati anaerobi rispetto ai batteri facoltativi (2).

Gli effetti della dieta sulla composizione della flora batterica intestinale iniziale sono stati studiati in

maniera approfondita. Sebbene non sia stato chiaramente dimostrato, si pensa che i neonati allattati

al seno abbiano una flora batterica dominata da bifidobatteri, la cui composizione differisce poco da

quella dei neonati svezzati con il latte in polvere (1, 4, 7). I bifidobatteri sono considerati salutari e

possono inibire la crescita di batteri patogeni in vitro (8). Il latte materno ha uno scarso potere

tampone rispetto al latte in polvere, è ricco di oligosaccaridi e può favorire la crescita dei

bifidobatteri (9). E’ stato suggerito che il latte materno possa anche fornire bifidobatteri e

lattobacilli (10, 11). I neonati svezzati con il latte in polvere sembrano sviluppare una flora batterica

intestinale più complessa, sebbene questo dipenda dalla composizione del latte in polvere. Nei

4


neonati svezzati con latte in polvere anaerobi facoltativi, Bacteroides e clostridi sono stati osservati

in maggiore quantità e con una frequenza più elevata rispetto ai neonati allattati al seno materno (1,

7, 12). I lattobacilli compaiono e scompaiono dalla nascita fino allo svezzamento, suggerendo un

fenomeno di colonizzazione transitoria (1, 2). Molti neonati sono nutriti in maniera mista (latte

materno + latte in polvere), ma si sa poco circa l’influenza di un’alimentazione mista sulla

composizione della flora batterica intestinale (13). Un piccolo studio longitudinale che includeva 11

neonati inizialmente allattati e poi svezzati con latte in polvere ha dimostrato un’elevata variabilità

inter-individuale della composizione della flora batterica intestinale, il mantenimento di elevati

livelli di bifidobatteri durante lo svezzamento e la maturazione della flora batterica intestinale fecale

(14). Al momento dell’introduzione di alimenti complementari, ossia alimenti solidi, la

composizione della flora batterica intestinale si modifica, con cambiamenti più pronunciati nei

neonati allattati al seno. Successivamente, la flora batterica intestinale si modifica ancora, fino ad

assomigliare a quella degli adulti all’età di due anni (Fig. 1) (12, 15). Tuttavia, si sa

sorprendentemente poco circa lo sviluppo della flora batterica intestinale durante il periodo

compreso tra la fine dell’allattamento e l’introduzione degli alimenti complementari, e degli effetti

esercitati da singoli alimenti in un determinato periodo (16).

Didascalia alla Figura 1. Illustrazione schematica dello sviluppo della flora batterica intestinale

durante i primi due anni di vita. Adattata da S Salminen et al, 2005 (15), e stampata con il permesso

dell’editore.

Breastfeeding= allattamento al seno

Weaning= svezzamento

Complementary food= alimenti complementari

Established gut microbiota= flora batterica intestinale definitiva

Increase in microbial diversity= aumento della variabilità dei ceppi microbici

Unculturable bacteria= batteri non coltivabili

Bifidobatteri

Anaerobi

Aerobi ed anaerobi facoltativi

Age (years)= età (anni)

Gli acidi grassi a catena corta

Lo studio della flora batterica intestinale richiede una metodologia composta. Un metodo prevede lo

studio dei prodotti metabolici dell’ecosistema microbico. L’attività metabolica della flora intestinale

è complessa e le sue attività biochimiche possono risultare più importanti per l’organismo

dell’ospite rispetto al numero dei singoli microrganismi a livello di un particolare compartimento

dell’intestino. I batteri metabolizzano i carboidrati non assorbibili in acidi grassi a catena corta

(SCFA), CO2 e H2 nel colon. Gli SCFA sono il prodotto intermedio o finale della fermentazione dei

carboidrati da parte di un gruppo di batteri nel colon. Sono acidi monocarbossilici con una catena

costituita da almeno 6 atomi di carbonio ossia acido acetico, propionico, butirrico, iso-valerico,

valerico, iso-caproico e caproico. La composizione fecale degli SCFA riflette lo stato funzionale

della flora batterica intestinale. Così, l’analisi degli SCFA rappresenta un metodo complementare ad

altri metodi consolidati per lo studio della composizione della flora intestinale (17). Evidentemente,

i due prerequisiti chiave per la formazione degli SCFA sono la presenza dei substrati e di una flora

batterica intestinale in grado di fermentarli. La fermentazione dei polisaccaridi produce acido

acetico, propionico e butirrico, mentre gli acidi a catena ramificata, (gli iso-acidi), e ed altri acidi

minori sono probabilmente prodotti dalla digestione delle proteine e dei lipidi. Gli SCFA prodotti

dalla flora batterica rappresentano un carburante importante per i colonociti, e possono inoltre

contribuire al bilancio energetico complessivo. I tre principali SCFA, acetico, propionico e

butirrico, sono importanti per la proliferazione e la differenziazione delle cellule epiteliali (18).

Inoltre, gli SCFA possono risultare importanti nello stabilire un ecosistema bilanciato nell’intestino.

5


Come accennato, l’intestino è sterile alla nascita e di conseguenza non avviene la produzione di

SCFA. Nella prima infanzia la produzione di acido acetico risulta predominante, seguita dalla

produzione di acido propionico e butirrico. Con l’età, la percentuale di acido acetico diminuisce

mentre quella di altri SCFA aumenta, riflettendo lo sviluppo di una flora batterica intestinale più

complessa. I neonati allattati al seno hanno una composizione di SCFA in cui sono prevalenti

l’acido lattico e l’acido acetico, con una minor quota di acido butirrico, mentre nei neonati svezzati

con latte in polvere sono predominanti l’acido acetico e l’acido propionico, con una scarsa quantità

di acido butirrico (19). Durante il periodo di introduzione degli alimenti complementari, molti

carboidrati complessi non digeribili vengono introdotti nella dieta del neonato ed il profilo fecale

degli SCFA cambia. La capacità di fermentare questi carboidrati complessi può risultare lenta

soprattutto nei neonati allattati al seno. Il cambiamento nel profilo degli SCFA differisce tra neonati

che vengono solamente allattati al seno e quelli invece nutriti con latte in polvere. All’inizio, l’acido

propionico tende ad aumentare quando si inizia lo svezzamento, e le concentrazioni dell’acido

butirrico aumentano più lentamente. La percentuale di acido lattico diminuisce nel primo anno di

vita. Nei neonati nutriti con latte in polvere il cambiamento del profilo degli SCFA risulta meno

marcato, poiché sono più rapidi nello sviluppare la loro capacità di fermentare i carboidrati

complessi, per la diversa flora batterica intestinale dalla nascita. Nei neonati nutriti con latte in

polvere vi è un lento e graduale aumento dell’acido butirrico durante il periodo di introduzione

degli alimenti complementari (13, 16) (Fig. 2).

Didascalia alla Figura 2: Descrizione schematica dello sviluppo della flora batterica intestinale e

della produzione degli SCFA sulla base del tipo di alimentazione. Adattata da C Edwards, 2006

(16) e stampata con il permesso dell’editore.

La flora batterica intestinale ed il sistema immunitario

I batteri intestinali sono indispensabili per l’attivazione del sistema immunitario dell’ospite, e si

ritiene possano contribuire ad un appropriato bilancio delle risposte immunitarie nel corso della

vita. Modelli animali gnotobiotici (ossia, privi di germi) hanno dimostrato che i batteri intestinali

sono indispensabili per lo sviluppo delle risposte immunitarie intestinali e sistemiche (20-22). La

costituzione della flora batterica intestinale è considerata il prerequisito per la formazione

dell’equilibrio immunitario anche negli esseri umani (23, 24).

Il Sistema Immunitario Intestinale

La difesa immunitaria

Il sistema immunitario intestinale riveste un doppio ruolo sia nell’innescare le risposte immunitarie

verso i patogeni sia nel non reagire verso i batteri innocui e gli allergeni alimentari. Poiché

numerose infezioni patogene penetrano nell’organismo attraverso le mucose, è necessario poter

instaurare delle risposte immunitarie efficienti. Tuttavia, risposte immunitarie attive verso allergeni

alimentari innocui possono risultare dannose, come nel caso delle reazioni di ipersensibilità

responsabili di allergie alimentari e come avviene nella malattia celiaca (25, 26). La risposta

immunitaria intestinale agisce primariamente con il fine di prevenire l’adesione e l’invasione dei

patogeni attraverso la peristalsi e rivestendo l’epitelio della mucosa del tratto gastrointestinale con

uno strato di muco. Inoltre uno strato superficiale di componenti secretori non specifici, ossia

mucine e defensine, e specifici ossia IgA secretorie (sIgA), proteggono dall’adesione e

dall’invasione da parte di patogeni. L’acidità e gli enzimi proteolitici scindono le proteine ingerite

in peptidi, distruggendo quindi epitopi immunogenici, ossia la regione immunologicamente reattiva

di un antigene complesso. Tuttavia, se gli antigeni entrano in contatto con l’epitelio, incontrano il

tessuto linfoide intestinale (GALT). Negli esseri umani il GALT costituisce 2/3 del sistema

6


immunitario del corpo riflettendo l’enorme sfida immunologica esercitata dal contenuto luminale

intestinale. I linfociti sono presenti lungo tutto l’intestino, sia in aggregati organizzati, ossia in

follicoli singoli (solitari) nella mucosa, più numerosi nel colon, nell’appendice e negli aggregati di

follicoli linfoidi presenti a livello del piccolo intestino chiamati placche di Peyer (PP). I linfociti

sono inoltre distribuiti all’interno dell’epitelio (IEL) e nel tessuto connettivo sottostante (LPL). Gli

IEL sono costituiti prevalentemente da linfociti T (cellule T) mentre gli LPL sono costituiti sia da

cellule B che da cellule T. Nell’intestino sono presenti numerose plasmacellule in grado di produrre

anticorpi.

Gli antigeni possono penetrare all’interno dei follicoli attraverso cellule epiteliali specializzate, le

cellule dei microvilli (cellule M) ed interagiscono con le cellule presentanti l’antigene (APC), le

cellule B e le cellule T. Le cellule dendritiche (DC) sono cellule APC mature localizzate nelle PP e

nella lamina propria. Le cellule APC mature sono specializzate nel catturare, processare e

presentare gli antigeni alle cellule T. Si pensa che le cellule DC presenti nella lamina propria

possano venire in contatto con gli antigeni alimentari presentandoli poi alle cellule T. Gli IEL ( i

linfociti intraepiteliali) intestinali e le cellule T dell’LPL (tessuto connettivo sottostante) in

condizioni fisiologiche sono attivati e producono citochine con attività inibitoria ed antiinfiammatorie,

contribuendo ad uno stato che può essere considerato di infiammazione controllata.

Anche le cellule T citotossiche (CTL) sono presenti nel piccolo intestino, e sono in grado di

eliminare i patogeni penetrati mediante un meccanismo di citotossicità (27). Quando i linfociti

incontrano l’antigene a livello del tessuto linfatico, si attivano. Quindi lasciano gli organi linfoidi

come cellule effettrici ed entrano nel circolo sanguigno migrando verso il sito dove è avvenuto

l’incontro con l’antigene iniziale. I vasi linfatici afferenti drenano la linfa dalla lamina propria dei

villi e dalle PP verso i linfonodi mesenterici (MLN). L’espressione delle molecole di adesione Lselectine

sulla superficie dei linfociti è necessaria per permettere loro di penetrare nei tessuti

periferici mentre l’espressione delle integrine α4β7 è necessaria affinché i linfociti possano penetrare

nei tessuti mucosali, rispettivamente, (25, 28-30). Tuttavia, l’ingresso dei linfociti nei MLN richiede

anche l’espressione di molecole di adesione (31). Così, i MLN rappresentano un punto di incontro

per le vie di ricircolo periferiche e mucosali.

La tollerabilità orale

L’introduzione con la dieta di proteine solubili spinge la risposta immunitaria verso uno stato di

specifica ed attiva non risposta, chiamato tollerabilità orale. I dati sull’induzione della tollerabilità

orale provengono principalmente da modelli di roditori, ed i meccanismi alla base della tollerabilità

orale rimangono incerti. Sembra trattarsi di un’interazione molto complessa tra genetica, età, dose e

tempi dell’alimentazione postnatale, così come sembra dipendere dalla struttura e dalla

composizione antigenica delle proteine alimentari, dai meccanismi di barriera mucosa e dalla

risposta locale immunitaria. Si tratta di un processo antigene-mediato e le forze trainanti sono

rappresentate sia dai batteri intestinali che dagli antigeni alimentari. Sebbene manchino dati a

supporto, si pensa che la tollerabilità orale sia presente anche negli esseri umani. Schematicamente,

l’iper-responsività verso antigeni innocui penetrati nel GALT attraverso le cellule-M o attraverso

l’epitelio di superficie intestinale può essere mediata da 1) anergia delle cellule T, questo significa

che quando le cellule T incontrano l’antigene in assenza di segnali co-stimolatori, diventano

refrattarie ad un’ulteriore stimolazione da parte dell’antigene 2) delezione clonale di cellule T

antigene-specifiche attraverso il processo di apoptosi e 3) soppressione attiva citochina-mediata

attraverso l’interleuchina 10 (IL10) ed il fattore di crescita-β trasformante (TGF-β) prodotti dalle

cellule T regolatorie. E’ stato considerato che un’alta dose di antigeni induce anergia e delezione

clonale mentre multiple somministrazioni di piccole dosi di alimenti sembrano in grado di indurre

una soppressione attiva citochina-mediata. Tuttavia, questa dicotomia viene contestata poiché si

pensa che l’anergia e la regolazione attiva non siano aspetti separati della funzione delle cellule T,

(28-30, 32).

7


L’influenza dell’immunità sulla colonizzazione intestinale

Come precedentemente detto, la stimolazione batterica durante l’infanzia sembra essere un

prerequisito per lo sviluppo del sistema immunitario della mucosa intestinale. Ciò si fonda su studi

in modelli animali. E’ stato dimostrato che la stimolazione con batteri intestinali nello stadio

neonatale è necessaria per l’induzione della tollerabilità orale in topi privi di germi. Tuttavia, se la

colonizzazione batterica avviene più tardivamente può non essere in grado di instaurare la

tollerabilità orale (20). In un altro modello murino, una flora intestinale complessa è stata in grado

di instaurare la tollerabilità orale, al contrario della monocolonizzazione (22). Per un periodo di

tempo variabile dopo la nascita, la funzione di barriera intestinale, fornita in parte dagli anticorpi

secretori e dalle funzioni immunoregolatorie, non risulta pienamente sviluppata. Immediatamente

dopo la nascita, la superficie delle mucose viene colonizzata da un’ampia variabilità di

microrganismi ed esposta a vari antigeni proteici, questi ultimi maggiormente espressi nei neonati

nutriti con latte in polvere rispetto ai neonati nutriti con latte materno. Durante lo svezzamento,

l’esposizione agli antigeni alimentari aumenta e la flora batterica intestinale subisce dei

cambiamenti, stimolando il sistema immunitario in via di sviluppo nell’intestino. In un modello

murino è stata osservato un progressivo cambiamento della flora batterica intestinale nelle fasi

precoci dello svezzamento, dovuto probabilmente ad una diminuzione della quota delle

immunoglobuline secretorie materne di classe A (sIgA) assunte attraverso il latte. Gli anticorpi

sIgA presenti nel latte materno sono diretti verso i microrganismi presenti nell’ambiente materno e

forniscono protezione verso questi microrganismi anche alla prole. La funzione principale delle

sIgA è quella di impedire ai batteri ed ai virus già presenti sulla superficie delle mucose di legarsi

alle cellule epiteliali e di penetrare nel tessuto. Per diversi giorni, i livelli di sIgA risultano essere

bassi fino a quando non si sviluppa la secrezione endogena di sIgA. La produzione di sIgA da parte

dei neonati viene quindi seguita da una modifica della composizione della flora batterica intestinale,

suggerendo che il sistema immunitario sviluppato a livello intestinale è in grado di regolare il

processo di diversificazione della flora batterica intestinale (33). Inoltre questo dato suggerisce che

durante il periodo in cui le scorte di sIgA materne diminuiscono e la produzione endogena di sIgA

non è ancora pienamente sviluppata, avviene un periodo di aumentata vulnerabilità della superficie

della mucosa intestinale da parte di antigeni derivanti dai cibi e dai batteri intestinali. I dati circa

questo processo negli esseri umani sono scarsi. Tuttavia in un trial clinico controllato condotto per

valutare gli effetti dell’aggiunta di Lactobacillus acidophilus LAVRI-A1 (LAVRI-A1) sui livelli di

sIgA nei neonati è stato dimostrato che il fattore predittore ambientale più forte in grado di indurre

la produzione di sIgA è l’introduzione di alimenti complementari prima dei 6 mesi di età. In questo

studio, la colonizzazione da parte di bifidobatteri è risultata associata ad un aumento dei livelli

sierici di TGF-β (34).

La maturazione del sistema immunitario della mucosa intestinale e l’induzione della tollerabilità

orale sono influenzati dalla composizione della flora batterica intestinale, dalla natura degli

antigeni alimentari e dal periodo di esposizione ad essi, da fattori propri dell’ospite e

dall’allattamento al seno materno.

La malattia allergica

La prevalenza dell’allergia e dell’asma ha subito un incremento negli ultimi 50 anni e circa il 20%

della popolazione mondiale soffre di malattie allergiche IgE-mediate. In Svezia, circa un terzo dei

bambini nell’età prescolare presentano eczema, asma e/o rinocongiuntiviti allergiche (35). Sebbene

sembra esserci una forte componente ereditaria, il ruolo dei fattori genetici e gli altri meccanismi di

malattia rimangono sconosciuti. Gli individui con una storia familiare di atopia presentano un

aumentato rischio di sviluppare una sensibilizzazione IgE e sviluppano sintomi tipici di eczema,

asma allergico, riniti allergiche e/o congiuntiviti allergiche. Tuttavia, si tratta di una malattia

poligenica e ad oggi non esistono sicuri markers genetici ed immunologici in grado di identificare

8


un neonato a rischio rendendo così complicata la prevenzione primaria della sensibilizzazione delle

IgE. Nondimeno, un’anamnesi positiva familiare rappresenta il più sicuro predittore di allergia nei

bambini (36).

Nomenclatura

La terminologia nelle reazioni allergiche ed allergia-simili risulta essere ambigua. La nomenclatura

è stata revisionata da una Task Force dell’Accademia Europea di Allergologia ed Immunologia

Clinica (EAACI) nel 2001, e successivamente revisionata dalla Commissione per la recensione

della Nomenclatura dell’Organizzazione Mondiale dell’Allergia (WAO) nel 2004 (37, 38). Così,

l’ipersensibilità viene definita come “sintomi oggettivabili riproducibili o segni insorti in seguito

all’esposizione ad uno stimolo definito ad una dose tollerata da persone normali”. L’allergia è

definita come “una reazione di ipersensibilità indotta da meccanismi immunologici specifici”.

L’allergia può essere sia anticorpo-mediata che cellulo-mediata. L’allergia viene quindi

ulteriormente suddivisa in IgE-mediata e non IgE-mediata. Nella maggior parte dei pazienti con

sintomi allergici a carico delle membrane delle mucose del tratto gastrointestinale e delle vie

respiratorie, gli anticorpi responsabili appartengono alla famiglia delle IgE. Nel caso delle allergie

non IgE-mediate i mediatori possono essere linfociti allergene-specifici o anticorpi IgG. L’atopia è

“una tendenza personale e/o familiare, dell’infanzia o dell’adolescenza, ad essere sensibilizzati ed a

produrre anticorpi IgE in risposta ad esposizioni ordinarie ad allergeni, generalmente proteine.

Come conseguenza, queste persone possono sviluppare sintomi tipici di asma, rino-congiuntiviti, o

eczema”. Il termine atopia non dovrebbe essere utilizzato a meno che non risulti una documentata

sensibilizzazione IgE, ossia mediante un incremento documentato degli anticorpi specifici IgE od

un prick test cutaneo positivo (SPT). Infine, un allergene è definito come “un antigene in grado di

causare una malattia allergica”.

Il termine completo per definire l’infiammazione locale della cute è dermatite. La dermatite viene

quindi divisa in eczema, dermatite da contatto e in altre forme di dermatite. Il termine eczema

comprende la vecchia dicitura di dermatiti atopiche e di sindrome eczematosa/dermatitica atopica.

L’eczema può essere meglio definito come atopico o non-atopico, vecchio termine con cui prima ci

si riferiva a pazienti con una costituzione atopica (Fig.3). Un altro modo per distinguere tra tipi di

eczema è quello di usare i termini eczema IgE-associato e non-IgE-associato. Di seguito, il termine

eczema IgE-associato viene utilizzato quando è confermata la sensibilizzazione.

Didascalia alla Figura 3. Nomenclatura dei sintomi cutanei secondo la classificazione della WAO

(38).

L’asma viene suddiviso in asma allergico e non allergico. L’asma allergico è prevalentemente

scatenato dagli anticorpi IgE, ma si pensa che possano esistere altri meccanismi immunologici in

grado di promuovere l’infiammazione nell’asma allergico. I meccanismi alla base

dell’infiammazione nella forma di asma non-allergico non sono stati completamente definiti.

Il concettoTh1/Th2, cellule T regolatorie ed attivazione delle cellule T

I linfociti rappresentano gli elementi cellulari centrali dell’immunità adattativa. Vengono divisi in

linfociti B e linfociti T (cellule B e cellule T). Entrambi possiedono sulla superficie cellulare i

recettori per gli antigeni, cosiddetti recettori delle cellule B e recettori delle cellule T (BCR e TCR,

rispettivamente). Le cellule B sono fondamentali per l’immunità umorale mentre le cellule T sono

responsabili dell’immunità cellulo-mediata e della regolazione immunitaria. L’immunità umorale è

mediata dagli anticorpi che si legano agli epitopi. Nell’immunità cellulo-mediata, le cellule T

citotossiche e le cellule T produttrici di citochine risultano essere gli effettori. Le citochine sono

polipeptidi bioattivi secreti che regolano l’attività della cellula che le produce o di un’altra cellula.

9


Quindi, le citochine prodotte da specifici tipi cellulari in corso di attivazione sono in grado di

influenzare e regolare la conseguente risposta immunitaria. Le cellule T vengono inoltre suddivise

in 2 sottogruppi maggiori; cellule T helper (Th) CD4+ e cellule T citotossiche CD8+ (CTL). Le

cellule Th vengono chiamate cellule T helper poiché in grado di attivare altre cellule immunitarie

ossia cellule B, CTL e macrofagi, e sono essenziali per la produzione di anticorpi verso proteine e

glicoproteine. Le differenze nella tipologia delle citochine prodotte dalle cellule Th attivate sono

responsabili dei diversi tipi di risposta immunitaria.

Le cellule Th naïve (cellule Th0) producono interleuchina 2 (IL2), IL4 e interferon-γ (IFN-γ). Sulla

base della complessa interazione fra le cellule APC che presentano l’antigene alla cellula Th naïve,

questa può essere polarizzata in differenti direzioni sulla base della genetica, del tipo e della carica

di antigene, della presenza o assenza di molecole specifiche co-stimolatorie ed altri fattori

ambientali ossia l’ambiente della citochina predominante (Fig. 4).

Si possono ottenere due tipi di risposte immunitarie polarizzate sostenute dalle cellule Th che

vengono chiamate risposta Th1 e risposta Th2, rispettivamente (Fig. 4). Questi due tipi di risposte

sono stati prima dimostrati in modelli murini, e successivamente in modelli umani, anche se il

processo di polarizzazione negli umani non segue una così netta suddivisione come nei topi. Inoltre,

il concetto Th1 e Th2 serve come un modello di lavoro, benché ultra-semplificato. La produzione

iniziale di IL4 determina la polarizzazione verso Th2 mentre la produzione di IL2 e IFN-γ in

assenza di IL4 supporta la polarizzazione verso Th1. Le cellule del sistema immunitario innato,

ossia le cellule dendritiche (DC) e le cellule Natural Killer (NK), producono sia IL2 che IFN-γ

determinando la risposta di tipo Th1. Essa è caratterizzata da elevati livelli di citochine proinfiammatorie

interferon-gamma (IFN-γ), tumor necrosis factor beta (TNF-β) ed IL2 senza la

produzione di IL4, IL5, IL9 e IL13. Il rilascio di citochine pro-infiammatorie avrà effetti sulla

produzione di anticorpi opsonizzanti ed in grado di fissare il complemento da parte delle cellule B,

l’attivazione di macrofagi e la citotossicità cellulare. Le cellule Th1 aiutano i precursori delle

cellule T citotossiche a diventare CTL causando l’infiammazione locale. La risposta di tipo Th1 è

tipiche delle malattie autoimmunitarie ossia il diabete e la malattia celiaca. La risposta di tipo Th2,

o risposta umorale, è caratterizzata dalla produzione di IL4, IL5, IL9 ed IL13, senza la produzione

di IFN-γ e TNF-β. La risposta di tipo Th2 induce le cellule B a trasformarsi in plasmacellule,

secernere immunoglobuline, favorire la differenziazione e l’attivazione degli eosinofili ma inibisce

la funzione delle cellule fagocitarie. Questa è la tipica risposta nelle reazioni allergiche

caratterizzate dalla reattività delle IgE. IL4 e IL13 spingono le cellule B alla produzione di IgE

mentre IL5 attiva gli eosinofili (39-41).

Fino a poco tempo fa, i sottogruppi Th1 e Th2 venivano considerati le uniche risposte effettrici

CD4. Tuttavia, è stata scoperta una terza via chiamata Th17 (Fig.4). Le cellule Th17 producono

IL17, IL17F, IL22, IL6 e TNF-α ed è stato suggerito possano prendere parte sia al processo di

infiammazione tissutale che all’attivazione dei neutrofili. La risposta di tipo Th17 viene distinta ed

antagonizzata dalle risposte di tipo Th1 e Th2 (41,42).

Le cellule T in grado di sopprimere la risposta immunitaria, sia mediante il contatto cellula/cellula

che/o mediante la produzione di citochine inibitorie, vengono dette cellule T regolatorie. Le cellule

T regolatorie governano l’equilibrio immunitario (Fig.4). Esistono diverse famiglie di cellule T

regolatorie che includono le cellule T regolatorie CD4+ CD25+ (Treg), in grado di avere effetti di

repressione mediante il contatto cellulare e le cellule T regolatorie di tipo 1 (Tr1) e le cellule Th3

che esercitano i loro effetti attraverso citochine, ossia IL10 e TGF-β. Le cellule Treg derivano dal

timo e si caratterizzano per l’espressione di CD25 (recettore per IL2) e la trascrizione del fattore

Foxp3. La produzione delle cellule Treg è indotta dall’espressione timica di auto-antigeni e si pensa

che le cellule Treg abbiano un ruolo nella prevenzione dell’autoimmunità. La funzione soppressiva

delle cellule Treg sembra dipendere in parte dal TGF-β, ed in misura minore dall’IL10. Le cellule

10


Th3 derivano dall’intestino e si caratterizzano per la produzione di TGF-β (±IL10), svolgono il loro

ruolo mediando la tollerabilità a livello della mucosa e producendo IgA antigene-specifiche. Le

cellule Tr1 derivano dalla periferia e producono IL10 (±TGF-β). Tuttavia, la loro origine non è

chiara, e tuttora non è noto se rappresentino una distinta via di sviluppo o se derivino dalle cellule

Th o Treg. Dati suggeriscono che la produzione di IL10 da parte di cellule CD4+ possa indurre

risposte di tolleranza immunitaria (32, 43).

Didascalia alla Figura 4. Le cellule Th0 naïve possono differenziarsi in cellule Th1, Th2 o Th17. Le

cellule T regolatorie (Treg, Tr1 e cellule Th3) sono in grado di sopprimere la risposta immunitaria.

Durante la gravidanza le risposte mediate da cellule T potenzialmente dannose vengono inibite al

fine di proteggere il feto. Di recente, il concetto prevalente di una forte risposta immunitaria di tipo

Th2 in corso di gravidanza è stato messo in dubbio, ed è stato suggerito che una risposta

immunitaria bilanciata di tipo Th1/Th2 sia necessaria per portare a termine la gravidanza con

successo (44). Tuttavia, esistono dati che suggeriscono la mancanza di meccanismi di difesa

immunitaria cellulo-mediata durante il periodo neonatale responsabili di una risposta di tipo Th1

attenuata. Molti gruppi hanno dimostrato che le risposte IFN-γ nel neonato sono minori rispetto agli

adulti (45, 46) ed i livelli fetali di IL13 sono risultati maggiori mentre quelli di IL4, IL10 e IFN-γ

risultano inferiori rispetto ai livelli riscontrati negli adulti, a supporto di un’inclinazione Th2 (47).

Si pensa che la sensibilizzazione avvenga nell’utero, e allergeni degli acari della polvere domestica

sono stati riscontrati nel liquido amniotico e nel sangue del cordone ombelicale (48, 49). Il

significato di questi reperti per la futura sensibilizzazione e per l’espressione di allergie non è noto

(46). Recentemente è stato suggerito che IgE allergene-specifiche presenti nel sangue cordonale

siano il risultato di un passaggio di IgE materne al feto piuttosto che espressione della

sensibilizzazione fetale (50). Sembra che il sistema immunitario viri verso una forma di risposta

immunitaria bilanciata nel corso della prima infanzia. Nei bambini allergici questo non avviene,

piuttosto vi è un’aumentata reattività di tipo Th2 (46, 51).

L’elemento centrale alla base sia della risposta immunitaria di tipo umorale che di quella cellulomediata

è l’attivazione e l’espansione clonale delle cellule Th. Le cellule Th riconoscono gli

antigeni solamente quando questi sono legati alle molecole del complesso maggiore di

istocompatibilità (MHC) di classe II presente sulle cellule APC mature, ossia DC, cellule B e

macrofagi. In breve, l’interazione del complesso TCR-CD3 con un peptide antigenico processato

legato alle molecole MHC di classe II presenti sulla superficie delle cellule APC induce una serie di

eventi biochimici che porta le cellule ferme Th a proliferare e a differenziarsi in cellule di memoria

o cellule effettrici. Per una completa attivazione delle cellule T sono richiesti segnali co-stimolatori.

Questo segnale deriva dall’interazione tra CD28, una glicoproteina espressa sulla membrana delle

cellule T, e la molecola B7/CD80 presente sulle cellule APC. In questa tesi, le cellule T venivano

attivate in maniera policlonale dall’anticorpo monoclonale anti-CD3 (mAb) e dall’anticorpo anti-

CD28 e la conseguente risposta citochinica veniva valutata quale indice dell’attività delle cellule T.

Le differenze nei modelli delle citochine prodotte dalle cellule Th1 attivate determinano differenti

tipi di risposte immunitarie. Abbiamo studiato l’IL2 quale marker generico di attivazione delle

cellule T, l’IL4 quale marker di attivazione delle cellule Th2, l’IFN-γ quale marker di attivazione

delle cellule Th1 e l’IL10 quale marker dell’attività delle cellule T regolatorie.

La reazione di ipersensibilità IgE-mediata

La reazione di ipersensibilità IgE-mediata inizia in seguito all’esposizione ad un allergene in grado

di attivare le cellule B trasformandole in plasmacellule secernenti IgE. Le molecole di IgE secrete si

legano ai recettori Fc IgE-specifici, ossia glicoproteine di membrana con affinità per l’entità Fc

delle molecole di anticorpo (la parte terminale dell’anticorpo), presenti sulla superficie delle mast

11


cellule tissutali e dei basofili presenti nel sangue. Le cellule che vengono in contatto con le IgE

vengono sensibilizzate. La successiva esposizione allo stesso allergene determina il legame di

questo con le IgE presenti sulla superficie cellulare delle cellule sensibilizzate determinandone la

degranulazione. La degranulazione consiste nel rilascio di mediatori attivi, ossia istamina, citochine

e proteasi che determinano la contrazione della muscolatura liscia, l’incremento della permeabilità

vascolare e la vasodilatazione. L’avvenuta sensibilizzazione può essere confermata mediante la

valutazione degli anticorpi IgE specifici circolanti o attraverso il prick test cutaneo (SPT). Nel

momento in cui l’allergene viene inoculato sottocute in un individuo precedentemente

sensibilizzato, va ad incrociare le molecole di IgE presenti sulla superficie cellulare delle mast

cellule ed avviene la degranulazione di queste ultime. I granuli pre-costituiti contenenti istamina

vengono rilasciati con successiva infiltrazione progressiva del derma da parte di eosinofili e

neutrofili e conseguente formazione reattiva di un pomfo iperemico della cute che può essere

misurato (52).

La manifestazione atopica

Con il termine di manifestazione atopica si descrive un insieme di manifestazioni cliniche di

allergia, che insorgono come eczema ed allergia alimentare, fino a progredire verso un quadro di

allergie respiratorie (Fig. 5), (53, 54), anche se questa concezione è contestata (55). L’allergia

alimentare insorge prevalentemente nei primi 2 anni di vita con un processo di sensibilizzazione,

ossia il sistema immunitario risponde al contatto con proteine alimentari specifiche con la

produzione di IgE allergene-specifiche. In seguito alla sensibilizzazione, l’esposizione a quel cibo

può scatenare reazioni avverse. Tuttavia, mentre le allergie alimentari negli adolescenti sono

prevalentemente IgE-mediate, in bambini di età inferiore si riconoscono meccanismi non IgEmediati,

sebbene non siano pienamente compresi. Molte allergie verso gli alimenti vengono perse

durante l’infanzia. Per esempio, nei paesi industrializzati l’allergia verso le proteine del latte di

mucca (CMA) colpisce il 2-3% dei bambini al di sotto dei 2 anni ma scompare in circa il 50% dei

bambini di un anno e nel 90% dei bambini in età pre-scolare. I sintomi clinici della CMA sono vari,

potendo variare dalle reazioni anafilattiche all’eczema, alla dispnea correlata ai cibi, la colica

infantile, il reflusso gastro-esofageo, la diarrea e la stipsi (56). L’SPT e la valutazione degli

anticorpi specifici di classe IgE risultano essere utili ai fini dell’approccio diagnostico ma un test di

provocazione controllato con gli alimenti rappresenta il gold standard (57).

L’eczema è una manifestazione comune nei bambini piccoli. In un grande studio prospettivo di

coorte, svolto su neonati svedesi, lo studio BAMSE, l’incidenza cumulativa di eczema tra 0-4 anni

era del 33%. Il 21% dei pazienti presentava un eczema non-IgE mediato, ed il 12% dei pazienti un

eczema IgE-mediato. Il 27% dei bambini senza una storia familiare positiva (da parte della madre o

del padre) per allergie aveva manifestato la comparsa di eczema prima dei 4 anni. Il corrispettivo tra

i bambini con storia di familiarità in uno o due casi era del 38% e 50%, rispettivamente (35).

L’eczema è caratterizzato da lesioni cutanee croniche eritematose con decorso ricorrente, intensa

disidratazione della cute e prurito. Nella prima infanzia le lesioni eczematose colpiscono

prevalentemente il volto (specialmente le guance ed il mento), il cuoio capelluto, il tronco e la

superficie esterna delle estremità. L’area a contatto con il pannolino viene generalmente

risparmiata. Durante l’infanzia l’eczema assume un andamento più cronico con lichenificazione,

formazione di papule ed escoriazioni che colpiscono il collo, i polsi, le caviglie e le pieghe delle

articolazioni (54, 58). La funzione della barriera cutanea viene pregiudicata nell’eczema, soprattutto

nell’eczema atopico (59).

Nello studio BAMSE, il 9% dei bambini ed il 4% delle bambine presentavano asma all’età di 4 anni

(60). La fase I dello studio ISAAC ha messo in risalto differenze universali nella prevalenza di

sintomi di asma con una prevalenza a 12 mesi dell’8% nei bambini svedesi di 6-7 anni (61). Nello

studio OLIN, la prevalenza della diagnosi medica di asma nei bambini del nord della Svezia

12


aumentava con l’età, dal 6% a 7-8 anni all’8% a 11-12 anni (62). Nella fase III dello studio ISAAC,

il centro svedese ha riportato una prevalenza a 12 mesi di rino-congiuntiviti del 7% nei bambini di

13-14 anni (63).

Didascalia alla Figura 5. Descrizione schematica della manifestazione atopica. Adattata da JM

Spergel et al (54) e stampata con il permesso dell’editore.

Food allergy = allergia alimentare

Eczema

Rino-congiuntivite

Asma

Nel bambino atopico la manifestazione atopica progredisce. Una recente meta-analisi ha dimostrato

che 1 bambino su 3 con eczema sviluppa asma durante le fasi tardive dell’infanzia, un dato che è

inferiore rispetto ai precedenti riportati (64). Tuttavia, una precoce sensibilizzazione con IgE ed una

forma severa di eczema risultano associati ad un rischio aumentato di sviluppare asma (54).

La permeabilità intestinale nei soggetti allergici

Il tasso di incidenza piuttosto elevato delle allergie alimentari nell’infanzia e nella prima

adolescenza potrebbe essere spiegato dalla presenza di una barriera mucosa incompleta, da

un’aumentata permeabilità intestinale verso grandi molecole e da una risposta immunitaria

mucosale e sistemica immatura. La sensibilizzazione verso allergeni alimentari può essere

considerata come il fallimento del normale processo di induzione di tollerabilità o come

l’annullamento di una tollerabilità stabilita, ed è più frequente durante l’infanzia quando i

meccanismi di tollerabilità non sono completamente sviluppati.

L’aumento della permeabilità intestinale con l’aumentato assorbimento di macro-molecole è stato

riscontrato in bambini e giovani adulti con eczema e/o allergia alimentare, (65) ed in bambini con

asma (66). Quindi, l’intero sistema immunitario della mucosa può essere coinvolto nella malattia

allergica. Tuttavia, se questo aumento della permeabilità intestinale sia un tratto primitivo ereditario

o rifletta un danno della barriera mucosa intestinale guidato dall’infiammazione non è noto e

necessita di ulteriori studi (66).

Alterazione della flora batterica intestinale e malattia

L’ipotesi delle condizioni igieniche

Nel 1989, Strachan ha dimostrato in uno studio epidemiologico la relazione inversa tra la grandezza

del nucleo familiare ed il rischio di riniti allergiche. Egli ipotizzava che nei bambini, le infezioni

trasmesse dai familiari più anziani potessero proteggere dalla malattia allergica e che dietro

l’aumento delle allergie nel mondo Occidentale potesse nascondersi una minore esposizione agli

allergeni nel corso dell’infanzia (67). A sorpresa, è stata dimostrata una forte associazione nella

popolazione tra l’insorgenza del diabete di tipo 1, una patologia Th1-mediata, ed i sintomi di asma,

quale esempio di malattia Th2-mediata (68). In seguito, una versione modificata dell’ipotesi delle

condizioni igieniche proponeva che l’incontro di microbi generici potesse stimolare il sistema

immunitario verso una risposta immunitaria di tipo Th1, e che la flora batterica intestinale,

formatasi nel corso dell’infanzia, potesse avere un impatto maggiore nel guidare tali risposte (23).

Inoltre, è stato proposto che un carico di microrganismi potrebbe incrementare l’attività delle cellule

T regolatorie con un’inibizione delle malattie Th1- e Th2-mediate (69).

Quindi, è stato ipotizzato che una ridotta esposizione ai microrganismi nelle prime fasi della vita

possa essere responsabile della formazione di modelli aberranti della risposta immunitaria.

13


La flora batterica intestinale e l’allergia

La ridotta esposizione microbica durante le prime fasi dell’infanzia rappresenta uno dei più

probabili motivi dell’aumentata incidenza delle malattie allergiche nel mondo occidentale. Come

accennato, sia gli studi epidemiologici che i modelli animali gnotobiotici hanno supportato questa

ipotesi. Alla fine degli anni 90, Sepp e colleghi hanno dimostrato le differenze circa la

composizione della flora batterica intestinale tra bambini di un anno in buona salute svedesi ed

estoni. I lattobacilli e gli eubatteri erano molto più comuni nella flora batterica intestinale dei

bambini estoni, mentre i bambini svedesi presentavano una maggiore quota di clostridi,

specialmente il Clostridium difficile (C. difficile), rispetto ai bambini estoni (70). La flora microbica

dei bambini estoni, infatti, era simile a quella dei bambini svedesi negli anni 60. Lo stesso gruppo

ha poi studiato la composizione della flora batterica intestinale nei bambini sani e nei soggetti

allergici di entrambi i paesi. Inoltre, la conta dei germi facoltativi aerobi risultava essere maggiore

nei soggetti allergici, con un aumento della conta di S. aureus nei bambini svedesi e di coliformi nei

bambini estoni (71). In uno studio successivo, lo stesso gruppo ha seguito prospettivamente la

composizione della flora batterica intestinale e lo sviluppo delle allergie nei bambini svedesi ed

estoni. Quello studio ha dimostrato una minor colonizzazione da parte dei bifidobatteri durante il

primo anno di vita dei bambini che successivamente hanno sviluppato allergie (72). Da un altro

gruppo è stata riportata una minor conta di bifidobatteri nei bambini piccoli con eczema rispetto ai

controlli sani (73). Anche un altro gruppo ha dimostrato un rapporto ridotto di bifidobatteri rispetto

ai clostridi in bambini che successivamente sono diventati allergici (74). In neonati allergici e sani

allattati al seno è stato studiato se alcuni ceppi di bifidobatteri possano essere correlati oppure no

allo sviluppo di allergie. La frequenza della colonizzazione da parte del Bifidobacterium bifidis (B.

bifidis) è risultata maggiore nei neonati sani mentre i neonati allergici venivano più spesso

colonizzati dal B. adolescentis (75). Successivamente, due recenti ampi studi prospettivi di coorte,

condotti su neonati e che hanno impiegato tecniche di biologia molecolare, non sono riusciti a

dimostrare un effetto protettivo da parte di una precoce colonizzazione con bifidobatteri verso lo

sviluppo successivo di allergie (2, 76). Altri gruppi hanno studiato gli effetti del parto cesareo, che

risulta essere associato ad una ritardata ed alterata formazione della flora batterica intestinale

rispetto al parto naturale (2, 6), sulla successiva manifestazione dell’allergia. E’ stato osservato che

i neonati nati da parto cesareo presentano un aumentato rischio di sviluppare successivamente asma

e riniti allergiche (77, 78).

Quindi, esistono indicazioni circa un’associazione tra un’alterata composizione della flora

batterica intestinale e lo sviluppo di allergia, con differenze nella composizione della flora

batterica anche prima che insorgano i sintomi della malattia. Tuttavia, sono necessari ulteriori

studi al fine di chiarire questo problema.

I probiotici

Cenni storici e definizione

Il concetto di modulare la composizione della flora batterica intestinale per scopi terapeutici è senza

dubbio un concetto nuovo. La modulazione può essere effettuata rimuovendo microrganismi

mediante l’uso di antibiotici o aggiungendo nuovi organismi, ossia i probiotici. Inoltre,

l’introduzione di diversi fattori nutrizionali, ossia fibre alimentari o amidi indigeribili, può

influenzare la flora batterica. L’uso di latte fermentato risale a diversi secoli prima dell’era prebiblica.

Tuttavia, è stato non più di un secolo fa che gli studi sugli effetti salutari del consumo del

latte acido sono stati promossi dal lavoro pionieristico del vincitore del premio Nobel Elie

Metchnikoff. Egli proponeva che il latte acido potesse antagonizzare i batteri nocivi nel colon e la

regolare ingestione di latte acido poteva avere un impatto sulla longevità della popolazione bulgara

(79). Nello stesso periodo, Henri Tissier aveva dimostrato che i bifidobatteri rappresentavano la

classe predominante della flora batterica intestinale nei neonati allattati al seno. Egli quindi

14


proponeva che la somministrazione di questi bifidobatteri potesse ristabilire l’equilibrio nella flora

batterica intestinale e risolvere patologie diarroiche. Così, è nato il concetto dei probiotici.

Il termine probiotici sta per “in favore della vita”. Fuller li aveva definiti come “integratori

alimentari contenenti batteri vivi che influiscono in maniera vantaggiosa sull’animale ospite

migliorando l’equilibrio della sua flora microbica” (80). Questa definizione è stata poi

successivamente modificata dalla FAO/WHO che li ha denominati “microrganismi vivi che quando

ingeriti in adeguate quantità conferiscono effetti benefici all’ospite” (81). Le specie più

comunemente usate sono i lattobacilli ed i bifidobatteri, ma altri ceppi batterici sono stati usati come

probiotici e anche il lievito Saccharomyces boulardi. I prebiotici sono “ingredienti alimentari nondigeribili

che influiscono in maniera vantaggiosa sull’ospite stimolando in maniera specifica la

crescita e/o l’attività di uno o di un numero limitato di batteri nel colon, migliorando così la salute

dell’ospite” (82). Questi ingredienti alimentari sono oligosaccaridi non-digeribili ossia il galattooligosaccaride

(GOS) ed il frutto-oligosaccaride (FOS). Il latte materno è ricco di oligosaccaridi.

Con il termine simbiotici si fa riferimento ai prebiotici in combinazione con i probiotici (83).

Sicurezza e linee guida

I probiotici sono un gruppo di batteri che vengono Generalmente Riconosciuti Sicuri (Generally

Recognized As Safe, GRAS) (84). I bifidobatteri ed i lattobacilli sono comuni commensali della

flora batterica dei mammiferi e sono stati usati in vari tipi di alimenti per un lungo periodo.

Raramente sono responsabili di infezioni negli esseri umani. Tuttavia, teoricamente i probiotici

possono causare infezioni sistemiche, attività metaboliche potenzialmente dannose, un’eccessiva

stimolazione immunitaria ed il trasferimento di geni (85). Studi epidemiologici condotti in

Finlandia dopo l’introduzione nei mercati finlandesi del probiotico L. rhamnosus GG (LGG), hanno

dimostrato che non vi è incremento della batteriemia indotta dai lattobacilli dopo un aumentato

consumo di LGG (86). In uno studio svedese è stata valutata per cinque anni l’incidenza della

batteriemia indotta dai lattobacilli e la presenza nelle colture ematiche di tre tipi di probiotici

disponibili in commercio, incluso il L. paracasei ssp. ceppo paracasei F19. L’incidenza della

batteriemia causata dai lattobacilli costituiva


- Valutazione degli effetti avversi negli studi condotti su esseri umani

- Sorveglianza degli effetti avversi nei consumatori durante la fase post-vendita

Meccanismi d’azione proposti dei probiotici

La caratteristica comune ai probiotici è quella di essere microrganismi non-patogeni. Tuttavia,

esiste un’enorme diversità nei meccanismi di azione dei singoli ceppi di probiotici. Così, sembrano

esistere diversi meccanismi coinvolti nella mediazione degli effetti dei probiotici. I probiotici posso

avere effetti diretti sul chimo, sulla flora batterica ed effetti correlati ai cambiamenti dell’ecosistema

della flora batterica. Inoltre, possono esercitare effetti sugli enterociti e sulle cellule

immunocompetenti presenti nella mucosa intestinale (90).

I batteri colonizzanti interagiscono con la mucosa gastrointestinale e comunicano con i costituenti

linfocitari del sottostante strato epiteliale e mucosale, stimolando la difesa da parte dell’ospite a

livello intestinale. Questa comunicazione viene chiamata ”comunicazione-crociata” batteri-epitelio

(91). Con la scoperta della famiglia dei recettori Tool-like (TLR), questa comunicazione è stata

compresa meglio. I TLR sono prevalentemente espressi sulle cellule APC ed interagiscono con gli

assetti molecolari presenti sia sui batteri patogeni che sui batteri commensali, includendo quindi i

batteri probiotici. Negli esseri umani, sono noti 11 TRL che riconoscono le strutture molecolari

presenti sui microrganismi, i cosiddetti pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP). I TRL

avviano l’espressione dei geni antimicrobici e dei geni che codificano per le citochine

infiammatorie attraverso diversi tipi di cellule, mentre attivano le cellule DC, cellule APC mature,

ad innescare le risposte dell’immunità adattativa. Le cellule DC hanno come unica capacità quella

di attivare le cellule T näive in stato di fermo ed hanno un ruolo intermedio tra l’immunità innata e

quella adattativa al fine di aiutare la formazione della risposta immunitaria in via di sviluppo.

Nei mammiferi, la via dei Toll determina l’attivazione del fattore di trascrizione chiamato fattore

Nucleare kβ (NFkβ). I costituenti dei batteri ossia il lipopolisaccaride (LPS) presenti nella parete

cellulare dei batteri Gram-negativi possono attivare l’NFkβ presente nei linfociti attraverso questo

percorso di segnali. NFkβ attiva geni che contribuiscono alla risposta immunitaria adattativa ed alla

secrezione di citochine pro-infiammatorie. L’LPS comunica per mezzo del TRL4 in associazione

con un altro recettore per l’LPS, chiamato CD14. Un altro esempio è il TRL2 che si lega all’acido

lipoteico (LTA) presente nella parete cellulare dei batteri Gram-positivi. Il TRL9 riconosce il DNA

genomico dei batteri. NFkβ attiva i geni che contribuiscono all’immunità adattativa ed alla

secrezione delle citochine pro-infiammatorie (92).

Le cellule DC potrebbero essere bersagli potenziali dei batteri probiotici. Si pensa che le cellule DC

immature presenti nella lamina propria possano estendere i dendriti tra gli enterociti nel lume

intestinale. Attraverso la via di segnale-TRL le cellule DC si attivano, rilasciando citochine che

spingono le cellule Th näive a maturare in sottogruppi bilanciati di cellule Th1, Th2 e cellule T

regolatorie (93) (Fig. 6)

Didascalia alla Figura 6. I batteri probiotici possono mediare i loro effetti attraverso la via di

segnale-TRL, rilasciando IL10 ed IL12 che possono indurre le cellule Th näive a maturare in

sottogruppi equilibrati di cellule Th1, Th2 e cellule T regolatorie.

I probiotici nel trattamento della malattia infettiva

I probiotici sono stati usati nel trattamento della diarrea acuta infettiva sulla base del presupposto

che agiscano contro i patogeni presenti nell’intestino. Numerosi trial clinici hanno valutato

l’efficacia dei probiotici nel trattamento della diarrea infettiva. Una meta-analisi su trial

randomizzati controllati condotti per valutare l’ utilizzo dei probiotici nella diarrea acuta infettiva

(definita come > 3 evacuazioni liquide o acquose nelle 24 ore) nei neonati e nei bambini ha

16


dimostrato che i probiotici sono efficaci, soprattutto nelle gastroenteriti da rotavirus (94). Una

review Cochrane del 2004 ha identificato 23 trial controllati randomizzati per un totale di 1927

pazienti, valutando il trattamento con probiotici della diarrea infettiva. I probiotici hanno ridotto il

rischio di diarrea al 3° giorno e la durata media della diarrea di circa 1 giorno. Gli autori

concludevano che i probiotici sembravano essere un utile supporto alla terapia reidratante orale nel

trattamento della diarrea acuta infettiva nei bambini e negli adulti. Tuttavia, vi è ancora carenza di

trial condotti nei paesi in via di sviluppo dove ci si aspetta che gli effetti siano maggiori (95).

I probiotici nel trattamento e nella prevenzione della malattia allergica

Come discusso, sia i modelli epidemiologici che i modelli animali gnotobiotici suggeriscono che la

flora batterica intestinale rappresenti il maggiore stimolo alla maturazione del sistema immunitario.

Da qui l’idea di usare i probiotici, soprattutto bifidobatteri e lattobacilli, per il trattamento e la

prevenzione delle malattie allergiche. I meccanismi dei probiotici proposti sono l’omeostasi della

flora batterica intestinale, la stabilizzazione della barriera intestinale ed il controllo

dell’infiammazione (96). Esistono numerosi studi che hanno valutato l’efficacia dei probiotici nel

trattamento dell’eczema. Il primo studio si è occupato di neonati con eczema ed allergia al latte di

mucca (CMA). In quello studio l’indice di Punteggio della Dermatite Atopica (Scoring Atopic

Dermatitis Index SCORAD) si riduceva del 50% quando i neonati venivano nutriti con il siero

idrolizzato del latte in polvere arricchito con LGG rispetto allo stesso latte in polvere senza

l’aggiunta di LGG (97). In un altro piccolo studio, l’aggiunta di LGG o del B. lactis determinava

una più rapida risoluzione dell’eczema rispetto al placebo (98).

Inoltre, uno studio con un disegno simile a quello di Isolauri e colleghi (98), ha dimostrato la

mancata efficacia della somministrazione di LGG sull’eczema (99), ed in altri 2 studi non risultava

alcun effetto dell’LGG nei neonati con eczema lieve o moderato rispetto al placebo (100, 101).

Tuttavia, in uno studio più ampio, l’LGG ha ridotto l’indice SCORAD nei neonati con eczema IgEassociato

mentre ciò non è avvenuto utilizzando un MIX di 4 ceppi probiotici (102).

In uno studio condotto per valutare gli effetti dei probiotici sull’eczema da moderato a severo, il L.

fermentum ha determinato un significativa riduzione dell’indice SCORAD rispetto al placebo (103).

Effetti moderati della somministrazione dei probiotici sono stati anche osservati in uno studio

condotto su bambini più grandi. Questo studio prevedeva un disegno crociato (crossover), ed una

combinazione di L. reuteri e L. rhamnosus ha migliorato i sintomi soggettivi nei bambini con

eczema ma non è stata in grado di ridurre l’indice SCORAD (104).

Tre studi randomizzati controllati hanno dimostrato gli effetti preventivi della somministrazione

perinatale di probiotici sull’eczema, che includeva anche o solo l’eczema IgE-associato (105-107),

mentre due studi non hanno dimostrato alcun effetto protettivo (108,109).

Lactobacillus F19

Isolamento, colonizzazione e sicurezza

Il Lactobacillus paracasei ssp. ceppo paracasei F19 (LF19) è stato originariamente isolato dallo

strato profondo della mucosa colica in pazienti che non presentavano una malattia gastrointestinale.

E’ stato dimostrato che il ceppo si legava alla mucina ed era in grado di sopravvivere

all’esposizione al pH acido ed alla bile.

Quindi, si è pensato che il ceppo avesse una buona possibilità di sopravvivere al transito attraverso

il tratto gastrointestinale (GI) stabilendosi nella mucina GI (110).

La sopravvivenza, l’ecologia e la sicurezza dell’LF19 nei soggetti umani è stata inoltre valutata in

un progetto di ricerca multicentrico europeo, il progetto PROBDEMO. Il probiotico veniva

introdotto attraverso capsule e latte contenenti LF19 congelato-essiccato o nello yoghurt. Le dosi di

LF19 variavano tra 10 8 -10 10 UFC. L’LF19 colonizzava in maniera transitoria il lume colico e la

mucosa (111). La valutazione della flora batterica fecale dopo il termine dell’assunzione di LF19 ha

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dimostrato che alcuni bambini piccoli erano stati colonizzati 2 settimane dopo il termine, e 2

soggetti anziani erano ancora colonizzati da LF19 dopo 8 settimane. Il trials ha mostrato inoltre che

ceppi indistinguibili dall’LF19 venivano identificati mediante la metodica della polymerase chain

reaction ad amplificazione randomizzata (RAPD-PCR) nei campioni fecali di alcuni soggetti prima

della somministrazione di LF19. Al momento del trials l’LF19 non era ancora stato prodotto per

essere commercializzato e quindi i soggetti non potevano essere stati esposti a questo ceppo con i

cibi (112, 113).

Riassumendo, questi trials condotti sull’alimentazione negli esseri umani hanno dimostrato che

LF19 era ben tollerato dai bambini piccoli, dagli adulti e dagli anziani senza effetti avversi

osservati. Inoltre, i trials hanno dimostrato che LF19 o ceppi strettamente correlati, fanno parte della

flora batterica indigena in alcune persone dei paesi nordici (111).

Il profilo di antibiotico-resistenza dell’LF19 assomiglia a quello del gruppo del L. casei, inclusa la

resistenza alla Vancomicina. I lattobacilli sono intrinsecamente resistenti alla Vancomicina, e

questo tratto è considerato non-trasmissibile (89). Non si conosce alcuna resistenza antibiotica

dell’LF19 derivata da plasmidi (114). L’LF19 produce acido L-lattico, ma non acido D-lattico e non

è in grado di deconiugare i sali biliari (R Fondèn, comunicazione personale 2003).

Effetti immunologici in vitro e nei modelli animali

La stimolazione delle cellule mononucleate del sangue umano periferico (PBMC) con diversi ceppi

di lattobacilli vivi (incluso l’LF19) determina la produzione di TNF-α, IL6 ed IL10 in vitro (115).

L’incubazione di una sospensione contenente LF19 su una linea cellulare monocitaria determina la

trascrizione di NFkβ e causa la produzione di IL1β, IL8 ed IL10 (110). In un modello murino

creato per studiare l’espressione genica globale nell’ileo distale dopo l’ingestione di LF19, alcuni

componenti del recettore di segnale presente sulle cellule B venivano maggiormente espressi nei

topi monocolonizzati (116).

Quindi, LF19 risponde ai criteri del probiotico, ed è stato dimostrato avere effetti immunostimolatori

in vitro.

OBIETTIVI

L’obiettivo generale di questo studio è stato di valutare se l’assunzione del probiotico LF19 durante

lo svezzamento fosse in grado di mantenere alcuni dei benefici effetti conferiti dal latte materno

sulla composizione della flora batterica intestinale, con possibili effetti sull’attività della flora

intestinale, sull’immunità adattativa, sull’equilibrio tra risposta immunitaria Th1/Th2 e sullo

sviluppo dell’allergia.

Gli obiettivi specifici da valutare sono stati i seguenti:

- Gli effetti dell’assunzione di LF19 sui livelli fecali di lattobacilli e sulla composizione degli

SCFA come indice dell’attività della flora batterica intestinale

- Gli effetti dell’ingestione di LF19 sulle infezioni e le risposte di anticorpi IgG specifici ai

vaccini coniugati contro difterite, tetano ed Haemofilus influenzae tipo b

- La maturazione dell’attività delle cellule T in base all’età e gli effetti su di essa

dell’ingestione di LF19

- Gli effetti dell’ingestione di LF19 sull’incidenza cumulativa di eczema a 13 mesi di età,

l’equilibrio immunitario ed livelli di IgE allergene-specifiche.

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PAZIENTI E METODI

Disegno dello studio

Arruolamento allo studio

Vaccinazione

Prelievo di sangue

Ingestione di LF19

Diario

Questionario

Campionamento fecale

Didascalia alla Figura 7. Diagramma per l’arruolamento, le vaccinazioni, l’ingestione dei cereali, la

registrazione della morbidità mediante diari e questionari, campioni di sangue e di feci. I metodi

usati vengono descritti nella rispettiva sezione Pazienti e Metodi di ogni protocollo.

RISULTATI

Caratteristiche dei partecipanti

Abbiamo arruolato 180 neonati dell’età di 4 mesi. Dopo aver escluso un neonato per via dei criteri

di esclusione, (nato da parto cesareo), 89 neonati sono stati randomizzati a ricevere cereali con

l’aggiunta di LF19 e 90 a ricevere cereali senza aggiunta di LF19 (placebo). Il tasso di pazienti persi

(drop-out) è risultato minimo. Il 94% (n=84) ed il 97% (n=90) dei neonati hanno completato lo

studio nel gruppo probiotico e nel gruppo placebo, rispettivamente. Quindi, 171 neonati hanno

completato lo studio. Non si sono osservate differenze statisticamente significative tra i gruppi per

quanto riguarda il sesso, l’età gestazionale, il peso alla nascita, il numero dei fratelli maggiori, i

giorni di ospedalizzazione, l’esposizione ad animali domestici con il pelo o l’esposizione domestica

al fumo. Non si sono osservate differenze tra i due gruppi per quanto riguarda l’ereditarietà

dell’atopia; il 66% ed il 61% dei neonati nel gruppo probiotico e nel gruppo placebo avevano

almeno un parente di primo grado con allergia ed erano stati classificati come soggetti ad alto

rischio per lo sviluppo di allergia, rispettivamente, (p=0.5).

Non sono state osservate differenze tra i gruppi rispetto al numero di evacuazioni ed alla

consistenza delle feci o nella frequenza di rigurgito (dati non pubblicati). La CMA è stata

diagnosticata mediante un test provocativo alimentare in 6 ed in 3 neonati nel gruppo del probiotico

e nel gruppo placebo, rispettivamente (p=0.3). Tutti i neonati con CMA hanno reagito con sintomi

da interessamento cutaneo o del tratto gastrointestinale subito dopo aver introdotto il cereale, che ha

rappresentato il primo alimento per lo svezzamento basato sulle proteine del latte introdotto

nell’alimentazione del bambino, e tutti i bambini sono migliorati dopo aver eliminato le proteine del

latte. Non si sono osservate differenze tra i due gruppi per quanto riguarda la crescita (dati non

pubblicati). Quindi, i cereali sono stati ben accettati, determinando una normale crescita senza

effetti avversi dimostrati.

Figura 8. La somministrazione di cereali ad uno dei bambini dello studio.

Effetti dell’assunzione di probiotici durante lo svezzamento sullo stato

funzionale della flora microbica intestinale (Protocollo 1)

Nel primo protocollo, abbiamo voluto determinare se l’assunzione di probiotici durante lo

svezzamento potesse far aumentare la conta dei lattobacilli fecali e fosse in grado di prolungare gli

effetti benefici conferiti dal latte materno sulla composizione della flora batterica intestinale con

conseguenti effetti sulla composizione degli SCFA.

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La conta totale dei lattobacilli risultava maggiore durante l’integrazione nel gruppo probiotico

rispetto al gruppo placebo (p


Le analisi statistiche sono state quindi aggiustate per la colonizzazione persistente da parte

dell’LF19 durante l’integrazione e suddivise in persistentemente colonizzato, (isolato in tutti e tre i

campioni fecali nel corso dell’integrazione) o non colonizzato (isolato in


pubblicati). I neonati del gruppo probiotico hanno assunto antibiotici per un numero di giorni

lievemente inferiore a quello nel gruppo placebo (p=0.044).

Come ci si aspettava, la risposta anticorpale verso tutti e tre gli antigeni e’ stata marcatamente più

elevata dopo la terza dose rispetto alla seconda. Nell’insieme, non sono stati riscontrati effetti da

parte di LF19 sulla risposta anticorpale specifica verso nessuno degli antigeni. Tuttavia, LF19 ha

aumentato le concentrazioni della tossina difterica durante il corso della vaccinazione dopo

correzione in rapporto alla durata dell’allattamento al seno e colonizzazione di LF19 (p=0.024).

C’era un’interazione tra l’integrazione e la colonizzazione persistente di LF19 sulle concentrazioni

della tossina antitetanica durante il corso della vaccinazione (p=0.035). Tuttavia, le analisi di

follow-up non hanno raggiunto una significatività statistica in nessuno periodo. Al contrario, le

concentrazioni di anti-HibPS risultavano essere maggiori dopo la prima e la seconda dose del

vaccino Hib nei neonati allattati al seno < 6 mesi rispetto ai neonati allattati ≥6 mesi, (p=0.05), in

assenza di effetti da parte di’LF19.

Quindi, gli effetti dell’LF19 sulle risposte ai vaccini potrebbero essere stati mediati dai cambiamenti

indotti sulla flora batterica intestinale con successivi effetti di immuno-stimolazione. Tuttavia, gli

effetti dell’LF19 sono stati influenzati dalla durata dell’allattamento al seno e dalla colonizzazione

persistente da parte dell’LF19, (Fig.11).

Dopo la terza dose non vi era influenza da parte dell’assunzione di probiotici o della durata

dell’allattamento al seno sulle concentrazioni degli anticorpi specifici IgG verso alcuno degli

antigeni. Tutti i neonati hanno raggiunto concentrazioni di anticorpi specifici IgG verso la tossina

difterica e tetanica superiori a 1.0 UI, considerato indice di protezione a lungo termine verso la

difterite ed il tetano. Tutti i neonati hanno raggiunto concentrazioni di anticorpi anti-HibPS al di

sopra dei livelli di protezione 0.15 μg/ml quando l’immunizzazione risultava completata, e tutti i

neonati hanno raggiunto concentrazioni superiori a 1.0 μg/ml, considerato il valore soglia per una

protezione a lungo termine, eccetto uno nel gruppo probiotico e due nel gruppo placebo

rispettivamente.

Figura 11. Gli effetti dell’LF19 sulla risposta di anticorpi specifici IgG veniva modulata dalla durata

dell’allattamento al seno e dalla persistente colonizzazione da parte dell’LF19 durante

l’integrazione.

Riassumendo, i neonati che hanno ricevuto LF19 non hanno presentato un minor numero di

infezioni. La durata della terapia antibiotica risultava lievemente inferiore in termini di giorni nel

gruppo probiotico. Tuttavia, la colonizzazione persistente da parte di LF19 ha aumentato la capacità

di innescare le risposte immunitarie verso antigeni proteici durante il periodo delle vaccinazioni con

effetti più marcati nei neonati allattati al seno per un periodo inferiore ai 6 mesi. Al contrario, le

concentrazioni degli anticorpi anti-HibPS sono state fortemente influenzate dalla durata

dell’allattamento al seno , senza alcun effetto da parte dell’LF19.

Maturazione della funzione delle cellule T nei neonati e gli effetti su di essa

dell’assunzione di probiotici durante lo svezzamento (Protocollo III)

Abbiamo studiato il processo di maturazione dell’attività delle cellule T in base all’età ed abbiamo

valutato se l’assunzione di LF19 durante lo svezzamento potesse avere alcun impatto su di essa.

Abbiamo valutato i livelli di espressione dell’mRNA di IL2, IL10, IL4 ed IFN-γ sulle PBMC

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soggette all’attivazione policlonale o specifica delle cellule T. La funzione delle cellule T è stata

valutata come la capacità delle PBMC di rispondere agli attivatori policlonali delle cellule T mAb

anti-CD3 associati all’mAb anti-CD28 in vitro, usando l’IL2 come marcatore dell’attivazione

generale delle cellule T, IL4 come marcatore Th2, IFN-γ come marcatore Th1 e l’IL10 come

marcatore per l’attività delle cellule T regolatorie. L’analisi è stata eseguita a 5½ e 13 mesi di vita,

ossia dopo 1½ e 9 mesi di assunzione del probiotico. La funzione delle cellule T nell’immunità

adattativa è stata monitorizzata seguendo l’espressione di IL2, IL4, IL10 e IFN-γ dopo l’esposizione

in vitro delle PBMC con l’antigene T-dipendente della tossina tetanica (TT), che risulta anche

essere un componente della combinazione di vaccini pentavalente (vaccini per la tossina difterica e

tetanica, la pertosse acellulare, la polio e l’Hib-coniugato) che veniva somministrata ai neonati a 3,

5½ e 12 mesi di vita.

In seguito all’attivazione policlonale delle cellule T, i neonati di entrambi i gruppi esprimevano

livelli di IL2 maggiori rispetto alle altre citochine, sia a 5½ che a 13 mesi di vita, seguiti dall’ IFNγ,

mentre l’espressione di IL4 ed IL10 risultava bassa (Tabella 2 e dati non mostrati). L’espressione

di IL2 nel gruppo placebo risultava aumentata a 13 mesi rispetto a 5½ mesi (p=0.005), mentre nel

gruppo probiotico i livelli risultavano paragonabili (dati non mostrati). I neonati in entrambi i

gruppi presentavano una maggiore capacità di esprimere sia l’mRNA dell’IFN-γ che dell’IL4 dai

5½ ai 13 mesi, (p


contrario, i livelli di mRNA dell’ IL10 rimanevano bassi, senza alcuna differenza tra i due

campionamenti (dati non mostrati).

A 13 mesi di età, dopo 9 mesi di assunzione di probiotico, abbiamo osservato differenze tra i gruppi

nella risposta all’attivazione policlonale. L’espressione di IL2 e’ risultata maggiore nel gruppo

placebo, con una mediana (25-75 mo percentile) di 175 (94-290) copie di mRNA/18S rRNA U

rispetto a 117 (57-242) nel gruppo probiotico, (p=0.02). A quella età, l’espressione mediana di IFNγ

risultava maggiore nel gruppo probiotico, 40 (12-85) copie di mRNA/18S rRNA U rispetto a 26

(12-104) copie di mRNA/18S rRNA U, sebbene la differenza non risultasse statisticamente

significativa.

Non esistevano differenze tra i gruppi in risposta all’esposizione in vitro di TT. Poiché la

somministrazione di LF19 in questa popolazione di studio ha determinato un incremento della

capacità di generare risposte immunitarie IgG specifiche verso la tossina difterica nel corso delle

vaccinazioni, con un’analoga tendenza per la TT, abbiano analizzato la correlazione tra le

concentrazioni sieriche delle IgG specifiche per la TT e la risposta all’esposizione in vitro alla TT.

A 13 mesi di età, ossia 4 settimane dopo la terza dose, le concentrazioni degli anticorpi specifici per

TT correlavano con l’espressione di IL2 e IFN-γ dopo l’aggiunta di TT in vitro, (rs=0.31 e 0.26,

p


Nei neonati ad alto rischio, ossia neonati con almeno un parente di primo grado allergico,

l’incidenza cumulativa di eczema era pari a 6/55 [(11%) (2-19%, 95% CI)] nel gruppo probiotico,

rispetto a 14/53 [(26%) (14-39%, 95% CI)] nel gruppo placebo (p=0.038). L’asma è stato

diagnosticato da un medico in 2/84 neonati, (2%) ed in 5/87 neonati, (6%) nel gruppo probiotico e

nel gruppo placebo, rispettivamente (p=0.4). Le cifre corrispondenti nei neonati ad alto rischio

erano 2/55, 4% e 5/53, 9%, rispettivamente, (p=0.3). Tutti i neonati in cui è stato diagnosticato

l’asma avevano una storia familiare di allergie, (Fig. 12). In un neonato nel gruppo probiotico e’

stata diagnosticata una rino-congiuntivite allergica da un medico.

A 13 mesi di età il rapporto tra l’mRNA IFN-γ/IL4 risultava maggiore nel gruppo probiotico con

una mediana (25-75 mo percentile) di 26 (12-71) rispetto a 16 (6-48) nel gruppo placebo (p=0.040).

Anche nei neonati ad alto rischio, questo rapporto risultava maggiore a 13 mesi nel gruppo LF19

anche se questa differenza non raggiungeva una significatività statistica, (dati non mostrati). A 13

mesi di età, sono stati analizzati i livelli di IgE totali e di IgE specifiche verso il latte di mucca, la

chiara dell’uovo, il pelo del gatto e del cane. Anche se persisteva un effetto di LF19 sull’equilibrio

immunitario Th1/Th2, non vi era alcun effetto di LF19 sulla frequenza della sensibilizzazione.

Riassumendo, l’assunzione di LF19 durante lo svezzamento ha ridotto l’incidenza cumulativa di

eczema durante l’infanzia, e noi suggeriamo che il meccanismo potrebbe essere mediato, almeno in

parte, da un più elevato rapporto Th1/Th2 nei neonati che ricevono LF19.

DISCUSSIONE GENERALE

La composizione iniziale della flora batterica intestinale, associata ai periodi critici per la sua

formazione, rappresentati dal periodo postnatale e dallo svezzamento, sembra avere un ruolo sullo

sviluppo del sistema immunitario, sia a livello intestinale che a livello sistemico. Nel presente

studio, abbiamo cercato di mantenere alcuni dei benefici esercitati dall’allattamento al seno sulla

composizione della flora batterica intestinale, con possibili effetti sulla funzione della flora batterica

intestinale, sull’immunità adattativa, sull’equilibrio immunitario Th1/Th2 e sullo sviluppo di

allergia.

Gli effetti dei probiotici sull’omeostasi della flora batterica intestinale

Dose, compliance e tempo

Durante lo svezzamento, cessano gli effetti immunologici diretti esercitati dall’allattamento al seno,

ossia l’apporto di sIgA, e gli effetti stimolanti del latte materno sulla colonizzazione da parte di

bifidobatteri e lattobacilli. Il razionale della somministrazione dell’LF19 durante il periodo di

introduzione di alimenti complementari rappresentava un tentativo per mantenere la presenza dei

lattobacilli durante un periodo di cambiamenti in cui vi è un’aumentata esposizione ad antigeni

provenienti sia da una flora batterica più varia e sia da sostanze alimentari, con possibili effetti sulla

funzione della flora batterica intestinale e forse sulla formazione delle risposte immunitarie.

Abbiamo ipotizzato che l’assunzione del probiotico LF19 durante questo periodo potesse favorire la

stimolazione dell’attività della flora batterica intestinale e del sistema immunitario in via di

maturazione.

E’ stato scelto l’LF19 perché rispondeva a tutti i criteri del probiotico, ed in precedenti trials dosi

comprese tra 10 8 -10 10 UFC/giorno erano già state somministrate nell’alimentazione di soggetti

umani senza effetti collaterali (111, 113). All’inizio dello studio, non si conosceva la dose minima

necessaria per assicurare la colonizzazione da parte dei batteri probiotici, incluso l’LF19. Il presente

studio è stato condotto su neonati dai 4 mesi di età, mentre precedentemente erano stati studiati

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ambini di almeno un anno; questo ci ha spinto a scegliere una dose minima giornaliera di 10 8 UFC

per motivi di sicurezza. Più recentemente, uno studio disegnato per valutare la correlazione doserisposta

sulla colonizzazione dell’intestino in neonati alimentati con latte in polvere contenente

LGG alla dose di 10 8 , 10 9 , o 10 10 UFC/giorno, ha riportato una valida colonizzazione temporanea a

tutti i dosaggi (117). Diversi ceppi di probiotici differiscono per la capacità di colonizzare in

maniera temporanea l’intestino, motivo per cui questi risultati non possono essere estesi anche

all’LF19. Tuttavia, e’ stato dimostrato che la somministrazione di capsule di gelatina contenenti

LF19 alla dose di 10 10 UFC/giorno a soggetti sani, completamente svezzati dell’età di 1 anno e’

seguita dal ritrovamento fecale di LF19 alla dose mediana di circa log10 6 UFC/grammi di feci dopo

3 settimane di assunzione (113). Questo valore equivale a quello a 6½ e a 9 mesi nel gruppo

probiotico del seguente studio, utilizzando la dose minima giornaliera di 10 8 UFC. Tuttavia, a 13

mesi di età, la somministrazione di LF19, alla dose di 10 8 UFC/giorno, e’ stata seguita dal

ritrovamento fecale di LF19 di un log10 più basso rispetto alla dose di 10 10 UFC/giorno in bambini

di età simile nello studio condotto da Sullivan e colleghi (113). La minor presenza di LF19 a 13

mesi di età coincide con una ridotta frequenza di colonizzazione da parte dell’LF19, riflettendo

forse la formazione di una più diversificata flora batterica o lo sviluppo di resistenza alla

colonizzazione da parte dell’ospite. In questo studio non è stata valutata alcuna relazione doserisposta.

Quindi, non vi è la certezza che una maggiore dose di LF19 possa esercitare effetti

maggiori sulla funzione della flora batterica intestinale e sui markers immunologici ma è un dato

che non può essere escluso.

La compliance è risultata alta. L’assunzione raccomandata era di almeno una porzione di cereali al

giorno, e l’assunzione mediana è stata pari a 0.7 porzioni al giorno, senza differenze tra i gruppi.

Tuttavia, c’è stata una variazione circa l’assunzione di cereali tra i neonati durante il periodo di

integrazione durato nove mesi. Ovviamente, questa variazione è stata influenzata dalle differenze

riguardo l’assunzione giornaliera, ma anche dai periodi di ridotta assunzione di cereali da parte di

alcuni neonati per la mancanza di appetito, l’insorgenza di infezioni ecc. Inoltre, 9 neonati, 6 nel

gruppo probiotico e 3 nel gruppo placebo, rispettivamente, hanno avuto una diagnosi di CMA ed

hanno dovuto interrompere l’assunzione di cereali che contenevano proteine derivate dal latte di

mucca. Questo ha determinato una variazione della dose di LF19 assunto tra i neonati. Il consumo

medio quotidiano di cereali nel gruppo probiotico correlava moderatamente con l’isolamento

dell’LF19 in tutti i campionamenti, ed abbiamo deciso di aggiustare le analisi statistiche per la

colonizzazione persistente di LF19 durante lo studio come misura per colmare, almeno in parte, le

differenze circa la dose di LF19 assunta. Riconosciamo che i fattori propri dell’ospite in grado di

modificare la colonizzazione (12, 118) e la possibilità di ottenere colture falsamente negative, sono

aspetti che uniti all’assunzione di cereali (dose e regolarità), potrebbero avere influenzato la

colonizzazione persistente da parte dell’LF19 durante lo studio.

Colonizzazione con i lattobacilli

L’integrazione ha avuto successo in termini di mantenimento di un’alta conta fecale di lattobacilli

nel gruppo probiotico durante lo studio. Abbiamo osservato che l’intervallo tra i due gruppi si

ampliava sia in termini di quantità di lattobacilli coltivabili sia in termini di frequenza di campioni

fecali contenenti lattobacilli coltivabili. L’LF19 è stato isolato nel 71% dei neonati nel gruppo

probiotico a 13 mesi. I lattobacilli sono stati isolati nelle feci nell’87% dei neonati nel gruppo

probiotico rispetto al 46% nel gruppo placebo alla stessa età. A confronto, i lattobacilli erano stati

isolati nelle feci del 17% dei casi a 12 mesi di età nello studio AllergyFlora (119). Questo ultimo

studio aveva dimostrato una scarsa frequenza di lattobacilli nelle feci durante il primo anno di vita,

che raggiungeva i valori minimi a 12 mesi di età, con un ulteriore rialzo a 18 mesi di vita

presumibilmente per via dell’aumentato consumo di alimenti fermentati. In accordo con i risultati

dello studio AllergyFlora, nel nostro studio la condizione di allattamento al seno al momento del

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campionamento fecale a 6½ mesi nel gruppo placebo era associata ad un aumentata frequenza di

riscontro fecale di lattobacilli coltivabili, suggerendo un effetto stimolatore da parte del latte

materno. La condizione di allattamento al seno oltre i 6 mesi era inoltre associata ad una maggiore

frequenza di colonizzazione da parte dei lattobacilli e dei bifidobatteri in un altro studio (34). E’

stato suggerito che il latte materno potesse anche fornire questi batteri (10, 11). Tuttavia, l’aggiunta

del probiotico LF19 nell’alimentazione in corso di svezzamento manteneva la presenza dei

lattobacilli nelle feci sia nei neonati allattati al seno che nei neonati svezzati.

Scarseggiano dati recenti riguardo i cambiamenti dei microrganismi predominanti nell’intestino

durante il periodo di introduzione degli alimenti complementari negli esseri umani. Amarri e

colleghi hanno studiato gli effetti dell’assunzione degli alimenti complementari sulla composizione

della flora batterica intestinale dai 4 ai 9 mesi di vita nei neonati sani. Veniva raccomandata

un’alimentazione basata esclusivamente sul latte materno fino all’età di 4 mesi mentre

l’alimentazione complementare veniva iniziata a giudizio proprio dei genitori. La frequenza dei

neonati che venivano esclusivamente allattati con latte materno risultava alta, 73%, fino al 7° mese,

per poi ridursi al 36% alla fine dei 9 mesi. Gli autori hanno riscontrato una predominanza da parte

dei bifidobatteri in questi neonati che venivano esclusivamente allattati al seno prima che

iniziassero l’assunzione di alimenti complementari, ed i neonati allattati mantenevano un’alta conta

di bifidobatteri. Il numero degli enterobatteri e degli enterococchi aumentava con l’età.

I lattobacilli aumentavano e quindi diminuivano nel corso dello studio (120), dato che correla con

altri studi che hanno riportato forme di colonizzazione transitorie da parte dei lattobacilli dalla

nascita fino allo svezzamento (1, 2). Anche se i lattobacilli vengono considerati colonizzatori

transitori, è stato proposto che la somministrazione di probiotici nella prima infanzia possa indurre

una colonizzazione permanente dell’intestino. Tuttavia, 6 mesi dopo la cessazione dell’assunzione

perinatale di LGG, non si è osservato alcuna colonizzazione permanente da parte del ceppo nelle

feci del neonato (121). In accordo con questi dati, assumere latte in polvere con aggiunti LGG e B.

longum non determina una colonizzazione permanente, da parte di nessuno dei due ceppi (122). Nel

presente studio, non abbiamo monitorizzato la presenza di LF19 nelle feci dopo il termine

dell’assunzione.

Trials clinici hanno dimostrato gli effetti dell’assunzione di probiotici sulla composizione della flora

batterica intestinale. La somministrazione di latte in polvere arricchito con B. lactis a neonati

prematuri determinava un aumento del numero dei bifidobatteri e riduceva il numero degli

enterobatteri e dei clostridi rispetto al placebo (123). I neonati sensibilizzati svezzati con latte in

polvere molto idrolizzato arricchito con B. lactis presentavano un numero di E. coli e Bacteroides

inferiore rispetto ai neonati svezzati con lo stesso latte in polvere privo di ogni aggiunta (124). La

somministrazione di LGG o placebo alle madri prima del parto e poi ai neonati fino ai 6 mesi di età

ha dimostrato la presenza di una minore quantità di clostridi nel gruppo placebo a 6 mesi, ma a 2

anni di età vi era un minor numero di lattobacilli/enterococchi e clostridi nel gruppo probiotico

rispetto al gruppo placebo (125). La somministrazione di LAVRI-A1 ai neonati per 6 mesi

determinava un maggior tasso di colonizzazione da parte dei lattobacilli, con la tendenza ad una

minor frequenza di colonizzazione da parte dei coliformi ed una maggior frequenza di

colonizzazione da parte dei bifidobatteri (108). Al contrario, somministrare latte in polvere

arricchito con LGG e B. longum a neonati per 6 mesi dopo la nascita non alterava la composizione

generale della flora batterica intestinale (122). Anche se in maniera non inequivocabile, esistono

dati che supportano gli affetti dell’integrazione con probiotici durante l’infanzia non solo attraverso

l’aumento della carica e della frequenza del batterio probiotico ingerito, ma anche sulla

composizione generale della flora batterica intestinale.

27


Nel presente studio, la colonizzazione persistente da parte dell’LF19 ha indotto cambiamenti nella

composizione fecale degli SCFA, ossia differenze funzionali della flora intestinale. In accordo con i

nostri risultati, i bambini antroposofici molto giovani hanno mostrato dei cambiamenti nella

composizione di numerosi SCFA, con una maggiore proporzione di acido acetico ed una minore

proporzione di acido propionico, iso-butirrico, iso-valerico e valerico nelle feci rispetto ai bambini

che conducevano uno stile di vita tradizionale (126). I cambiamenti che abbiamo osservato nel

gruppo probiotico sono simili ai cambiamenti osservati nei bambini antroposofici giovani. Le

persone con uno stile di vita antroposofico presentano un’assunzione elevata e regolare di alimenti

prodotti organicamente e fermentati, e fanno un uso limitato di antibiotici e di vaccini. Nel presente

studio, non sono state osservate differenze tra i fattori riguardanti lo stile di vita ossia la presenza di

fratelli maggiori, l’esposizione ad animali domestici con il pelo, la durata dell’allattamento al seno e

le vaccinazioni. Tutti i neonati che hanno partecipato a questo studio sono stati vaccinati secondo il

protocollo nazionale di vaccinazione. I neonati del gruppo probiotico avevano fatto un uso

lievemente ridotto di antibiotici rispetto ai neonati del gruppo placebo, fattore che potrebbe aver

influito sulla composizione della flora batterica intestinale e, quindi, sulla sua funzione. Tuttavia, le

differenze circa la composizione fecale degli SCFA persistevano dopo aver aggiustato per l’uso di

antibiotici. La maggior parte dei neonati erano stati trattati con penicillina V, che non dovrebbe

influenzare la composizione della flora batterica intestinale come altri antibiotici a largo spettro.

Quindi, i cambiamenti osservati nella composizione fecale degli SCFA nel gruppo probiotico

sembrano essere stati indotti dalla somministrazione del probiotico. Attualmente, i bambini

secolarizzati che seguono uno stile di vita antroposofico presentano un numero inferiore di

manifestazioni allergiche e pochi risultano essere sensibilizzati rispetto ai bambini che conducono

uno stile di vita tradizionale (127). Non è chiaro se i cambiamenti indotti sull’attività della flora

batterica intestinale nel gruppo probiotico possano avere effetti sullo sviluppo successivo di allergie

e sulla sensibilizzazione.

Il prodotto finale principale del processo di fermentazione del glucosio da parte dei lattobacilli è

l’acido lattico, e riteniamo che l’aumento della quota di acido acetico nel gruppo probiotico sia

dovuta ad un incremento del numero di bifidobatteri che tra le altre specie sono in grado di

metabolizzare i carboidrati in acido acetico (12). L’ingestione di altri ceppi probiotici determina un

aumento del numero dei bifidobatteri (108). Quindi, ipotizziamo che la somministrazione di LF19

possa aver creato un ambiente intestinale in grado di favorire la permanenza dei bifidobatteri. Ci si

potrebbe aspettare che l’aggiunta di batteri probiotici ossia ceppi specifici di lattobacilli possano

competere per lo spazio ed i nutrienti con altri lattobacilli presenti nella loro nicchia ecologica.

Tuttavia, la somministrazione di LF19 negli anziani determina un aumento transitorio di lattobacilli

diversi dall’LF19 (113). Inoltre, la somministrazione di un probiotico, ossia LF19, potrebbe aver

creato un ambiente intestinale in grado di favorire la crescita di altri lattobacilli.

La produzione di SCFA è una caratteristica di numerosi batteri. Tuttavia, l’acido iso-caproico si

pensa indichi specificamente la presenza del C. difficile (128). Il C. difficile è stato associato in

passato allo sviluppo di allergia. Anche se precedentemente è stato dimostrato che l’LF19 riduce il

numero dei clostridi in un Simulatore dell’Ecosistema Microbico dell’Intestino Umano (SHIME) in

un modello in vitro (129), non abbiamo osservato effetti sulle concentrazioni o sulle proporzioni

dell’acido iso-caproico da parte dell’LF19. Tuttavia, i neonati con livelli valutabili di acido isocaproico

in tutti i campionamenti che potessero essere inclusi per un confronto statistico erano

pochi. Quindi, il potere di valutare le differenze tra i gruppi risultava scarso.

Il numero dei clostridi è risultato maggiore nei bambini con IgE specifiche per allergeni alimentari

o inalanti (130). Nel presente studio, si è osservato una tendenza verso una maggiore prevalenza di

acido iso-caproico nelle feci di neonati che avevano manifestato eczema durante l’integrazione,

suggerendo una relazione tra la presenza iniziale del C. difficile e lo sviluppo di eczema. Questi

28


isultati sono in accordo con i dati di uno studio di coorte prospettivo condotto su neonati, secondo

il quale i neonati allergici hanno un’alterata composizione di SCFA con maggiori concentrazioni di

acido iso-caproico rispetto ai neonati non allergici (131). Inoltre, due grandi studi prospettivi di

coorte condotti sui neonati sono giunti a differenti conclusioni circa l’associazione tra i clostridi e lo

sviluppo di allergia. La colonizzazione da parte del C. difficile ad 1 mese di età è risultata essere

associata allo sviluppo di allergia a 2 anni in uno degli studi (76), mentre non è stata riscontrata

alcuna associazione nell’altro (2).

E’ stato suggerito che la diversità della flora sia importante ai fini della maturazione dei meccanismi

di regolazione immunitaria. I neonati che vivono nei paesi in via di sviluppo ove vi è una bassa

prevalenza di allergie hanno un ricambio più rapido dei ceppi batterici rispetto ai neonati che

vivono nei paesi industrializzati (5). I bambini che conducono uno stile di vita antroposofico hanno

una maggiore diversità della flora batterica intestinale (132), e nello studio AllergyFlora era stata

riscontrata una ridotta diversità nella flora fecale ad 1 settimana di vita nei neonati che

successivamente hanno sviluppato un eczema IgE-associato (133). Per tale motivo, è necessaria una

conoscenza più approfondita circa i cambiamenti indotti dai prebiotici e dai probiotici sulla

composizione della flora batterica intestinale.

Effetti dei probiotici sull’immunità adattativa

Effetti sulle infezioni

Non si è verificato alcun effetto da parte di LF19 sul numero di infezioni contratte, forse per via

della lunga durata dell’allattamento al seno e dello scarso numero di infezioni contratte durante il

primo anno di vita in questi neonati sani svedesi. In un trial randomizzato condotto in Israele, il L.

reuteri ed il B. lactis hanno ridotto la durata in termini di giorni ed il numero degli episodi di diarrea

in neonati con un’età simile a quella del presente trial (134). In quello studio, il L. reuteri ha inoltre

ridotto i giorni di assenza per ospedalizzazione e la durata della terapia antibiotica. Nessun

probiotico agisce sulle malattie respiratorie. Tuttavia, tutti i neonati sono stati svezzati dal latte

materno all’ingresso al trial che è stato condotto in un ambiente ospedaliero, al contrario del

presente trial dove la maggior parte dei neonati venivano allattati al seno e curati a casa. A

differenza dei risultati dello studio in Israele, Abrahamsson e colleghi non hanno osservato alcun

effetto preventivo sulle infezioni dopo somministrazione di L. reuteri ai neonati sani svedesi

rispetto al placebo (107). Inoltre, in un trial randomizzato finlandese condotto su larga scala su

bambini in attesa di ricovero, l’assunzione di LGG riduceva l’incidenza delle infezioni respiratorie e

la durata della terapia antibiotica rispetto al placebo, sebbene aggiustando per l’età non sussistevano

più le differenze (135). La somministrazione di LF19 lentamente riduceva la durata della terapia

antibiotica in termini di giorni,, fattore che poteva suggerire un effetto preventivo da parte

dell’LF19 sulle infezioni batteriche. Contrariamente ai risultati osservati nel nostro studio e negli

studi condotti in Finlandia ed in Israele riguardo gli effetti preventivi da parte dei probiotici sulla

durata della terapia antibiotica, Abrahamsson e colleghi quasi inaspettatamente hanno osservato un

lento incremento nella durata della durata della terapia antibiotica nel gruppo sottoposto ad

integrazione con L. reuteri (107). In molti neonati di quello studio gli antibiotici erano stati

prescritti a causa di un’otite media. E’ stato dimostrato che l’allattamento al seno ha un effetto

protettivo verso l’otite media (136). Di conseguenza, l’elevata percentuale di allattamento al seno

presente in entrambi i gruppi di quello studio potrebbe aver protetto i neonati in entrambi i gruppi.

Infatti, vi era la tendenza a prolungare la durata dell’allattamento materno nel gruppo placebo

rispetto al gruppo probiotico (107). E’ da sottolineare che la differenza circa la durata in termini di

giorni della terapia antibiotica tra i due gruppi nel presente studio è piuttosto piccola, e che nello

studio finlandese l’aggiustamento per età aveva annullato la differenza circa la durata della terapia

antibiotica tra i gruppi. Quindi, l’effetto più evidente sulla prevenzione dell’infezione batterica da

parte dei probiotici (L. reuteri) è stata osservata nei neonati non allattati al seno in Israele.

29


Anche se le meta-analisi dimostrano un effetto moderato dei probiotici sulla riduzione della durata

delle gastroenteriti virali (94, 95), esistono studi condotti su neonati e bambini che mostrano che

non vi è alcun effetto preventivo svolto dall’assunzione dei probiotici sulle gastroenteriti virali. In

uno di questi, l’LGG non è stato in grado di prevenire l’infezione nosocomiale da rotavirus, mentre

il latte materno si è dimostrato protettivo (137). In uno studio svolto per valutare gli effetti

dell’LGG nei bambini peruviani malnutriti, l’incidenza della diarrea veniva ridotta nel gruppo

probiotico rispetto al gruppo placebo, ma solamente nei neonati non allattati al seno e nei bambini.

Gli autori suggeriscono che anche se i probiotici stimolano alcuni degli effetti del latte materno,

l’effetto del latte materno sulla flora batterica intestinale è superiore rispetto a quello dei probiotici

(138). Riassumendo, i probiotici potrebbero prevenire in qualche misura le infezioni ma gli effetti

appaiono più pronunciati nelle aree con un alto tasso di esposizione alle infezioni, nei neonati non

allattati al seno e nei bambini. I nostri dati supportano questa idea. Tuttavia, tutti gli studi

sopramenzionati sono relativamente piccoli, eccetto uno. Sono pertanto necessari ulteriori trials

controllati randomizzati su larga scala sia nei paesi industrializzati che in quelli in via di sviluppo.

Effetti sulle risposte degli anticorpi specifici vero i comuni vaccini

Sono stati studiati gli effetti dei probiotici sulle risposte antigene specifiche ai vaccini orali.

L’assunzione di LGG determina, nei neonati, l’aumento della secrezione di IgA in seguito alla

vaccinazione orale verso i rotavirus (139), e tende ad aumentare la secrezione di IgA specifiche

negli adulti sani in seguito al vaccino orale per la Salmonella typhii (140).

Le risposte degli anticorpi specifici IgG dipendono dall’interazione funzionale tra le cellule

presentanti l’antigene, le cellule T helper specifiche per l’antigene, la comunicazione intercellulare

mediata dalle citochine e la differenziazione delle cellule B antigene-specifiche in plasma-cellule in

grado di produrre anticorpi. Quindi, la valutazione della risposta anticorpale IgG specifica è un utile

indice per valutare le risposte dell’immunità adattativa. Abbiamo dimostrato che l’assunzione di

LF19 determina un aumento della risposta degli anticorpi specifici IgG verso la tossina difterica

durante il periodo della vaccinazione con un effetto maggiore nei neonati allattati al seno per meno

di 6 mesi, e ha un simile comportamento in risposta alla TT. Abbiamo osservato una correlazione

tra le concentrazioni degli anticorpi IgG specifici per TT e l’espressione di IL4 ed IFN-γ dopo

l’aggiunta di TT in vitro nel gruppo probiotico, mentre non vi è alcuna correlazione tra le

concentrazioni di anticorpi specifici per TT e IL4 ed esiste una debole correlazione con IFN-γ nel

gruppo placebo. Le carenze funzionali delle cellule T durante l’infanzia si manifestano con una

ridotta capacità di produrre diverse citochine, in particolare IFN-γ (141), con conseguente riduzione

delle funzioni CTL e della capacità di offrire un adeguato aiuto da parte delle cellule B per una

produzione efficace di anticorpi (142). Inoltre, è stato dimostrato che i monociti neonatali hanno

una risposta notevolmente inferiore verso i ligandi di numerosi TRL, inclusi i lipopeptidi batterici e

l’LPS, con un minor rilascio di TNF-α (143). Esistono dei dati che dimostrano che l’immaturità

delle cellule DC durante l’infanzia limita la capacità di esprimere cellule T di memoria vaccinospecifiche

dal momento che l’integrazione delle DC aumenta la reattività TT-specifica nei neonati

di 12 mesi (144). E’ stato dimostrato che i probiotici svolgono un ruolo sulle funzioni delle cellule

APC. I probiotici potenziano la funzione delle cellule DC nell’intestino umano di un adulto (145), e

la maturazione dei monociti nei cuccioli di animale (146). Quindi, riteniamo che l’LF19 possa aver

guidato il processo di maturazione delle cellule APC, con conseguenti effetti sulle cellule Th che si

riflettono su una maggiore capacità di innescare risposte immunitarie verso antigeni proteici durante

il corso delle vaccinazioni associata ad un rafforzamento delle correlazioni tra le risposte delle

cellule B e T TT-specifiche al termine dell’immunizzazione primaria. A confronto, uno studio ha

valutato gli effetti dell’integrazione con i probiotici sulle risposte delle cellule T TT-specifiche nei

30


neonati. Si è riscontrata una più scarsa risposta di IL10 verso TT nel gruppo probiotico, ma non vi

era alcuna differenza circa le risposte di IL4 ed IFN-γ tra i gruppi (147).

L’LF19 non ha avuto alcun effetto sulle concentrazioni degli anti-HibPS o sul numero di neonati

che raggiungevano le concentrazioni protettive di anti-HibPS. Questo dato è in contrasto con i

risultati di Kukkonen e colleghi, che hanno dimostrato che la somministrazione perinatale di un mix

di 4 ceppi probiotici e prebiotici GOS determinava un aumento della frequenza dei neonati che

raggiungevano le concentrazioni protettive di anti-HibPS dopo l’immunizzazione primaria rispetto

al placebo. In questo studio abbastanza piccolo, gli autori non hanno riportato alcuna differenza tra i

gruppi circa le concentrazioni di IgG specifiche verso HibPS o verso la tossina difterica o la tossina

tetanica (148). L’inconsistenza dei risultati potrebbe essere dovuta all’uso di differenti ceppi

probiotici aventi una diversa capacità immuno-stimolatoria, oppure potrebbe essere attribuita alle

differenze presenti in natura ed alla dose di antigeni, all’età del neonato ed ai livelli di anticorpi

materni (149).

Gli effetti dei probiotici nella prevenzione dell’ allergia

La prevenzione dell’eczema e delle allergie respiratorie

Abbiamo osservato una riduzione dell’incidenza cumulativa di eczema a 13 mesi nel gruppo

probiotico. In confronto, 3 trials randomizzati controllati con placebo hanno dimostrato effetti

preventivi della somministrazione perinatale di probiotici sull’eczema, che includeva anche o solo

l’eczema IgE-associato (105-107). Nel primo studio LGG è stato somministrato alle madri prima

del parto e successivamente alle madri o ai loro neonati fino ai 6 mesi di vita (106). L’incidenza

cumulativa di eczema è stata ridotta del 50% nel gruppo probiotico e l’effetto preventivo dell’LGG

sull’eczema si estendeva dai 4 ed ai 7 anni di vita (150, 151). Tuttavia, non vi era alcun effetto

dell’LGG sulla sensibilizzazione, ed è stato suggerito un meccanismo IgE-indipendente. In un altro

studio, la somministrazione di L. reuteri alle madri prima del parto ed ai neonati fino ai 12 mesi di

vita è risultato in grado di prevenire l’eczema IgE-associato, ma non l’eczema (107). Ancora, in uno

studio con un ampio campione, la somministrazione di quattro ceppi probiotici alle madri prima del

parto, e la somministrazione dello stesso mix di probiotici uniti al GOS ai loro neonati fino ai 6

mesi di vita era in grado di prevenire sia l’eczema che l’eczema IgE-associato (105). Al contrario,

l’assunzione di LAVRI-A1 dalla nascita fino ai 6 mesi non riduceva il rischio di sviluppare eczema

(108). Recentemente, uno studio con un disegno simile a quello di Kalliomäki e colleghi ha

dimostrato che non vi è alcun effetto preventivo dell’LGG sull’eczema o sulla sensibilizzazione

(109) (Tabella 3). Nessuno degli studi di prevenzione sopra-menzionati ha dimostrato un effetto

preventivo sulle allergie respiratorie.

Ad oggi, esistono solo pochi studi pubblicati sull’uso dei probiotici nella prevenzione dell’allergia,

e due meta-analisi giungono a diverse conclusioni riguardo le raccomandazioni sull’uso dei

probiotici nel trattamento e nella prevenzione dell’allergia (152, 153).

31


Tabella 3. Effetti dell’integrazione con i probiotici nella prevenzione dell’eczema nei trials

randomizzati controllati contro placebo

Popolazione Integrazione Risultato/outcome Primo autore

/anno

≥1 Parente di L. rhamnosus Eczema a 2 anni di età Kalliomäki et al,

primo grado allergico GG1x10 10 UFC/die nel 23% dei pazienti nel 2001

(77 madri) e placebo gruppo probiotico vs il 46%

(82 madri) 2-4 settimane dei pazienti nel gruppo

prima del parto e poi ai loro placebo*

neonati (o alle madri se

allattavano) fino al 6° mese

≥1 Parente di L. rhamnosus Eczema a 2 anni di età Kopp et al,

primo grado allergico GG5x10 9 UFC/die nel 28% dei pazienti nel 2008

due volte al giorno gruppo probiotico vs il 27%

(54 madri) e placebo dei pazienti nel gruppo

(51 madri) 4-6 settimane placebo, (ns)

prima del parto e poi ai loro

neonati fino al 6° mese

≥1 Parente di L. reuteri Eczema a 2 anni di età Abrahamsson

primo grado allergico 1x10 8 UFC/die nel 36% dei pazienti nel et al, 2007

(117 madri) e placebo gruppo probiotico vs il 34%

(115 madri) 4 settimane dei pazienti nel gruppo

prima del parto e poi ai loro placebo, (ns)

neonati fino al 12° mese Eczema IgE-associato

a 2 anni nell’8% dei pazienti

del gruppo probiotico vs

il 20% del gruppo placebo*

≥1 Parente MIX di probiotici Eczema a 2 anni di età Kukkonem

allergico (610 madri) nel 26% dei pazienti nel et al, 2007

e placebo (613 madri) gruppo probiotico vs il 32%

2-4 settimane prima dei pazienti nel gruppo

del parto e MIX+GOS o placebo*

placebo ai neonati fino Eczema IgE-associato

al 6° mese a 2 anni nel 12% dei pazienti

del gruppo probiotico vs

il 18% del gruppo placebo*

Madre allergica L. acidophilus (LAVRI-A1) Eczema a 1anno di età Taylor et al,

3x10 8 UFC/die (n=115) nel 26% dei pazienti nel 2007

e placebo (n=111) gruppo probiotico vs il 23%

dalla nascita fino al 6° mese dei pazienti nel gruppo

placebo, (ns)

Neonati sani L. paracasei ssp. ceppo Eczema a 13 mesi di vita Questo studio

paracasei F19 1x10 8 nell’11% dei pazienti nel

UFC/die (n=89) gruppo probiotico vs il 22%

e placebo (n=90) dei pazienti nel gruppo

dal 4° fino al 13° mese placebo*

di vita

* La differenza è statisticamente significativa

32


La sensibilizzazione e l’allergia verso il latte di mucca

La programmazione immunitaria inizia nelle prime fasi della vita e nel corso degli anni sono stati

tentati numerosi approcci al fine di prevenire lo sviluppo dell’allergia e della sensibilizzazione delle

IgE. Le misure dietetiche utilizzate nella prevenzione dell’allergia hanno incluso l’eliminazione di

antigeni alimentari nel corso della gravidanza e dell’allattamento al seno senza alcuna evidenza di

una prevenzione a lungo termine dell’allergia (154). Studi condotti per valutare gli effetti

dell’allattamento al seno sulla prevenzione dell’allergia sono giunti a conclusioni discordanti, ed un

apparente aspetto negativo è rappresentato dalla mancanza di studi randomizzati per ragioni etiche

(155, 156). Una spiegazione dei risultati contrastanti circa il ruolo dell’allattamento al seno nella

prevenzione dell’allergia potrebbe essere dovuto al fatto che la composizione del latte materno varia

tra le donne (157). Ad oggi, l’opinione riguardo la prevenzione dell’allergia è passata

dall’allontanamento dell’allergene all’induzione della tollerabilità (158).

E’ stato osservato come alcuni ceppi batterici probiotici inducano la produzione di citochine Th1 o

regolatorie in vitro. In un modello murino, la somministrazione di L. casei ceppo Shirota determina

un aumento della produzione di citochine Th1 ed una riduzione delle citochine Th2, con

conseguente riduzione dei livelli di IgE (159). Studi condotti in vitro su esseri umani hanno

identificato batteri produttori di acido lattico in grado di indurre la produzione di IL10, che inibisce

le citochine Th2 (160).

Non abbiamo osservato alcun effetto sulla sensibilizzazione dopo assunzione di LF19. In

particolare, in entrambi i gruppi vi sono stati pochi neonati sensibilizzati poiché il potere statistico

per valutare le differenze risultava basso. Tuttavia, nessuno degli studi che aveva dimostrato gli

effetti preventivi dei probiotici sull’eczema e sull’eczema IgE-associato aveva riscontrato effetti

sulla sensibilizzazione (105-107), eccetto nelle analisi di un sottogruppo, (105, 107). A questa età, i

livelli degli anticorpi IgE totali e specifici si sovrappongono tra i bambini atopici e non atopici (161,

162), questo è il motivo per cui il follow-up in età successiva può mettere in luce gli effetti dei

probiotici sulla sensibilizzazione per se. Sono disponibili i dati provenienti da uno studio di follow

up sull’assunzione di LGG nella prevenzione dell’allergia. All’età di 4 e 7 anni, sono stati riportati

effetti sostanziosi da parte dell’assunzione di LGG sull’incidenza dell’eczema ma non è stato notato

alcun effetto sulla sensibilizzazione o sulle allergie respiratorie. Piuttosto, vi era la tendenza verso il

maggior tasso di sensibilizzazione ed allergie respiratorie nel gruppo probiotico rispetto al gruppo

placebo a queste età (150, 151). Uno degli studi di prevenzione ha addirittura riportato un tasso di

sensibilizzazione maggiore a 12 mesi nei neonati che ricevevano LAVRI-A1 rispetto al placebo

(108), sottolineando ulteriormente la necessità di un follow-up per i bambini più grandi. Nel

presente studio, l’incidenza di allergia al latte di mucca è stata in un certo senso superiore alle

aspettative, 5% verso i valori riportati del 2-3%. Una correlazione IgE (SPT positivo al momento

della diagnosi) è stata dimostrata in 5 neonati su 9. Di questi, 4 neonati erano stati nutriti con

probiotici ed 1 neonato con placebo. Tutti i neonati con CMA avevano sviluppato sintomi cutanei o

gastrointestinali subito dopo l’introduzione del cereale, che rappresentava il primo alimento dello

svezzamento a base di proteine del latte introdotto nella dieta del neonato, e tutti i neonati hanno

mostrato un miglioramento dopo l’eliminazione delle proteine derivate dal latte di mucca. Non

sembra possibile che la somministrazione di una così esigua dose di LF19 possa aver scatenato una

tale reazione verso le proteine derivate dal latte di mucca. In uno studio condotto per valutare gli

effetti dei probiotici sul trattamento del CMA e dell’eczema, l’eliminazione delle proteine derivate

dal latte di mucca in aggiunta all’assunzione di LGG aveva migliorato la severità dell’eczema e

dell’infiammazione intestinale (97). In uno studio più ampio, la somministrazione di LGG a

bambini molto piccoli con eczema IgE-associato e sospetta CMA aveva alleviato la severità

dell’eczema. In quello studio un mix di ceppi probiotici non aveva avuto alcun effetto sulla CMA al

contrario degli effetti benefici dell’LGG, ma il mix di probiotici non aveva neanche procurato alcun

effetto indesiderato dannoso (102).

33


La funzione di barriera intestinale

Abbiamo osservato una correlazione più forte tra gli acidi iso-butirrico ed iso-valerico nel gruppo

placebo rispetto al gruppo probiotico a 13 mesi di età. Inoltre, la concentrazione degli acidi isobutirrico

ed iso-valerico nei neonati con una colonizzazione persistente da parte di LF19 risultava

inferiore rispetto al gruppo placebo. Gli SCFA a catena ramificata, ossia le iso-forme, sono prodotti

metabolici che si ottengono dalla digestione parziale delle proteine e dei lipidi. Il follow-up di uno

studio di coorte condotto sui neonati ha dimostrato che la correlazione tra gli acidi iso-butirrico ed

iso-valerico era più forte nei bambini di 4 anni sensibilizzati rispetto ai bambini non sensibilizzati,

forse per via della maggiore desquamazione dell’epitelio intestinale nei bambini sensibilizzati (E

Norin, comunicazione personale). Nei bambini con la malattia celiaca, le concentrazioni degli acidi

iso-butirrico ed iso-valerico nelle feci erano maggiori rispetto ai bambini sani, suggerendo

un’alterata composizione della flora batterica intestinale nel piccolo intestino, un rapido passaggio

intestinale e/o una minore attività metabolica dovuta all’enteropatia del piccolo intestino, che fa sì

che un eccesso di nutrienti parzialmente digeriti raggiunga il colon (163).

Uno dei meccanismi proposto dei probiotici è rappresentato dalla stabilizzazione della barriera

intestinale. La somministrazione di LGG in ratti che allattavano aveva migliorato l’integrità della

mucosa intestinale (164). Gli individui allergici presentano un’aumentata permeabilità intestinale

(65, 66). In un piccolo studio l’eliminazione delle proteine derivate dal latte di mucca in aggiunta

all’assunzione di LGG aveva migliorato sia la severità dell’eczema che l’infiammazione intestinale,

che si rifletteva nei ridotti livelli di α1-antitripsina fecale e negli aumentati livelli di TGF-β (97). La

combinazione di L. reuteri e L. rhamnosus migliorava i sintomi gastrointestinali invertendo il

processo di incremento della permeabilità intestinale nei bambini con eczema (165).

Quindi, suggeriamo che la minore concentrazione degli acidi iso-butirrico ed iso-valerico, e la

minore correlazione tra questi iso-acidi nei neonati con colonizzazione persistente da parte

dell’LF19 durante l’integrazione rispetto al placebo, possa riflettere la presenza di una barriera

mucosa più integra ed una più completa digestione. Inoltre, proponiamo che l’effetto preventivo

dell’LF19 sull’eczema sia, in fondo, in parte dovuto ad un aumento dell’integrità della mucosa

intestinale. Se così fosse, i cambiamenti indotti nella composizione degli SCFA potrebbero influire

sulla successiva sensibilizzazione e è quindi necessario un approfondimento.

Effetti immuno-stimolatori

Le risposte immunitarie materne e fetali

E’ stato suggerito che la somministrazione di probiotici alla madre prima del parto possa

rappresentare il prerequisito per ottenere gli effetti preventivi sullo sviluppo di allergia e gli effetti

immuno-stimolatori (107, 166, 167). Questo dato lo si è evince dai risultati di tre studi che hanno

dimostrato come, la somministrazione dei probiotici prima del parto, potesse avere effetti preventivi

sull’eczema, che includeva anche o solo l’eczema IgE-associato (105-107), ed è in contrapposizione

con i risultati di uno studio in cui, somministrando i probiotici 48 ore dopo il parto, non è stato

osservato alcun effetto preventivo (108). In effetti, è stato dimostrato che l’assunzione di LGG da

parte delle madri in stato di gravidanza può influire sulla composizione delle specie di bifidobatteri

nei loro neonati, ma non sono stati riportati altri effetti in questo studio piuttosto piccolo (168). In

un altro studio, è stato dimostrato come l’LGG aumenti la produzione di IL10 ed IFN-γ in vitro, ma

non in vivo nelle PBMC delle madri sottoposte ad integrazione o nelle cellule mononucleate del

cordone ombelicale (CBMC) dei loro neonati (169). L’assunzione di prebiotici (GOS/FOS) da parte

delle madri in stato di gravidanza aumentava la carica dei bifidobatteri nell’intestino materno ma

34


non aveva alcun effetto diretto sul trasferimento di batteri tra la madre ed il neonato. Non vi era

un’indicazione sull’effetto dell’assunzione di prebiotici da parte della madre sui parametri

immunitari del neonato, valutati mediante la fenotipizzazione dei sottogruppi linfocitari e della

distribuzione delle citochine nelle CBMC (170). Marshan e colleghi hanno studiato gli effetti della

somministrazione di un MIX di ceppi probiotici alle madri prima del parto e quindi ai loro neonati

in combinazione con prebiotici fino al 6° mese di vita sulle risposte immunitarie fetali. In accordo

con i risultati di Kopp e colleghi, l’assunzione di probiotici da parte delle madri durante la

gravidanza non influenzava le risposte immunitarie delle CBMC (169, 171).

Il sistema immunitario del neonato è influenzato dall’immunità della madre, sia durante la

gestazione che durante il periodo di allattamento al seno. E’ stato dimostrato che i livelli delle IgE e

le risposte citochiniche correlano tra i neonati e le loro madri (172). In particolare, nello studio di

Abrahamsson e colleghi, la reattività ai prick test cutanei era meno frequente nei neonati di madri

allergiche nel gruppo probiotico (107). Sono stati anche studiati gli effetti dell’ingestione di

probiotici da parte delle madri in stato di gravidanza sulla composizione del latte materno. La

somministrazione di LGG alle madri durante l’allattamento determinava l’aumento dei livelli di

TGF-β2 nel latte maturo, anche se non vi era alcuna associazione con lo sviluppo di allergia o

sensibilizzazione da parte dei loro neonati (173). L’assunzione di L. reuteri da parte delle madri

prima del parto riduceva i livelli di TGF-β2 nel colostro, e questa riduzione era associata ad una

minore sensibilizzazione delle IgE nella prima infanzia (167). Questo potrebbe in parte essere

spiegato dagli effetti preventivi di L. reuteri nella prevenzione dell’eczema IgE-associato (107). E’

da notare, tuttavia, che i livelli di TGF-β2 nel latte materno maturo non erano associati alla

successiva sensibilizzazione. In quel caso, la somministrazione prenatale alle madri potrebbe essere

stata cruciale per la modulazione della composizione del latte colostro, con possibili effetti sulla

futura sensibilizzazione. Tuttavia, i dati a disposizione provengono da un numero limitato di studi e

sono necessari ulteriori studi per valutare gli effetti dell’assunzione prenatale di probiotici sulle

risposte immunitarie materne e fetali.

Le risposte immunitarie dei neonati

In contrapposizione alla carenza di dati circa gli effetti sulle risposte immunitarie fetali da parte

dell’integrazione con probiotici nel periodo prenatale, il presente studio dimostra che i probiotici

somministrati durante lo svezzamento sono in grado di modulare la funzione delle cellule T. Ad

oggi, non è ben chiaro quale sia il momento ideale in cui somministrare un supplemento di

probiotici nei neonati del genere umano. Tuttavia, è stato studiato il periodo in cui iniziare

l’assunzione dei probiotici in un modello murino. Sono stati studiati gli effetti sulla produzione

delle sIgA da parte dei cuccioli in seguito alla somministrazione di L. johnsooni NCC533 (La1) nei

topi durante la fase iniziale, intermedia e tardiva dello svezzamento. La somministrazione di La1

durante la fase intermedia dello svezzamento determinava un aumento della produzione delle sIgA

da parte dei cuccioli, mentre la somministrazione di La1 durante la fase iniziale dello svezzamento

aveva effetti negativi sulla produzione delle sIgA. La somministrazione di La1 durante la fase

tardiva dello svezzamento non aveva effetti sulla produzione delle sIgA. Gli autori suggeriscono

che durante la fase iniziale dello svezzamento, l’intestino dei cuccioli è ancora protetto dalle sIgA

materne, mentre durante la fase tardiva dello svezzamento è già stata indotta la produzione

endogena delle sIgA, proteggendo l’intestino del cucciolo dal contatto con La1. Quindi, la fase

intermedia dello svezzamento rappresentava un periodo cruciale per il contatto tra il probiotico e la

mucosa intestinale con conseguenti effetti immuno-stimolatori. Gli autori hanno quindi valutato la

somministrazione di La1 durante la fase intermedia dello svezzamento in un modello murino di

eczema, riscontrando effetti preventivi sullo sviluppo di lesioni eczematose associati ad un aumento

dei livelli fecali delle sIgA (174).

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Nel presente studio, l’attività delle cellule T aumentava in seguito all’attivazione policlonale in

entrambi i gruppi durante la seconda metà dell’infanzia, sebbene i livelli fossero ancora inferiori

rispetto ai livelli presenti negli adulti. I nostri dati supportano lo sviluppo di entrambe i tipi di

risposta immunitaria, Th1 e Th2, durante questo periodo. Gli effetti dell’LF19 sulla funzione delle

cellule T risultavano modesti ma misurabili. A 13 mesi di età l’espressione di IL2 risultava inferiore

nel gruppo probiotico rispetto al gruppo placebo, mentre l’espressione di IFN-γ risultava maggiore

nel gruppo probiotico. Le cellule Th näive producono IL2 in seguito all’attivazione, mentre la

risposta da parte delle cellule Th1 determina la produzione di IFN-γ (175). Riteniamo che

l’assunzione di LF19 abbia guidato le cellule T verso una risposta immunitaria di tipo Th1 in

seguito all’attivazione policlonale mentre i neonati nel gruppo placebo esprimono una risposta di

tipo Th0. IL4 ed IFN-γ sono dei regolatori (176), e quando si è analizzato il rapporto dell’mRNA

IFN-γ /IL4 per avere un’indicazione sul tipo di risposta immunitaria verso cui si propende, questo

rapporto è risultato maggiore nel gruppo probiotico dopo 9 mesi di assunzione dell’LF19. Anche se

la risposta delle cellule PBMC all’attivazione policlonale può riflettere il grado di maturità del

sistema immunitario indotta nella mucosa attraverso le vie di ricircolo mucosali e sistemiche, questa

risposta potrebbe risultare inferiore rispetto a quella che avremmo trovato se avessimo studiato la

risposta nelle biopsie mucosali. Tuttavia, per ragioni etiche non è stata presa in considerazione

questa opzione in questi neonati sani.

Ne deduciamo che l’incremento del rapporto Th1/Th2 spieghi solo in parte la ridotta incidenza di

eczema nel gruppo probiotico. In tal caso, questo effetto concorda con gli effetti dati

dall’assunzione dei probiotici osservati nel trattamento dell’eczema. La somministrazione di LGG a

neonati ed a bambini molto piccoli affetti da CMA ed eczema IgE-associato migliora le loro

risposte IFN-γ all’attivazione policlonale di cellule T rispetto al placebo, mentre ciò non avviene

con un mix di quattro ceppi probiotici, incluso l’LGG (177). La somministrazione di Lactobacillus

fermentum PCC TM a neonati con eczema IgE-associato ha ridotto la severità della malattia e ha

aumentato le risposte policlonali IFN-γ da parte delle cellule T rispetto al placebo (178).

Ad ulteriore supporto degli effetti immuno-stimolatori da parte dei probiotici sulle risposte

immunitarie dei neonati, è stato osservato che la somministrazione di un mix di ceppi probiotici alle

madri prima del parto e quindi di simbiotici ai loro neonati per 6 mesi non altera i parametri

immunitari fetali, ma influenza i parametri immunitari del neonato (179). E’ stato osservato un

profilo coerente a quello di un’infiammazione di basso grado dopo 6 mesi di assunzione di

probiotici in neonati sottoposti a terapia con probiotici. I livelli plasmatici di IL10, PCR, IgA totali

ed IgE sono risultati aumentati nel gruppo probiotico rispetto al gruppo placebo. Gli autori hanno

inoltre osservato che aumentati livelli plasmatici di PCR a 6 mesi di età risultavano associati ad un

rischio ridotto di sviluppare eczema e malattie allergiche a 2 anni. L’aumento delle IgE totali nel

gruppo probiotico potrebbe risultare paradossale, ma gli autori hanno dimostrato che questo

aumento non era correlato ai livelli di IgE allergene-specifiche. Gli autori propongono che i

probiotici possano indurre un’infiammazione cronica di basso grado durante l’assunzione, mimando

la risposta immunologica ad un’infezione elmintica con un aumento dei livelli di IL10 ed IgE totali.

Nonostante induca una risposta di tipo Th2, l’infezione elmintica è in grado di proteggere verso

l’espressione di allergia, forse per via dell’induzione di meccanismi regolatori nell’intestino (180).

Marschan e colleghi hanno inoltre proposto che l’induzione dell’infiammazione possa rappresentare

l’anello di congiungimento tra gli effetti immuno-stimolatori indotti dai probiotici e l’induzione

della tollerabilità (179).

E’ possibile che l’aumento del rapporto IFN-γ/IL4 nel gruppo probiotico possa essere stato indotto

dalle popolazioni di cellule regolatorie. E’ stato dimostrato che i batteri probiotici sono in grado di

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indurre popolazioni di cellule T regolatorie. In un modello animale, i probiotici inducono le cellule

Treg nell’intestino (181) e, come accennato, studi in vitro condotti sugli esseri umani hanno

identificato batteri produttori di acido lattico in grado di indurre la produzione dell’IL10, che

inibiscono le citochine Th2 (160). Le cellule Trl vengono stimolate in presenza dell’IL10 ed

esercitano la loro attività inibitoria attraverso la produzione di IL10 (182). In precedenza, l’LF19

aveva indotto la produzione di IL10 da parte delle cellule PBMC umane in vitro, così come in una

linea cellulare monocitaria (110, 115). Non abbiamo osservato effetti da parte dell’LF19 sui livelli

di mRNA dell’IL10 in seguito all’attivazione policlonale delle PBMC. Tuttavia, in vitro ed in vivo

la risposta immunitaria può differire. Malgrado ciò, probabilmente un periodo di 6 ore dall’

attivazione policlonale non rappresenta il periodo ottimale per questa particolare citochina dal

momento che i livelli risultavano bassi anche negli adulti in seguito all’attivazione policlonale.

Un’altra citochina chiave immuno-regolatoria nell’induzione della tollerabilità orale è il TGF-β.

Sarebbe stato interessante studiare gli effetti dell’LF19 sull’espressione del TGF-β, ma durante gli

esperimenti tempo-curva precedenti, i livelli del TGF-β non erano cambiati in seguito

all’attivazione policlonale delle cellule PBMC, ecco perché questa opzione non è stata considerata

nel nostro studio.

In uno studio sono stati valutati gli effetti del LAVRI-A1 sulla frequenza delle cellule Treg e

sull’espressione della trascrizione del fattore Foxp3 nei neonati. E’ stata notata un’aumentata

espressione dell’mRNA del Foxp3 nelle cellule PBMC dopo l’attivazione con allergeni in neonati

con eczema rispetto ai neonati senza eczema. Tuttavia la somministrazione per 6 mesi nei neonati di

LAVRI-A1 non determinava effetti sull’espressione di cellule T CD4+CD25+ o sull’espressione

dell’mRNA di Foxp3 (183). Inoltre, sono stati usati ligandi specifici per valutare le funzioni di

TRL2 e 4, ed anche se non vi erano differenze statisticamente significative tra i gruppi, vi era la

tendenza verso una maggiore produzione di TNF-α ed IFN-γ in seguito all’attivazione del TRL2 nel

gruppo probiotico (184). Inoltre, come precedentemente discusso, in quello studio non vi erano

effetti da parte di LAVRI-A1 sull’incidenza di eczema, e nel gruppo probiotico vi era un numero

maggiore di neonati di 12 mesi sensibilizzati rispetto al gruppo placebo (184).

I ceppi probiotici dovrebbero essere considerati per i loro meriti individuali. L’inconsistenza dei

risultati sugli effetti immuno-stimolatori dei probiotici nella prevenzione primaria dell’allergia

potrebbe essere spiegata dall’uso di differenti ceppi di probiotici ma anche dalle differenze tra i

fattori propri dell’ospite ed i fattori ambientali (166), (Tabella 4).

Tabella 4. Fattori propri dei probiotici, dell’ospite e fattori ambientali che potrebbero avere un ruolo

sulle conseguenze cliniche nel neonato

Probiotico Madre Neonato

Ceppo Background genetico Background genetico

Dose Ambiente Ambiente

Viabilità Status allergico Modalità di parto

Tempo Composizione del latte materno Modalità di assunzione

Durata

Punti di forza e debolezze dello studio

Questo studio ha valutato gli effetti della somministrazione di LF19 in relazione ai risultati clinici

così come lo sviluppo della composizione della flora batterica intestinale ed il processo di

maturazione del sistema immunitario. Un punto di forza del disegno di questo studio è

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appresentato dal fatto che abbiamo seguito i neonati in modo prospettivo durante il periodo dello

svezzamento. La forza dei risultati è rappresentata dall’esigua percentuale di pazienti persi e

dall’elevato numero di campioni ematici e fecali disponibili per le analisi.

La diagnosi di eczema è stata basata su questionari e diari. Abbiamo utilizzato una definizione di

eczema precedentemente validata che ha dimostrato un’elevata sensibilità (92%) e specificità

(100%) rispetto alla diagnosi clinica posta da un dermatologo (185). Un punto debole dello studio è

rappresentato dalla mancanza di dati circa la severità dell’eczema. In alternativa, si poteva utilizzare

una valutazione clinica ed una classificazione della severità dell’eczema basata sull’indice

SCORAD. D’altro canto, l’aver valutato l’incidenza cumulativa come abbiamo fatto invece di

puntare sulla prevalenza potrebbe persino rappresentare un punto di forza. Se i bambini vengono

valutati solo una volta, l’eczema può non essere diagnosticato per via del decorso tipicamente

ricorrente della malattia e per via del fatto che in alcuni bambini può scomparire con il tempo.

Infine, sono state effettuate ripetute visite cliniche con la valutazione della severità dell’eczema e la

raccolta dei dati estrapolati dai diari e dai questionari.

In caso di diagnosi di CMA i neonati venivano sottoposti ad un regime alimentare che prevedeva

l’eliminazione delle proteine derivate dal latte di mucca e quindi l’introduzione del nuovo regime

alimentare risultava in aperto. In generale, i neonati raramente riportavano sintomi soggettivi, ma il

fatto che il cambiamento fosse in aperto e non in cieco potrebbe aver portato ad un incremento delle

diagnosi (57).

Un altro punto debole è rappresentato dal potere statistico relativamente scarso per le variabili

dell’outcome clinico. Un campione di studio maggiore avrebbe permesso di valutare gli effetti

dell’LF19 sull’insieme delle infezioni, delle allergie respiratorie, della sensibilizzazione delle IgE e

di eseguire un sottogruppo di analisi distinguendo tra l’eczema IgE e non-IgE mediato. Inoltre, con

un più ampio campione di studio, l’andamento degli effetti dei probiotici sulla funzione delle cellule

T sarebbe stato più evidente.

Riguardo le considerazioni etiche, il protocollo di studio può essere risultato impegnativo per alcune

famiglie. Nella maggior parte dei casi, le infermiere dello studio inviavano i cereali ed effettuavano

delle visite domiciliari per raccogliere i diari, completare i questionari, rilevare delle misure

antropometriche ed eseguire i prelievi venosi. Questi ultimi, potenzialmente stressanti per il

neonato, venivano eseguiti in un ambiente familiare, riducendo quindi la tensione sia nei neonati

che nei genitori. Prima del prelievo venoso veniva applicata una crema anestetica. Anche se

abbiamo preso tutte le precauzioni sopra elencate, non può essere escluso completamente che

alcune di quelle procedure siano risultate stressanti per alcuni neonati ed i loro genitori. Tuttavia,

alcuni genitori hanno apprezzato il supporto ed il rapporto diretto con le esperte infermiere dello

studio, e la possibilità di poter fissare un appuntamento con i medici dello studio in caso di malattia

del bimbo.

Aspetti futuri

Abbiamo acquisito alcune conoscenze e sono sorte molte altre domande. Le indagini circa gli

aspetti dell’ecosistema nell’intestino e l’intricato scambio con il sistema immunitario si scontrano

con la loro enorme complessità. Tuttavia, in un prossimo futuro proveremo ad aggiungere qualche

altro tassello a questo puzzle.

Prima di tutto, è in corso un’analisi più approfondita della composizione della flora batterica

intestinale e degli effetti dell’LF19 al didi questo studio.

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Studieremo ulteriormente l’impatto dell’LF19 sulla funzione delle cellule T regolatorie in questo

ambito, così come i markers dell’infiammazione.

Inoltre, la principale necessità è seguire questi bambini e valutare se gli effetti preventivi

sull’eczema si estendono all’età scolare con effetti sullo sviluppo dell’immunità e sulle allergie

respiratorie.

Conclusioni

La composizione della flora batterica iniziale sembra avere un ruolo sullo sviluppo del sistema

immunitario, sia a livello dell’intestino che a livello sistemico. Durante lo svezzamento, avviene la

maggiore esposizione agli antigeni alimentari con una flora batterica intestinale che va

diversificandosi, sfidando il sistema immunitario in via di sviluppo. Nel presente studio abbiamo

cercato di mantenere alcuni degli effetti benefici conferiti dal latte materno sulla composizione della

flora batterica intestinale valutandone i possibili effetti sullo sviluppo del sistema immunitario,

mediante l’aggiunta del batterio probiotico LF19 ai cerali dello svezzamento.

L’integrazione ha ottenuto risultati positivi ed ha mantenuto alti i livelli dei lattobacilli nelle feci

durante lo svezzamento nel gruppo probiotico. L’assunzione di LF19 è risultata sicura senza

evidenza di effetti avversi. Nei neonati di entrambi i gruppi è stata osservata una maturazione del

sistema immunitario specifico e globale ed un aumento della capacità di esprimere citochine sia di

tipo Th1 che Th2. Tuttavia, non abbiamo osservato effetti preventivi sulle infezioni, ma solo una

lieve riduzione della durata della terapia antibiotica.

Inoltre, l’assunzione di LF19 ha ridotto il rischio di eczema associato ad un miglioramento del

rapporto Th1/Th2 in seguito all’attivazione policlonale delle cellule T. Abbiamo inoltre osservato

come l’LF19 induca differenze funzionali nella flora batterica intestinale, con possibili effetti sulla

funzione di barriera intestinale. Quindi, suggeriamo che la riduzione del rischio di eczema nel

gruppo probiotico in parte dipenda dagli effetti dell’LF19 sulla funzione delle cellule T ed in parte

dall’aumentata integrità della mucosa intestinale.

In ultimo, è stato ipotizzato che la flora batterica intestinale ed il sistema immunitario in via di

sviluppo possano essere modulati dalla somministrazione dei batteri probiotici nei neonati. I

risultati del presente lavoro supportano questa ipotesi, e dimostrano che l’assunzione dei probiotici,

se iniziata durante lo svezzamento, può influenzare la funzione della flora batterica intestinale, la

funzione delle cellule T nell’immunità adattativa e possa ridurre il rischio di eczema.

RINGRAZIAMENTI

Prima di tutto, vorrei ricordare tutti i neonati e le loro famiglie che hanno partecipato a questo

studio, rendendo possibile questo progetto. Grazie!

Questo lavoro ed il progetto alle spalle rappresentano lo sforzo comune di un gruppo dinamico di

persone dedicate alle quali vorrei esprimere tutta la mia più profonda gratitudine.

Olle Hernell- il mio principale superiore per avermi invitato ad occuparmi di questa parte così

appassionante della ricerca e per le sue idee, l’impegno, le grandi abilità scientifiche ed il supporto

resomi quando necessario.

39


Marie-Louise Hammarstöm- il mio superiore per la sua vasta esperienza in campo scientifico, le

idee innovative, le fruttuose discussioni ed il supporto.

Leif Gothefors- il mio superiore per il suo entusiasmo contagioso e per essere stato mentore sia in

campo clinico che scientifico.

Sten Hammarstöm- per i preziosi consigli e per le discussioni avute nel corso di questo progetto.

Hans Stenlund- sempre pronto a dispensare preziosi consigli nel campo della Statistica, con

pazienza e grandi capacità di insegnamento.

Gisela Dahlquist- per aver condiviso i consigli lungo il percorso.

Margareta Henriksson and RuthGerd Larsson- per il contatto estremamente prezioso con i neonati

e le loro famiglie, per essersi prese cura dei neonati durante lo studio e per essere riuscite ad

ottenere con successo campioni ematici prelevati da vasi invisibilmente sottili. Margareta

Bäckman per il suo aiuto riguardo gli aspetti pratici quando le altre infermiere dello studio avevano

bisogno di una mano e per l’amicizia e l’ottima collaborazione in altri progetti.

Yvonne Andersson- per il tuo contributo estremamente prezioso a questo progetto sotto numerosi

aspetti, inclusa la tua abilità ed esperienza nel laboratorio, i consigli e l’amicizia condivisa in questi

anni.

Marianne Sjöstedt- per il lavoro dedicato alle analisi del qRT-PCR.

Anne Israelsson per aver elaborato i primers e le sonde per le analisi del qRT-PCR.

Helèn Fält, Elisabeth Granström, Carina Lagerqvist, e Lotta Westman per il vostro impegno,

l’abile assistenza con le analisi di laboratorio e le utili osservazioni.

Helena Brännström, Helena Harding, Karin Moström, Anna Nordström e Ulla Norman per

l’eccellente assistenza per quanto riguarda l’aspetto amministrativo.

Marta Granström per aver condiviso la tua vasta esperienza sulle risposte dei neonati ai vaccini, la

loro metodologia e per aver stimolato il dibattito. Ingrid Yones per l’abile assistenza con le analisi

di laboratorio.

Helena Käyhty per avermi accolto ad Helsinki e per aver condiviso la tua competenza nel campo

delle valutazioni sierologiche dei vaccini. Leena Saarinen per l’eccellente assistenza con le analisi

di laboratorio e Anu Nurkka per l’utile confronto.

Elisabeth Norin per aver condiviso la tua conoscenza nel campo della microbiologia e per gli utili

dibattiti. Anna-Karin Persson per l’abile assistenza con le analisi di laboratorio.

Catharina Tennefors e Lars-Börje Sjöberg del Semper AB per il prezioso contributo

all’organizzazione ed allo svolgimento di questo progetto, incluso lo sviluppo del prodotto dello

studio e per il supporto in tutti questi anni.

Ragne Fondèn e Ulla Svensson dell’Arla Foods AB per il supporto nel corso di questo progetto e

per gli interessanti dibattiti sull’LF19. Janet Håkansson e Astrid Walles-Granberg per le

stimolanti discussioni e l’eccellente assistenza con le analisi di laboratorio.

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Åsa Sullivan e Ann-Chatrin Palmgren per l’eccellente assistenza con le analisi di laboratorio.

Aamir Mukhdoomi- per il meticoloso lavoro di inserimento dei dati.

Anna Möllsten, Luis Cobian e Michael Haney per gli utili consigli riguardo l’impaginazione e la

revisione del corpo del testo.

I colleghi passati e presenti del Dipartimento di Pediatria per aver condiviso i pensieri ed i consigli

in tutti questi anni, ed in special modo, Anneli Ivarsson, Berit Kriström, Torbjörn Lind, Sussie

Lindquist, Christian Möller, Solveig Petersen, Auste Pundziute-Luckå, Olof Sandström, Sven-

Arne Silfverdal e Inger Öhlund.Magnus Domellöf, Göte Forsberg, Leif Gothefors, Ulrika Norèn

Nyström, Annida Rydberg, Svante Sjöstedt e Anna Winberg, che oltre ai buoni consigli hanno

condiviso con me l’amicizia, le canzoni e le risate.

I miei amici più stretti, in particolare Ulrika NN, per essere stata un’eccellente compagna di viaggio

in questo percorso e Mia Malby per avermi ricordato di godermi il viaggio.

I miei genitori Benita e Stig, per l’amore ed il supporto, e mio fratello Ulf e la sua famiglia per

esserci stati e per il loro sostegno durante le ultime frenetiche settimane di scrittura della tesi.

Il mio compagno di vita Björn, per essere stato sempre al mio fianco nei momenti belli ed in quelli

brutti e quello che ho di più caro, i miei figli David e Lukas per ricordarmi ogni giorno “il fine di

tutto questo”.

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