Biocristallografia a raggi X
Biocristallografia a raggi X
Biocristallografia a raggi X
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<strong>Biocristallografia</strong> a <strong>raggi</strong> X<br />
Alessandra Pesce<br />
Dipartimento di Fisica e Centro di Eccellenza per la Ricerca<br />
Biomedica - Università di Genova<br />
E-mail: pesce@ge.infm.it
<strong>Biocristallografia</strong> a <strong>raggi</strong> X<br />
Metodologie Chimico Fisiche per lo Studio dei Sistemi Biologici<br />
Camogli, 16-21 settembre 2007<br />
La cristallografia a <strong>raggi</strong> X è la scienza che permette di determinare la<br />
disposizione degli atomi di una molecola in un cristallo a partire dal modo in<br />
cui i <strong>raggi</strong> X sono diffratti dal cristallo.<br />
La cristallografia a <strong>raggi</strong> X misura la densità degli elettroni all’interno del<br />
cristallo, da cui si possono dedurre le posizioni atomiche.<br />
Scopo della biocristallografia a <strong>raggi</strong> X: determinazione della struttura<br />
tridimensionale di macromolecole biologiche a risoluzione atomica (coordinate<br />
x,y,z per ciascun atomo che costituisce la macromolecola biologica).<br />
Macromolecole biologiche oggetto dello studio: DNA, RNA, proteine e loro<br />
complessi (virus, ribosoma, ecc.).<br />
Le proteine più piccole sono costituite da ben oltre 1000 atomi e le proteine<br />
più grandi possono essere costituite da 10 4 a 10 5 atomi.
<strong>Biocristallografia</strong> a <strong>raggi</strong> X<br />
Applicazioni<br />
La conoscenza della struttura 3D di una macromolecola consente di capire i<br />
processi biologici e di eseguire studi funzionali a risoluzione atomica (Å)<br />
- interazioni fra macromolecole<br />
- interazioni fra macromolecole e piccole molecole (substrati, cofattori,<br />
inibitori, ioni, ecc.)<br />
- studi struttura-funzione su enzimi<br />
- sviluppo di farmaci<br />
- applicazioni biotecnologiche<br />
Metodologie Chimico Fisiche per lo Studio dei Sistemi Biologici<br />
Camogli, 16-21 settembre 2007
<strong>Biocristallografia</strong> a <strong>raggi</strong> X<br />
Passato e presente<br />
Metodologie Chimico Fisiche per lo Studio dei Sistemi Biologici<br />
Camogli, 16-21 settembre 2007<br />
La prima struttura cristallografica di una proteina fu quella della mioglobina di<br />
capodoglio, determinata da Max Perutz e Sir John Cowdery Kendrew nel<br />
1958, per la quale essi ricevettero il premio Nobel per la Chimica nel 1962.<br />
La biocristallografia a <strong>raggi</strong> X è, a tutt’oggi, la disciplina più prolifica<br />
nell’ambito della biologia strutturale: delle ∼46000 strutture tridimensionali di<br />
proteine attualmente note, ∼85% sono state determinate tramite la<br />
biocristallografia a <strong>raggi</strong> X.<br />
Genomica strutturale: è la nuova frontiera della biocristallografia a <strong>raggi</strong> X.
Le proteine<br />
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Camogli, 16-21 settembre 2007<br />
Le proteine giocano un ruolo cruciale in tutti i processi biologici.<br />
- Reazioni catalitiche: molte proteine sono enzimi che catalizzano le reazioni<br />
biochimiche e sono vitali per il metabolismo. La maggior parte delle reazioni<br />
catalizzate da enzimi sono milioni di volte più veloci di quelle corrispondenti<br />
non catalizzate.<br />
- Funzioni meccanico-strutturale: la contrazione dei muscoli è accompagnata<br />
dallo scorrimento di due tipi di proteine fibrose, actina e miosina. La pelle e le<br />
ossa sono costituite dal collagene, i capelli dalla cheratina, la seta dalla fibrina.<br />
- Trasporto molecolare: molte piccole molecole e/o ioni sono trasportati da<br />
proteine: per esempio l’ossigeno nel sangue è trasportato dall’emoglobina.<br />
- Trasporto attraverso la membrana: alcune proteine (proteine di membrana)<br />
formano canali e controllano il passaggio di ioni attraverso le membrane delle<br />
cellule e degli organelli.
Le proteine<br />
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- Risposta immunitaria: gli anticorpi sono proteine usate dal sistema<br />
immunitario per identificare e neutralizzare agenti esterni potenzialmente<br />
pericolosi. Gli anticorpi sono altamente specifici nel riconoscere come estranei<br />
virus, batteri e cellule di altri organismi.<br />
- Ormoni: alcuni ormoni sono proteine che trasmettono informazioni fra<br />
cellule e organi specifici. Esempio: l’insulina, la cui funzione è di istruire i<br />
tessuti a rispondere ad aumenti di concentrazione di glucosio nel sangue (per<br />
esempio dopo un pasto), con conseguenti cambiamenti del metabolismo<br />
cellulare.<br />
- Sistemi recettoriali: le cellule ricevono informazioni dall’ambiente<br />
circostante attraverso una classe di proteine chiamate recettori.
<strong>Biocristallografia</strong> a <strong>raggi</strong> X<br />
Struttura 3D di una proteina<br />
• C<br />
• O<br />
• N<br />
• S<br />
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Camogli, 16-21 settembre 2007
Le proteine<br />
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Camogli, 16-21 settembre 2007<br />
Rappresentazione schematica della struttura 3D di una proteina
<strong>Biocristallografia</strong> a <strong>raggi</strong> X<br />
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Camogli, 16-21 settembre 2007<br />
Crescita dei cristalli<br />
Esperimenti di diffrazione con i <strong>raggi</strong> X<br />
Soluzione del ‘problema della fase’<br />
e calcolo della densità elettronica<br />
Costruzione e raffinamento della catena<br />
polipeptidica<br />
Deposizione delle coordinate atomiche nella<br />
Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb)
<strong>Biocristallografia</strong> a <strong>raggi</strong> X<br />
Perché i <strong>raggi</strong> X<br />
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L’uso di radiazione elettromagnetica per visualizzare oggetti richiede che la<br />
radiazione abbia una λ paragonabile ai più piccoli dettagli che si vogliono<br />
risolvere.<br />
λ <strong>raggi</strong> X ~10 -10 m prossima alla distanza tra atomi<br />
di carbonio legati covalentemente<br />
(1 Ångstrom = 10 -10 m)
<strong>Biocristallografia</strong> a <strong>raggi</strong> X<br />
Perché i cristalli<br />
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Camogli, 16-21 settembre 2007<br />
Un cristallo è costituito da un enorme numero di molecole (10 15 -10 16 ) disposte<br />
nella stessa orientazione, cosicché i <strong>raggi</strong> X diffratti si sommano in fase e<br />
rendono il segnale di diffrazione totale di intensità misurabile rispetto al<br />
rumore di fondo.<br />
I <strong>raggi</strong> X interagiscono con la materia ordinata nei cristalli e subiscono<br />
diffrazione. Dalla misura delle intensità e della posizione dei <strong>raggi</strong> diffratti è<br />
possibile ricavare la struttura dell’oggetto che ha causato il fenomeno di<br />
diffrazione (coordinate x,y,z degli atomi costituenti la molecola cristallizzata).
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Cristallizzazione di macromolecole biologiche<br />
Un cristallo è un insieme tridimensionale ordinato di molecole, tenute insieme<br />
da interazioni non covalenti.<br />
- dimensioni decine-centinaia di μm<br />
- contenuto solvente 30%-80%<br />
- interazioni deboli<br />
- bassa resistenza meccanica (E stab.< 10 kcal/mol)<br />
elemento di simmetria<br />
cristallografica<br />
molecola<br />
unità asimmetrica<br />
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cella elementare<br />
cristallo
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Cristallizzazione di macromolecole biologiche<br />
In un cristallo la molecola proteica assume praticamente la stessa struttura che<br />
ha in soluzione:<br />
- la proteina nel cristallo è essenzialmente in soluzione. A parte le zone di<br />
contatto cristallino, la molecola proteica nel cristallo è in contatto con il<br />
solvente per buona parte della sua superficie (molecole di solvente sono spesso<br />
presenti anche al suo interno), proprio come la struttura in soluzione;<br />
- molte proteine cristallizzano in più di una forma cristallina (a seconda delle<br />
condizioni di cristallizzazione). Normalmente la loro struttura rimane la stessa,<br />
indipendentemente dal modo in cui cristallizzano. Le forze che tendono a fare<br />
interagire fra loro le molecole nel cristallo non modificano in modo<br />
significativo la loro struttura tridimensionale;
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Cristallizzazione di macromolecole biologiche<br />
- molti enzimi sono cataliticamente attivi nello stato cristallino, quindi la loro<br />
struttura tridimensionale è equivalente a quella da loro assunta in soluzione.<br />
Infatti, la presenza di canali all’interno delle molecole nei cristalli favorisce la<br />
diffusione dei substrati e quindi la reazione catalitica, suggerendo che i siti<br />
catalitici e di legame sono intatti;<br />
- Esempio di mantenimento della funzione della proteina nello stato cristallino:<br />
l’emoglobina subisce cambiamenti conformazionali in seguito al legame<br />
dell’ossigeno. La diffusione di ossigeno nei cristalli di emoglobina nella forma<br />
deossi fa rompere i cristalli, perché i cambiamenti conformazionali sono<br />
incompatibili con i vincoli imposti dal reticolo cristallino.
Cristallizzazione di macromolecole biologiche<br />
Metodi fisico-chimici per la crescita di cristalli<br />
Procedura empirica di ‘trial and error’ in cui una proteina viene lentamente<br />
fatta precipitare a formare un precipitato cristallino (non amorfo), mediante<br />
l’aggiunta di agenti precipitanti che ne diminuiscono la solubilità<br />
- purezza ed omogeneità del campione<br />
- interazioni intermolecolari di superficie<br />
- diminuzione della solubilità della proteina<br />
Variabili chimico-fisiche<br />
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- forza ionica - costante dielettrica del solvente<br />
- pH - temperatura<br />
- concentrazione macromolecola / concentrazione precipitanti
Cristallizzazione di macromolecole biologiche<br />
Processo di cristallizzazione attraverso 3 fasi<br />
- nucleazione<br />
la soluzione è portata in<br />
condizione di supersaturazione;<br />
- crescita<br />
il grado di saturazione<br />
diminuisce (sovrasaturazione);<br />
- cessazione della crescita<br />
<strong>raggi</strong>ungimento della curva di<br />
solubilità (equilibrio cristalli-soluzione).<br />
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(crescita cristallina)<br />
(nucleazione cristallina)
Cristallizzazione di macromolecole biologiche<br />
Metodo della diffusione di vapore<br />
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hanging drop sitting drop
Cristallizzazione di macromolecole biologiche<br />
Microgravità<br />
assenza di sedimentazione e di movimenti<br />
convettivi (mezzo di crescita più omogeneo)<br />
- miglior grado di ordine dei cristalli<br />
- riduzione nucleazione secondaria<br />
- minore incorporazione di contaminanti<br />
nel reticolo cristallino<br />
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Macromolecole Biologiche<br />
Cristallizzazione di macromolecole biologiche<br />
Robot per la cristallizzazione
Generazione di <strong>raggi</strong> X<br />
Raggi X: radiazione elettromagnetica con λ= 10 -7 -10 -11 m (1000 - 0.1 Å).<br />
Esistono due modi per produrre <strong>raggi</strong> X:<br />
- generatore a tubo fisso e ad anodo rotante (<strong>raggi</strong> X monocromatici)<br />
- sincrotrone (<strong>raggi</strong> X policromatici)<br />
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Generazione di <strong>raggi</strong> X<br />
Danni da radiazione<br />
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I <strong>raggi</strong> X incidenti sul cristallo proteico causano danni sia alle molecole<br />
proteiche che a quelle del solvente. I fotoni portano alla produzione di radicali<br />
liberi che, a loro volta, danneggiano altre molecole del cristallo.<br />
I danni da radiazione talvolta sono così gravi che solo dopo poche ore di<br />
esposizione del cristallo ai <strong>raggi</strong> X a temperatura ambiente non si ha più<br />
diffrazione.<br />
Inoltre, viene generato calore, soprattutto con la radiazione di sincrotrone e<br />
può accadere che il <strong>raggi</strong>o primario deteriori il cristallo.<br />
Per evitare ciò, oltre a ridurre i tempi di esposizione, durante la raccolta dati il<br />
cristallo viene costantemente raffreddato con un flusso di vapori di azoto<br />
liquido, ad una temperatura di circa 100 K. A queste temperature i radicali<br />
liberi si formano lo stesso, ma viene eliminata/rallentata la loro diffusione nel<br />
cristallo.
Generazione di <strong>raggi</strong> X<br />
Generatore a <strong>raggi</strong> X<br />
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Tubo fisso Anodo rotante<br />
Anodo di rame → generazione <strong>raggi</strong> X di λ = 1.5418 Å
Generazione di <strong>raggi</strong> X<br />
Generatore ad anodo rotante (λ = 1.5418 Å)<br />
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Cristallo<br />
Raggi X Azoto<br />
Cristallo
Generazione di <strong>raggi</strong> X<br />
Sincrotrone: struttura circolare con<br />
anello di decine/centinaia di metri<br />
di diametro<br />
- circolazione di elettroni (o positroni)<br />
a velocità relativistiche;<br />
- energie delle particelle dell’ordine del<br />
miliardo di eV (ESRF: 6 GeV);<br />
- bending magnets per guidare le particelle<br />
sulla loro orbita;<br />
- emissione radiazione, con λ comprese tra<br />
<strong>raggi</strong> γ e visibile, in direzione tangenziale<br />
all’orbita delle particelle;<br />
- selezione <strong>raggi</strong> X di opportuna λ con un<br />
monocromatore.<br />
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Camogli, 16-21 settembre 2007<br />
European Synchrotron Radiaton<br />
Facility (ESRF), Grenoble<br />
(circonferenza = 844m, E = 6GeV)
Generazione di <strong>raggi</strong> X<br />
Setup sperimentale al sincrotrone<br />
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λ = 0.933 Å (13.294 keV); 9.6 < E < 14.5 keV; beamsize 50-200 μm; d max = 0.97 Å
Generazione di <strong>raggi</strong> X<br />
Vantaggi della luce di sincrotrone<br />
Raggi X ad elevata intensità<br />
- intensità 1000-10000 volte maggiori dei <strong>raggi</strong> X generati con l’anodo rotante<br />
- raccolta dati su cristalli piccoli oppure di grandi complessi molecolari<br />
- tempi ridotti delle raccolte dati (ore rispetto a giorni)<br />
λ variabile<br />
- scattering anomalo<br />
-bassa λ implica minor assorbimento nel cristallo<br />
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Diffrazione di <strong>raggi</strong> X<br />
Raccolta dati di intensità di diffrazione<br />
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Camogli, 16-21 settembre 2007
Diffrazione di <strong>raggi</strong> X<br />
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Camogli, 16-21 settembre 2007<br />
La diffrazione di <strong>raggi</strong> X nel cristallo avviene in direzioni discrete e le<br />
condizioni geometriche che definiscono la diffrazione possono essere descritte<br />
mediante la legge di Bragg:<br />
2dsenθ = nλ<br />
Ciascun atomo di un cristallo diffonde i <strong>raggi</strong> X in tutte le direzioni e soltanto<br />
quelli che interferiscono positivamente l’uno con l’altro, secondo la legge di<br />
Bragg, danno luogo a <strong>raggi</strong> di diffrazione, le cui intensità vengono registrate<br />
come macchie (spot) di diffrazione. Ciascuno spot di diffrazione è il risultato<br />
dell’interferenza di tutti i <strong>raggi</strong> X diffratti da tutti gli atomi presenti nel<br />
cristallo, in corrispondenza di un certo angolo θ.<br />
I <strong>raggi</strong> X interagiscono quasi esclusivamente con gli elettroni della materia e<br />
non con i nuclei. Una struttura 3D determinata tramite diffrazione di <strong>raggi</strong> X è<br />
quindi un’immagine della distribuzione nello spazio degli elettroni (densità<br />
elettronica) dell’oggetto che si sta studiando.
Diffrazione di <strong>raggi</strong> X<br />
Esempio di pattern di diffrazione sul detector<br />
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I <strong>raggi</strong> diffratti in<br />
corrispondenza di una data<br />
orientazione del cristallo<br />
vengono raccolti su un<br />
detector, che ne misura la<br />
posizione e l’intensità rispetto<br />
al rumore di fondo.<br />
Per determinare la struttura<br />
3D di una macromolecola<br />
biologica si devono misurare<br />
tutti i <strong>raggi</strong> X diffratti dagli<br />
atomi della macromolecola.
Diffrazione di <strong>raggi</strong> X<br />
Intensità di diffrazione e fattori di struttura<br />
Risultato dell’esperimento di diffrazione<br />
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h k l I σ<br />
0 0 18 5377.7 426.7<br />
0 0 30 87315.1 7080.9<br />
0 0 39 79150.9 5678.3<br />
0 0 42 88255.3 6544.6<br />
0 0 45 14582.6 1511.1<br />
0 0 48 8125.2 596.7<br />
0 0 51 46929.6 3740.0<br />
0 0 54 79917.3 8107.1<br />
0 0 57 2243.6 316.8<br />
0 0 60 21097.8 1703.7<br />
0 0 63 90391.1 6236.3<br />
0 0 66 96333.2 9161.3<br />
...<br />
eccetera<br />
...
Diffrazione di <strong>raggi</strong> X<br />
Intensità di diffrazione e fattori di struttura<br />
Ihkl = k λ3 |Fhkl | 2 I0 Vcryst /V2 cell → I ∝ |Fhkl |2<br />
<br />
<br />
Il ‘fattore di struttura’ F hkl è un vettore che<br />
rappresenta in modulo (F hkl ) e fase (α hkl )<br />
l’onda diffratta (<strong>raggi</strong> X) in una certa<br />
direzione da tutti gli atomi, che produce un<br />
annerimento sul detector.<br />
<br />
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Camogli, 16-21 settembre 2007
Diffrazione di <strong>raggi</strong> X<br />
Fattore di struttura<br />
N = numero di atomi presenti nella cella elementare<br />
f j = fattore di scattering atomico per ciascun atomo j-esimo<br />
(x j ,y j ,z j ) = posizione nella cella elementare di ciascun atomo j-esimo<br />
Ciascun <strong>raggi</strong>o diffratto è un’onda data dalla somma dei contributi diffrattivi,<br />
in quella determinata direzione, di tutti gli N atomi presenti nella cella<br />
elementare.<br />
Il contributo di ciascun atomo j a F hkl dipende:<br />
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Fhkl = Σ fj e [2πi(hxj + kyj + lzj)] = |Fhkl | eiαhkl N<br />
<br />
j=1<br />
<br />
- dal tipo di atomo, che determina f j , cioè l’ampiezza del contributo;<br />
- dalla posizione dell’atomo (x j ,y j ,z j ) nella cella elementare, che determina la<br />
‘fase’ del contributo.
Diffrazione di <strong>raggi</strong> X<br />
Densità elettronica<br />
Gli effettivi diffrattori dei <strong>raggi</strong> X sono le nuvole di elettroni della molecola<br />
nel cristallo. La diffrazione rivela quindi la distribuzione degli elettroni<br />
(densità elettronica, ρ(x,y,z)) degli atomi<br />
che costituiscono la molecola.<br />
La densità elettronica riflette quindi la<br />
forma di tale molecola.<br />
La densità elettronica graficamente viene<br />
rappresentata come un’immagine delle<br />
nuvole elettroniche che circondano gli<br />
atomi della cella elementare.<br />
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Camogli, 16-21 settembre 2007<br />
ρ(x,y,z)
Diffrazione di <strong>raggi</strong> X<br />
Risoluzione<br />
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I cristalli proteici presentano un certo grado di disordine: molecole o parti di<br />
molecole in diverse celle elementari non occupano esattamente la stessa<br />
posizione e non hanno esattamente la stessa orientazione (le proteine non sono<br />
completamente rigide).<br />
Tale disordine fa sì che i cristalli abbiano un limite di risoluzione nella loro<br />
diffrazione da <strong>raggi</strong> X. Se i cristalli proteici diffrangono a bassa risoluzione<br />
allora la densità elettronica che si otterrà dai dati sperimentali non sarà in<br />
grado di rivelare i dettagli strutturali più minuti della proteina.<br />
Poiché la mappa di densità elettronica di una proteina deve essere interpretata,<br />
cioè devono essere definite le posizioni degli atomi di ciascun aminoacido,<br />
l’accuratezza dell’analisi strutturale dipende dal limite di risoluzione del<br />
cristallo.
Diffrazione di <strong>raggi</strong> X<br />
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Camogli, 16-21 settembre 2007<br />
La risoluzione viene misurata in Å: più piccolo è questo numero, più elevata è<br />
la risoluzione e quindi maggiore è la quantità di dettagli che si possono<br />
osservare.<br />
Risoluzione di 5 Å: si ricava la forma della<br />
molecola e talvolta è possibile identificare<br />
le regioni ad α elica come tratti di densità<br />
elettronica a forma di cilindro.<br />
Risoluzione di 3 Å: si può tracciare la<br />
catena polipeptidica e distinguere le catene<br />
laterali, anche se non sempre in dettaglio.<br />
Risoluzione di 2 Å o più: i dettagli sono sufficienti per distinguere tutte le<br />
catene laterali e per risoluzioni intorno a 1 Å si possono osservare gli atomi<br />
come sfere distinte di densità elettronica.
Problema della fase<br />
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I hkl<br />
?
Problema della fase<br />
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Per determinare la posizione degli atomi che danno luogo ai <strong>raggi</strong> diffratti è<br />
necessario conoscere sia l’ampiezza che la fase di ciascun <strong>raggi</strong>o diffratto, in<br />
modo tale da poter calcolare la densità elettronica.<br />
In che modo si possono determinare le fasi dei <strong>raggi</strong> diffratti?<br />
Questo è il cosiddetto problema della fase della cristallografia a <strong>raggi</strong> X.<br />
Fattore di struttura<br />
Densità elettronica<br />
Fhkl = Σ fj e [2πi(hxj + kyj + lzj)] = |Fhkl | eiαhkl N<br />
<br />
j=1<br />
ρ(x,y,z) = Σ (|Fhkl |eiαhkl 1 <br />
) e-2πi(hx+ky+lz) V hkl
Problema della fase<br />
Esistono diversi metodi, che richiedono estensivi calcoli matematici (basati<br />
sulla trasformata di Fourier), per risolvere il problema della fase in modo da<br />
riuscire a calcolare la densità elettronica e quindi determinare la struttura 3D<br />
di una macromolecola biologica.<br />
I principali metodi sono:<br />
- Molecular Replacement (MR)<br />
- Metodi che utilizzano atomi pesanti<br />
Metodologie Chimico Fisiche per lo Studio dei Sistemi Biologici<br />
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- Multiple Isomorphous Replacement (MIR)<br />
- Single or Multi-wavelength Anomalous<br />
Diffraction (SAD o MAD)<br />
Synchrotron<br />
Pt<br />
Hg
Problema della fase<br />
Molecular Replacement (MR)<br />
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Si utilizzano fattori di struttura i cui moduli sono ricavati sperimentalmente e<br />
le cui fasi sono calcolate a partire da una molecola ‘modello’ di struttura<br />
tridimensionale simile (identità di sequenza ≥ 30-35%).<br />
1<br />
V<br />
ρ(x,y,z) = Σ ( F hkl e -iα hkl ) e -2πi(hx+ky+lz)<br />
hkl<br />
Proteina Ihkl ∝ |Fhkl| 2<br />
oss oss<br />
Modello Fhkl= Fhkleiα calc calc calc<br />
hkl<br />
oss<br />
calc
Problema della fase<br />
Molecular Replacement (MR)<br />
Il metodo del molecular replacement può essere usato per determinare la<br />
struttura tridimensionale di:<br />
- proteine omologhe (identità di sequenza ≥ 30-35%)<br />
- stessa proteina in una diversa forma cristallina<br />
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Camogli, 16-21 settembre 2007<br />
- stessa proteina con piccole differenze e struttura relativamente rigida<br />
(mutanti o complessi con piccole molecole)<br />
Limiti del metodo:<br />
- non è sempre utilizzabile<br />
- la struttura tridimensionale può essere influenzata dalla struttura<br />
della proteina modello
Problema della fase<br />
Metodi che utilizzano atomi pesanti → sempre utilizzabili<br />
Pt Hg<br />
cristallo<br />
nativo<br />
(I hkl ) P<br />
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Multiple Isomorphous Replacement (MIR)<br />
atomi<br />
pesanti<br />
H<br />
(I hkl ) PH<br />
cristallo<br />
derivato
Problema della fase<br />
Metodi che utilizzano atomi pesanti<br />
Il metodo MIR richiede l’introduzione di nuovi centri di diffrazione<br />
all’interno della cella elementare del cristallo, per diffusione all’interno dei<br />
canali dei cristalli proteici già formati.<br />
Questi centri sono costituiti da atomi pesanti, in modo tale che<br />
contribuiscano significamente al diagramma di diffrazione.<br />
Gli atomi pesanti incorporati<br />
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Camogli, 16-21 settembre 2007<br />
- devono essere in numero limitato, in modo tale che le loro posizioni<br />
possano essere localizzate facilmente;<br />
- non dovrebbero cambiare le caratteristiche strutturali della molecola<br />
proteica o della cella elementare del cristallo.
Problema della fase<br />
Metodi che utilizzano atomi pesanti<br />
Sincrotrone<br />
Principali sincrotroni europei<br />
ELETTRA, Trieste (Italia)<br />
ESRF, Grenoble (Francia)<br />
DESY/EMBL, Amburgo (Germania)<br />
DIAMOND, Oxford (Inghilterra)<br />
SLS, Zurigo (Svizzera)<br />
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Single o Multi-wavelength Anomalous Diffraction<br />
(SAD o MAD)<br />
Gli elettroni più interni degli atomi pesanti<br />
assorbono i <strong>raggi</strong> X di una particolare λ (soglia di<br />
assorbimento) ed emettono di nuovo i <strong>raggi</strong> X<br />
dopo un ritardo, inducendo uno shift della fase.
Problema della fase<br />
Metodi che utilizzano atomi pesanti (SAD o MAD)<br />
Incorporati nella proteina<br />
(devono essere presenti abbastanza<br />
Se-Met; una Se-Met può fasare una<br />
proteina di circa 15kDa)<br />
Naturalmente<br />
presenti nella proteina<br />
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Se<br />
Fe<br />
Se-metionina<br />
S → Se
Problema della fase<br />
Metodi che utilizzano atomi pesanti (SAD o MAD)<br />
- E’ sufficiente un solo cristallo<br />
→ si evitano problemi dovuti a mancanza di isomorfismo (MIR) o<br />
dovuti all’influenza del modello di partenza (MR)<br />
- Necessità della radiazione di sincrotrone (λ variabile)<br />
Possibili difficoltà<br />
- non sempre si riesce ad esprimere la proteina con le Se-Met<br />
- incorporazione incompleta delle Se-Met<br />
→ controllare con spettrometria di massa<br />
- le Se-Met sono sensibili all’ossidazione<br />
→ per es. aggiungere β-mercaptoetanolo<br />
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Camogli, 16-21 settembre 2007
Problema della fase<br />
Metodi che utilizzano atomi pesanti<br />
Qualunque sia il metodo con gli atomi pesanti utilizzato<br />
- si determinano le posizioni atomiche (coordinate x,y,z) degli atomi pesanti<br />
nella cella elementare del cristallo<br />
- si calcolano delle fasi approssimate da associare all’ampiezza di ciascuna<br />
onda diffratta dagli atomi della proteina nel cristallo<br />
- si calcola la densità elettronica<br />
Metodologie Chimico Fisiche per lo Studio dei Sistemi Biologici<br />
Camogli, 16-21 settembre 2007
Densità elettronica<br />
Densità<br />
elettronica<br />
Metodologie Chimico Fisiche per lo Studio dei Sistemi Biologici<br />
Camogli, 16-21 settembre 2007
Densità elettronica<br />
Densità<br />
elettronica<br />
Metodologie Chimico Fisiche per lo Studio dei Sistemi Biologici<br />
Camogli, 16-21 settembre 2007
Densità elettronica<br />
Metodologie Chimico Fisiche per lo Studio dei Sistemi Biologici<br />
Camogli, 16-21 settembre 2007<br />
Mappa di densità elettronica a 2.7 Å Mappa di densità elettronica a 1.54 Å
<strong>Biocristallografia</strong><br />
Raffinamento cristallografico e validazione<br />
Costruzione modello atomico<br />
Costruzione del modello atomico nella densità elettronica, conoscendo la<br />
sequenza aminoacidica della proteina<br />
- catena polipeptidica principale<br />
- catene laterali degli aminoacidi<br />
- molecole d’acqua
<strong>Biocristallografia</strong><br />
Raffinamento cristallografico e validazione<br />
Raffinamento cristallografico<br />
Il raffinamento è un processo di aggiustamento del modello in modo tale che ci<br />
sia il miglior accordo possibile tra i fattori di struttura calcolati a partire dal<br />
modello e quelli osservati sperimentalmente.<br />
Tale accordo viene rappresentato da un indice, il fattore R:<br />
Σ hkl ||F hkl oss | - |Fhkl calc ||<br />
R = (× 100)<br />
Σ hkl |F hkl oss |<br />
Cicli di calcolo della mappa di densità elettronica e di costruzione della catena<br />
polipeptidica sono alternati a cicli di raffinamento, nel tentativo di migliorare<br />
l’accordo del modello con le intensità di diffrazione osservate.
<strong>Biocristallografia</strong><br />
Raffinamento cristallografico e validazione<br />
Raffinamento cristallografico<br />
La funzione da minimizzare è<br />
Q = Σ whkl (Fhkl,o –Fhkl,c) 2<br />
hkl<br />
C = Q + kU dove<br />
U = Σ 1/2 kb,j (bj,c –bj,o) 2 + Σ 1/2 kτ,j (τj,c – τj,o) 2 +<br />
j j<br />
lunghezza legami<br />
angoli di legame<br />
+ Σ kφ [1 + cos (nφj – δ)] + Σ [(Br-12 ) ij + (Ar-6 ) ij]<br />
j ij<br />
angoli di torsione van der Waals
<strong>Biocristallografia</strong><br />
Raffinamento cristallografico e validazione<br />
Validazione modello<br />
- accordo fra modello e dati sperimentali: fattore R e R-free<br />
- stereochimica delle strutture macromolecolari (Ramachandran Plot)
<strong>Biocristallografia</strong><br />
Raffinamento cristallografico e validazione<br />
Validazione modello<br />
- contatti/interazioni fra residui vicini spazialmente
Raffinamento cristallografico e validazione<br />
File formato PDB<br />
Metodologie Chimico Fisiche per lo Studio dei Sistemi Biologici<br />
Camogli, 16-21 settembre 2007<br />
CRYST1 39.550 74.570 66.560 90.00 99.94 90.00 P 1 21 1 4<br />
ATOM 1 CB SER 1 30.854 -6.329 36.118 1.00 41.46 6<br />
ATOM 2 OG SER 1 31.600 -7.531 36.190 1.00 44.54 8<br />
ATOM 3 C SER 1 30.991 -3.833 36.183 1.00 40.24 6<br />
ATOM 4 O SER 1 30.868 -2.883 36.961 1.00 40.08 8<br />
ATOM 5 N SER 1 31.848 -5.217 38.114 1.00 39.55 7<br />
ATOM 6 CA SER 1 31.668 -5.130 36.630 1.00 40.83 6<br />
ATOM 7 N THR 2 30.605 -3.796 34.906 1.00 39.92 7<br />
ATOM 8 CA THR 2 29.920 -2.658 34.286 1.00 38.97 6<br />
ATOM 9 CB THR 2 30.734 -2.067 33.086 1.00 39.67 6<br />
ATOM 10 OG1 THR 2 31.045 -3.101 32.139 1.00 38.83 8<br />
ATOM 11 CG2 THR 2 32.020 -1.403 33.566 1.00 38.83 6<br />
ATOM 12 C THR 2 28.542 -3.116 33.777 1.00 38.40 6<br />
ATOM 13 O THR 2 27.815 -2.341 33.141 1.00 38.79 8<br />
.<br />
.<br />
.<br />
ATOM 2166 HOH WAT 401 20.048 3.400 49.038 1.00 31.45 8<br />
ATOM 2167 HOH WAT 402 -9.403 0.553 32.633 1.00 44.09 8<br />
ATOM 2168 HOH WAT 403 3.928 -6.370 32.724 1.00 21.48 8<br />
END<br />
x y z occ B
Metodologie Chimico Fisiche per lo Studio dei Sistemi Biologici<br />
Camogli, 16-21 settembre 2007<br />
Protein Data Bank (http:// www.rcsb.org/pdb)<br />
Deposizione delle coordinate della macromolecola nella banca dati PDB.<br />
- X-ray crystallography (~ 85%)<br />
- nuclear magnetic resonance (NMR) (~ 15%)
<strong>Biocristallografia</strong> a <strong>raggi</strong> X<br />
Cristalli Raccolta dati<br />
Raffinamento<br />
Validazione e PDB<br />
Metodologie Chimico Fisiche per lo Studio dei Sistemi Biologici<br />
Camogli, 16-21 settembre 2007<br />
Densità<br />
elettronica<br />
Costruzione della<br />
catena polipeptidica<br />
Fasi approssimate<br />
MR, MIR,<br />
MAD