cdt - AntonioDeVuono

UN MARCATORE BIOLOGICO PER LA
DIAGNOSI DI ABUSO ALCOLICO: CDT
Valeria Crespi,
Ursula Andreotta
Laboratorio di Tossicologia
UO Medicina del Lavoro e
Preventiva
AO Ospedale di Circolo e
Fondazione Macchi Varese

ALCOLISMO
PROBLEMA RILEVANTE IN AMBITO LAVORATIVO CON
RIPERCUSSIONI DI TIPO ECONOMICO
PER GLI ELEVATI COSTI SOCIALI:
RIDOTTA PRODUTTIVITA’
ASSENTEISMO
AUMENTO INFORTUNI
PER LA SALUTE
PER LA SICUREZZA DEI LAVORATORI E DEI LORO COMPAGNI
DI LAVORO

RUOLO DEL LABORATORIO
D’ ANALISI NELL’ABUSO CRONICO
IMPEGNO CRESCENTE NEL TEMPO PER CERCARE DI METTERE
A DISPOSIZIONE DEL CLINICO BIO-MARCATORI IN GRADO
DI RISOLVERE:
PROBLEMI SIA DIAGNOSTICI CHE PRONOSTICI
INDIVIDUARE I FORTI BEVITORI
MONITORARE I PAZIENTI IN REMISSIONE
IDENTIFICARE LE EPATOPATIE DI ORIGINE ALCOLICA DALLE
ALTRE

MARCATORE DIAGNOSTICO IDEALE
DI ABUSO ALCOLICO
ESSERE IL PRODOTTO BIOCHIMICO CORRELATO IN MODO
SPECIFICO CON LA PRESENZA O CON IL METABOLISMO
DELL’ALCOL;
ESSERE DIPENDENTE DAL CONSUMO DI ALCOL;
ESSERE ABBASTANZA SENSIBILE DA PERMETTERE UNA
VALUTAZIONE DEI LIVELLI DI CONSUMO ALCOLICO MINIMI
CHE SI ASSOCIANO A DANNI FISICI E PSICHICI;
ESSERE CARATTERIZZATO DA UNA CINETICA DI
ELIMINAZIONE NOTA, CIOE’ AVERE UN TEMPO DI
DIMEZZAMENTO (t 1/2) RELATIVAMENTE BREVE IN MODO
DA POTER MONITORARE L’ASTINENZA.

CDT(CARBOYDRATE DEFICIENT
TRANSFERRIN) o
TRANSFERRINA DESIALATA
L’INDICATORE BIOLOGICO CDT o TRANSFERRINA
DESIALATA SODDISFA I CRITERI RICHIESTI E
RAPPRESENTA UNO DEI RELATIVAMENTE RECENTI
MARCATORI DI ABUSO ALCOLICO I CUI LIVELLI SIERICI
AUMENTANO IN CASO DI CONSUMO ELEVATO DI ALCOL
UN CONSUMO REGOLARE DI 50-80 g DI ALCOL AL GIORNO,
CORRISPONDENTE AD UNA BOTTIGLIA DI VINO DA 750 mL di
11°-13°, SPESSO SI TRADUCE IN UN ELEVATO VALORE DI CDT
( SENSIBILITA’ > 80% Helander, Department of Clinical
Neuroscience,Karolinska Institude,Sweden)
DOPO ASTINENZA, IL TEMPO DI DIMEZZAMENTO (t 1/2)
DELLA CDT NEL SIERO E’ DI 10 - 15 GIORNI, CON UNA
NORMALIZZAZIONE DOPO 2 – 4 SETTIMANE

ABUSO ALCOLICO
BEVANDE VOLUME g Alcol/gg per 2
settimane che
alterano la CDT
VINO 11° - 13° 0.75 L 60 - 80g
BIRRA 5° 1.5 L 60 - 80g
SUPER ALCOLICI
~ 40°
0.20 L 60 - 80g
Grammi di alcol = ( ml di bevanda alcolica x grado x 0.80 )/100

TRANSFERRINA
L’ABUSO ALCOLICO INTERFERISCE NELLA GLICOSILAZIONE
DELLA TRANSFERRINA
GLICOPROTEINA DEPUTATA AL TRASPORTO DEL FERRO
COMPOSTA DA UNA CATENA POLIPEPTIDICA DI 679aa
DUE DOMINI CON OGNUNO UN SITO SPECIFICO DI LEGAME
PER UNO IONE Fe+++
DUE CATENE COMPLESSE DI N-GLICANI, ACUI IN PARTE E’
DOVUTA LA MICROETEROGENEITA’ DELLA MOLECOLA, CHE
TERMINANO NORMALMENTE CON RESIDUI DI ACIDO
SIALICO

TRANSFERRINA
Glicoproteina con PM = 79,5 kD
H2N
Due siti di legame
per gli ioni Fe 3+
Fe 3+
ACIDO SIALICO da 0 a 8 residui
Due catene di glicani
bi-,tri- o tetra-ramificate
Fe 3+
COOH
Catena polipeptidica di 679 residui amminoacidici divisa in due
domini :
- N-terminale di 336 aa
- C-terminale di 343 aa

TRANSFERRINA ISOFORME
IN ACCORDO CON IL LIVELLO DI RAMIFICAZIONE, LE DUE
CATENE DI N-GLICANI MOSTRANO STRUTTURE BI-TRI- E
TETRA RAMIFICATE E OGNI RAMIFICAZIONE TERMINA CON
UN RESIDUO DI ACIDO SIALICO.
ASIALO-Tf G < 1% MONOSIALO-Tf < 1% DISIALO-Tf < 2%
TRISIALO-Tf 4.5 – 9%
TETRASIALO-Tf 70 – 80% PENTASIALO-Tf 12 - 18%
ESASIALO-Tf ~ 2% EPTASIALO-Tf < 2% OTTASIALO-Tf < 1%

CAUSE dell’ AUMENTO DELLA CDT
L’ABUSO CRONICO DI ALCOL PORTA AD UN’ALTERAZIONE
NELLA BIOSINTESI DELLA TRANSFERRINA CON RIDUZIONE
DELLA GLICOSILAZIONE
Il PROBABILE MECCANISMO E’ L’INIBIZIONE DELLE
GLICOTRANSFERASI EPATICHE DA PARTE DELL’ACETALDEIDE
PRODOTTA DAL CATABOLISMO DELL’ETANOLO
AUMENTO, ETANOLO DIPENDENTE, DELLE SIALIDASI
EPATICHE
INTERFERENZA SUL TRASPORTO DELLE PROTEINE A LIVELLO
DELL’APPARATO DEL GOLGI
QUESTE ALTERAZIONI PORTANO AD UN AUMENTO
SIGNIFICATIVO DELLE ISOFORME CON BASSE
RAMIFICAZIONI COME ASIALO, MONOSIALO E DISIALO
TRANSFERRINA

CDT
LA CDT CORRISPONDE ALLE ISOFORME DELLA TRANSFERRINA
ASIALO, MONOSIALO E DISIALO.
LA MOLECOLA TARGET PER LA STANDARDIZZAZIONE DELLA
CDT E’ LA DISIALO TRANSFERRINA, PRINCIPALE ISOFORMA
(WG-CDT,Ingelheim,2006)
RISPETTO AI MARCATORI TRADIZIONALI DI ABUSO CRONICO
DI ALCOL (GGT, MCV, ALT e AST), LA CDT HA UNA SPECIFICITA’
MAGGIORE INTORNO AL 95%
LA CDT SI PRESENTA COME UN MARCATORE INDIPENDENTE, A
MEDIO TERMINE, NON SOGGETTO A VARIAZIONI CAUSATE DA
ALTRE ALTERAZIONI DOVUTE A FARMACI, DIABETE ,OBESITA’,
EPATOPATIE E DISORDINI EMATOLOGICI.
AFFIANCATA AI MARCATORI TRADIZIONALI, AIUTA IL
CLINICO A DIFFERENZIARE TRA DISORDINI EPATICI DOVUTI
AD ASSUNZIONE DI ALCOL O NO

SENSIBILITA’ E SPECIFICITA’
BIOMARCATORI DI ABUSO ALCOLICO
CRONICO
TEST SENSIBILITA’ SPECIFICITA’ EMIVITA
GGT 34 – 85% 20 – 85% 3 – 4
settimane
MCV 40 – 90% 60 - 90 3 mesi
AST
ALT
15 – 69%
26 – 58%
Bassa
Bassa
2 – 3
settimane
CDT >80% 90 – 97% 2 settimane

ALTRE ISOFORME DELLA
TRANSFERRINA e SINDROMI CDG
ESISTONO ALTRE ISOFORME DELLA TRANSFERRINA, OLTRE A
QUELLE CITATE:
ISOFORME RELATIVE AI LEGAMI CON LO IONE Fe+++
ISOFORME RELATIVE ALLA SOSTITUZIONE DI aa NELLA CATENA
POLIPEPTIDICA, LE COSI’ DETTE VARIANTI GENETICHE .
NE SONO STATE CARATTERIZZATE CIRCA 40, MA SOLO 3-4
HANNO UNA PREVALENZA NELLA POPOLAZIONE DI CIRCA L’1%
I DISTURBI CONGENITI DELLA GLICOLSILAZIONE, CDG
( CONGENITAL DISORDERS OF GLYCOSILATION ), DOVE, LA
MANCATA SINTESI O UN DIFETTO DI SINTESI DI PARTE DELLE
CATENE DI CARBOIDRATI, PORTA AD UN AUMENTO DELLE
ISOFORME CARENTI IN CARBOIDRATI

APPLICAZIONI DOSAGGIO CDT
SCOPI CLINICI
IDENTIFICAZIONE DI POTENZIALI INDIVIDUI A RISCHIO DI
ABUSO ALCOLICO;
MONITORAGGIO DI PAZIENTI IN TERAPIA DI
RIABILITAZIONE DA TALE ABUSO( SIA PER CONTROLLARE
L’ASTINENZA CHE PER INDIVIDUARE LE RICADUTE);
DIFFERENZIAZIONE DI MALATTIA EPATICA DOVUTA AD
ASSUNZIONE O NON DI ALCOL;
INDIVIDUAZIONE PAZIENTI AD AUMENTATO RISCHIO DI
COMPLICAZIONI POST-OPERATORIE O POST-TRAUMATICHE;
INDENTIFICAZIONE DELLE SINDROMI CDG

APPLICAZIONI DOSAGGIO CDT
SCOPI MEDICO-LEGALI
VALUTAZIONE DELL’IDONEITA’ AL RINNOVO DELLA
PATENTE DI GUIDA IN SEGUITO A SOSPENSIONE PER
VIOLAZIONE DELL’ART. 186 DEL CODICE DELLA
STRADA, IN ASSOCIAZIONE AD ALTRI MARKERS DI
ABUSO (GGT, MCV, ALT e AST, BILIRUBINA)
VALUTAZIONE IDONEITA’ PER IL RILASCIO DI ALTRI
PERMESSI AD ES. PORTO D’ARMI

METODI DI LABORATORIO PER CDT
IMMUNOLOGICI ( DI RCENTE INTRODUZIONE UN TEST
BASATO SU REAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO)
CE ( CAPILLARY ELECTROPHORESIS)
HPLC ( HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)
I TEST IMMUNOLOGICI IN GENERE SI BASANO SULLA
INIZIALE SEPARAZIONE ATTRAVERSO MICROCOLONNE A
SCAMBIO ANIONICO SULLA BASE DEL PI DELLE DIVERSE
FRAZIONI E SULLA DETERMINAZIONE IMMUNOCHIMICA
DELLE ISOFORME ELUITE.
DUE PROBLEMATICHE:
- CHE LA FRAZIONE CDT RACCOLTA CONTENGA ISOFORME NON
CDT(TRISIALO E TETRASIALO)
- NON DISTINGUE L’EVENTUALE PRESENZA DELLE VARIANTI
GENETICHE CHE POSSONO DARE RISULTATI FALSI POSITIVI
NEL CASO DELLA VARIANTE GENETICA DI TIPO D, O FALSI
NEGATIVI NELCASO DELLA VARIANTE GENETICA DI TIPO B

METODI DI LABORATORIO PER CDT
LA TECNICA IN ELETTROFORESI CAPILLARE (CE), PERMETTE LA
SEPARAZIONE DELLE VARIE ISOFORME DISTINGUENDO SIA I
PICCHI RELATIVI AD OGNI ISOFORMA SIA LE VARIANTI
GENETICHE.
CON QUESTA TECNICA , POTREBBERO VERIFICARSI DELLE
INTERFERENZE, ALLA LUNGHEZZA D’ONDA DI LETTURA DI 200
nm, DA PARTE DI ALTRE BIOMOLECOLE CON PI SIMILE ( WG-CDT,
Ingelheim, 2006)
LA TECNICA IN CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA
RISOLUZIONE (HPLC) E’ CONSIDERATA IL METODO DI
RIFERIMENTO PERCHE’ PERMETTE LA RIPRODUCIBILE
SEPARAZIONE E IDENTIFICAZIONE DELLE DIFFERENTI
ISOFORME , NONCHE’ DELLE VARIANTI GENETICHE E DELLE
ISOFORME ATIPICHE, CAUSA DI NON CORRETTA
DETERMINAZIONE DELLA CDT CON METODI IMMUNOCHIMICI.
INOLTRE LA MISURAZIONE A 460 nm RENDE IL METODO
SENSIBILE E SPECIFICO CON BASSO RISCHIO DI
INTERFERENZE( WG-CDT, Ingelheim, 2006)

HPLC-METODO RECIPE
PER LA VALENZA MEDICO-LEGALE DELLE RICHIESTE DEL NOSTRO
LABORATORIO, E IN BASE ALLE INDICAZIONI DELLE SOCIETA’
SCIENTIFICHE, LA SCELTA OPERATA E’ STATA QUELLA DELLA TECNICA
CROMATOGRAFICA IN HPLC
IL METODO PREVEDE:
- SATURAZIONE FERRICA DEL CAMPIONE
- INCUBAZIONE PER 30’
- CENTRIFUGAZIONE
- SURNATANTE INIETTATO NEL CROMATOGRAFO (400uL)
- ELUIZIONE A GRADIENTE TERNARIO
- COLONNA A SCAMBIO ANIONICO
- RIVELAZIONE UV-vis A 460 nm
RISULTATO ESPRESSO COME % CDT RISPETTO ALLA TRANSFERRINA
TOTALE

% CDT HPLC
CAMPIONE NEGATIVO
1.5% 4.7% 83% 10.8%

% CDT – HPLC
CAMPIONE PATOLOGICO con asialo Tf
0.7% 7.5% 4.9% 75.7% 11.2%

% CDT – HPLC VARIANTE
GENETICA di tipo D

% CDT- HPLC SINDROME CDG

CASISTICA
VIENE PRESENTATA LA DISTRIBUZIONE DI UNA CASISTICA
DI UN CENTINAIO DI PAZIENTI ANALIZZATI DAL NOSTRO
LABORATORIO, CON METODO RECIPE IN HPLC.
SI TRATTA DI PAZIENTIINVIATI PER LA QUASI TOTALITA’
DALLA COMMISSIONE MEDICA LOCALE PATENTI di GUIDA DI
VARESE.
I VALORI DECISIONALI, SONO STATI CALCOLATI
ANALIZZANDO 20 CAMPIONI DI NON BEVITORI.
IL VALORE DI CUT-OFF RICAVATO È RISULTATO ESSERE DEL
2% .
I CONTROLLI UTILIZZATI, CONFORMI AI DETTAMI DEL WG PER
LA STANDARDIZZAZIONE DELLA CDT HANNO DIMOSTRATO DI
AVERE UN CV% INTER ASSAY IN LINEA CON LE INDICAZIONI
DELLE SOCIETA’ SCIENTIFICHE

CONTROLLO BASSO
Media 1.63%
Ds 0.16
CV% 9.67%
CONTROLLO ALTO
Media 3.54%
Ds 0.22
CV% 6.3%

N° PAZIENTI
DISTRIBUZIONE DEI VALORI DI CDT DI 110 PAZIENTI
Cut off 2%
0,7-0.8 09 -1.0 1.1 -1.2 1.3 -1.4 1.5-1.6 1.7-1.9 2-2.2 2.4-2.5 2.7-3.4
CDT%
Media = 1.2
Mediana = 1.1
Ds = 0.5
Positivi = 8.2%