Regolazione dell'espressione genica negli eucarioti

Regolazione dell’espressione
genica negli eucarioti
Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie

L’inizio della trascrizione
negli eucarioti necessita
della RNA polimerasi e
dei fattori di trascrizione.
Qualsiasi proteina sia
necessaria per l’inizio
della trascrizione, ma non
sia parte della polimerasi,
è un fattore di trascrizione
L’inizio della trascrizione
necessita di un gran
numero di questi fattori,
che legano varie sequenze
cis-agenti.
Il promotore eucariotico
• Il promotore eucariotico è l’insieme di tutti questi siti di legame; la polimerasi si lega solo
vicino al sito di inizio, non contatta le regioni a monte del promotore. Qunidi sono i fattori
di trascrizione che riconoscono il promotore e creano una struttura riconosciuta dall’enzima.
– fattori generici di trascrizione
• Le sequenze che costituiscono il promotore sono localizzate vicino al sito di inizio e sono
necessarie per l’inizio stesso. La presenza dei siti intensificatori (enhancer) invece stimola
l’inizio. Queste sequenze si possono trovare anche a grande distanza dal sito di inizio, e
sono il bersaglio per la regolazione dell’espressione tessuto specifica o temporale.
• La regolazione negli eucarioti è positiva.
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Il complesso di inizio
• Il primo evento è il
legame di TFIID alla
TATA.
• Poi si lega TFIIA. • TFIIB contatta il solco
secondario a valle ed il
solco principale a monte
della TATA box.
• TFIIF (subunità RAP 38)
recluta la polimerasi e la
porta nel complesso.
• Poi si lega TFIIE. • Dopo TFIIE si legano
TFIIH e TFIIJ. TF IIE e TF IIH aprono in
due filamenti di DNA e
permettono alla RNA
polimerasi II di iniziare la
trascrizione. L’attività
chinasica di TF IIH fosforila
il CTD, e questo permette
alla polimerasi di iniziare
la fase di elongazione.
I fattori si staccano.
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L’inizio della trascrizione
negli eucarioti necessita
della RNA polimerasi e
dei fattori di trascrizione.
Qualsiasi proteina sia
necessaria per l’inizio
della trascrizione, ma non
sia parte della polimerasi,
è un fattore di trascrizione
L’inizio della trascrizione
necessita di un gran
numero di questi fattori,
che legano varie sequenze
cis-agenti.
Il promotore eucariotico
• Il promotore eucariotico è l’insieme di tutti questi siti di legame; la polimerasi si lega solo vicino al
sito di inizio, non contatta le regioni a monte del promotore. Qunidi sono i fattori di trascrizione che
riconoscono il promotore e creano una struttura riconosciuta dall’enzima.
– fattori generici di trascrizione
• Le sequenze che costituiscono il promotore sono localizzate vicino al sito di inizio e sono necessarie
per l’inizio stesso. La presenza dei siti intensificatori (enhancer) invece stimola l’inizio. Queste
sequenze si possono trovare anche a grande distanza dal sito di inizio, e sono il bersaglio per la
regolazione dell’espressione tessuto specifica o temporale.
• La regolazione negli eucarioti è positiva.
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Il promotore della RNA
polimerasi II è formato da
due regioni. Il sito di
inizio è identificato dalla
regione Inr e dalla TATA
box nella sue vicinanze.
La RNA polimerasi II,
assieme ai fattori generici
di trascrizione, forma il
complesso di inizio nella
regione del sito di inizio.
Brevi sequenze di riconoscimento
nel promotore legano gli attivatori
GC box
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CAAT box
• L’efficienza e la specificità con cui un promotore è riconosciuto dipendono però da altre
sequenze, situate a monte, che sono riconosciute da altri fattori, chiamati attivatori
– i siti di legame sono ~100 bp a monte del sito di inizio, ma possono essere anche più distanti.
• I motivi di sequenza a monte della TATA influenzano la frequenza di inizio, agendo
direttamente sui fattori generici di trascrizione per aumentare l’efficienza di assemblaggio
del complesso di inizio.
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La struttura del promotore è flessibile
I promotori sono organizzati in maniera combinatoriale.
Diversi elementi possono contribuire alla funzionalità del
promotore, ma nessuno di essi è essenziale per tutti i
promotori. Oltre alla TATA, tre sequenze si trovano in
parecchi promotori: la scatola CG (GC box), la scatola
CAAT (CAAT box) e l’ottamero (una sequenza di 8 paia
di basi). In ogni singolo promotore, sequenze come queste
differiscono per numero, posizione e orientamento.
Nessuna sequenza è comune a tutti i promotori.
• Sebbene il promotore sia direzionale (la trascrizione avviene solo in una direzione) la
“CG box” e la “CAAT box” funzionano in entrambi gli orientamenti
– queste sequenze funzionano solamente come siti di legame al DNA per richiamare i fattori di
trascrizione nelle vicinanze del sito di inizio.
• Gli attivatori ubiqitari agiscono su qualsiasi promotore che contenga la loro sequenza di
legame; tra queste ci sono la “CAAT box”, la “GC box” e l’ottamero. Tutti i promotori
hanno bisogno di uno o più di questi elementi per funzionare efficientemente. Di solito,
un attivatore riconosce una sequenza di DNA di

Gli enhancer contengono elementi si sequenza che funzionano in
entrambi gli orientamenti e che facilitano l’inizio della trascrizione
Non sempre i promotori funzionano
da soli. In alcuni casi l’attività di un
promotore è aumentata enormemente
dalla presenza di un enhancer, che è
composto da un altro gruppo di
sequenze, site però a distanze variabili
da quelle che compongono il
promotore stesso.
Non è necessario che la posizione dello
enhancer sia fissa rispetto al promotore:
essa può essere variata in maniera
significativa. Nei genomi, gli enhancers
si sono trovati all’interno dei geni o a
decine di migliaia di coppie di basi di
distanza in entrambe le direzioni.
• Il promotore è definito dall’insieme delle sequenze di DNA che devono essere in una
posizione (relativamente) rigida rispetto al sito di inizio.
• In base a questa definizione, la TATA box (per esempio) fa parte del promotore, le
sequenze che formano l’enhancer no.
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Gli enhancer contengono gli stessi elementi di sequenza
che si trovano nei promotori
Una differenza tra
l’enhancer ed il promotore
è rappresentata dalla
densità dei motivi di
sequenza. Quando si
effettua un analisi
mutazionale, è molto più
frequente che una
mutazione sia rilevante
quando è fatta all’interno
di un enhancer piuttosto
che all’interno di un
promotore.
• Molte delle sequenze che si trovano negli enhancer sono presenti anche nei promotori; per
esempio, l’ottamero.
• La specificità della trascrizione può essere controllata sia dall’enhancer che dal promotore.
• Un promotore può essere regolato, e un enhancer nelle “vicinanze” può essere usato per
aumentare l’efficienza di inizio della trascrizione.
• Un promotore può non essere regolato, ma diviene veramente efficace quando viene
attivato un enhancer nelle sue “vicinanze”.
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Ci sono vari tipi di fattori di trascrizione
• I fattori generici di trascrizione si legano al sito di
inizio e alla TATA box, assieme alla RNA pol. II
– posizionano la polimerasi ed assicurano che l’inizio
della trascrizione avvenga al punto giusto.
• Gli attivatori sono dei fattori di trascrizione che
riconoscono specifiche, corte sequenze consenso
– si legano a siti nel promotore o nell’enhancer;
– aumentano la frequenza di inizio e sono necessari
per un adeguato funzionamento del promotore;
– alcuni sono presenti in tutte le cellule (ubiquitari);
– altri hanno una funzione regolatoria: sono sintetizzati
o attivati a tempi precisi o in tessuti specifici
• questi fattori sono responsabili del controllo della
trascrizione
La diversità di elementi che costituiscono un promotore funzionale e la variabilità
della loro posizione suggerisce che gli attivatori possono interagire tra loro in
molteplici maniere. E’ stato dimostrato che gli attivatori che si legano sull’enhancer si
vengono a trovare vicino al promotore perchè è il DNA che si ripiega.
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Come agiscono gli attivatori
Gli attivatori sono composti da domini indipendenti:
• il dominio di legame al DNA (classificazione degli attivatori);
• il dominio di connessione (linker);
• il dominio di attivazione vero e propio.
I motivi di sequenza del promotore possono essere ad una
distanza considerevole da sito di inizio, e orientati in
entrambe le maniere; gli enhancer possono essere ancora più
lontani: la struttura dell’attivatore deve essere flessibile.
• Il dominio di attivazione agisce contattando i fattori
generici di trascrizione coinvolti nelle fasi iniziali di
assemblaggio del complesso di inizio
– tipicamente TF IID, TF IIB o TF IIA.
• La funzione dell’attivatore è quella di facilitare ed
accellerare l’assemblaggio del complesso di inizio.
• TFIID è formato da TBP e da 11 TAF: il ruolo
principale dei TAF è di creare un collegamento tra
l’apparato basale e gli attivatori
– diversi TAF possono fornire le superfici di contatto per
diversi attivatori.
Altri attivatori con un dominio di attivazione ad alta carica negativa (acidic activators)
aumentano invece l’efficienza con cui TFIIB è reclutato nel complesso di inizio.
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Altri tipi di attivatori
• A volte l’attivatore
non ha un dominio di
attivazione
• In questo caso
l’attivatore lega
un’altra proteina che
ha un dominio di
attivazione: un
coattivatore, che
fornisce il
collegamento tra il
dominio di legame al
DNA e l’apparato di
base della
trascrizione.
Infine, alcuni regolatori agiscono cambiando la struttura
della cromatina e rendendola più accessibile alla
trascrizione.
In genere la gerarchia é: attivatore→(coattivatore)→ fattori
generici di trascrizione→RNA polimerasi II
–questo spiega la flessibilità di costruzione del sistema: i
fattori non devono contattare direttamente la polimerasi.
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Regolazione
degli attivatori
• Sintesi.
• Modificazione.
• Attivazione
indotta da
ligando.
• Taglio
proteolitico da
un precursore
inattivo.
• Associazione
con altre
proteine.
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Il legame al DNA:
dita con zinco
Le “dita con zinco” (zinc fingers) prendono il nome dalla
loro struttura, in cui un piccolo gruppo di amminoacidi
conservati legano un atomo di zinco, formando un dominio
indipendente nella proteina. Il consenso per un “dito” è:
Cys-X 3 -Cys-X 12 -His-X 3 -His, in complesso 23 amminoacidi
e sono chiamate “dita Cys 2 /His 2 ”.
• Gli attivatori di questa classe hanno da un minimo di
2 “dita” fino a un massimo di 27 “dita”.
• Ci sono mediamente 7-8 amminoacidi tra due “dita”.
• La parte C-terminale di ogni “dito” forma una α-elica
che lega il DNA, mentre la parte N-terminale forma
un foglietto β.
• Le α-eliche si infilano nel solco maggiore del DNA
instaurando delle interazioni sequenza-specifiche.
• Gli amminoacidi non conservati nella regione Cterminale
(α-elica) sono responsabili della specificità
di riconoscimento.
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I recettori
degli steroidi
• I recettori degli steroidi sono attivatori.
• Le diverse attività biologiche dei vari
steroidi dipendono da quali geni
vengono “accesi” dagli attivatori con
cui ogni steroide interagisce.
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Il legame dei recettori degli steroidi alla sequenza
bersaglio è indotto dall’interazione con il ligando
Il dominio di legame al DNA ha 2 “dita di zinco”, di tipo leggermente diverso, con un
consenso Cys-X 2 -Cys-X 13 -Cys -X 2 -Cys, chiamato “dito di zinco Cys 2 /Cys 2 ”.
• Gli steroidi attraversano la membrana per
semplice diffusione (sono idrofobici).
• Nella cellula, legano il recettore nella regione
C-terminale della proteina
– il complesso ormone recettore si ritrova nel nucleo
• Con meccanismi che dipendono dai singoli
recettori, il recettore diventa capace di legare la
sua sequenza bersaglio sul DNA, che di solito si
trova in un enhancer.
• Due copie del recettore/attivatore legano una
singola sequenza di riconoscimento
– molti attivatori agiscono in realtà come dimeri.
A questo punto, il promotore associato all’enhancer è attivato e la trascrizione inizia.
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L’omeodominio
L’omeodominio è una
sequenza conservata di 60
amminoacidi presente in
alcuni attivatori. Attivatori
contenenti un omeodominio
sono presenti in tutti gli
eucarioti. L’omeodominio è
il dominio di legame al DNA
• L’omeodominio forma 3 α-eliche.
• L’elica 3 entra nel solco maggiore ed è
responsabile per il maggior numero di contatti.
• Altri contatti sono a carico della regione Nterminale
dell’omoedominio, che entra nel solco
minore.
• Un numero relativamente piccolo di amminoacidi
nell’elica 3 e nella regione amminoterminale sono
responsabili della specificità di riconoscimento.
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Da “I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER
L’omeodominio
• Conseguenze della mutazione della
proteina bithorax.
• Conseguenze della mutazione della
proteina antennapedia.
Da “I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER
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La serratura di leucine (leucine zipper)
Le proteine a “serratura di leucine” devono il loro nome alla ripetizione di 4 o 5
residui di leucina posti a distanza fissa uno dall’altro. Questa caratteristica fa si che
due proteine che contengono queste ripetizioni di leucine interagiscono tra loro a
formare dei dimeri.
• Si formano delle α-eliche in cui gli amminocidi
idrofobici (tra cui le leucine) sono da un lato e
gli amminoacidi polari sono dall’altro.
• Le leucine della α-elica della prima proteina si
incastrano nelle leucine della α-elica della
seconda proteina, formando il dimero.
• La regione N-terminale delle due proteine è
fortemente basica (carica positivamente) e forma
il dominio di legame al DNA.
Si forma una struttura a Y, in cui il gambo della Y è formato dalla serratura di
leucine, e le due regioni basiche si biforcano simmetricamente formando le braccia
che legano il DNA. La sequenza bersaglio di queste proteine è una palindrome.
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