interpretazione critica degli esami coagulativi di primo livello

INTERPRETAZIONE CRITICA
DEGLI ESAMI COAGULATIVI DI
PRIMO LIVELLO
Barbara Montaruli
Laboratorio Analisi
Ospedale Evangelico Valdese, Torino

Fasi processo emostatico
ADESIONE PIASTRINICA

Fasi processo emostatico
ATTIVAZIONE PIASTRINICA

S
H
A
P
E
C
H
A
N
G
E
ADP, TxA2, PAF : attivano plts

S
H
A
P
E
C
H
A
N
G
E

Fasi processo emostatico
AGGREGAZIONE PIASTRINICA

Aggregazione

Fasi processo emostatico
ATTIVAZIONE COAGULAZIONE

Fasi processo emostatico
ATTIVAZIONE FIBRINOLISI

Processo Coagulativo

1° enzima converte substrato
in un 2° enzima
L’ultimo attiva un altro
substrato, e così via …..
Spesso durante l’attivazione
dei substrati vengono
rilasciati piccoli marker di
attivazione della cascata in
vivo (F1+2)
Cascata Enzimatica
Enzimi sono altamente
specifici, le reazioni non
possono essere bypassate

Processo Coagulativo
Il processo coagulativo avviene sulla superficie (PL) delle
cellule e in presenza di cofattori!!!!
Cofattori

Fattori vitamina K dipendenti
• VII
• IX
• X
• II
• posseggono GLA domain (residui di acido y
carbossi glutammico) essenziali per il legame con
i PL anionici. La carbossilasi che interviene
nell’attacco nell attacco dei GLA domain ai fattori ha bisogno
della vit. K

Fattori vitamina K dipendenti
GLA domain
F VII
Se GLA domain
mancano non possono
attaccarsi alle superfici
anioniche, pertanto le
reazioni coagulative
avvengono in maniera
molto rallentata
PL

Via Intrinseca e Comune

Via Estrinseca e Comune

Coagulazione nuovo schema

Cascata coagulativa: nuovo schema

Formazione Fibrina

Fibrinogeno

Formazione di fibrina

Formazione di fibrina

Formazione di fibrina
Legami covalenti

Meccanismi controllo coagulazione
AT

Fase pre-analitica
pre analitica
• Un controllo non ottimale delle variabili connesse al
prelievo, al trattamento e alla conservazione del campione
può compromettere in modo sostanziale l’affidabilità della
risposta nei test di coagulazione.
• Fase pre-analitica:
condizioni paziente al momento prelievo
raccolta campione di sangue
• modalità prelievo
• contenitore
• anticoagulante e sua concentrazione
• rapporto sangue anticoagulante
preparazione plasma
conservazione campione (sangue intero o plasma)

Fase pre-analitica
pre analitica
variabilità variabilit biologica del paziente
• Fattori a lungo termine
– età
• neonati tempi coagulazione più
lunghi - fattori vitamina K
dipendenti più bassi si
normalizzano 5a-10a settimana
• menopausa: aumentano VII e VIII
– sesso
• non esistono differenze sostanziali
fra i due sessi per quello che
riguarda i test globali
– gravidanza
• aumento attività maggior parte
fattori, diminuisce PS, APC
resistance acquisita
• Fattori a breve termine
– stress
• aumento VIII e VIII:Ag
– attività fisica
• aumento VIII e VIII:Ag
– fumo
• aumento fibrinogeno, VIII e VIII:Ag
– farmaci
• danno epatico (anestetici, antibiotici,
antidepressivi anineoplastici…),
piastrinopenia antimitotici, aspirina,
eparina..), piastrnopatia asprina,
anestetici…)
– traumi
• aumento fibrinogeno, VIII:C e VIII:Ag
– ritmi circadiani
• firbrinogeno aumenta e APTT
diminuisce nel corso della giornata
– gruppo sanguigno
• gruppo 0 numero plts ridotto, VIII e
VIII:Ag più bassi
Sono importanti ai fini della definizione dei corretti intervalli di riferimento.

Fase pre-analitica
pre analitica
raccolta campione di sangue
• Minore traumatismo possibile e con minima stasi per
evitare il rilascio TF.
• Mai usare per prelievo cateteri a permanenza per il
pericolo di contaminazione da farmaci (eparina!!!!!!!)
oppure scartare i primi 20-30 ml.
• Uso di sistemi sottovuoto è preferibile al prelievo
tradizionale con ago e siringa perché vi è una maggiore
standardizzazione nella forza di aspirazione e una minore
incidenza di emolisi.
• Imperativo uso di materiale non contattante ovvero
incapace di attivare XII e XI plastica o vetro siliconato.

Fase pre-analitica
pre analitica
raccolta campione di sangue
• Anticoagulante:
citrato di sodio alle concentrazioni 3.2% (0.109M del sale
dididrato) o 3.8% (0.129M del sale diidrato).
diverse concentrazioni danno valori di INR diversi in
funzione dello strumento usato.
gli organismi preposti alla standardizzazione consigliano il
3.2% (0.109M).
In Italia la più prevalentemente usata è la 0.129 M
DOBBIAMO ADEGUARCI!!!!!

Fase pre-analitica
pre analitica
raccolta campione di sangue
• Perché è meglio la concentrazione 0.109
mol/L (3.2%)
conformità ai metodi di assegnazione ISI
conformità agli intervalli terapeutici APTT in
terapia eparinica
maggiore sensibilità alle carenze fattori
coagulazione

Fase pre-analitica
pre analitica
raccolta campione di sangue
Rapporto sangue anticoagulante tradizionalmente
9 (sangue):1(anticoagulante):
per volumi di sangue minori la concentrazione di citrato
aumenta, il citrato non entra nelle cellule con significativi
aumenti dell’APTT meno sul PT.
Riempire provetta per almeno l’80%.
Verificare sempre l’assenza di coaguli.

• Materiali di controllo:
Materiali CQI
– standards liofili a due livelli (normale e patologico)
– Pool di plasmi freschi congelato
• Materiali di riferimento:
– 1) plasmi calibranti commerciali
– 2) Pool di plasmi freschi congelato

Procedure controllo della fase
analitica
• All’inizio di ogni giornata lavorativa ed almeno
una volta/ciclo
• Nei laboratori ad elevato carico di lavoro devono
essere ripetuti ogni 20 analisi
• Prima di essere utilizzati i liofili vanno analizzati
(20gg in 20 sedute analitiche diverse) per calcolo
media e ds

Fase post-analitica
post analitica
Variabili
• Modalità di espressione dei risultati
– corretta dicitura (per es AT e non AT III)
– corretta Unità di misura (PT INR e ratio e
non %)
– formulazione diagnostica se necessario
• Definizione intervallo di riferimento

Intervallo di riferimento
• Ogni laboratorio deve calcolare il proprio
intervallo di riferimento (ranges di normalità)
analizzando un certo numero (20 soggetti almeno
ugualmente suddivisi fra uomini e donne) di
campioni prelevati da soggetti sani rappresentativi
della popolazione che afferisce al laboratorio.
• Tali soggetti non devono avere malattie conosciute
o assumere farmaci.

Intervallo di riferimento
• L’intervallo di riferimento deve essere ricalcolato
ogni volta che interviene qualsiasi variazione nel
sistema operativo:
– nuovo strumento
– nuovo reagente
– modifiche nella metodica

Pool
• Un pool di plasmi normali serve come standard
per esprimere i risultati dei test di laboratorio;
per questo motivo deve essere preparato,
conservato ed usato seguendo delle procedure
ben definite che sono riportate qui di seguito.

Preparazione Pool
Selezionare un numero di soggetti normali adeguato allo scopo.
Eseguire il prelievo di sangue citratato.
Centrifugare i campioni con tecnica standard.
Separare il plasma dalle cellule, ignorando la parte di plasma a
diretto contatto con le cellule (e’ ricca in piastrine).
Trasferire parti uguali del plasma dei soggetti prescelti in un
contenitore di plastica e mescolare dolcemente.
Dispensare in aliquote (0.5-1 ml), utilizzando provette di plastica dal
volume appropriato e con chiusura ermetica (tappo a pressione, o a
vite).
• Durata e temperatura della preparazione
Tutte le operazioni (dal prelievo al congelamento devono
concludersi entro 3 ore).
Per gli scopi piu’ generali, tutte le operazioni devono essere
eseguite a temperatura ambiente (controllata).

Conservazione e utilizzo Pool
• Conservazione
Congelare rapidamente il contenuto delle provette immergendole in
azoto liquido (o miscela di ghiaccio secco e etanolo).
Conservare le provette in congelatore a –70 °C.
• Utilizzo
Scongelare poco prima dell’uso a temperatura controllata (bagnomaria,
37 °C, per 2-3 minuti) e rimescolare dolcemente il plasma
prima dell’uso.
Si esegue il test sul pool indiluito in serie con i campioni dei pazienti e
si utilizza per esprimere i risultati di tutti i test classici che prevedono
la determinazione di un tempo di coagulazione (PT, APTT, Tempi di
Trombina e Reptilase, ecc.). Il risultato puo’ essere espresso
convenientemente in rapporto (tempo-paziente/tempo-pool).
Si esegue il test sul pool opportunamente diluito (secondo la metodica)
e si utilizza per esprimere i risultati di tutti i test che prevedono la
determinazione di un’attivita’ (o concentrazione antigenica) in forma
di unita’ o percentuale (PT, singoli fattori, ecc.).

CQI: Livello Normale

CQI: Livello Patologico

CQI: Pool

VEQ: PT
secondi

VEQ: PT
ratio

VEQ
NEQAS

Tipologia richieste esami
emostasi afferenti ad un
laboratorio generale
Screening Pre-operatorio
Valutazione Protidosintesi Epatica
Controllo Terapie Anticoagulanti (Orale,
Raro Eparinica)
Diagnosi Malattie Emorragiche
Diagnosi Malattie Trombotiche
Emergenze Emorragiche

SCREENING
PRE-OPERATORIO
PRE OPERATORIO
• Conta piastrinica
• PT
• APTT

Malattie epatiche
• PT (il primo a prolungarsi)
• APTT (spesso prolungato)
• Fibrinogeno (tende a diminuire)
• Conta piastrinca (bassa in concomitanza
spesso a ipersplenismo con sequestro plts.)

Controllo terapie
antitrombotiche
• PT (pazienti in TAO)
• APTT (pazienti in terapia eparinica non
frazionata, raro)
• Eparina Xa (solo alcuni pazienti in terapia
con LMWH: gravidanze a rischio
trombofilico, insuff. renale , grandi obesi)

Test di primo filtro
della coagulazione
Sono le prove minime e sufficienti per consentire
un bilancio preoperatorio o un approccio
diagnostico alla normalità:
• Tempo di emorragia
• Conteggio delle piastrine
• Tempo di tromboplastina parziale attivato
(APTT)
• Tempo di protrombina (PT)
Tripodi A. Linee guida SISET 1998

Test di primo filtro
TEMPO DI EMORRAGIA
• test globale di esplorazione della fase vasculopiastrinica
• alterato nelle PIASTRINOPENIE e nelle
PIASTRINOPATIE
• definito come tempo (minuti) necessario
all’arresto del sanguinamento provocato da
punture o incisioni superficiali eseguite, in
condizioni standardizzate, sull’avambraccio del
paziente.

Test di primo filtro
TEMPO DI EMORRAGIA
• influenzato da variabili analitiche e deve essere
eseguito con perizia e soprattutto
standardizzando scrupolosamente la procedura.
• metodo Ivy standardizzato: lama da bisturi
inserita in un portalama automatico a scatto
produce una incisione sulla cute della faccia
volare dell’avambraccio, mentre a monte con lo
sfigmomanometro si esercita una pressione
costante di 40 mmHg.

Test di primo filtro
TEMPO DI EMORRAGIA
• nell’interpretazione tenere sempre presente
l’influenza dei farmaci che interferiscono
con la fase vasculo-piastrinica dell’emostasi
(per es. aspirina e farmaci antifiammatori
non steoridei)
• tempo normale è < o = a 8 minuti
• alternativa: PFA-100

PFA-100 PFA 100
• Utlizza sangue intero attraverso un sistema
di capillari
• Mima la condizione di alto shear stress
presente in vivo
• Sistema rapido, non necessita della presenza
del paziente, non è operatore dipendente

PFA-100 PFA 100
Il sistema PFA-100 ® simula la condizione In Vivo
Flusso
Agonisti
Collagene
Tappo Piastrinico
Cartuccia del PFA-100 ®

PFA-100 PFA 100
• Variabili che modificano PFA-100
– HB
– HCT
– conta plts
– ASA, FANS ecc.

• COL/EPI
PFA-100 PFA 100
– Cartuccia per lo screening
– Sensibile all’ASA, malattia di von Willebrand,
difetti piastrinici congeniti, trombocitopenia, basso
ematocrito e vari agenti inibitori delle piastrine
• COL/ADP
– Utilizzata quando COL/EPI è anormale per
discriminare tra disfunzioni indotte da ASA e
difetti congeniti
– il tempo di chiusura è solitamente normale dopo
assunzione di ASA

Test di primo filtro
CONTEGGIO DELLE PIASTRINE
• indica se il numero delle plts è sufficiente per
un’emostasi efficace
• la PIASTRINOPENIA è una delle cause più
comuni di sanguinamento
• fornito dai contaglobuli automatici insieme
all’emocromo
• esplora l’emostasi primaria (fase vasculopiastrinica)
• intervallo di riferimento normale per il
conteggio: 150-450 plts/mm 3

Test di primo filtro
CONTEGGIO DELLE PIASTRINE
• è importante escludere una
pseudopiastrinopenia da EDTA
• è utile verificare i risultati su striscio di
sangue periferico colorato con May
Grunwald-Giemsa per avere informazioni
su morfologia e distribuzione delle plts

PT
Tempo in (secondi) necessario affinchè
un’aliquota di plasma povero di piastrine
coaguli in seguito all’aggiunta di un estratto
tissutale (tromboplastina) e ioni calcio a
37°C.
Sensibilità a carenze multiple o isolate di VII,
X, V, II e fibrinogeno.
X
V
Va
PL
Ca
VII/VIIa
PL, Ca
Xa X
Via comune
Protrombina Trombina
Via estrinseca
Danno tessutale
Fattore tessutale (TF)
Fibrinogeno Fibrina

Test di primo filtro
TEMPO DI PROTROMBINA (PT)
• tempo in (secondi) necessario affinchè
un’aliquota di plasma povero di piastrine
coaguli in seguito all’aggiunta di un
estratto tissutale (tromboplastina) e ioni
calcio a 37°C.
• Esplora la via ESTRINSECA

Test di primo filtro
TEMPO DI PROTROMBINA (PT)
• PT è prolungato:
*carenza dei fattori VII, X, V, II e fibrinogeno
*carenza di vit. K
*in presenza di eparina
*in presenza di anticoagulanti orali
*epatopatie

PT
Procedimento analitico
Tempo di coagulazione del plasma citratato
povero di piastrine dopo aggiunta di
quantità ottimali di estratto tissutale
(tromboplastina) e ioni calcio.

PT
Reagenti
Tromboplastina
Costituita da fosfolipidi (fosfatidilcolina e
fosafatidil-etanolamina) estratti da
cervello, placenta o polmoni (umani, di
coniglio, bue o scimmia) o di derivazione
ricombinante (umana).
Le tromboplastine più vicine alla specie
umana sono le più sensibili.
Alla tromboplastina vengono aggiunti ioni
calcio.

PT
Reagenti
Tromboplastina: ISI
Per ottenere gli stessi risultati con tutte le
varie tromboplastine queste vengono
attualmente calibrate contro un
riferimento internazionale.
Per ognuna di esse viene definito un ISI
(indice di sensibilità internazionale)
espressione della sensibilità rispetto alla
tromboplastina di riferimento.

PT
Reagenti
Tromboplastina: ISI
Esistono tre diversi standard internazionali
corrispondenti a tre diversi estratti tissutali di
origine: umana, bovina e di coniglio.
I tre standard attuali sono calibrati contro la
standard ancestrale che ha ISI = 1 per definizione.
La calibrazione del PT contro gli standard
internazionali è a cura del produttore che fornisce
valori di ISI al laboratorio per quella
tromboplastina.

PT
Reagenti
Tromboplastina: ISI
* ISI = international sensitivity index
corrisponde allo slope della retta di regressione
ortogonale ottenuto confrontando la
tromboplastina in uso con lo standard
internazionale di riferimento
ISI = 1 sensibilità uguale standard internaz.
ISI < 1 sensibilità maggiore standard internaz.
ISI > 1 sensibilità minore standard internaz.

PT
Reagenti
Tromboplastina: ISI
ISI = international sensitivity index
sistemi con ISI < o = a 1 sono da preferire
Attualmente molte ditte produttrici
forniscono valori di ISI specifici delle loro
tromboplastine validi per gli strumenti diffusi
in commercio si consiglia quindi di usare
sistemi (reagente/strumento) con valori di ISI
specifico.

PT
Espressione dei risultati
tempo coagulazione (secondi)
attività % (estrapolata da una curva dose risposta,
allestita con opportune diluizioni scalari NP
riportando su un sistema di assi i tempi e le
rispettive %)
PT ratio (rapporto tempo di coagulazione del
plasma da testare e quello di un pool di plasmi
normali)
INR (International Normalized Ratio)
(PT paziente/PT normal pool) ISI

PT
Espressione dei risultati
• INR = (PT paziente/PT normal pool) ISI dipende:
– dalla variabile ISI
– dalla variabile PT paziente
– dalla variabile PT normale
• Validità INR solo nelle seguenti situazioni:
– pz in TAO
– per un ambito di coagulazione fra 1.5 - 4.5
– nella fase stabile della terapia

PT
Espressione dei risultati
INR dovrebbe permettere di superare il problema
della variabilità dei sistemi di misura e consentire
la comparabiltà dei risultati ottenuti in laboratori
diversi
Esprimere PT in ratio (o secondi e ratio) non in
INR in situazioni cliniche al di fuori della TAO in
quanto per determinare l’ISI si utilizzano plasmi
di pazienti in TAO e quindi il valore del’ISI che
ne risulta può non essere valido per altri difetti.

PT
Espressione dei risultati in %
• Questo significa che a livelli alti e a livelli bassi di
attività bastano pochi decimi di secondo di differenza
nei tempi di coagulazione per leggere percentuali di
attività fra loro diverse.
• Questo comportamento è dannoso. Ad esempio, un
valore di 100% può benissimo diventare del 150% solo
cambiando il tempo di coagulazione di una frazione di
secondo. Quando ciò accade il medico ed il paziente si
preoccupano perché nell’immaginario collettivo avere
un PT corto (percentuale alta) viene interpretato come
una tendenza all’ipercoagulabilità per la quale non ci
sono fondamenti.

PT
Espressione dei risultati
Variabile PT Normale
• PT normale utilizzato per calcolare il rapporto
è una altra delle variabili che possono
influenzare la ratio e l’INR.
• Per le linee guida OMS l’ideale per ottenere il
valore del PT normale è di calcolare la media
geometrica di 20 o più soggetti normali
determinata con il sistema (lotto reagente e
strumento) in uso (MNPT).
• In alternativa usare il valore di PT in secondi di
un pool di plasmi congelato o liofilo

PT
Espressione dei risultati
Variabile PT Normale
• In alternativa usare il valore di PT in secondi di un pool di plasmi
congelato o liofilo.
• Svantaggi di questi 2 metodi soprattutto del PT normale liofilo è che
il valore spesso si discosta dal valore medio della popolazione
normale introducendo così una variabile indesiderata nel calcolo
dell’INR.
• La media predeterminata oltre che più pratica, avrebbe il vantaggio
di rappresentare più fedelmente di quanto non faccia il pool il valore
medio della popolazione. Però la media predeterminata avrebbe lo
svantaggio di dipendere dal lotto di reagente usato. Ci sono ampie
variazioni da lotto a lotto, soprattutto per alcuni reagenti del
commercio. Pertanto, sarebbe necessario ricalcolare il valore ad ogni
cambio di lotto.

PT
Espressione dei risultati
Variabile PT Normale
• Il pool giornaliero avrebbe il vantaggio di tenere sotto
controllo la variabilità metodologica normalizzando i risultati
ottenuti in giorni diversi. Per contro questo vantaggio non
sarebbe possibile usando la media di più normali
determinata in precedenza che, per definizione, sarebbe
sempre la stessa.
• Considerando i pro e i contro, penso che la scelta più
semplice sia l'uso del pool giornaliero che, se preparato e
conservato correttamente, è un valore di sicuro riferimento.
Se la scelta cade sul pool è opportuno che questo sia
analizzato insieme ai campioni dei pazienti in ogni serie
analitica.

PT
Reagenti
Sensibilità Sensibilit dei reagenti alle carenze fattoriali
I reattivi per la misura del PT devono essere in grado di
rilevare carenze del 30% (0,3 U/ml) di fattori della via
estrinseca (VII) e comune (II, V, X).
Uno studio CISMEL ha dimostrato una buona
sensibilità delle varie tromboplastine per i fattori V e X
anche a livelli critici di concentrazione del 20-30%; per il
fattore II molti reagenti hanno dato risultati falsamente
negativi per concentrazioni pari al 25-40%.
Per carenze gravi (livelli inferiori al 10%) tutti i reagenti
del commercio sono in grado di segnalare l’alterazione.

HMWK
PK
XII XIIa
Via intrinseca
XI XIa
IX IXa
VIII VIIIa
PL
Ca
X
V
Va
PL
Ca
APTT
Tempo (in secondi) richiesto per la
formazione del coagulo di fibrina in un
campione di plasma citratato, povero di
piastrine, per azione di un attivatore della
fase di contatto e in presenza di fosfolipidi
che simulano quelli piastrinci.
Sensibilità a carenze multiple o isolate di tutti
i fattori delle coagulazione eccetto VII e XIII.
Xa X
Via comune
Protrombina Trombina
Fibrinogeno Fibrina

Test di primo filtro
TEMPO TROMBOPLASTINA PARZIALE
ATTIVATO (APTT)
• tempo (in secondi) necessario affinchè un’aliquota
di plasma povero di piastrine coaguli in seguito
all’aggiunta di un attivatore della fase di contatto
(caolino, ac. ellagico, silice micronizzata), di
fosfolipidi in funzione di un sostituto piastrinico e
ioni calcio a 37°C.
• Esplora la via INTRINSECA.

Test di primo filtro
TEMPO TROMBOPLASTINA PARZIALE
ATTIVATO (APTT)
• APTT è prolungato:
*carenza dei fattori precallicreina, chininogeno
ad alto peso molecolare, XII, XI, IX, VIII, X,
V, II e fibrinogeno
*in presenza di anticoagulanti circolanti (LA,
anticorpi anti fattore)
*in presenza di eparina
*in presenza di anticoagulanti orali

Test di primo filtro
TEMPO TROMBOPLASTINA PARZIALE
ATTIVATO (APTT)
I valori sono espressi in secondi e in Ratio (per
migliorare la comparabilità dei risultati fra i vari
laboratori perché tutti i valori vengono corretti
contro il plasma di riferimento e l’influenza
delle variabili, dipendenti dal tipo di reattivo e
dalle condizioni di lavoro, viene attenuata).
Ratio = rapporto tra l’aPTT del plasma
campione e quello del plasma di riferimento
(NP).

aPTT
Procedimento analitico
Il plasma citratato, un attivatore di contatto, e dei
fosfolipidi (PL) procoagulanti vengono mescolati e
incubati a 37°C. L’attivatore di contatto attiva i
Fattori XI e XII. I PL forniscono la superficie per
l’interazione dei fattori della coagulazione. Dopo
l’incubazione viene aggiunta una concentrazione
appropriata di Ioni Calcio (gli ioni calcio
promuovono l’attivazione della via intrinseca della
cascata coagulativa) e misurato il tempo di
formazione del coagulo.

aPTT
Reagenti
Tromboplastina parziale
Reagente costituito da fosfolipidi (PL)
che simulano quelli piastrinici e da un
attivatore della fase di contatto (celite,
caolino, ac. ellagico, silice micronizzata)
associati in forma liofila o liquida in
un’unica confezione.

aPTT
Reagenti
Tromboplastina parziale
Fosfolipidi
I fosfolipidi ottenuti per estrazione da
organi umani o animali, sono costituiti in
opportune concentrazioni da:
fosfatidilserina
fosfatidilcolina
fosfatidil- etanolamina
trigliceridi

aPTT
Reagenti
Tromboplastina parziale
Attivatori fase di contatto
Sono sostanze esogene naturali a diverso
p.m.:
ac. Ellagico
celite
caolino
silice micronizzata

aPTT
Reagenti
Tromboplastina parziale
Attivatori fase di contatto
Ac. ellagico: attivatore rapido, ha il vantaggio, essendo
solubile, di assicurare quantità di attivatore uguali ed
omogenee ad ogni dosaggio.
Caolino, silice, celite: insolubili, tendono a sedimentare,
necessitano, pertanto, la riomogenizzazione prima dell’uso.
Caolino insolubile: dà misure poco riproducibili e non si
adatta ad apparecchi di tipo ottico, ma sembra più sensibile
al deficit di fattore VIII ed, in assenza di fosfolipidi, alla
ricerca LAC.

aPTT
Reagenti
Reagente ausiliario
Reagente ausiliario è una soluzione di
Calcio Cloruro (CaCl2):
0,020 M
0,025 M

aPTT
Reagenti
Sensibilità Sensibilit dei reagenti alle carenze fattoriali
I reattivi per la misura dell’aPTT devono essere in grado
di rilevare carenze del 30% (0,3 U/ml) di fattori della
via intrinseca.
Uno studio CISMEL ha dimostrato una buona
sensibilità delle varie tromboplastine parziali per i
fattori IX, XI, XII anche a livelli critici di
concentrazione del 20-30%; per il fattore VIII molti
reagenti hanno dato risultati falsamente negativi per
concentrazioni pari al 25-40%.
Per carenze gravi (livelli inferiori al 10%) tutti i reagenti
del commercio sono in grado di segnalare l’alterazione.

aPTT
Reagenti
Sensibilità Sensibilit dei reagenti al lupus anticoagulant
Diversi reagenti aPTT presentano diversa sensibilità nei
confronti del LA. Ciò dipende dalla potenza dell’inibitore e
dalla concentrazione e composizione dei PL del reagente. E’
possibile un aPTT normale in presenza di LAC.
Variazioni aPTT per accrescere la sensibilità del test
coagulativo.
Diminuzione concentrazione PL vedo inibitori poco
potenti. (KCT, DRVVT, SCT)
Aumento concentrazione PL sopprimo effetto LA
agevolando diagnosi differenziale con altri inibitori.
(KCT conferma, DRVVT conferma, SCT conferma)

aPTT
Reagenti
Diversa sensibilità sensibilit diversi reattivi aPTT
Ac. Ellagico: poco sensibile alle carenze di
fattore comprese fra il 30-50%. Insensibile
alla carenza di fattore XII. Poco sensibile
al LA.
Caolino, silice: Più sensibili alle carenze di
fattori. Più sensibili al LA.
Diversa concentrazione : diversa
sensibilità al LA.

aPTT
Suggerimenti NCCLS specifici per l’aPTT l aPTT
I controlli devono includere un pool di plasmi
normali ed un campione anormale. Essi devono
essere analizzati all’inizio di ogni giornata
lavorativa e almeno una volta all’inizio di ogni
ciclo. Nei laboratori dove c’è un elevato carico di
lavoro i controlli devono avvenire almeno ogni 20
analisi. In alternativa è sufficiente un re-run di un
campione anormale (in quanto più sensibile a
identificare i cambiamenti nel sistema) ogni 40
determinazioni.

aPTT
Suggerimenti NCCLS specifici per l’aPTT l aPTT
Il sistema deve dare risultati anormali con
plasmi che hanno attività inferiore al 30%
dei fattori VIII, IX, XI, XII e deve essere
sensibile all’eparina. Tale sensibilità può
essere determinata aggiungendo
concentrazioni terapeutiche di eparina a
plasma normale e determinanado quindi i
tempi di coagulazione di ciascun campione.

aPTT
Fonti di errore
Le fonti di errore più comune sono:
I reagenti contaminati o ricostituiti in maniera
errata sia per quanto riguarda il volume sia per
quanto riguarda il tipo di diluente.
Gli errori nelle condizioni operative (mancato
rispetto nei tempi di incubazione, delle variazioni
nella temperatura, del pH, della dispensazione
dei volumi dei reagenti.

aPTT
Espressione dei risultati
I valori sono espressi in secondi e in Ratio (per
migliorare la comparabilità dei risultati fra i vari
laboratori e nello stesso laboratorio in giorni
differenti, perché tutti i valori vengono corretti
contro il plasma di riferimento e l’influenza delle
variabili, dipendenti dal tipo di reattivo e dalle
condizioni di lavoro, viene attenuata).
Ratio = rapporto tra l’aPTT del plasma campione e
quello del plasma di riferimento.

aPTT
Espressione dei risultati
L’espressione dei risultati come ratio, sebbene
vantaggiosa, perde parte dell’efficacia per la
mancanza in commercio di un plasma che abbia i
requisiti di riferimento.
Il pool di plasmi normali congelato a -80°C può
essere un riferimento idoneo se costituito da un
numero di campioni tale da eliminare la variabilità
biologica e l’eccessiva oscillazione dei valori nelle
varie preparazioni.

aPTT
Espressione dei risultati
Intervallo di riferimento: ogni laboratorio
dovrebbe costruire il proprio intervallo di
riferimento analizzando un numero minimo
di 20 campioni prelevati da soggetti sani che
non assumono farmaci rappresentativi della
popolazione afferente al laboratorio. Sui
valori ottenuti deve essere calcolata la media
+/- 2 D.S.

Test di secondo filtro
Se test di primo filtro alterati per giungere all’identificazione del
difetto:
Aggregazione piastrinica
Dosaggio Fattori della Coagulazione
Studio M. von Willebrand
Se test di primo filtro nella norma ma in presenza di una chiara
storia clinica positiva per sindrome emorragica:
fattore XIII
alfa 2 -antiplasmina
attivatore tissutale del plasminogeno (t-PA)
inibitore dell’attivatore tissutale del plasminogeno (PAI-1)
tempo di trombina e tempo di reptilase
fattore piastrinico 3 (PF3)

Cause carenza fattori
coagulazione
Ridotta sintesi (anomalie quantitative)
Sintesi di una molecola anormale
(anomalie qualititative)
Formazione di anticorpi diretti
specificamente contro alcuni fattori
(autoanticorpi)

Nomenclatura Fattori Coagulazione
• Fattore
fibrinogeno (I)
II
V
VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
Precallicreina (Fletcher)
HMWK (Fitzgerald)
• Conc. necessaria per emostasi normale
100 mg/dl
30-40%
30-40%
30-40%
30-40%
30-40%
30-40%
30-40%
20%
non necessario
1%
non necessario
non necessario

Fibrinogeno
• Glicoproteina che trasformandosi in
fibrina per attivazione da parte della
trombina permette la formazione del
coagulo.
• Di origine epatica
• Proteina fase acuta

Fibrinogeno
• Utile nelle seguenti condizioni:
afibrinogenemie o disfibrinogenemie congenite
o acquisite (epatoma o mieloma)
cirrosi epatica
malattie infiammatorie, autoimmuni
CID
valutazione rischio trombotico

Disfibrinogenemia
• Anomalia molecolare del fibrinogeno
autosomica dominante (le mutazioni
conducono all’alterazione di singoli
aminoacidi in una delle tre catene del
fibrinogeno).
• Caratterizzata da una discrepanza fra i
livelli funzionali di fibrinogeno (ridotti) e
i livelli antigenici (normali o aumentati).

Disfibrinogenemia
• Test primo filtro nella norma
• Pazienti affetti disfibrinogenemia: evento
emorragico, evento trombotico, nessun evento
• Diagnosi laboratorio: tempo di trombina (TT) e
tempo di reptilase
• Questi test esplorano la reazione di conversione di
fibrinogeno in fibrina
• TT è sensibile anche all’eparina quindi l’uso
combinato dei due test permette di differenziare
situazioni in cui TT è prolungato per presenza di
eparina (tempo reptilase nella norma)

Metodi dosaggio fibrinogeno
• Metodo immunologico:
– immunodffusione radiale in piastre agar.
– Da usare SOLO nello studio delle disfibrinogenemie,
dove in presenza di ridotto fibrinogeno funzionale è
presente una normale concentrazione di fibrinogeno
Ag.
• Metodo derivazione PT
– in molti strumenti il fibrinogeno è calcolato
utilizzando la curva del PT. Infatti il valore è
ricavato misurando il delta fra l’inizio e la fine della
formazione del coagulo

Metodi dosaggio fibrinogeno
• Metodo secondo Clauss
– consente di quantificare il fibrinogeno realmente
funzionante.
– in largo eccesso di trombina la velocità della
reazione di coagulazione dipende solo dalla
concentrazione del fibrinogeno.

Dosaggio fattori coagulazione
Principio del metodo:
• valutazione del grado di correzione del
tempo di coagulazione operato dal
plasma in esame su un plasma carente
del corrispondente fattore.
• PT per i fattori: VII, V, II, X
• APTT per i fattori: VIII, IX, XI, XII
• il grado di correzione si esprime in %
procoagulante
• curva di riferimento (scala bilog)

Plasma with 0%
F.VII has a
Prolonged
Prothrombin Time
0.1 mL F.VII
Deficient
Substrate
Factor Assays
Extrinsic Proteins II, V, VII, X
By adding various
concentrations
of Factor VII Standard
the Prothrombin Time
is corrected
0.1 mL F.VII
Standard or patient’s
plasma dilution
The degree
of correction
is proportional to
the concentration
0.2 mL
Thromboplastin
Calcium Chloride
Mixture

Plasma with
0%
Factor VIII has
a prolonged
APTT
By adding
various
concentrations
of Factor VIII
Standard the
APTT is
shortened
Factor Assays
Intrinsic Proteins VIII, IX, XI, XII
0.1 mL Factor
VIII
Deficient Plasma
0.1 mL Factor VIII
Standard or patient’s
plasma dilution
The degree of
correction is
proportional to
the
concentration
0.1 mL Phospholipid
and Activator
0.1 mL Calcium
Chloride

The Standard Curve
Dilution % Activity Clotting Time
1:5 20.0% 14.3 seconds
1:10 10.0% 17.3 seconds
1:20 5.0% 21.0 seconds
1:40 2.5% 26.0 seconds
30
25
20
15
10
5
2 5 10 20

Curva Calibrazione Fattore VIII

PT (ratio < 1.2)
APTT (ratio > 1.2)
Miscela 1:2 con NP
corregge non corregge
Dosaggio fattori via intrinseca:
•deficit deficit IX (emofilia B)
•deficit deficit XI
•deficit deficit XII
•deficit deficit VIII
Emofilia A
malattia di Willebrand
LA
inbitori anti fattori
via intrinseca
(dosaggio dosaggio fattori )
contaminazione
eparina (TT)
Dosaggio VIII:Ag
Dosaggio RICOF
RIPA, multimeri

TAO
PT (ratio > 1.2)
APTT (ratio < 1.2)
Inibitore VII
non
corregge
Miscela 1:2 con NP
Carenza congenita VII Deficit vit. K Epatopatia
Dosaggio VII
Dosaggio K
dipendenti
corregge
Dosaggio altri
fattori, fibrinogeno,
conta plts

PT (ratio > 1.2)
APTT (ratio > 1.2)
Miscela 1:2 con NP
corregge non corregge
•Epatopatia Epatopatia (fibrinogeno, conta plts.)
•Carenza Carenza vit. K
•CID CID (fibrinogeno, AT, D-Dimero, D Dimero, conta plts.)
•deficit deficit fattori via comune (II, V, X)
•ipofibrinogenemia
ipofibrinogenemia
•disfibrinogenemia disfibrinogenemia (dosaggio fib. immun., aumentato o normale)
inibitori anti fattori
via comune
(dosaggio dosaggio fattori )
contaminazione
eparina (TT)

Caso clinico 1
• Paziente: uomo 32 anni ricoverato per intervento
ernia inguinale con riscontro di APTT prolungato
negli esami pre-ricovero .
• Anamnesi: nessun episodio di sanguinamento
riferito dal paziente, nessun intervento subito in
precedenza.

PT (ratio < 1.2)
APTT (ratio > 1.2)
Miscela 1:2 con NP
corregge non corregge
Dosaggio fattori via intrinseca:
•deficit deficit IX (emofilia B)
•deficit deficit XI
•deficit deficit XII
•deficit deficit VIII
Emofilia A
malattia di Willebrand
LA
inbitori anti fattori
via intrinseca
(dosaggio dosaggio fattori )
contaminazione
eparina (TT)
Dosaggio VIII:Ag
Dosaggio RICOF
RIPA, multimeri

PT ratio = 1.02 (vn< 1.2)
APTT ratio = 1.48 (vn

Caso clinico 2
• Paziente: bambina 8 anni con riscontro di APTT
prolungato negli esami pre-ricovero per
tonsillectomia.
• Anamnesi: alcuni episodi di sanguinamento
spontaneo indotti piccoli traumi

PT (ratio < 1.2)
APTT (ratio > 1.2)
Miscela 1:2 con NP
corregge non corregge
Dosaggio fattori via intrinseca:
•deficit deficit IX (emofilia B)
•deficit deficit XI
•deficit deficit XII
•deficit deficit VIII
Emofilia A
malattia di Willebrand
LA
inbitori anti fattori
via intrinseca
(dosaggio dosaggio fattori )
contaminazione
eparina (TT)
Dosaggio VIII:Ag
Dosaggio RICOF
RIPA, multimeri

PT ratio = 1.02 (vn< 1.2)
APTT ratio = 1.29 (vn

Diagnosi differenziale tra emofilia A e
malattia di Willebrand
• Bambina (esclusione emofilia A)
• BT: non eseguito
• PFA-100 : entrambi i TC prolungati
• Dosaggio vWF antigene = 30% (vn > 50%)
• Dosaggio von Willebrand attività = 27% (vn > 50%)
Conclusione: Malattia di Willebrand di tipo I

Caso clinico 3
• Paziente: uomo 48 anni ricoverato per intervento di
appendicectomia con riscontro negli esami prericovero
di APTT fortemente prolungato.
• Anamnesi: nessun episodio di sanguinamento
riferito dal paziente, nessun intervento chirurgico
subito in precedenza.

PT (ratio < 1.2)
APTT (ratio > 1.2)
Miscela 1:2 con NP
corregge non corregge
Dosaggio fattori via intrinseca:
•deficit deficit IX (emofilia B)
•deficit deficit XI
•deficit deficit XII
•deficit deficit VIII
Emofilia A
malattia di Willebrand
LA
inbitori anti fattori
via intrinseca
(dosaggio dosaggio fattori )
contaminazione
eparina (TT)
Dosaggio VIII:Ag
Dosaggio RICOF
RIPA, multimeri

PT ratio = 1.02 (vn< 1.2)
APTT ratio = 2.98 (vn

Caso clinico 4
• Paziente: donna 52 anni ricoverato per intervento
mastectomia a seguito neoplasia, riscontro negli
esami pre-ricovero di APTT fortemente prolungato.
• Anamnesi: nessun episodio di sanguinamento
riferito dalla paziente, nessun intervento chirurgico
subito in precedenza.

PT (ratio < 1.2)
APTT (ratio > 1.2)
Miscela 1:2 con NP
corregge non corregge
Dosaggio fattori via intrinseca:
•deficit deficit IX (emofilia B)
•deficit deficit XI
•deficit deficit XII
•deficit deficit VIII
Emofilia A
malattia di Willebrand
LA
inbitori anti fattori
via intrinseca
(dosaggio dosaggio fattori )
contaminazione
eparina (TT)
Dosaggio VIII:Ag
Dosaggio RICOF
RIPA, multimeri

PT ratio = 1.02 (vn< 1.2)
APTT ratio = 3.58 (vn

Ulteriori accertamenti
• Ricerca LA negativa
• Dosaggio fattore VIII su campione diluito
– VIII 1:50 = 0.8%
– VIII 1:100 = 20%
– VIII 1:200 = 62%
Conclusione: inibitori anti fattore VIII:C a medio
titolo.

Caso clinico 5
• Paziente: donna 69 anni con richiesta di visita
ematologica per un riscontro di PT
persistentemente prolungato negli esami prericovero
ortopedia.
• Sintomatologia: asintomatica
• Anamnesi: 1992 episodio TVP arti inferiori dopo
intervento chirurgico con esami pre-ricovero nella
norma, no trombofilia, no alterazioni acquisite
emostasi predisponenti la trombosi.

TAO
PT (ratio > 1.2)
APTT (ratio < 1.2)
Inibitore VII
non
corregge
Miscela 1:2 con NP
Carenza congenita VII Deficit vit. K Epatopatia
Dosaggio VII
Dosaggio K
dipendenti
corregge
Dosaggio altri
fattori, fibrinogeno,
conta plts

PT ratio = 1.89 (vn< 1.2)
APTT ratio = 1.08 (vn

Caso clinico 6
• Paziente: uomo 39 anni con richiesta di visita
ematologica per riscontro di PT e APTT
persistentemente prolungato negli esami prericovero
chirurgia plastica.
• Anamnesi: paziente mai operato o sottoposto ad
estrazioni dentarie.

PT (ratio > 1.2)
APTT (ratio > 1.2)
Miscela 1:2 con NP
corregge non corregge
•Epatopatia Epatopatia (fibrinogeno, conta plts.)
•Carenza Carenza vit. K
•CID CID (fibrinogeno, AT, D-Dimero, D Dimero, conta plts.)
•deficit deficit fattori via comune (II, V, X)
•ipofibrinogenemia
ipofibrinogenemia
•disfibrinogenemia disfibrinogenemia (dosaggio fib. immun., aumentato o normale)
inbitori anti fattori
via comune
(dosaggio dosaggio fattori )
contaminazione
eparina (TT)

PT ratio = 1.48 (vn< 1.2)
APTT ratio = 1.39 (vn

Caso clinico 7
• Paziente: donna 22 anni episodio TVP dopo
assunzione estroprogestinico.
• Anamnesi: storia familiare positiva per trombofilia.

SCREENING DI LABORATORIO:
PC coagulativa = 85% vn 69 - 150%
PS coagulativa = 38% vn 50 - 150%
PS free antigene = 39% vn 50 -150%
APC resistance ratio = 2.85 vn > 2.20
omocisteina = 5.2 μmol/L vn < 12 μmol/L
mutazione G20210A protrombina = assente
ricerca Anticorpi Antifosfolipidi = negativa
Conclusione: Carenza congenita PS da
confermare sempre con studi familiari

Caso clinico 8
• Paziente: donna 34 anni tromboflebiti recidivanti,
EP dopo parto.
• Anamnesi: storia familiare positiva per trombofilia.

SCREENING DI LABORATORIO:
PC coagulativa = 102% vn 69 - 150%
PS coagulativa = 42% vn 50 - 150%
PS free antigene = 80% vn 50 -150%
APC resistance ratio = 1.2 vn > 2.20
omocisteina = 7.5 μmol/L vn < 12 μmol/L
mutazione G20210A protrombina = assente
mutazione V Leiden = omozigote
ricerca Anticorpi Antifosfolipidi = negativa
Conclusione: portatrice mutazione V Leiden in forma
omozigote (entrambi i genitori eterozigoti), interferenza
mutazione sul dosaggio PS coagulativa

Caso clinico 9
• Paziente: uomo 58 anni giunto al laboratorio con
richiesta screening per trombofilia.
• Anamnesi: non nota.

SCREENING DI LABORATORIO:
PC coagulativa = 38% vn 69 - 150%
PS coagulativa = 50% vn 50 - 150%
PS free antigene = 40% vn 50 -150%
APC resistance ratio = 2.8 vn > 2.20
omocisteina = 4.2 μmol/L vn < 12 μmol/L
mutazione G20210A protrombina = eterozigote
ricerca Anticorpi Antifosfolipidi = negativa

Ulteriori accertamenti condotti
• PT ratio = 2.01
Conclusione: portatore mutazione G20210A protrombina in
forma eterozigote; consigliare sempre lo studio familiare ed
esecuzione dosaggio PC e PS almeno 10 giorni dopo la
sospensione della TAO.

Caso clinico 10
• Paziente: donna 29 anni giunta al laboratorio con
richiesta dosaggio PC, PS e APC resistance e
ricerca mutazione V Leiden.
• Anamnesi: non nota.

SCREENING DI LABORATORIO:
PC coagulativa = 69% vn 69 - 150%
PS coagulativa = 42% vn 50 - 150%
PS free antigene = 38% vn 50 -150%
APC resistance ratio = 2.18 vn > 2.20
mutazione V Leiden = assente

Controllo impegnativa
• 28a settimana di gravidanza
Conclusione: segnalare sempre l’inappropriatezza
dell’esecuzione dei dosaggi PS e APC resistance in
corso di gravidanza.

Caso clinico 11
• Paziente: uomo 26 anni.
• Anamnesi: 2 episodi TVP a 14 e 25 anni,
piastrinopenia (70.000 plts) non familiarità per
trombofilia.

SCREENING DI LABORATORIO:
PC coagulativa = 151% vn 69 - 150%
PS coagulativa = 97% vn 50 - 150%
Antitrombina = 89% vn 65 - 150%
APC resistance ratio = 2.9 vn > 2.20
omocisteina = 8.5 μmol/L vn < 12 μmol/L
mutazione G20210A protrombina = assente
PT ratio = 0.89 vn < 1.20
APTT ratio = 3.64 vn < 1.20
APTT mix ratio = 2.01 vn < 1.20

Ricerca APL
• APTT sensibile ratio = 2.98 vn < 1.20
• mix ratio = 2.50 vn < 1.20
• conferma = positivo
• DRVVT ratio = 2.26 vn < 1.24
• mix ratio = 1.88 vn < 1.24
• conferma = positivo
• SCT ratio = 4.20 vn < 1.28
• mix ratio = 3.20 vn < 1.28
• conferma = positivo
• aCL IgG = 128 GPL/ml vn < 10
• aCL IgM = 82 MPL/ml vn < 8
• aBeta2GpI IgG = 145 U/ml vn < 8
• aBeta2GpI IgM = 65 U/ml vn < 8

Diagnosi
APS primaria con anticorpi ad alto
titolo e ad ampio spettro; piastrinopenia
autoimmune.

Caso clinico 12
• Paziente: uomo 58 anni, APTT pre-operatorio
ratio = 3.23.
• Anamnesi: asintomatico, privo eventi trombotici,
non diatesi emorragica, in attesa di intervento
chirurgico per massa surrenalica. Il paziente esce
dalla lista operatoria per paura di complicanze
emorragiche.

SCREENING DI LABORATORIO:
PT ratio = 1.02 vn < 1.20
APTT ratio = 4.23 vn < 1.20
APTT mix ratio = 2.85 vn < 1.20

Ricerca APL
• APTT sensibile ratio = 4.25 vn < 1.20
• mix ratio = 3.81 vn < 1.20
• conferma = positivo
• DRVVT ratio = 1.11 vn < 1.24
• SCT ratio = 3.81 vn < 1.28
• mix ratio = 2.92 vn < 1.28
• conferma = positivo
• aCL IgG = 9.8 GPL/ml vn < 10
• aCL IgM = 2.5 MPL/ml vn < 8
• aBeta2GpI IgG = 6.5 U/ml vn < 8
• aBeta2GpI IgM = 7.9 U/ml vn < 8
• aPT IgG = 8.9 U/ml vn < 10
• aPT IgM = 2.8 U/ml vn < 10

Diagnosi
Presenza di anticorpi antifosfolipidi,
assenza di coagulopatia emorragica,
sindrome secondaria a carcinoma
metastatizzato, intervento chirurgico
effettuato senza complicanze e uso di
emoderivati.

Caso clinico 13
• Paziente: donna 68 anni.
• Anamnesi: stenosi arteria renale, embolia
arteriosa. Non familiarità per trombofilia.

SCREENING DI LABORATORIO:
PT ratio = 1.01 vn < 1.20
APTT ratio = 1.02 vn < 1.20

Ricerca APL
• APTT sensibile ratio = 1.12 vn < 1.20
• DRVVT ratio = 1.08 vn < 1.24
• SCT ratio = 1.29 vn < 1.28
• mix ratio = 1.08 vn < 1.28
• conferma = dubbio
• aCL IgG = 2.5 GPL/ml vn < 10
• aCL IgM = 1.9 MPL/ml vn < 8
• aBeta2GpI IgG = 8 U/ml vn < 8
• aBeta2GpI IgM = 1.2 U/ml vn < 8
• aPT IgG = 22.5 U/ml vn < 10
• aPT IgM = 2.8 U/ml vn < 10

Diagnosi
APS primaria con anticorpi a basso
titolo?