Tesi Neonicotinoidi

f) Preparazione di campioni costituiti da 20 api (contemporaneamente)
Per la preparazione all’analisi da un numero cospicuo di api, contenenti dei principi attivi
neonicotinoidi in tracce, si opera ponendo venti api all’interno di una fiala in vetro con tappo
a vite da 25 mL e, dopo un trattamento di liofilizzazione della durata di circa 16 ore (una
notte) si frantumano le api mediante una palettina di acciaio. Il trattamento estrattivo avviene
con l’ausilio di 5 mL di metanolo ed altrettanti di acqua MilliQ. Dal sistema vengono
prelevati sei campioni da 1 mL ciascuno successivamente purificati tramite centrifugazione a
10.000 giri/min. e conseguente filtrazione con filtri in PVDF e pori da 0,20 µm.
2.2.5 Verifica qualitativa della metodica di preparazione da campioni di 20 api
(Paragrafo 2.2.4 - f)
Nella fiala da 25 mL contenete i frammenti di api e circa 4 mL di estratto, rimasto dopo i
prelievi (come descritto nel Paragrafo 2.2.4 – f), si aggiungono 6 mL di metanolo in modo da
raggiungere un volume totale di solvente all’interno della fiala di circa 10 mL. I pezzetti di
ape presenti nella fiala vengono lasciati sotto agitazione magnetica in questa soluzione per
una notte. La miscela risultante viene centrifugata a 3.000 giri/min per circa 30 minuti. Tale
processo estrattivo viene effettuato altre due volte variando i tempi per i trattamenti;
innanzitutto si aggiungono al residuo di api 5 mL di metanolo per ognuna di queste nuove
estrazioni e poi si lasciano sotto agitazione magnetica per 5 minuti centrifugando infine il
tutto per 10 minuti. Gli estratti così ottenuti vengono filtrati mediante gooch G3, collegato ad
un sistema da vuoto, e raccolti in un pallone da 50 mL lavando sempre il gooch con metanolo.
Il pallone contenente i tre estratti si collega quindi ad un evaporatore rotante e il liquido al suo
interno viene ridotto fino a 2 mL (principalmente costituiti da acqua). Il liquido risultante
viene quindi travasato in un cilindro graduato tramite pipetta Pasteur per misurarne
approssimativamente il volume e ad esso si aggiungono i 2 mL di metanolo utilizzati per
lavare tutto il deposito presente sulle pareti del palloncino. Della soluzione così ottenuta,
filtrata mediante siringa con filtri a porosità 0,45 µm in PTFE, 1 mL viene travasato in una
microprovetta Eppendorf e centrifugato per 60 minuti a 10.000 giri al minuto. Dopo una
ulteriore filtrazione mediante siringa dotata di filtri in PVDF con pori del diametro di 0,20 µm
si pone quanto ottenuto in una fialetta in vetro da 1,5 mL con tappo a vite e setto in Teflon per
l’analisi liquido cromatografica.
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