Sara Ottimo - Università di Palermo

Università degli Studi di
Catania
Università degli Studi di
Palermo
Facoltà di Farmacia
Dipartimento di Chimica e Tecnologie Farmaceutiche
Dottorato di Ricerca in:
Tecnologie delle sostanze biologicamente attive
XXII Ciclo, A.A. 2007/2008
SSD CHIM/09
Ministero dell’Istruzione,
dell’Università e della
Ricerca
STUDIO DI SISTEMI DI INTERESSE
FARMACEUTICO MEDIANTE ANALISI
CALORIMETRICA E DI TENSIONE SUPERFICIALE
Tutor:
Chiar.mo Prof. Francesco Castelli
Dott.ssa Ottimo Sara
Coordinatore:
Chiar.mo Prof. Gaetano Giammona

SVILUPPO DELLA RICERCA
Studio del rilascio di farmaci da Drug Delivery System a biomembrane modello:
Idrogel polisaccaridico;
Micelle polimeriche.
Studio dell’interazione e delle cinetiche di assorbimento di sostanze biologicamente
attive con biomembrane modello:
Derivati del resveratrolo;
Acidi grassi polinsaturi;
Aciclovir, Citosina Arabinoside, Paclitaxel e rispettivi prodrug squalenici;
Idrocarburi policiclici aromatici nitrosostituiti;
Derivati cumarinici.

TECNICHE IMPIEGATE
Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC):
Cinetiche di cessione dei farmaci dai sistemi di rilascio;
Interazione tra molecole biologicamene attive e biomembrane modello;
Cinetiche di permeazione;
Cinetiche di trasferimento transmembrana.
Tecnica di Langmuir-Blodgett:
Misure di tensione superficiale di monolayer.

CALORIMETRIA A SCANSIONE DIFFERENZIALE
La Calorimetria a Scansione Differenziale è una tecnica che consente di
determinare, durante una scansione effettuata con incrementi lineari della
temperatura, la variazione dell’entalpia (∆H) e della temperatura (∆T) di un
processo mediante misura del flusso di calore necessario per mantenere il
campione della sostanza in esame alla stessa temperatura di un campione di
riferimento (inerte).

MODELLI DI BIOMEMBRANA IMPIEGATI
Vescicole unilamellari (LUV) o multilamellari (MLV) di
Dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC).
In queste strutture sferoidali, dette liposomi, il fosfolipide si organizza
formando uno o più strati concentrici (lamelle) separati da compartimenti
acquosi. La natura anfifilica dei liposomi permette il loro impiego come drug
delivery system per molecole di varia natura:
Idrofile (negli spazi acquosi tra le lamelle);
Lipofile (tra le catene idrofobiche dei fosfolipidi);
Anfotere (parte idrofila all’esterno del bilayer e parte idrofoba all’interno).

PRINCIPIO DEL METODO
Le membrane lipidiche sono soggette, quando riscaldate, ad una transizione
dalla fase gel (ordinata) a cristallo liquido (disordinata), caratterizzata da una
temperatura (T m) e da una variazione entalpica (∆H). Tali parametri possono
variare per la presenza e l’interazione tra biomolecole ed il bilayer fosfolipidico.
Le variazioni osservate sono dipendenti dalla frazione molare di sostanza
disciolta nel bilayer lipidico.
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 °C
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
°C

DMPC
Composto in esame
Preparazione di una soluzione in
solventi organici (CHCl 3:CH 3OH) del
fosfolipide, contenente il composto
biologicamente attivo (se liposolubile)
INTERAZIONE IN FASE ORGANICA:
PREPARAZIONE DEI LIPOSOMI
“Thin Layer Evaporation Method”
Evaporazione del solvente e
formazione di un sottile film
fosfolipidico
Tris
Liposomi
Il film fosfolipidico è idratato
con una soluzione tampone
(eventualmente contenente il
composto in esame, se
idrosolubile)
Si ottengono liposomi multilamellari
(MLV), con la massima interazione tra
fosfolipide e composto. Sottoponendo
gli MLV ad estrusione si hanno
liposomi unilamellari (LUV)

MISURE CINETICHE
La variazione della T m può essere usata come un mezzo per monitorare diversi
processi cinetici, quali:
Il prelievo di molecole dalla fase acquosa da parte delle vescicole lipidiche;
(cinetiche di permeazione)
Il trasferimento di molecole disperse nei liposomi ai modelli di biomembrana.
(cinetiche di trasferimento transmembrana)

LANGMUIR-BLODGETT
Tecnica basata sulla capacità di molecole anfifiliche di orientarsi all’interfaccia
aria/acqua in modo da minimizzare la loro energia libera e formare un monolayer
insolubile chiamato Film di Langmuir.
MONOLAYER FOSFOLIPIDICO
Sistema bidimensionale che, in
seguito a variazioni di tensione
superficiale, area e temperatura è
in grado di fornire informazioni
sulla distribuzione e l’orientazione
molecolare dei fosfolipidi depositati
su una subfase acquosa.
L’uso dei monolayer, come modello
di membrana, deriva dal fatto che
esso rappresenta la metà di un
doppio strato lipidico (bilayer) e
che possiede caratteristiche
direttamente legate alle proprietà di
quest’ultimo.

Parametri fondamentali alla base della tecnica sono:
Tensione superficiale
ARIA
LIQUIDO
Quantità di lavoro richiesta per aumentare l’estensione della superficie di un liquido di un’unità,
mantenendo costante la temperatura del sistema.
La tensione superficiale viene misurata quindi, come una forza per unità di lunghezza (mN/m).
Tipo di molecole adoperate
Pressione superficiale
Π Π = = γγ−γ
γ 0
γ = tensione superficiale in assenza di monolayer
γ0 = tensione superficiale in presenza di monolayer

Le misure di tensione superficiale sono state eseguite con un sistema
Minitrough fornito dalla KSV Instruments LTd (Finlandia).
Barriere mobili
Elettrobilancia con
lamina in platino
Trough in Teflon

I composti vengono sciolti in
un solvente organico volatile
e immiscibile con H 2O;
Vengono depositati sulla
superficie della subfase
mediante una microsiringa;
Evaporazione del solvente e
formazione del monolayer;
Compressione.
FORMAZIONE DEL FILM

La registrazione delle isoterme π/A è un metodo per descrivere il
comportamento e le interazioni tra i due componenti di una miscela lipidica
Area per molecola (Å 2 )
100
80
60
40
20
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Frazione Molare

RILASCIO DI FARMACI DA UN IDROGEL DI INULINA
SCOPO DEL LAVORO
Valutare il rilascio di farmaci da un idrogel di inulina e misurarne
l’assorbimento da parte di modelli di biomembrana;
Verificare l’applicabilità dell’idrogel come sistema di rilascio di
farmaci al colon;
Valutare l’influenza del pH e del drug loading.

RILASCIO DI FARMACI DA UN IDROGEL DI INULINA
HO
H O
H O
H O
C H 2
C H 2
O H
O H
O H
O
O
O
O H O H
C H 2
O H
O H
O
C H 2
O
C H 2 O H
m
Polisaccaride naturale trovato in vari vegetali;
Appartiene ai glucofruttani;
È costituito da molecole di fruttosio legate in β 2-1;
Può contenere una molecola di glucosio ad una estremità
della catena;
Non tossico, biocompatibile, solubile in acqua,
biodegradabile e poco costoso;
IDROGEL
Sistema che assorbe una grande quantità di acqua senza passare in soluzione o
perdere l’integrità strutturale;
Formato da polimeri idrofili ramificati covalentemente, ma anche mediante legami
idrogeno, legami ionici o Forze di Van der Waals;
Bassa tossicità, buona biocompatibilità;
Disperso in mezzo acquoso rilascia i soluti in esso contenuti;
Adatto per sistemi a rilascio prolungato e/o controllato o in un sito target specifico.

HO
HO
OH
OH
CH 2
CH 2
OH
OH
OH
O
O
INU
O
OH
O
OH
OH
CH2 CH2
O
CH2 CH2
O
n
IDROGEL DI INULINA
DMF
TEA
24h/25 °C
CH3 H2C C C O
CH3 H2C C C O
H H2C 2C C
Derivatizzazione dell’inulina (INU) con anidride metacrilica (MA);
1)
2)
Derivatizzazione con anidride succinica (SA);
+
O
O
O
CH 3
MA
SA
C
O
Ramificazione fotochimica (Photocrosslinking) del derivato con irradiazione UV.
O
DMF
TEA
24h/25 °C
L’INU-MA presenta:
Buona capacità di swelling;
Bassa resistenza all’idrolisi acida.
L’aggiunta dei gruppi carbossilici consente:
Ridotto swelling in un mezzo acido;
Resistenza ai fluidi gastrici.
HO
O
C
CH2 CH2
CH 2
CH2 CH2
C
CH3 CH3
O
C
O
C
O
HO
HO
O CH 2
CH2 CH2
INU-MA-SA
OH
OH
OH
O
O
O
OH
O
OH
OH
CH2 CH2
O
CH2 CH2
O

IDROGEL DI INULINA
Potrebbe essere adatto per il rilascio di farmaci nel tratto intestinale;
Potrebbe permettere una minore degradazione dei farmaci sensibili al pH acido
gastrico;
Potrebbe ridurre gli effetti collaterali sulla mucosa gastrica (ad es. per gli NSAID).
L’Idrogel è stato caricato con un farmaco modello
HOOC
HO
È un derivato dell’acido salicilico;
Poco solubile in acqua;
Analgesico, antinfiammatorio;
F
DIFLUNISAL
Effetti collaterali gastrointestinali (emorragie, ulcerazioni).
F

Studi di swelling;
Studi di degradazione enzimatica;
Studi di degradazione chimica;
Interazione LUV/diflunisal;
Cinetiche di rilascio: eseguite con idrogel caricato con diverse quantità di farmaco
(10,4; 17 e 24%) e a pH 7,4 e 4,0.
ESPERIMENTI EFFETTUATI

q (W s/W d)
8
7
6
5
4
3
2
1
0
STUDI DI SWELLING
acqua distillata PBS pH 7,4 PBS pH 6,8 pH 1 1h
Mezzo
Resa %
q
pH 1 24h
pH 1 2h
DEGRADAZIONE ENZIMATICA
Il saggio quantitativo del fruttosio,
liberato dalla degradazione enzimatica
con inulinasi dell’idrogel INU-MA-SA,
ha evidenziato una degradazione
dell’idrogel del 53 ± 3% in peso
rispetto al campione iniziale.
DEGRADAZIONE CHIMICA
pH 1 1h
PBS pH
7,4 24h
PBS pH
6,8 24h
PBS pH
4,7 24h
acqua
distillata
60
40
20
0
100
80
acqua distillata
PBS pH 4,7 24h
PBS pH 6,8 24h
PBS pH 7,4 24h
pH 1 1h
pH 1 2h
pH 1 24h

2 mW
endo
INTERAZIONE LUV/DIFLUNISAL
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
DMPC
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
(∆T/T0 m ) x 1000
pH = 4 (a)
0
-2
-4
-6
-8
-10
-12
-14
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14
frazioni molari
2 mW
endo
pH = 7,4 (b)
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
DMPC
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
b
a

2 mW
endo
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
CINETICHE DI RILASCIO
pH = 7,4
r
22 h
8 h
7 h
6 h
5 h
4 h
3 h
2 h
1 h
0,2 h
DL = 10,4%
DMPC
2 mW
endo
DL = 17%
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
r
22 h
8 h
7 h
6 h
5 h
4 h
3 h
2 h
1 h
0,2 h
DMPC
2 mW
endo
DL = 24%
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
r
22 h
8 h
7 h
6 h
5 h
4 h
3 h
2 h
1 h
0,2 h
DMPC

2 mW
endo
CINETICHE DI RILASCIO
pH = 7,4
22 h
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
(∆T/T 0
m ) x 1000
2
0
-2
-4
-6
-8
-10
IDROGEL
8 h
7 h
6 h
5 h
4 h
3 h
2 h
1 h
0,2 h
DMPC
-12
// //
0 2 4 6 8 10 22 r
//
//
//
tempo (ore)
2 mW
endo
DFN
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
DFN
idrogel + DFN 10,4%
idrogel + DFN 17%
idrogel + DFN 24%
idrogel
DFN X=0,09
//
//
r
22 h
8 h
7 h
6 h
5 h
4 h
3 h
2 h
1 h
0,2 h
DMPC

2 mW
endo
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
CINETICHE DI RILASCIO
pH = 4,0
r
22 h
8 h
7 h
6 h
5 h
4 h
3 h
2 h
1 h
0,2 h
DL = 10,4%
DMPC
2 mW
endo
DL = 17%
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
r
22 h
8 h
7 h
6 h
5 h
4 h
3 h
2 h
1 h
0,2 h
DMPC
2 mW
endo
DL = 24%
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
r
22 h
8 h
7 h
6 h
5 h
4 h
3 h
2 h
1 h
0,2 h
DMPC

2 mW
endo
CINETICHE DI RILASCIO
pH = 4,0
22 h
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
(∆T/T0 m ) x 1000
4
2
0
-2
-4
-6
IDROGEL
8 h
7 h
6 h
5 h
4 h
3 h
2 h
1 h
0,2 h
DMPC
-8
DFN
idrogel
idrogel + DFN 10,4%
//
-10
idrogel + DFN 17%
idrogel + DFN 24%
DFN X= 0,09
-12
0 2 4 6 8 10
//
22 r
tempo (ore)
//
//
//
2 mW
endo
DFN
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 34 36 38 °C
r
22 h
8 h
7 h
6 h
5 h
4 h
3 h
2 h
1 h
0,2 h
DMPC

CONCLUSIONI
L’idrogel di INU-MA-SA non è degradato chimicamente;
Subisce degradazione enzimatica da parte dell’inulinasi;
Il rilascio del diflunisal dall’idrogel di INU-MA-SA è influenzato dal grado di
loading e dal pH del mezzo;
L’idrogel di INU-MA-SA risulta un buon carrier per il rilascio di farmaci al colon.

RILASCIO DI FARMACI DA MICELLE POLIMERICHE
I copolimeri anfifilici biodegradabili sono in grado di aggregarsi, in un mezzo
acquoso, formando strutture micellari con una buona capacità di loading.
La componente idrofobica del copolimero forma un core capace di inglobare il
farmaco, quella idrofilica forma una corona esterna che fornisce protezione sterica.
COMPOSIZIONE COPOLIMERO
α,β-poli(N-idrossietil)-DL-aspartammide (PHEA);
Etilendiammina;
– Polimero sintetico;
– Biocompatibile;
– Solubile in acqua.
Polisorbato 80 (PS 80);
Acido Polilattico (PLA);
– Polimero sintetico;
– Biocompatibile;
– Lipofilo.
O
HN
HO
HO
O
NH
Ox(CH 2CH2O) O
NH
Ox(CH 2CH2O) O NH O NH
O O O
N
H
HO(CH 2CH 2CH2O) 2O) n
NH
O O OH
O
O
N
H
O
O
O
N
H
O
O
CH(OCH 2CH 2CH2)yOH 2)yOH
CH CH2O 2O (CH (CH2CH 2CH2O)z 2O)z 1 CH CH2CH 2CH2OCOCH 2OCOCH 2(CH 2(CH2) 2) 5CH 5CH2CH 2CH
HN
N
H
OH
NH
O
NH NH
O O
NH O
O
P HE A E DA
P L A
P S 80
CAC
CHCH 2(CH 2(CH2) 2) 6CH 6CH 3

RILASCIO DI FARMACI DA MICELLE POLIMERICHE
Le micelle sono state caricate con R-Flurbiprofene (R-Flu)
Farmaco appartenente alla classe degli NSAID;
F
Modula l’attività dell’enzima gamma-secretasi coinvolto nella sintesi del peptide
β-amiloide che porta alla formazione di placche ed aggregati neurofibrillari
all’origine della patogenesi del morbo di Alzheimer;
La somministrazione orale non produce nel fluido cerebrospinale una
concentrazione sufficiente per ridurre la concentrazione del peptide amiloide;
L’uso di un carrier, come le micelle polimeriche, può consentire sia la protezione
che il direzionamento specifico del farmaco verso il sito target.
O
OH

2 mW
endo
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
Curve calorimetriche, in riscaldamento,
degli MLV di DMPC in presenza di
crescenti frazioni molari di R-Flu.
INTERAZIONE MLV/R-Flu
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
0,00
°C
(∆T/T 0
m ) x 103
5
0
-5
-10
-15
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14
frazione molare
R-Flu

2 mW
endo
Micelle Vuote
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
CINETICHE DI RILASCIO
MLV
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
°C
2 mW
endo
R-Flu
X=0,09
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
°C
2 mW
endo
Micelle/R-Flu
X=0,09
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
°C

2 mW
endo
Micelle Vuote
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
CINETICHE DI RILASCIO
LUV
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
°C
2 mW
endo
R-Flu
X=0,09
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
°C
2 mW
endo
Micelle/R-Flu
X=0,09
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
°C

(∆T/T 0
m ) x 103
CONCLUSIONI
L’R-Flu interagisce con gli MLV di DMPC in dipendenza della sua concentrazione;
Le micelle polimeriche non causano variazioni della T m delle vescicole fosfolipidiche;
L’R-Flu libero è rapidamente assorbito;
5
0
-5
-10
-15
0 2 4 6 8 10 r
scansioni calorimetriche
MLV PHEA-EDA-PS 80 -PLA
MLV R-Flu
MLV PHEA-EDA-PS 80 -PLA R-Flu
LUV PHEA-EDA-PS 80 -PLA
LUV R-Flu
LUV PHEA-EDA-PS 80 -PLA R-Flu
L’incorporazione del farmaco nelle micelle permette un assorbimento graduale e completo;
Le micelle di PHEA-EDA-PS 80-PLA permettono di prolungare l’azione del farmaco all’interno
delle cellule.

DERIVATI DEL RESVERATROLO
HO
Il 3,5,4’-triidrossi-trans-stilbene (resveratrolo) è una sostanza fitochimica naturale
sintetizzata da molte specie di piante in risposta a stimoli nocivi, è presente in grandi
quantità nel vino rosso;
Esiste in due forme, cis e trans, quest’ultima sembra essere la più attiva biologicamente;
Possiede diverse proprietà biologiche tra cui:
- Attività antiossidante;
- Attività antinfiammatoria;
- Attività antitumorale;
- Attività protettiva contro l’aterosclerosi e le patologie coronariche;
OH
Il resveratrolo è il composto di riferimento per la preparazione di analoghi dotati di
attività simile ma con un profilo farmacocinetico migliore.
OH

MeO
OMe
DERIVATI DEL RESVERATROLO
OMe
MeO
OMe
3,5,4’-Trimetossistilbene (TMS) 3,5,3’,5’-Tetrametossistilbene (CT-C1) 3,5,3’,4’-Tetrametossistilbene (CT-D)
La metilazione consente
OMe
OMe
MeO
Protezione dall’esteso metabolismo a cui il resveratrolo è soggetto;
Maggiore lipofilia, che si traduce in un aumento della permeabilità attraverso le
membrane cellulari;
Lunga emivita di eliminazione.
Svantaggio
Minore solubilità in acqua, che ostacola la biodisponibilità orale.
OMe
OMe
OMe

2 mW
endo
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
INTERAZIONE MLV/COMPOSTI
Curve calorimetriche, in riscaldamento, degli MLV di DMPC in
presenza di crescenti frazioni molari dei composti in esame.
TMS
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
0,00
°C
2 mW
endo
CT-C1
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
0,00
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
°C
2 mW
endo
CT-D
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
0,00
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
°C

2 mW
endo
CINETICHE DI PERMEAZIONE
TMS
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
r
(∆T/T 0
m ) x 103
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
X=0,00
5
0
-5
-10
°C
2 mW
endo
CT-C1
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 °C
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
X=0,00
-15
-20
TMS
CT-C1
CT-D
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 r
scansioni calorimetriche
2 mW
endo
CT-D
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 °C
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
X=0,00

CICLODESTRINE (CD)
Per il TMS le cinetiche di permeazione sono state eseguite in presenza di
β-ciclodestrine, con lo scopo di verificare la possibilità di migliorare la
solubilità in acqua, la velocità e l’entità del processo cinetico, quindi
l’assorbimento del TMS da parte delle membrane biologiche, nonché la
sua biodisponibilità quando somministrato per via orale.
Sono oligosaccaridi ciclici formati da unità di D(+)glucosio legate da legami
glucosidici α(1-4);
Le più comuni sono costituite da 6, 7, 8 unità di glucosio (rispettivamente α, β,
γ ciclodestrine);
La superficie esterna è idrofila, mentre la cavità interna è idrofoba;
È possibile includere dentro la loro cavità molecole insolubili o poco solubili in
acqua, con formazione di complessi host-guest;
Sono utilizzate come solubilizzanti, stabilizzanti per sostanze biologicamente
attive, per ridurre l’irritazione gastro-intestinale o oculare, per eliminare
odori e sapori sgradevoli e per evitare interazioni farmaco-farmaco.

2 mW
0 3
(∆T/Tm ) x 10
endo
2
0
-2
-4
-6
-8
CINETICHE DI PERMEAZIONE TMS/β-CD
1:0,5
-10
-12
TMS
TMS/β-CD 1:0,5
TMS/β-CD 1:1
TMS/β-CD 1:2
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 r
scansioni calorimetriche
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
X=0,00
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 °C
2 mW
endo
1:1
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
X=0,00
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 °C 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 °C
(∆∆H/∆H 0 ) x 10 3
0
-100
-200
2 mW
-300
-400
TMS
TMS/β-CD 1:0,5
TMS/β-CD 1:1
TMS/β-CD 1:2
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 r
endo
scansioni calorimetriche
1:2
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
X=0,00

2 mW
endo
CINETICHE DI PERMEAZIONE β-CD
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
X=0,00
1:0,5
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
°C
2 mW
endo
1:1
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
X=0,00
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
°C
2 mW
endo
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
1:2
X=0,00
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 °C

0 3
(∆T/Tm ) x 10
ESPERIMENTI DI STABILITA’
2
0
-2
-4
-6
-8
-10
TMS/β-CD 1:0.5
TMS/β-CD 1:1
TMS/β-CD 1:2
-12
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 r
scansioni calorimetriche

CONCLUSIONI
Le β-CD aumentano la solubilità del TMS favorendone l’assorbimento da
parte degli MLV;
La solubilizzazione è maggiore con un rapporto TMS/β-CD 1:2;
Gli MLV di DMPC contenenti il TMS formano un sistema stabile;
Le β-CD non sono in grado di estrarre il TMS da tale sistema.

Area per molecola (Å 2 )
Area per molecola (Å 2 )
100
80
60
40
20
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
100
80
60
40
20
TMS
TMS
Frazione Molare
MISURE DI TENSIONE SUPERFICIALE
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Frazione Molare
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m
Area per molecola (Å 2 )
Area per molecola (Å 2 )
100
80
60
40
20
100
CT-C1
10°C
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
80
60
40
20
CT-C1
Frazione Molare
37°C
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Frazione Molare
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m
Area per molecola (Å 2 )
Area per molecola (Å 2 )
100
80
60
40
20
CT-D
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
100
80
60
40
20
CT-D
Frazione Molare
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Frazione Molare
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m

ACIDI GRASSI
Sono la componente più importante e comune di tutte le classi di lipidi,
sono ampiamente rappresentati negli organismi viventi nei quali
svolgono funzioni strutturali, energetiche e metaboliche;
Chimicamente sono catene idrocarburiche lineari, di lunghezza
variabile, contenenti generalmente un numero pari di atomi di
carbonio, sebbene acidi a catena dispari siano presenti in natura;
Vengono introdotti con la dieta, o sintetizzati dall’organismo,
soprattutto a livello epatico;
Possono essere saturi o insaturi.

ACIDI GRASSI Ω-3
Riducono la coagulazione del sangue;
Proteggono il cuore;
Dilatano i vasi sanguigni;
Riducono la pressione sanguigna;
Sopprimono le infiammazioni;
Antitumorali;
Incrementano i livelli dell’ormone della crescita (promuovono la
crescita muscolare).

HO
HO
O
O
HO
O
C
H 3
ACIDI GRASSI Ω-3
Acido Linolenico
LNA (18:3 n-3)
Acido Eicosapentaenoico
EPA (20:5 n-3)
Acido Docosapentaenoico
DPA (22:5 n-3)
Acido Docosaesaenoico
DHA (22:6 n-3)
COOH

SCOPO DELLA RICERCA
Le funzioni biologiche degli acidi grassi ω-3 fanno ipotizzare una loro
interazione con le membrane lipidiche in cui provocano cambiamenti strutturali
delle regioni del doppio strato lipidico interessate dalla loro presenza.
Gli acidi grassi introdotti con la dieta, per esplicare le loro funzioni, devono
ripartirsi tra il mezzo acquoso e le membrane biologiche, interagire ed essere,
quindi, assorbiti e trasportati all’interno delle stesse.
Studiare l’interazione degli ω-3 a differenti frazioni molari con modelli di
membrane biologiche;
Verificare la capacità degli acidi grassi ω-3 di migrare attraverso il mezzo
acquoso, interagire e penetrare nelle vescicole lipidiche;
Verificare la capacità di trasferimento transmembrana degli acidi grassi ω-3.

INTERAZIONE MLV/COMPOSTI
5 mW endo
0,18
0,15
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
0,00
LNA
8 12 16 20 24 28 32 °C
5 mW endo
0,18
0,15
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
0,00
DPA
8 12 16 20 24 28 32 °C
5 mW endo
0,18
0,15
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
0,00
EPA
8 12 16 20 24 28 32 °C
5 mW endo
0,18
0,15
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
0,00
DHA
8 12 16 20 24 28 32 °C

CINETICHE DI PERMEAZIONE
MLV
5 mW endo
5 mW endo
8 12 16 20 24 28 32 °C
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
LNA
8 12 16 20 24 28 32 °C
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
DPA
5 mW endo
5 mW endo
8 12 16 20 24 28 32
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
EPA
8 12 16 20 24 28 32 °C
r
°C
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
DHA

5 mW endo
8 12 16 20 24 28 32
5 mW endo
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
LNA
r
°C
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
DPA
8 12 16 20 24 28 32 °C
CINETICHE DI PERMEAZIONE
LUV
5 mW endo
8 12 16 20 24 28 32 °C
5 mW endo
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
EPA
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
DHA
8 12 16 20 24 28 32 °C
(∆T/T 0
m ) x 103
2
0
-2
-4
-6
-8
-10
-12
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 r
scansioni calorimetriche
LNA
DPA
DHA
EPA

CINETICHE DI TRASFERIMENTO
5 mW endo
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
X=0,12
LNA
8 12 16 20 24 28 32 °C
5 mW endo
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
DPA
8 12 16 20 24 28 32
X=0,12
°C
5 mW endo
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
X=0,12
EPA
8 12 16 20 24 28 32 °C
5 mW endo
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
X=0,12
DHA
8 12 16 20 24 28 32 °C

CONCLUSIONI
I risultati mettono in evidenza la capacità degli ω-3 di interagire con il
modello di biomembrana;
L’aumento della lunghezza della catena alchilica e il maggior numero di
doppi legami sono le caratteristiche che determinano una maggiore
interazione con il sistema lipidico;
Dagli esperimenti di cinetica è stato evidenziato che il mezzo acquoso ne
ostacola l’assorbimento da parte dei modelli di biomembrana;
Il trasporto attraverso un carrier lipofilo facilita l’assorbimento dei
composti.

Aciclovir (ACV)
Analogo della deossiguanidina;
Potente attività antivirale;
Breve emivita;
Scarso assorbimento;
Bassa biodisponibilità.
PRODRUG SQUALENICI
Citosina Arabinoside (AraC)
Analogo della deossicitidina;
Utilizzato nel trattamento di leucemie acute
mieloidi e dei linfomi;
Rapido metabolismo epatico (deamminazione).
Paclitaxel (PTX)
Agente stabilizzante dei microtubuli;
Utilizzato nel trattamento di tumori al
seno, polmone, ovaie;
Emivita molto variabile;
Metabolismo epatico;
Problemi di formulazione.
N
H 2
O
HN
NH
O
N
OH
O
N
HO
HO
O
O
N
O
OH
AcO
HO
NH 2
N
OH
O
N
O
O
H
O
OH
OAc
O

HO
O
OH
HO
HN
N
AraC-Squalene
N
O
O
PRODRUG SQUALENICI
O
N H
O O
H 3C
O H 3 C
O
O
H 3 C H
H O
O O
O
PTX-Squalene
O
O C H 3
C H 3
O H
O
O
C H 3
N
O
O
N
O
N NH 2
O
NH
ACV-Squalene

2 mW
endo
INTERAZIONE MLV/COMPOSTI
2 mW
endo
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
DMPC
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
ACV
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
DMPC
°C
Squalene
2 mW
endo
2 mW
endo
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
AraC
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
DMPC
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 °C
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
SqualeneCOOH
2 mW
endo
DMPC
°C
PTX
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
0,00
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 °C

2 mW
endo
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
INTERAZIONE MLV/PRODRUG
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
DMPC
ACV-Squalene
2 mW
endo
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
DMPC
AraC-Squalene
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 °C
2 mW
endo
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
DMPC
PTX-Squalene
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 °C

2 mW
endo
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
CINETICHE DI TRASFERIMENTO
2 mW
endo
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
ACV
DMPC
X=0,12
°C
Squalene
2 mW
endo
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
X=0,12
°C
2 mW
endo
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
AraC
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 °C
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
X=0,12
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
X=0,12
SqualeneCOOH
2 mW
endo
°C
r
PTX
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
X=0,06
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 °C

2 m W
endo
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
CINETICHE DI TRASFERIMENTO
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
ACV-Squalene
X=0,12
°C
2 mW
endo
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 °C
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
AraC-Squalene
X=0,12
2 mW
endo
PTX-Squalene
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
X=0,06
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 °C

Pressione superficiale (mN/m)
Pressione superficiale (mN/m)
40
30
20
10
MISURE DI TENSIONE SUPERFICIALE
0
0 20 40 60 80 100 120
40
30
20
10
Area per molecola (Å 2 )
DMPC
0,015
0,03
0,045
0,06
0,09
0,12
0,25
0,5
0,75
Squalene
0
0 20 40 60 80 100 120
Area per molecola (Å 2 )
DMPC
0,015
0,03
0,045
0,06
0,09
0,12
0,25
0,5
0,75
Squalene
10°C
Pressione superficiale (mN/m)
37°C
Pressione superficiale (mN/m)
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80 100 120
40
30
20
10
Area per molecola (Å 2 )
DMPC
0,015
0,03
0,045
0,06
0,09
0,12
0,25
0,5
0,75
SqualeneCOOH
0
0 20 40 60 80 100 120
Area per molecola (Å 2 )
DMPC
0,015
0,03
0,045
0,06
0,09
0,12
0,25
0,5
0,75
SqualeneCOOH

Pressione superficiale (mN/m)
Pressione superficiale (mN/m)
50
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80 100 120
Area per molecola (Å2 )
50
40
30
20
10
DMPC
0,015
0,03
0,045
0,06
0,09
0,12
0,25
0,5
0,75
Aciclovir
0
0 20 40 60 80 100 120
Area per molecola (Å 2 )
MISURE DI TENSIONE SUPERFICIALE
DMPC
0,015
0,03
0,045
0,06
0,09
0,12
0,25
0,5
0,75
Aciclovir-Squalene
Pressione Superficiale (mN/m)
Pressione Superficiale (mN/m)
40
30
20
10
10°C
0
0 20 40 60 80 100 120
40
30
20
10
Area per molecola (Å 2 )
DMPC
0,015
0,03
0,045
0,06
0,09
0,12
0,25
0,5
0,75
AraC
0
0 20 40 60 80 100 120
Area per molecola (Å 2 )
DMPC
0,015
0,03
0,045
0,06
0,09
0,12
0,25
0,5
0,75
AraC-Squalene
Pressione Superficiale (mN/m)
Pressione Superficiale (mN/m)
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80 100 120 140
40
30
20
10
Area per molecola (Å 2 )
DMPC
0,015
0,03
0,045
0,06
0,09
0,12
0,25
0,5
0,75
Paclitaxel
DMPC
0,015
0,03
0,045
0,06
0,09
0,12
0,25
0,5
0,75
Paclitaxel-Squalene
0
0 20 40 60 80 100 120 140
Area per molecola (Å 2 )

Pressione superficiale (mN/m)
Pressione superficiale (mN/m)
50
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80 100 120
50
40
30
20
10
MISURE DI TENSIONE SUPERFICIALE
Area per molecola (Å 2 )
0
0 20 40 60 80 100 120
Area per molecola (Å 2 )
DMPC
0,015
0,03
0,045
0,06
0,09
0,12
0,25
0,5
0,75
Aciclovir
DMPC
0,015
0,03
0,045
0,06
0,09
0,12
0,25
0,5
0,75
Aciclovir-Squalene
Pressione Superficiale (mN/m)
Pressione Superficiale (mN/m)
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80 100 120
40
30
20
10
37°C
Area per molecola (Å 2 )
0
0 20 40 60 80 100 120
Area per molecola (Å 2 )
DMPC
0,015
0,03
0,045
0,06
0,09
0,12
0,25
0,5
0,75
AraC
DMPC
0,015
0,03
0,045
0,06
0,09
0,12
0,25
0,5
0,75
AraC-Squalene
Pressione Superficiale (mN/m)
Pressione Superficiale (mN/m)
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80 100 120 140
Area per molecola (Å 2 )
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80 100 120 140
Area per molecola (Å 2 )
DMPC
0,015
0,03
0,045
0,06
0,09
0,12
0,25
0,5
0,75
Paclitaxel
DMPC
0,015
0,03
0,045
0,06
0,09
0,12
0,25
0,5
0,75
Paclitaxel-Squalene

Area per molecola (Å 2 )
Area per molecola (Å 2 )
100
80
60
40
20
MISURE DI TENSIONE SUPERFICIALE
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
100
80
60
40
20
Squalene
Frazione Molare
Squalene
10mN/m
20mN/m
30mN/m
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Frazione Molare
10mN/m
20mN/m
30mN/m
10°C
37°C
Area per molecola (Å 2 )
Area per molecola (Å 2 )
100
80
60
40
20
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
100
80
60
40
20
SqualeneCOOH
Frazione Molare
SqualeneCOOH
10mN/m
20mN/m
30mN/m
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Frazione Molare
10mN/m
20mN/m
30mN/m

Area per molecola (Å 2 )
Area per molecola (Å 2 )
100
80
60
40
20
ACV
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
100
80
60
40
20
ACV-Squalene
Frazione Molare
MISURE DI TENSIONE SUPERFICIALE
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Frazione Molare
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m
Area per molecola (Å 2 )
Area per molecola (Å 2 )
100
80
60
40
20
100
AraC
10°C
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
80
60
40
20
AraC-Squalene
Frazione Molare
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Frazione Molare
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m
Area per molecola (Å 2 )
Area per molecola (Å 2 )
100
80
60
40
20
100
PTX
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
80
60
40
Frazione Molare
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m
20
10 mN/m
PTX-Squalene
20 mN/m
30 mN/m
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Frazione Molare

Area per molecola (Å 2 )
Area per molecola (Å 2 )
100
80
60
40
20
100
80
60
40
20
ACV
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
ACV-Squalene
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
MISURE DI TENSIONE SUPERFICIALE
Frazione Molare
Frazione Molare
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m
Area per molecola (Å 2 )
Area per molecola (Å 2 )
100
80
60
40
20
100
80
60
40
20
AraC
AraC-Squalene
37°C
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Frazione Molare
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Frazione Molare
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m
Area per molecola (Å 2 )
Area per molecola (Å 2 )
100
80
60
40
20
100
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
80
60
40
PTX
Frazione Molare
20
10 mN/m
PTX-Squalene 20 mN/m
0
30 mN/m
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Frazione Molare
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m

CONCLUSIONI
I farmaci altamente idrofili, come l’ACV o l’AraC, si localizzano quasi
esclusivamente nel compartimento acquoso dei liposomi, ciò limita la loro stabilità e,
quindi, le loro possibili applicazioni.
Per favorire l’incorporazione di tali farmaci, nei liposomi è possibile utilizzare
prodrug lipofili allo scopo di migliorare le caratteristiche chimico-fisiche del
farmaco rendendolo più adatto all’inserimento nel doppio strato fosfolipidico e
conferendo una maggiore stabilità metabolica.
Gli studi effettuati, mediante DSC, hanno dimostrato che:
L’ACV, l’AraC e lo Squalene hanno un effetto molto basso sul comportamento
termotropico delle membrane modello dovuto, rispettivamente, alla localizzazione
negli strati acquosi fra i doppi strati fosfolipidici ed all’insolubilità nell’ambiente
idrofobo delle catene aciliche fosfolipidiche;
Lo SqualeneCOOH ed i prodrug causano una forte destabilizzazione del doppio
strato lipidico, proporzionale alla quantità di composto presente, ciò indica che
essi si inseriscono nel doppio strato;
Il maggiore carattere lipofilo consente l’incorporazione dei prodrug nei liposomi,
essi sono inoltre trattenuti all’interno delle vescicole.

CONCLUSIONI
Il PTX, nonostante il suo carattere altamente lipofilo, influenza il
comportamento degli MLV solo a basse concentrazioni; ad alte
concentrazioni, il farmaco è incapace di dissolversi ed inserirsi nel
bilayer fosfolipidico.
Il prodrug ha una maggiore effetto sugli MLV rispetto al farmaco
libero, proporzionale alla concentrazione. Ciò è dovuto alla
componente squalenica che consente l’inserimento del prodrug nel
doppio strato fosfolipidico degli MLV.
Dalle cinetiche di trasferimento transmembrana, possiamo dedurre
che il sistema liposomiale riesce ad incorporare il prodrug e a
trattenerlo maggiormente al suo interno, rispetto al farmaco libero,
rappresentando così un valido candidato come sistema carrier.

CONCLUSIONI
Gli studi d’interazione con modelli di membrana costituiti da monolayer di
DMPC, mediante la tecnica di Langmuir-Blodgett, hanno confermato la
migliore interazione dei prodrug Squalenici, rispetto ai farmaci liberi;
Per tutti e tre i prodrug si instaurano, infatti, forti deviazioni positive,
soprattutto a frazioni molari più alte;
Tali deviazioni sono attribuibili ad interazioni repulsive che si instaurano tra
i composti e la DMPC dovuta ad una riduzione della densità del monolayer
causata da una maggiore area occupata dalle molecole che lo compongono.

NITRO-IDROCARBURI POLICICLICI AROMATICI
Sono derivati degli Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA), contengono due o più
anelli aromatici condensati;
Sono presenti nell’ambiente in miscela con altri composti organici, sia liberi nell’aria
che adsorbiti a materiale particolato;
I nitro-IPA sono prodotti diretti o indiretti di combustioni incomplete;
Tali composti sono solo parzialmente degradati da microrganismi e possono
persistere nell’ambiente a causa della loro bassa solubilità, dell’elevato peso
molecolare e per il carattere polare del nitrogruppo.
O 2 N
2,7-dinitrofluorene
NO 2
2-nitrofluorene
NO 2
3-nitrofluorantene
NO 2

NITRO-IDROCARBURI POLICICLICI AROMATICI
Questi composti possono rappresentare un rischio per la salute, infatti
numerosi studi hanno dimostrato la loro
Attività mutagena;
Attività carcinogenica;
Metabolizzazione in derivati che legano DNA e proteine;
Induzione della sintesi, non programmata, di DNA.
Per chiarire la relazione tra la struttura chimica dei nitro-IPA ed il loro
effetto sulle biomembrane abbiamo studiato l’influenza di tre diversi nitro-
IPA sul comportamento termotropico di MLV di DMPC, scelti come
biomembrane modello.
Inoltre, sono state studiate le cinetiche di assorbimento dei composti da parte
delle biomembrane modello per comprendere il ruolo svolto dall’idrofilia o
dalla lipofilia del mezzo in tale processo.

2 mW
endo
INTERAZIONE MLV/COMPOSTI
0,18
0,15
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
DMPC
2,7 - dinitrofluorene
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
(∆T/T° m ) x 10 3
2
0
-2
-4
2 mW
endo
0,18
0,15
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
DMPC
2 - nitrofluorene
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
2-nitrofluorene
2,7-dinitrofluorene
3-nitrofluorantene
-6
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2
frazione molare
2 mW
endo
0,18
0,15
0,12
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
DMPC
3 - nitrofluorantene
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C

2 mW
endo
CINETICHE DI PERMEAZIONE
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
2,7 - dinitrofluorene
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
(∆T/T° m ) x 10 3
1
0
-1
-2
-3
2 mW
endo
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
2 - nitrofluorene
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
2-nitrofluorene
2,7-dinitrofluorene
3-nitrofluorantene
-4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 r
scansioni calorimetriche
2 mW
endo
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
3 - nitrofluorantene
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C

2 mW
endo
CINETICHE DI TRASFERIMENTO
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
X=0,09
2,7 - dinitrofluorene
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
(∆T/T0 m ) x 103
1
0
-1
-2
2 mW
endo
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
X=0,09
2 - nitrofluorene
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C
-3
-4
2-nitrofluorene
2,7-dinitrofluorene
3-nitrofluorantene
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 r
scansoni calorimetriche
2 mW
endo
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
X=0,09
3 - nitrofluorantene
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 °C

CONCLUSIONI
Gli studi effettuati, mediante DSC, hanno dimostrato:
Il seguente ordine d’interazione: 3-nitrofluorantene>2-nitrofluorene>
2,7-dinitrofluorene;
Uno scarso assorbimento dei nitro-IPA attraverso i modelli di
biomembrana nel mezzo acquoso;
Un forte assorbimento dei nitro-IPA attraverso i modelli biomembrana
mediato dal mezzo lipofilo.

CUMARINE
Gruppo eterogeneo di composti aventi diverse proprietà
farmacologiche e terapeutiche (vasodilatatrice, antiproliferativa,
antimicrobica, analgesica, antitumorale ed antiossidante);
Appartengono alla classe dei benzopirani, costituiti da un anello
benzenico unito ad un pirone;
Sono molto rappresentate nel regno vegetale, per la loro capacità di
agire come fitoalesine;
Dopo somministrazione orale sono completamente assorbite nel tratto
gastrointestinale.

H 3 COC
HO
O O
Scopoletina
(7-idrossi-6-metossi-2H-1 benzopiran-2-one )
HO
H
H
OH
OH
H
O
H
OH
O
HO
HO
HO
O O
O O
Esculetina
(6,7-diidrossi-2H-1-benzopiran-2-one)
Esculina
(6-(β-D-glucopiranosilossi)-7-idrossi-2H-1-benzopiran-2-one)

(∆T/T 0
m ) x 103
0
-1
-2
-3
-4
-5
2 mW
endo
Scopoletina
Esculetina
Esculina
INTERAZIONE MLV/COMPOSTI
pH = 4,0
-6
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
Frazioni Molari
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
0,00
Scopoletina
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
°C
2 mW
endo
(∆∆H/∆H 0 ) x 10 3
Esculetina
0
-50
-100
-150
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
0,00
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
°C
Scopoletina
Esculetina
Esculina
2 mW
endo
-200
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
Frazioni Molari
Esculina
0,09
0,06
0,045
0,03
0,015
0,00
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
°C

2 mW
endo
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
CINETICHE DI PERMEAZIONE
pH = 4,0
Scopoletina
(∆T/T 0
m ) x 103
1
0
-1
-2
-3
-4
-5
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
°C
2 mW
endo
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
Scopoletina
Esculetina
Esculina
Esculetina
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
-6
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 r
scansioni calorimetriche
°C
2 mW
endo
Esculina
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
r
9 scan
8 scan
7 scan
6 scan
5 scan
4 scan
3 scan
2 scan
1 scan
DMPC
°C

Pressione Superficiale (mN/m)
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80 100 120
Area per molecola (Å 2 )
100
80
60
40
20
Scopoletina
Area per molecola (Å 2 )
MISURE DI TENSIONE SUPERFICIALE
DMPC
0,024
0,048
0,09
0,17
0,5
0,75
Scopoletina
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Frazione Molare
Area per molecola (Å 2 )
Pressione Superficiale (mN/m)
100
80
60
40
20
40
30
20
10
37°C; pH = 4,0
0
0 20 40 60 80 100 120
Esculetina
Area per molecola (Å 2 )
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Frazione Molare
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m
DMPC
0,024
0,048
0,09
0,17
0,5
0,75
Esculetina
Area per molecola (Å 2 )
Pressione Superficiale (mN/m)
100
80
60
40
20
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80 100 120
Esculina
Area per molecola (Å 2 )
10 mN/m
20 mN/m
30 mN/m
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Frazione Molare
DMPC
0,024
0,048
0,09
0,17
0,5
0,75
Esculina

Dalle analisi effettuate è emerso che
CONCLUSIONI
L’Esculetina, insieme alla Scopoletina, interagiscono maggiormente con
il bilayer fosfolipidico;
L’Esculina, essendo più idrofila, destabilizza meno il bilayer;
Esculina ed Esculetina sono assorbite lentamente, ed in maniera
incompleta, dagli MLV di DMPC, nonostante la loro idrofilia; ciò può
essere giustificabile con la formazione di legami idrogeno con le teste
polari dei fosfolipidi che tengono i composti ancorati alla superficie delle
vescicole;
La Scopoletina, avendo maggiore affinità per l’ambiente idrofobico, del
bilayer viene completamente assorbita dagli MLV;
Nei monolayer misti tra le molecole di DMPC e le cumarine si
instaurano interazioni repulsive ciò è dovuto alla capacità che hanno
molecole simili di aggregarsi tra loro, riducendo la densità del
monolayer.

Prof. Francesco Castelli;
RINGRAZIO
Dott.ssa Maria Grazia Sarpietro;
Prof. Gaetano Giammona.