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CARATTERIZZAZIONE FISIOLOGICA E MOLECOLARE

DI LIEVITI APICULATI D’INTERESSE ENOLOGICO

Giuseppe COMI

Dipartimento di Scienze degli Alimenti, Facoltà di Agraria, Università degli Studi di Udine, Via

Marangoni, 97, 33100 Udine,I.

E-mail: giuseppe.comi@uniud.it

Parole chiave: lieviti apiculati, caratterizzazione, metodi tradizionali, metodi molecolari.

Key-words: Apiculate yeasts, characterization, traditional methods, molecular methods.

1. INTRODUZIONE

I lieviti sono microrganismi ampiamente distribuiti in natura e nei più disparati

substrati alimentari, quali carni, formaggi e latte, vegetali, frutta e in particolare sull’uva.

Pasteur aveva osservato che la polpa dell’uva, prelevata in asepsi, e i frutti immaturi

erano privi di lieviti. Questi, infatti, possono essere osservati solo sulla buccia a

maturazione avvenuta. Successivamente, grazie all’utilizzo del microscopio a scansione,

si è potuto osservare che i lieviti sono localizzati sulle lenticelle e sugli stomi; in queste

sedi essi formano microcolonie sfruttando le sostanze zuccherine fuoriuscite tramite

soluzioni di continuità. Sulla bacca si possono trovare, oltre ai lieviti alcolici, anche

blastomiceti ossidanti, batteri acetici, batteri lattici e muffe.

Quando si osserva la flora blastomicetica di mosti in fermentazione, ci si accorge

che questa cambia con il procedere del processo fermentativo (Comi, Traldi, 1982;

Delfini, 1995; Zambonelli, 2005); già De Rossi (cit. Castelli, 1969) stabilì che i lieviti

devono essere isolati dai mosti in tre fasi successive e precisamente dopo la pigiatura,

durante la fermentazione tumultuosa ed alla fine del processo fermentativo. I lieviti

isolati nelle tre fasi in questo studio, poi confermati da diversi autori, sono i seguenti:

Kloeckera apiculata, Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora rosei, Saccharomyces

bayanus, Metschnikowia pulcherrima, Kloeckera magna e Candida stellata.

Suddividendo i lieviti in sporigeni ed asporigeni si è notato che nei mosti di Paesi

a clima caldo predominano gli sporigeni, in quelli a clima freddo gli asporigeni: infatti

il genere Kloeckera, asporigeno, presente soprattutto nei mosti del nord, viene sostituito

nei mosti del sud dal genere Hanseniaspora, sporigeno. Castelli (1969) ha dimostrato

che tale cambiamento è proprio dovuto al clima; infatti ha notato che in zone di alta

collina del sud predominano i ceppi asporigeni, come anche in zone a clima temperato:

quindi, in queste località, nella prima fase della fermentazione si sviluppano Kloeckera

spp. e solo in un secondo tempo Saccharomyces cerevisiae (Romano et al., 1992; 1993;

1997; Zironi et al., 1993; Esteve-Zarzoso et al., 2001; Comi et al., 1997; 2001; Zohre,

QUAD. VITIC. ENOL. UNIV. TORINO, 30, 2008


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Erten, 2002; Cocolin et al., 2002; 2004; Manzano et al., 2004). Inoltre nei mosti ottenuti

da uve botritizzate si possono trovare anche concentrazioni notevoli di Candida stellata,

mentre in vini giovani, in particolare in bianchi, possono essere isolati

Schizosaccharomyces pombe e Saccharomyces bayanus (Cocolin et al., 2002; 2004).

È comunque opinione condivisa che la stragrande maggioranza dei lieviti implicati

nei processi fermentativi provengano dalle cantine e dalle attrezzature enologiche

piuttosto che dalle uve. Si è di fatto notato che in cantine di nuova costruzione il mosto

fatica ad entrare in fermentazione, appunto perché l’ambiente non è sufficientemente

contaminato da lieviti fermentanti.

La popolazione blastomicetica dei mosti e dei vini è ampiamente rappresentata da

lieviti buoni fermentatori e da lieviti ossidanti: questi ultimi compaiono principalmente

ad inizio fermentazione ed appartengono ai generi Pichia, Hansenula, Candida e

Brettanomyces (Comi, Traldi, 1982; Romano et al., 1992; 1993; 1997; Zironi et al., 1993;

Cocolin et al., 2004).

Ora, vista l’ampia diffusione dei lieviti in cantina ed in alcuni casi anche sulle bacche,

i microbiologi hanno effettuato una selezione in funzione delle specie, indirizzando la loro

attenzione su quelle che presentano caratteri ritenuti industrialmente utili e vantaggiosi,

quindi verso Saccharomyces cerevisiae e S. bayanus, Schizosaccharomyces pombe e

Torulaspora rosei. Naturalmente alcune specie, benché isolate nelle cantine e presenti

nei mosti, non hanno finora dimostrato un grande interesse dal punto di vista enologico

(Kloeckera apiculata), mentre altri sono tuttora oggetto di studio (Schizosaccharomyces

pombe).

1.1.I lieviti apiculati

G. COMI

Il processo di vinificazione è il risultato di una complessa interazione tra diversi

gruppi microbici.

Gli studi effettuati hanno dimostrato che nel processo fermentativo possono

intervenire diverse specie di lieviti indigeni (Fleet et al., 1984; Heard, Fleet, 1986).

Nelle prime fasi delle fermentazioni spontanee, prendono il sopravvento lieviti apiculati,

quali Kloeckera apiculata, Hanseniaspora guilliermondii, ed altre specie quali

Candida stellata, Hansenula spp., Torulaspora delbrueckii, e solo in un secondo tempo

si ha l’intervento della specie Saccharomyces cerevisiae. Infatti, con il procedere della

fermentazione gli apiculati soccombono e lasciano che S. cerevisiae la domini e la

completi. Tali cambiamenti sono stati osservati durante le fermentazioni spontanee in

ogni parte del mondo (Fleet, 1989; Herraiz et al., 1990; Fregoni et al., 2004; Ribéreau-

Gayon et al., 2004; Comi et al., 2005).

Tuttavia la presenza di Kloeckera apiculata, Hanseniaspora guilliermondii ed

Hanseniaspora uvarum, come già accennato, parrebbe legata alle condizioni climatiche

della zona di vinificazione; è noto, infatti, che Kloeckera spp. è presente principalmente


LIEVITI APICULATI D’INTERESSE ENOLOGICO 85

in mosti di zone fredde, viceversa Hanseniaspora spp. in mosti di zone a clima

mediterraneo. In Italia, infatti, Kloeckera spp. viene isolata dalle uve del Nord, viceversa

Hanseniaspora spp. viene isolata da uve provenienti da aree meridionali.

Inizialmente la concentrazione di questi lieviti non-saccaromicetici nel mosto non

supera mai le 10 4 -10 5 UFC mL -1 ; poi durante lo sviluppo la loro concentrazione può

raggiungere valori compresi tra le 10 6 e le 10 8 UFC mL -1 . Quindi, a causa dell’incremento

della concentrazione dell’alcool e della competizione operata da Saccharomyces spp.,

gli apiculati decrescono fino a scomparire entro la prima settimana di fermentazione

(Fregoni et al., 2004; Ribéreau-Gayon et al., 2004; Comi et al., 2005). Tuttavia il loro

intervento può risultare significativo nella produzione dell’aroma e della composizione

chimica del vino (Romano et al., 1993; 1997; Comi et al., 2001). Infatti è ormai

riconosciuto che la produzione dei circa 400 componenti volatili del vino è imputabile

allo sviluppo in associazione di varie specie levuliformi e non solo alla specie

Saccharomyces cerevisiae (Lafon-Lafourcade, Riberéau-Gayon,1984). Del resto la

natura e la concentrazione dei composti volatili e non-volatili presenti in ogni tipo di

produzione vinaria dipende non solo dai parametri chimico-fisici (temperatura, pH,

composizione dei mosti), ma anche e soprattutto dallo sviluppo, dalla persistenza e

dalla prevalenza ora dell’una, ora dell’altra specie microbica (Kunkee, Amerine, 1970;

Lafon-Lafourcade, Riberéau-Gayon, 1984; Romano et al., 1993;1997; Comi et al., 2001):

lo sviluppo, infatti, di Kloeckera apiculata e Torulaspora delbrueckii prima del S. cerevisiae

incrementa la concentrazione dei componenti volatili nei vini (Herraiz et al., 1990).

Per questi motivi, negli anni, si è diffusa la tecnica di inoculare ceppi di lieviti buoni

fermentatori (Saccharomyces cerevisiae e/o S. bayanus) nel mosto ai fini di operare

fermentazioni in purezza, che permettano di ottenere vini di qualità. Indubbiamente

l’uso di ceppi starters permette ai vinificatori di migliorare la produzione, canalizzando

l’andamento della fermentazione; i ceppi maggiormente utilizzati appartengono alle

specie Saccharomyces cerevisiae e S. bayanus che, una volta inoculati nel mosto, si

presuppone siano in grado di prendere rapidamente il sopravvento sui lieviti indigeni

e sugli apiculati in particolare.

Invece spesso accade che ceppi indigeni, quali Candida spp. e Kloeckera spp.

continuino a svilupparsi normalmente, nonostante gli inoculi di 10 6 -10 7 UFC mL -1 di

ceppi starters attivati: i non-saccaromicetici, sviluppandosi, possono comunque portare

il loro contributo alla fermentazione. Solo dopo 3-4 giorni di fermentazione il ceppo

inoculato prende definitivamente il sopravvento. Inoltre, anche gli stessi Saccharomyces

indigeni continuano indisturbati la loro crescita.

L’uso di inoculi con ceppi marcati geneticamente o distinguibili all’analisi elettroforetica

ha dimostrato che questi ceppi starters non dominano completamente la

fermentazione (Delteil, Aizac, 1988) e gli apiculati continuano a fermentare per diversi

giorni; da ciò deriva che difficilmente si riesce ad operare una fermentazione in purezza

se non si usano mosti trattati con SO 2 o filtrati. L’uso degli stessi lieviti killer non è

sufficiente ad impedire lo sviluppo dei lieviti indigeni: quindi, nonostante l’impiego


86

G. COMI

degli starters, gli apiculati riescono a dare un contributo fondamentale alle fermentazioni.

La temperatura regola lo sviluppo dei microrganismi, per cui risulta molto importante

il suo controllo durante la fermentazione: attualmente è possibile operare con tecnologie

che permettono di regolare la temperatura di ogni punto della massa fermentativa.

In colture miste l’impiego di temperature idonee può favorire lo sviluppo e la

predominanza ora dell’una, ora dell’altra specie: in particolare, temperature inferiori

ai 20 °C favoriscono lo sviluppo dei non-saccaromiceti (Heard, Fleet, 1988a, b). A questa

temperatura la fermentazione sembra essere dominata da K. apiculata e S. cerevisiae

(Heard, Fleet, 1988a, b) mentre a 10 °C, K. apiculata può prendere addirittura il

sopravvento su Saccharomyces (Fleet, 1989). La stessa resistenza all’etanolo è incrementata

in K. apiculata e Candida stellata a temperature comprese tra i 10 ed i 20 °C (Gao,

Fleet, 1988; Heard, Fleet, 1988a, b); cellule di K. apiculata tollerano il 10-12,5 % di

alcol a 15 °C, ma non a 10 °C e 30 °C (Gao, Fleet, 1988), mentre C. stellata tollera il

12,5 % di alcol a 10-l5 °C, ma non a 30 °C. Gli stessi S. cerevisiae manifestano un’alta

resistenza all’etanolo a temperature inferiori ai 20 °C, ma a temperature superiori la loro

resistenza diminuisce (Gao, Fleet, 1988).

Una delle ragioni principali dell’aggiunta di SO 2 ai mosti è la limitazione dello

sviluppo dei lieviti indigeni; nelle fermentazioni naturali, infatti, l’assenza di tale

composto favorisce lo sviluppo dei lieviti indigeni saccaromicetici, apiculati e filmogeni:

la dominanza dei primi viene ottenuta solo dopo una settimana di fermentazione.

Nel caso di mosti fermentati con starters risulta quasi d’obbligo l’impiego di diossido

di zolfo. Infatti si tende a considerare che questo sopprima sia Saccharomyces indigeni,

sia i lieviti apiculati e filmogeni. Tuttavia, spesso le sperimentazioni hanno dimostrato

che l’SO 2 non sempre ha effetto sui lieviti indigeni (Fleet, 1989), nonostante alcuni

ricercatori sostengano che la composizione aromatica e la qualità dei vini prodotti con

mosti addizionati di tale composto sia simile a quella di vini fermentati in presenza di

soli Saccharomyces (Herraiz et al., 1989).

In mosti rossi la concentrazione di 100 ppm di SO 2 non inibisce la crescita di

K. apiculata (Fleet, 1989), mentre in mosti bianchi 50 ppm di SO 2 sono sufficienti ad

inibire questo lievito (Heard, Fleet, 1988b). In ogni caso, lo sviluppo dei non-saccaromiceti

risulta lievemente rallentato dalla presenza di SO 2 : tale rallentamento è correlato alla

concentrazione dell’inibente e risulta più marcato per le specie Candida rispetto a

Kloeckera ed a Torulaspora.

Naturalmente il limitato sviluppo dei non-saccaromiceti si ripercuote anche sulla

composizione dei componenti, volatili e non, dei vini: è stato infatti osservato che vini

fermentati con associazioni di K. apiculata, Torulaspora delbrueckii e S. cerevisiae

contenevano una frazione volatile quantitativamente superiore rispetto a quella di vini

fermentati con solo S. cerevisiae (Herraiz et al., 1989; 1990).

Inoltre nel mosto l’attività di lieviti apiculati o non-saccaromiceti è favorita in parte

anche dalla loro potenziale capacità di produrre il cosiddetto fattore Killer (K+), glicoproteina

o proteina molto efficace nei confronti di un gran numero di Saccharomyces


LIEVITI APICULATI D’INTERESSE ENOLOGICO 87

spp. sia di origine naturale che di starter selezionati del commercio. È ormai conosciuta

l’esistenza di lieviti killer, appartenenti a varie specie presenti nei mosti in fermentazione

(Heard et al., 1987); gli stessi lieviti starter del commercio possono contenere il fattore

killer oppure il fattore che induce resistenza (R+) ai ceppi killer. Tuttavia la specificità

della tossina killer di tali ceppi è tale da non produrre significative mutazioni nella

flora microbica naturale di un mosto (Heard, Fleet, 1987), per cui questi lieviti K+ non

hanno un grande effetto sui ceppi apiculati del mezzo. Del resto l’azione della PK

(Proteina Killer) è così specifica che il bersaglio può essere rappresentato da un solo

ceppo, ma mai da un’intera specie o genere, anche se i lieviti K+ del commercio, essendo

selezionati, possono avere un ampio spettro d’azione. Infatti è stato dimostrato come

l’inoculo di alcuni ceppi starter costituiti da S. cerevisiae K+ abbia inattivato la maggior

parte della flora indigena, anche se secondo alcuni autori l’uso di ceppi selezionati

produttori del fattore K+ può essere inutile, essendo alta la concentrazione dei ceppi

indigeni nel mosto resistenti a tale fattore (Barre, Vezinhet, 1984).

Altri parametri che possono influenzare lo sviluppo dei lieviti apiculati sono la

composizione dei mosti (particolarmente importanti risultano la concentrazione degli

zuccheri e delle componenti azotate ed il pH del mezzo), la presenza di residui di

fungicidi e la popolazione microbica antagonista. È noto che a pH=3,0-3,5 a 25 °C S.

cerevisiae è il lievito dominante, mentre le altre specie, benché presenti, vengono inattivate

con il procedere della fermentazione (Heard et al., 1988a). Il pH non influenza

invece la resistenza all’alcol dei non-saccaromiceti: come abbiamo sopra riportato, è

solo la temperatura che incide sulla resistenza a questo composto (Gao et al., 1988).

In generale l’influenza dei fungicidi e della flora antagonista è poco conosciuta; è

noto tuttavia che alcuni fungicidi possono rallentare i processi fermentativi ed inattivare

gli apiculati nel mosto.

Infine sull’antagonismo dei batteri acetici si sa che Acetobacter aceti, A. pasteurianus

e Gluconobacter oxydans non inibiscono la crescita degli apiculati e di Saccharomyces

spp.; del resto la competizione è limitata principalmente alle fonti azotate e non a quelle

carboniche, per cui si potrebbe osservare solo un rallentamento dello sviluppo in fase

di latenza.

Di conseguenza gli apiculati e i non-saccaromiceti si sviluppano e fermentano

durante i primi stadi di fermentazione e in alcuni casi fino a concentrazione dell’alcol

pari al 5-6 %; valore limite per gran parte degli apiculati stessi.

I lieviti apiculati comprendono i generi: Kloeckera, Hanseniaspora e

Saccharomycodes (tab. 1). Sulle uve e nei mosti italiani sono presenti in particolare

Kloeckera apiculata, Hanseniaspora uvarum, H. guilliermondii e Saccharomycodes

ludvigii.

Le fermentazioni vinarie sono condotte da lieviti buoni fermentatori quali S. cerevisiae

e S. bayanus, lieviti naturalmente presenti nel mosto o addizionati intenzionalmente

come starter. Uno dei problemi principali di queste fermentazioni guidate è sapere se

effettivamente il lievito inoculato abbia preso il sopravvento sui lieviti indigeni e abbia


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Tab. 1 - Principali specie di lieviti apiculati presenti nei mosti.

Kloeckera apiculata

Kloeckera magna

Hanseniaspora uvarum

Hanseniaspora guilliermondii

Hanseniaspora vinae

Saccharomycodes ludvigii

iniziato e portato a termine la fermentazione. A tale scopo sono stati prodotti e ottimizzati

numerosi metodi molecolari. Tali metodi, basati sullo studio del genoma, permettono di

identificare in ogni fase della fermentazione i ceppi che intervengono. Di conseguenza

permettono di identificare sia i ceppi “buoni fermentatori” sia ceppi di apiculati. Ora

ai fini fermentativi risulta più importante individuare i ceppi inoculati piuttosto che i ceppi

indigeni. Del resto la maggior parte dei metodi molecolari della letteratura identificano

prevalentemente ceppi di Saccharomyces spp. anche se per ottenere una completa

informazione sulle specie che intervengono in ogni stadio della fermentazione vinaria

risulta altrettanto importante la produzione e l’ottimizzazione di metodi molecolari in

grado di caratterizzare gli apiculati. A tal proposito, in questa sede, saranno citati metodi

tradizionali e non-convenzionali e/o molecolari per caratterizzare e tipizzare lieviti

apiculati direttamente o previo isolamento da mosti in fermentazione.

2. CARATTERIZZAZIONE DEI LIEVITI APICULATI

G. COMI

Gli apiculati vengono caratterizzati attraverso studi fenotipici e genotipici. I primi

si basano sullo studio delle caratteristiche morfologiche, fermentative e ossidative nei

confronti di composti organici quali zuccheri o acidi. I secondi si basano sull’analisi del

genoma attraverso studi del cariotipo, del DNA ribosomiale, del DNA mitocondriale e

delle impronte digitali (fingerprinting). In letteratura, ai fini ecologici o per definire la

diffusione delle diverse popolazioni di apiculati, vengono utilizzate una o più associazioni

di metodi molecolari.

Per tipizzare gli apiculati sono state usate: l’analisi del DNA ribosomiale, ottenuta

attraverso l’amplificazione di rDNA (sequence ITS-Internal transcribed spaces, NTSnon

transcribed spaces, domini D1/D2) e successiva restrizione degli ampliconi (PCR-

RFLP- Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Lenght Polymorphism); l’analisi

(cariotipo) di cromosomi interi o di cromosomi trattati con enzimi di restrizione, attraverso

PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis); l’amplificazione di frammenti di rDNA, e

successiva rilevazione degli ampliconi attraverso DGGE (Denaturing Gel Gradient


LIEVITI APICULATI D’INTERESSE ENOLOGICO 89

Electrophoresis) o TGGE (Temperature Gel Gradient Electrophoresis); la restrizione

del DNA mitocondriale (mt-DNA-RFLP); il fingerprinting basato sull’amplificazione

di sequenze ripetute di DNA o di microsatelliti o RAPD-PCR (Random Amplified

Polymorphic-DNA). L’impiego di tali tecniche permette di discriminare i lieviti apiculati

a livello intra e inter-specie, e di conoscere la diffusione in natura o in fermentazioni

delle diverse popolazioni.

I metodi di identificazione e caratterizzazione comprendono test tradizionali, sempre

coltura-dipendenti e molecolari, che possono essere coltura-indipendenti o dipendenti.

I metodi molecolari coltura-dipendenti o indipendenti vengono utilizzati per identificare

i microrganismi dopo isolamento o direttamente dal substrato. Per studi ecologici, di

popolazioni o per valutare la biodiversità intraspecifica, si utilizzano solo metodi

coltura-dipendenti.

2.1.Metodi tradizionali

I metodi tradizionali usati per identificare gli apiculati comprendono l’isolamento

in piastra, lo studio della morfologia, della capacità di produrre o meno le spore, i test

di fermentazione o di assimilazione: si riporta quindi un esempio di test da eseguire per

identificare alcune specie di Kloeckera e Hanseniaspora (tab. 2).

Tali test permettono la sola identificazione della specie e non del ceppo e di

conseguenza non sono utili ai fini di valutare la biodiversità microbica intraspecifica.

Sono utili ai fini ecologici per valutare le diverse specie che intervengono in un

substrato in fermentazione.

Tab. 2 - Test consigliati per identificare alcune specie di Kloeckera e Hanseniaspora.

Cellule a forma di limone

Kloeckera apiculata:

No crescita a 37 °C

No fermentazione saccarosio

Assimilato 2-keto-D-gluconato

Hanseniaspora guilliermondii H. uvarum

ascospore a cappello ascospore rotonde

Crescita a 37 °C + Crescita a 37 °C -

Maltosio - Maltosio -

Saccarosio - Saccarosio -

Legenda: - non assimilato


90

2.2.Metodi molecolari

G. COMI

2.2.1.Analisi del cariotipo

Tale tecnica permette di separare interi cromosomi o frammenti di cromosomi

tagliati con enzimi di restrizione attraverso un’elettroforesi in campo pulsato (PFGE).

Esteve-Zarzoso e coll. (2001) utilizzando tale tecnica identificarono diverse specie

di apiculati e in particolare Hanseniaspora guilliermondii, H. uvarum, H. valbyensis,

H. occidentalis, H. osmophila e H. vinae. Infatti tramite PFGE, ceppi di

Hanseniaspora vennero classificati dapprima in due gruppi principali e quindi nelle

diverse specie in base al numero e alla posizione delle bande ottenute nel gel in seguito

alla separazione degli interi cromosomi.

2.2.2.Analisi del DNA mitocondriale (mit-DNA-RFLP)

La tecnica permette di identificare i lieviti a livello intraspecifico e consiste

nell’estrarre il DNA totale dalle cellule di lievito, digerirlo con enzimi di restrizione

(es. IndIII o InfI) e separare i frammenti del mit-DNA per elettroforesi in agarosio.

Le tecniche dell’analisi del cariotipo e del mitDNA-RFLP vennero utilizzate da

Rodriguez e coll. (2004) per caratterizzare lieviti indigeni di vini prodotti in Patagonia.

L’analisi del cariotipo permise di identificare le diverse specie di lieviti non-

Saccharomyces (Candida e Hanseniaspora), mentre l’analisi del mit-DNA-RFLP

permise di separare i lieviti a livello di ceppo. In base a questi ultimi dati gli autori

conclusero che esisteva una notevole variazione genetica a livello intraspecifico,

variazione non evidenziabile però a livello fenotipico.

2.2.3.Analisi del DNA ribosomiale (rDNA)

Il DNA ribosomiale utilizzato in tale tecnica (fig. 1) comprende rDNA 18 S, rDNA

5.8 S, circondato da 2 frammenti nucleotidici che non sono trascritti (ITS1 e ITS2),

rDNA 26S, che contiene i domini D1/D2, rDNA 5 S, compreso tra due sequenze di DNA

non trascritte (NTS1 e NTS2) e dal rDNA 18S. Tali rDNA sono il bersaglio di primers, che

permettono, attraverso la rilevazione con diverse tipologie di elettroforesi, l’identificazione

a livello di specie (primers specifici) o a livello di ceppo (fingerprinting) quando

l’amplicone viene digerito con enzimi di restrizione.

Fig. 1 - DNA ribosomiale (Mannazzu, Budroni, 2005).


LIEVITI APICULATI D’INTERESSE ENOLOGICO 91

Prodotti di PCR (interi o tagliati con enzimi di restrizione) ottenuti attraverso

l’amplificazione di rDNA sono rilevati in diverse elettroforesi; dalla classica elettroforesi

in gel di agarosio, alla DGGE, TGGE. L’impiego di DGGE e di TGGE permette

l’identificazione della specie senza utilizzare l’isolamento delle colonie (è un metodo

coltura-indipendente). Tali elettroforesi ottenute in gel di acrilamide permettono di

separare gli ampliconi prodotti in base alla sequenza nucleotidica e non al loro peso

molecolare. In altre parole possono essere separate sequenze diverse anche se ottenute con

gli stessi primers. Di seguito si riportano esempi di applicazione di tali tecniche basate

si riportano sull’amplificazione del rDNA per tipizzare e caratterizzare lieviti apiculati.

Caruso e coll. (2002) amplificarono le sequenze NTS (spazi non trascritti) con

primers specifici ai fini di tipizzare ceppi di Kloeckera apiculata isolati da uve

‘Aglianico’ del Vulture. In particolare per valutare la biodiversità intraspecifica, gli

ampliconi ottenuti in PCR vennero digeriti con due enzimi di restrizione HaeIII e MspI.

Pur avendo ottenuto un numero rilevante di bande in seguito a restrizione dell’amplicone

(NTS), la tecnica non permise agli autori di discriminare gli isolati a livello di ceppo.

Infatti, contrariamente a quanto ottenuto da altri autori, tutti i ceppi considerati

presentavano gli stessi profili elettroforetici.

Esteve-Zarzoso e coll. (2001) amplificarono la regione ITS e la regione 5.8S-ITS

per caratterizzare diversi ceppi di Hanseniaspora. I prodotti PCR vennero digeriti in

diversi frammenti con enzimi di restrizione (CfoI, DdeI, HaeIII e HinfI). In base al

numero e al peso molecolare dei frammenti, gli autori poterono discriminare gli isolati

sia a livello di specie sia di ceppo e pertanto conclusero che tale tecnica debba essere

considerata discriminante e in grado di studiare popolazioni microbiche di uve o di mosti.

Mills e coll. (2002) utilizzarono metodiche coltura-dipendente e indipendente per

caratterizzare lieviti di mosti di uve botritizzate, nel corso della fermentazione. In

particolare impiegarono la tecnica DGGE per valutare profili elettroforetici di ampliconi

ottenuti attraverso l’amplificazione di rDNA e rRNA. La tecnica DGGE permette di

identificare ceppi senza il bisogno di isolarli dal substrato (coltura-indipendente). Per

identificare i ceppi attivi in tutte le fasi della fermentazione gli autori amplificarono

l’rRNA, che poi era tradotto in rDNA attraverso trascrittasi inversa (RT-PCR). In questa

maniera la tecnica permise di identificare ceppi, che pur rimanendo attivi fino a fine

fermentazione del mosto, non erano evidenziabili attraverso l’isolamento in piastra.

Infatti gli autori identificarono un ceppo di Candida spp. solo con RT-PCR; Candida,

estremamente fruttosofila, non è evidenziabile tramite coltura in piastra. Di conseguenza

conclusero che le tecniche coltura-dipendenti e indipendenti debbono essere associate

ai fini di ottenere un quadro reale e generale dei ceppi che intervengono in fermentazioni

sia guidate che spontanee.

Ai fini di identificare rapidamente lieviti vinari, Guillamon e coll. (1998) utilizzarono

la tecnica della RFLP (restrizione enzimatica) applicata a prodotti PCR ottenuti

amplificando le regioni ITS1 e ITS4 del rDNA. Gli enzimi di restrizione utilizzati

comprendevano CfoI, HaeIII e HinfI. La tecnica era altamente discriminativa e permetteva


92

G. COMI

di separare nettamente, in base al numero e al peso dei frammenti ottenuti dalla digestione

degli ampliconi, le diverse specie di non-Saccharomyces e Saccharomyces isolate dai

vini. Pertanto gli autori proposero la RFLP-PCR per monitorare la presenza di lieviti

durante fermentazioni spontanee.

2.2.4.Analisi del fingerprinting tramite l’amplificazione di sequenze ripetute di

DNA o di microsatelliti o RAPD-PCR (Random Amplified Polimorphic-DNA),

REP, ERIC.

Tecniche basate sull’amplificazione di DNA tramite primers in grado di legarsi a

sequenze ripetute lungo i cromosomi dei microrganismi. Esse sono poco ripetibili e

riproducibili e talvolta non producono alcuna discriminazione. Tuttavia trovano largo

impiego nella caratterizzazione intraspecifica di microrganismi o popolazioni microbiche

presenti nei diversi substrati alimentari.

Fig. 2 - Studio tramite FISH (Fluorescence in situ hybridization) dell’evoluzione di specie

fungine in mosti a fermentazione naturale (A) ed a fermentazione con aggiunta di

S. cerevisiae starter (B) (Xufre et al., 2006).


LIEVITI APICULATI D’INTERESSE ENOLOGICO 93

Legenda: Sonde di S. cerevisiae (Sce); Candida stellata (Cst); Hanseniaspora uvarum (Huv); Hanseniaspora

guilliermondii (Hgu); Kluyveromyces thermotolerans (Kth); Kluyveromyces marxianus (Kma);

Torulaspora delbrueckii (Tde); Pichia melibiosa (Pme); Pichia anomala (Pan); eumiceti (generale - EUK).

Fig. 3- Identificazione tramite FISH (Fluorescence in situ hybridization) di specie fungine di

mosti (Xufre et al., 2006).


94

Caruso e coll. (2002) utilizzarono microsatelliti (GAC)5 e (GTG)5 per tipizzare

ceppi di Saccharomyces cerevisiae e Kloeckera apiculata isolati da uve ‘Aglianico’. La

tecnica permise di ottenere ottimi risultati nella discriminazione di ceppi di S. cerevisiae;

viceversa fallì a livello di ceppi di Kloeckera apiculata.

Risultati simili vennero ottenuti da Bujdoso e coll. (2001), che caratterizzarono

tramite tecniche molecolari ceppi di Hanseniaspora uvarum e H. osmophila. Le tecniche

utilizzate comprendevano RAPD-PCR, microsatelliti (PCR) e ITS-PCR. I prodotti

ITS-PCR vennero tagliati con DdeI. Tramite ITS, i ceppi di H. uvarum presentavano lo

stesso numero di bande ed erano indistinguibili tra loro e distinguibili da H. osmophila.

Invece tramite microsatelliti e RAPD-PCR i diversi ceppi di H. uvarum erano

distinguibili tra loro e da H. osmophila.

2.2.5.Analisi FISH (Fluorescence In Situ Hybridization).

Tale tecnica permette di analizzare popolazioni microbiche attraverso l’impiego di

sonde oligonucleotidiche fluorescenti specie-specifiche. Queste si legano al segmento

complementare del DNA delle cellule bersaglio specifiche, che sono osservate al

microscopio a epifluorescenza.

Xufre e coll. (2006) analizzarono la popolazione di lieviti Saccharomyces e non-

Saccharomyces isolati da vini attraverso l’impiego di sonde oligonucleotidiche marcate

con fluoresceina che ibridavano i domini D1/D2 della regione 26S rRNA. La tecnica

permise di identificare Candida stellata, Hanseniaspora guilliermondii, H. uvarum,

Kluyveromyces marxianus, Kl. thermotolerans, Pichia anomala, P. membranifaciens,

Saccharomyces cerevisiae e Torulaspora delbrueckii. L’identificazione era a livello di

specie e non intraspecifica o di ceppo. Tuttavia gli autori poterono seguire l’andamento

di fermentazioni spontanee e guidate (figg. 2 e 3).

3. CONCLUSIONI

G. COMI

Gli apiculati Kloeckera apiculata, Hanseniaspora guilliermondii e H. uvarum sono

lieviti considerati poco interessanti ai fini enologici. Intervengono solo nei primi stadi

della fermentazione e producono poco etanolo, al massimo il 6-8 %, e alte concentrazioni

di acidità volatile (0,5-1 ‰). Tuttavia recentemente sono stati riscoperti e si ritiene che in

fermentazioni spontanee e controllate possano arricchire il fermentato di aromi costituiti

da composti sia volatili che non volatili (esteri, acidi). Essi vengono caratterizzati attraverso

studi fenotipici e genotipici. I primi si basano sullo studio delle caratteristiche morfologiche,

fermentative e ossidative nei confronti di composti organici quali zuccheri o acidi,

mentre i secondi si basano sull’analisi del genoma attraverso studi del cariotipo, del

DNA ribosomiale, del DNA mitocondriale e del fingerprinting. I metodi tradizionali

richiedono tempi lunghi di risposta, viceversa quelli molecolari sono più rapidi e non

obbligano l’isolamento della colonia, essendo coltura-indipendenti.


LIEVITI APICULATI D’INTERESSE ENOLOGICO 95

In particolare i metodi molecolari permettono la caratterizzazione del ceppo a livello

intra- e interspecie, e, di conseguenza, sono utili per l’identificazione con o senza isolamento,

per studi sull’ecologia e di popolazioni e per la scelta di starter per fermentazioni guidate.

Attualmente vengono prodotti e ottimizzati prevalentemente metodi molecolari per

caratterizzare i ceppi di S. cerevisiae e S. bayanus, le due principali specie utili ai fini

enologici. Tuttavia parallelamente sono descritti metodi molecolari per caratterizzare e

tipizzare lieviti apiculati, con lo scopo di avere sempre un quadro completo e reale

delle fermentazioni spontanee e guidate del vino.

In futuro si spera che detti metodi possano permettere di comprendere il reale

significato dei lieviti apiculati nella produzione vinaria.

Riassunto

I lieviti apiculati, Kloeckera apiculata, Hanseniaspora guilliermondii e H. uvarum, sono

presenti sulle bacche e nel mosto, e intervengono nei primi stadi della fermentazione vinaria.

Essi vengono caratterizzati attraverso studi fenotipici e genotipici. I primi si basano sullo studio

delle caratteristiche morfologiche, fermentative e ossidative nei confronti di composti organici

quali zuccheri o acidi, mentre i secondi si basano sull’analisi del genoma attraverso studi del

cariotipo, del DNA ribosomiale, del DNA mitocondriale e del fingerprinting.

PHYSIOLOGICAL AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF APICULATE

YEASTS FROM MUSTS AND WINES

Abstract

The apiculate yeasts, Kloeckera apiculata, Hanseniaspora guilliermondii and H. uvarum, are

present on grapes and in grape juices. In traditional winemaking they produce spontaneous

fermentation during the first stage, then die off with the increasing of ethanol concentration,

being replaced by Saccharomyces cerevisiae. Apiculate yeasts are characterized by traditional

and molecular methods, including karyotyping analysis, PCR-DGGE, PCR-TGGE, mit-DNA,

rDNA, and fingerprinting-analysis.

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