曾寧瑄 - 黃慶璨研究室

生化科技學系微生物與細胞專題討論
題目: A molecular mechanism that stabilizes cooperative secretions in Pseudomonas
aeruginosa
作者:Joao B. Xavier, Wook Kim, Kevin R. Foster
文章來源:Molecular Microbiology, 79(1):166-179, 2011.
演講人:Ning-Hsuan Tseng 曾寧瑄 B97B02061
指導老師:Ching-Tsan Huang, PhD 黃慶璨 博士
演講日期:June 12, 2012
演講地點:The 6th Classroom
摘要
綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種伺機性的病原菌,易產生抗藥性而
造成嚴重的院內感染,當菌體存在於固體表面時,會由單一營養(vegetative)細胞
變成多細胞、多鞭毛且具有表面移行能力的swarmer cells。研究指出以這種型態
存在的菌體具有較高的抗藥性。細菌間會利用分泌某些化合物來進行細胞間的溝
通進而產生致病性,而綠膿桿菌間的溝通受到群體感應系統(quorum sensing
system)的調控,群體感應系統藉由細胞密度來調控基因的表現。細菌的移動與
養分的利用有很大的關係,綠膿桿菌主要有三種移動方式,分別為抽動
(twitching)、泳動(swimming)以及表面移行(swarming),表面移行是細菌感應外在
環境變化的一種細胞群體移動行為,需要藉由鞭毛的驅動以及鼠李醣脂
(rhamnolipids)的分泌以進行移動。目前已知鼠李醣脂的分泌和rhl基因家族的表現
有關,rhlA基因表現RhlA酶,對於合成鼠李醣脂有重要的影響,因此rhlAB調控
子的表現在利用鼠李醣脂時至為關鍵。當菌株缺失rhlA基因時將無法合成鼠李醣
脂並導致其無法進行表面移行,但是當野生株和突變株共同培養時,這種突變株
卻能夠利用野生株分泌的鼠李醣脂來恢復表面移行的能力。本文利用此特性來探
討野生株以及缺少rhlA基因的突變株在培養基上的移動性並且提出分泌的合作
機制(metabolic prudence),當碳氮比(C/N ratio)高時菌體會由生長轉往至利用多餘
的碳來生產並分泌鼠李醣脂。
Keywords:Pseudomonas aeruginosa, quorum sensing system, swarming, cooperative
secretion, metabolic prudence
本研究之重要性
前言
綠膿桿菌這種伺機性病原菌,會造成病人傷口感染以及抗藥性等問題[1],
綠膿桿菌藉由表面移行以更有效的利用養分,並擴散到其他地方[2],而鼠李醣
脂缺陷株可利用野生株分泌的鼠李醣脂來恢復移行能力[3],提升綠膿桿菌的致
病性。群體感應系統調控合成鼠李醣脂必頇的基因,當該基因被刪減後,菌株無

法進行表面移行,若能干擾群體感應系統將可抑制綠膿桿菌的致病性[4]。
前人作過的研究
鼠李醣脂調控綠膿桿菌的表面移行能力[5],而 rhlA 基因對於鼠李醣脂前驅
物的合成是必頇的[6]。
作者為何要作本研究
目前對於突變株和野生株進行合作卻能夠維持分泌機制的穩定性有兩種解
釋,一種是由於空間分佈的關係,使得對分泌產生貢獻的野生株能夠遠離突變
株;另一種可能是藉由基因多效性調控的機制。然而作者認為這兩種假設的可能
性不高,尤其是大量分泌所需付出的代價相當的高,本文提出了 metabolic
prudence 機制,即在有碳源過多的情況下,鼠李醣脂才會被合成,以減少能量耗
損,並解釋致病性分泌的穩定性。
本研究欲完成之項目
探討野生株分泌鼠李醣脂以及突變株利用其以進行表面移行的合作機制,未
來或許能夠應用在治療致病性細菌的感染。
菌株
材料與方法
(一) 綠膿桿菌菌株 P. aeruginosa PA14 野生株。
(二) 刪減 rhlA 基因的 PA14 rhlA _ 突變株,不具有表面移行的能力。
(三) 刪減 rhlA 基因但可以利用 PBAD 啟動子誘導表現 rhlAB 基因的 PA14
rhlA _ PBADrhlAB 突變株,具有表面移行的能力。
質體
(一) pYL122:帶有 PrhlABGFP fusion。
(二) pEC16:帶有 PBAD 啟動子可經由 L-arabinose 誘導表現 P. aeruginosa 的 rhlAB
基因。
Swarming assays
接種菌液來自前一天培養的菌液,預先用 PBS 洗兩次後再取 2 μL 接種到培養基
的中心於 37 o C 培養一天。
Liquid assays
96 孔微量盤於 37 o C 震盪培養,每 10 分鐘測一次 OD600 和綠色螢光強度。
Chloroform/methanol extraction
將體積比 2:1 的氯仿和甲醇混合溶液加入上清液後混勻,於 40 o C 隔夜放置,從
中萃取出分泌的脂質。
結果與討論
野生株的表面移行可增加培養基上的菌落數

隨著培養時間的增加,野生株的菌落會從培養基的中心擴散到四周,養分的
利用也更有效率使得菌落數明顯高於無法進行表面移行的突變株(圖一)。
rhlA _ 突變株可利用野生株分泌的鼠李醣脂來進行表面移行
野生株以及 rhlA _ 突變株共同培養時,野生株分泌的鼠李醣脂會使其開始表
面移行,當鼠李醣脂與突變株接觸後,原本無法進行表面移行的突變株也能夠開
始移行(圖二)。
當碳氮比高時,菌體可開始合成鼠李醣脂,遵循 metabolic prudence 機制
利用 2D matrices 表示細胞密度、rhlAB 表現量和碳源、氮源的關係(圖三),
當碳氮比高時,菌體開始合成鼠李醣脂,與本文提出的 metabolic prudence 機制
一致。
進入穩定期 rhlAB 基因才會開始表現
rhlAB 基因受到群體感應系統的調控,當細胞密度較高時下游基因才會表
現,一旦開始表現就能夠開始合成鼠李醣脂(圖四)。
lasI 基因和 rhlI基因對於 rhlAB 基因的調控是必頇的
綠膿桿菌有兩套群體感應系統:las 系統以及 rhl 系統,系統具有表現自體誘
導物合成酶的 I 基因和促進轉錄的 R 基因,當菌株的 I 基因被刪除時,無法合成
自體誘導物,因此無法順利啟動群體感應系統去調控 rhlAB 基因的表現(圖五),
使得突變株無法進行表面移行;然而在 lasI _ 和 rhlI _ 突變株分別添加自體誘導物
後,可恢復其表面移行的能力(圖六)。
添加 L-arabinose 使得可被誘導的 rhlA _ PBADrhlAB 突變株開始進行表面移行
對照野生株可發現雖然移動的形態有差異,但是加入誘導物後的突變株在鼠
李醣脂的分泌量和菌落數都會增加(圖七)。
共同培養野生株和突變株時菌落數沒有顯著的差異
同時從培養基的中間接種野生株和突變株的菌株(圖八),突變株可利用野生
株分泌的鼠李醣脂進行表面移行,兩者利用養分的效率一致,所以在菌落數上沒
有明顯的差異。
可誘導的 rhlA _ PBADrhlAB 突變株會被 rhlA _ 突變株取代
共同培養 rhlA _ PBADrhlAB 突變株和 rhlA _ 突變株(圖九),經過連續四天的繼代
會發現隨著時間,rhlA _ PBADrhlAB 突變株因為沒有受到外加誘導物的誘導而失去
表面移行的能力。
參考文獻
1. Christian Van Delden, Barbara H. Iglewski. Cell-to-cell signaling and
Pseudomonas aeruginosa infections, Emerging Infectious Disease, 4 (4):551-558,
1998.
2. Joao B Xavier. Social interaction in synthetic and natural microbial communities,
Molecular Systems Biology, 7:483, 2011.

3. Rodrigo S. Reis, Alyson G. Pereira, Bianca C. Neves, Denise M.G. Freire. Gene
regulation of rhamnolipid production in Pseudomonas aeruginosa- A review,
Bioresource Technology, 102:6377-6384, 2011.
4. Everett C. Pesci, Barbara H. Iglewski. Quorum sensing in Pseudomonas
aeruginosa, Cell-Cell signaling in bacteria, American Society for Microbiology,
1999.
5. Thilo Kohler, Lasta K. Curty, Francisco Barja, Christian van Delden,
Jean-Claude Pechere. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on
cell-to-cell signaling and requires flagella and pili, Journal of Bacteriology.,
182(21):5990–5996, 2000.
6. Daniel B. Kearns. A field guide to bacterial swarming motility, Nature Reviews
Microbiology, 8:634-644, 2010.
7. Nicky C. Caiazza, Judith H. Merritt, Kimberly M. Brothers, George A. O'Toole.
Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas
aeruginosa PA14, Journal of Bacteriology, 189(9):3603-3612, 2007.
圖表
圖一、表面移行會使得菌落數增加但是需要個別菌體分泌鼠李醣脂
隨著培養時間的增加,野生株的菌落會從培養基的中心擴散到四周,養分的利用
也更有效率使得菌落數明顯高於無法進行表面移行的突變株。
圖二、rhlA _ 突變株會利用野生株分泌的鼠李醣脂來進行表面移行

當鼠李醣脂與突變株接觸後,原本無法進行表面移行的突變株也能夠開始進行移
動。
圖三、當碳氮比高時,菌體可開始合成鼠李醣脂
利用 2D matrices 表示細胞密度、rhlAB 表現量和碳源、氮源的關係,當碳氮比高
時,菌體開始合成鼠李醣脂。
圖四、進入穩定期 rhlAB 基因才會開始被表現
rhlAB 基因受到群體感應系統的調控,當細胞密度較高時下游基因才會被表現,
一旦開始表現就能夠開始合成鼠李醣脂。
圖五、綠膿桿菌的群體感應系統
綠膿桿菌有兩套群體感應系統:las 系統以及 rhl 系統,系統中具有表現自體誘導
物合成酶的 I 基因和促進轉錄的 R 基因,當菌株的 I 基因被刪減時,無法合成自
體誘導物,因此無法順利啟動群體感應系統去調控 rhlAB 基因的表現。

圖六、lasI 基因和 rhlI基因對於 rhlAB 基因的調控是必頇的
在 lasI _ 和 rhlI _ 突變株分別添加自體誘導物後,可恢復其表面移行的能力,但是
在野生株中外加自體誘導物並不會影響其表面移行的能力和菌落數。
圖七、添加 L-arabinose 使得可被誘導的 rhlA _ PBADrhlAB 突變株開始進行表面移
行
對照野生株可發現雖然移動的形態有差異,但是加入誘導物後的突變株在鼠李醣
脂的分泌量和菌落數都會增加。
圖八、共同培養野生株和突變株時菌落數沒有顯著的差異
同時從培養基的中間接種野生株和突變株的菌株,突變株可利用野生株分泌的鼠
李醣脂進行表面移行,兩者利用養分的效率一致,所以在菌落數上沒有明顯的差
異。
圖九、可誘導的 rhlA _ PBADrhlAB 突變株會被 rhlA _ 突變株取代
共同培養 rhlA _ PBADrhlAB 突變株和 rhlA _ 突變株,經過連續四天的繼代會發現隨
著時間,rhlA _ PBADrhlAB 突變株因為沒有受到外加誘導物的誘導而失去表面移行
的能力。