Comunicazioni orali e Poster sul Monitoraggio biologico - Giornale ...

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl, 17-112 © PI-ME, Pavia 2004
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COMUNICAZIONI ORALI E POSTER
SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
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E.P. Abbritti 1 , N. Murgia 1 , N. Orazi 1 , M. dell’Omo 1 , T. Pierini 2 , G. Abbritti 1 , G. Muzi 1
Effetti del cromo esavalente sulla cellularità polmonare di addetti
alla cromatura galvanica
1 Sezione di Medicina del Lavoro e Tossicologia Professionale e Ambientale, Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Università di Perugia
2 Medico Competente
RIASSUNTO. Il cromo metallico ed i composti del cromo trivalente
ed esavalente sono largamente impiegati in ambito industriale. L’esposizione
professionale a cromo (Cr), anche a basse concentrazioni, può causare
flogosi delle vie aeree e asma bronchiale. Evidenze sperimentali suggeriscono
che l’espettorato indotto è una metodica valida per analizzare
gli indici cellulari e biochimici di infiammazione polmonare. Allo scopo
di ottenere informazioni sull’infiammazione polmonare causata dall’esposizione
professionale a Cr sono stati valutati gli effetti su 11 lavoratori maschi
addetti alla cromatura galvanica ed i risultati confrontati con quelli ottenuti
in un gruppo di 9 soggetti non esposti. Tutti i partecipanti, non fumatori
e non affetti da patologie polmonari in atto, sono stati sottoposti a
spirometria e a valutazione dell’espettorato indotto. I parametri spirometrici
sono risultati normali. Nei campioni di espettorato la concentrazione
leucocitaria totale (82,98 ± 49,00 x10 4 cell/ml vs 68,89 ± 22,71
x10 4 cell/ml) e la concentrazione assoluta dei neutrofili (53,08 ± 34,79
x10 4 cell/ml vs 40,45 ± 12,52 x10 4 cell/ml) sono risultate maggiori negli
esposti rispetto ai non esposti. I risultati ottenuti, anche se non statisticamente
significativi, anche a causa del modesto numero di partecipanti allo
studio, potrebbero indicare la presenza di iniziali alterazioni flogistiche.
Parole chiave: cromo esavalente, cellularità polmonare, flogosi delle
vie aeree.
ABSTRACT. EFFECTS OF HEXAVALENT CHROMIUM ON LUNG CEL-
LULARITY IN CHROMATE WORKERS. Chromium and tri- and hexavalent
chromium compounds are widely used in industry. Occupational exposure
to chromium, even though at lower concentrations than current
TLV, may cause airway inflammation and bronchial asthma. Eleven male
chromate workers have been evaluated using induced sputum technique,
and the results have been compared to a group of 9 non-exposed
subjects. Members of both groups, non-smokers and those currently
unaffected by lung disease, have been submitted to lung function tests
and to sputum induction. Lung function values were normal. Total
leukocyte concentration and absolute neutrophils concentration, evaluated
on induced sputum, were higher in exposed than in non-exposed
subjects (82,98 ± 49,00 x10 4 cell/ml vs 68,89 ± 22,71 x10 4 cell/ml;
53,08 ± 34,79 x10 4 cell/ml vs 40,45 ± 12,52 x10 4 cell/ml), but the differences
were not statistically significant. These results, although obtained
from only a few exposed workers, may indicate early inflammation
alterations in the airways.
Key words: hexavalent chromium, lung cellurarity, airway inflammation.
Introduzione
Il cromo metallico è largamente impiegato nell’industria. I
principali bersagli del Cr sono cute e mucose. L’esposizione a Cr,
a concentrazioni anche inferiori agli attuali TLV, può provocare
infiammazione delle mucose bronchiali e asma nei lavoratori
esposti (1). Studi citologici di campioni ottenuti mediante BAL e
biopsia bronchiale hanno evidenziato che i composti del Cr possono
essere rilevati nei tessuti polmonari degli esposti e indurre
modificazioni degli indici cellulari di flogosi (2). Numerosi studi
hanno evidenziato che l’espettorato indotto è una metodica valida,
già utilizzata per analizzare gli indici cellulari e biochimici di
flogosi polmonare nello studio dell’asma bronchiale, della bronchite
cronica, delle esposizioni a tossici ambientali e professionali
e dell’effetto di alcuni farmaci sull’infiammazione delle vie
aeree (3, 4, 5, 6).
Questo studio è stato condotto allo scopo di ottenere informazioni
sull’infiammazione polmonare causata dall’esposizione
professionale a Cr alle concentrazioni attualmente presenti negli
ambienti di lavoro.
Materiali e metodi
Allo studio hanno partecipato 11 lavoratori maschi addetti alla
cromatura galvanica (età media ± DS: 43,7 ± 7,2 aa) con
un’anzianità lavorativa media pari a 9,6 ± 6,4 aa, ed un gruppo di
9 soggetti non esposti (età media: 30,8 ± 4,5 aa). Tutti i partecipanti,
non fumatori e non affetti da malattie respiratorie in atto,
sono stati sottoposti a dosaggio del Cr urinario, spirometria ed
espettorato indotto. I campioni di espettorato sono stati quindi
raccolti e processati seguendo metodiche validate (7).
Risultati
Tutti i partecipanti allo studio presentavano valori spirometrici
normali.
Nei campioni di espettorato la concentrazione leucocitaria
totale (82,98 ± 49,00 x10 4 cell/ml vs 68,89 ± 22,71 x10 4
cell/ml) e la concentrazione dei neutrofili (53,08 ± 34,79 x10 4
cell/ml vs 40,45 ± 12,52 x10 4 cell/ml) sono risultate maggiori
negli esposti rispetto ai non esposti, pur non raggiungendo la significatività
statistica.Non è emersa alcuna correlazione significativa
tra anzianità lavorativa, concentrazione urinaria di Cr
(fine turno lavorativo, 7,59 ± 4,60 µg/g creat) e indicatori di flogosi
presi in esame.
Discussione
I risultati di questo studio, pur mostrando un aumento della
concentrazione dei leucociti e dei neutrofili nei lavoratori esposti,
non sembrano sufficienti a supportare l’ipotesi che l’esposizione
professionale a basse concentrazioni di Cr provochi alterazioni
degli indici cellulari di flogosi nell’espettorato indotto.
Questo studio è il primo in cui l’espettorato indotto viene impiegato
per studiare la flogosi polmonare indotta da Cr. Questa
tecnica è stata utilizzata nella valutazione dell’asma bronchiale
e di altre patologie bronco-polmonari, anche conseguenti all’esposizione
a tossici professionali (3,4,5,8), dimostrando in alcuni
casi sensibilità paragonabile a quella del BAL e della biopsia
bronchiale (9).
L’inalazione di Cr, anche a concentrazioni al di sotto degli
standard consentiti, può provocare infiammazione a livello tracheobronchiale
(1). Park et al hanno rilevato un aumento della
reattività bronchiale alla metacolina in soggetti sottoposti a esposizione
controllata a sali di Cr (10).
Kondo et al, in uno studio condotto su biopsie bronchiali di
lavoratori esposti, hanno rilevato un accumulo di Cr nelle regioni
bronchiolo-alveolari e subpleuriche maggiore che in quelle più
prossimali dell’apparato respiratorio, dove peraltro è presente a

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livello delle biforcazioni bronchiali (11). Studi condotti su animali
hanno evidenziato che l’inalazione di Cr provoca un incremento
dei linfociti e dei macrofagi alveolari e zone di modesta
infiltrazione interstiziale, per lo più costituita da linfociti, neutrofili
ed eosinofili (12,13).
I risultati di questo studio potrebbero indicare che l’esposizione
a basse concentrazioni di Cr non sia tale da indurre
effetti infiammatori rilevabili con l’espettorato indotto
in un limitato numero di esposti. Tuttavia, l’aumento della
concentrazione leucocitaria totale e dei neutrofili, soprattutto
considerando l’accurato controllo dei possibili fattori di
confondimento, potrebbe indicare la presenza di iniziali alterazioni
flogistiche.
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C.M. Ansalone 1 , G. Sarcletti 2 , V. Crespi 2 , D. Cavallo 3 , R. Borchini 2 , M. Ferrario 1,2
RIASSUNTO. Vengono riportati i risultati preliminari delle associazioni
tra i valori medi delle concentrazioni di sevoflurano (SF) e protossido
d’azoto (PA) nei campioni urinari di 65 soggetti professionalmente
esposti a basse concentrazioni ed i valori medi ambientali degli stessi
anestetici rilevati in 12 sale operatorie nel 2004 in un ospedale lombardo.
I dati raccolti hanno dimostrato che la variabilità statistica spiegata dai rilievi
biologici è superiore per il SF rispetto al PA. Il coefficiente di correlazione
lineare è risultato di 0,47 per il PA e di 0,63 per il SF. L’ampiezza
degli intervalli di confidenza sta ad indicare la considerevole variabilità
dei dosaggi biologici. Una ulteriore standardizzazione delle variabili
individuali e della tecnica analitica potrebbero migliorare ulteriormente
le associazioni riscontrate.
Parole -chiave: sevoflurano, monitoraggio biologico, esposizione
professionale, personale ospedaliero.
ABSTRACT. BIOLOGICAL MONITORING OF OCCUPATIONAL EXPO-
SURE TO LOW SEVOFLURANE CONCENTRATIONS: A NEW TECHNIQUE FOR
MEASURING URINARY SEVOFLURANE. This paper reports the preliminary
results of the association between biological and environmental measurements
of exposure of two of the most frequently used anesthetics:
sevoflurane (SF) and nitrous oxide (N2O). Environmental measurements
of SF and N2O were performed in twelve operating theaters of a
university hospital in northern Italy. Urine samples were simultaneously
collected from 65 surgical staff. SF and N2O determinations were
done using gas-chromatography with an ECD detector. All environmental
measurements were within threshold limit values, confirming
flammation and pulmonary function. Proceedings of the American
Thoracic Society 1997.
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Messa a punto di un metodo di misura del sevoflurano urinario per
il monitoraggio biologico della esposizione a basse concentrazioni
1 Scuola di Specializzazione di Medicina del Lavoro, Università degli Studi dell’Insubria, Varese
2 Medicina del Lavoro e Preventiva, AO Ospedale di Circolo Fondazione Macchi di Varese, Varese
3 Dipartimento di Scienze Chimiche e Ambientali, Facoltà di Scienze, Università degli studi dell’Insubria, Como
low-dose exposures. Correlation coefficients between biological and
environmental mean values were 0.47 for N 2 O and 0.63 for SF. Only
part of the environmental SF and N 2 O variability could be explained
by the corresponding biological measurements. Further standardization
of the duration and conditions of individual exposure and the
adoption of individual environmental sampling may further improve
the associations.
Key words: sevoflurane, biological monitoring, occupational exposure,
health care workers.
Introduzione
Il sevoflurano (SF) è un etere alogenato introdotto tra i gas
anestetici in Italia dal 1985, in associazione con il protossido d’azoto
(PA). Ha bassa solubilità ematica, che consente rapidi induzione
dell’anestesia e risveglio; bassi coefficienti di ripartizione
sangue-aria alveolare e sangue-tessuti, che contribuisce a conferire
potenza narcotica elevata, facile dosaggio e rapide modificazioni
della profondità dell’anestesia (4).
La maggior parte del SF è eliminata nelle urine tal quale.
Solo il 5% del SF subisce biotrasformazione epatica, con ossidrilazione
ad opera dell’isoenzima CYP 2E1 e formazione di
fluoraldeide (quindi di acido formico) e di alcool esa-fluoroisopropilico
e liberazione di ioni fluoro (5,6). Ad elevate con-

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centrazioni ematiche, il SF ha dimostrato
tossicità epatica, depressione
respiratoria e cardiovascolare,
convulsioni ed ipertermia maligna
(4). Il SF reagisce con la Soda
Lime [NaOH 5%, Ca(OH)2 95%],
utilizzata per assorbire la CO 2 nei
circuiti di anestesia, producendo il
Composto A, riconosciuto nefrotossico
nei ratti. Nell’uomo sono
state segnalate lesioni reversibili
del tubulo renale, anche a basse
concentrazioni (5,7). Per il monitoraggio
biologico dei soggetti professionalmente
esposti sono spesso
utilizzati i fluoruri nelle urine, che
presentano bassa specificità. Più
recentemente è stato proposto il dosaggio urinario dell’alcool
esa-fluoro-isopropilico e del sevoflurano tal quale (2,5,8). Con
il presente contributo si riportano i risultati preliminari delle associazioni
tra i valori medi delle concentrazioni di SF e PA nei
campioni urinari di 65 soggetti professionalmente esposti a basse
concentrazioni ed i valori medi ambientali degli stessi anestetici
riscontrati in 12 sale operatorie, rilevati nel 2004 in un
ospedale lombardo.
Materiali e metodi
Determinazioni ambientali: I monitoraggi ambientali sono
stati eseguiti in 12 sale operatorie nei mesi di febbraio-marzo
2004, tramite monitor Brüel-Kjaer per analisi dei gas, dotato
di spettroscopia fotoacustica a raggi infrarossi, come sistema
analitico, e di microfono come trasduttore di misura. Per la presente
analisi sono stati utilizzati i rilievi medi relativi all’intera
seduta operatoria (1). Il campionamento è avvenuto posizionando
il sensore a circa 150 cm di altezza, in prossimità del
campo operatorio.
Raccolta e conservazione dei campioni urinari: I campioni
di urine sono stati raccolti al termine della seduta operatoria o
dopo almeno tre ore dall’inizio dell’intervento. La raccolta dei
campioni urinari è stata condotta al di fuori del comparto operatorio,
nel minor tempo possibile (entro 5 minuti), utilizzando
contenitori con 0.2 ml di acido solforico 9N, immediatamente sigillati.
I campioni raccolti sono stati conservati a 4°C ed analizzati
entro una settimana. Le determinazioni di SF e PA sono state
effettuate in gas-cromatografia con la tecnica dello spazio di
testa e rilevazione ECD, secondo il metodo proposto da Buratti et
al. (2), parzialmente modificato. Si è utilizzato un gas-cromatografo
Perkin Elmer 8500 dotato di rivelatore a cattura di elettroni.
Come gas di trasporto (carrier) e di make-up è stato utilizzato
azoto puro. La linearità delle determinazioni è stata valutata tramite
sequenze scalari di standard (Sevorane - Abbott) da 10 a
1000 µg/L. Il limite di rilevabilità per il SF è di 1,0 µg/L. I dosaggi
sono stati effettuati presso il Laboratorio di Tossicologia
della UO di Medicina del Lavoro e Preventiva dell’Ospedale di
Circolo di Varese.
Risultati
In Tabella I sono riportati i valori medi ambientali del SF e del
PA, per le singole sale operatorie sottoposte a controllo, il numero
di campioni di urine raccolte ed i valori medi urinari (e relativo
errore standard) dei dosaggi di SF e PA. Un soggetto con riconosciuta
infezione delle basse vie urinarie e con campioni raccolti
in due sale operatore è stato escluso per il dosaggio di PA.
Tabella I. Valori ambientali e biologici di protossido di azoto e sevoflurano registrati
La variabilità statistica spiegata (R 2 ) dei rilievi biologici è risultata
superiore per il sevoflurano rispetto al protossido di azoto.
Il coefficiente di correlazione lineare di Pearson è risultato di
0,47 per il PA e di 0,63 per il SF.
Discussione
I vantaggi della determinazione del SF tal quale sono rappresentati
dalla elevata specificità, dalla possibilità di poterlo
determinare con la medesima colonna del PA. Per contro lo
svantaggio principale è rappresentato dalla necessità di avere
elevate sensibilità dello strumento di rilevazione (2, 3). L’ampiezza
degli intervalli di confidenza riscontrati indica la considerevole
variabilità dei dosaggi biologici, che possono risentire
di numerosi fattori, quali i tempi e le modalità di stazionamento
in sala operatoria, oltre che delle variabilità intra-individuale e
analitica. Una ulteriore standardizzazione delle variabili individuali
e della tecnica analitica, potrebbero migliorare ulteriormente
le associazioni con i livelli ambientali, incluso l’utilizzo
di campionatori personali.
Bibliografia
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A. Baccarelli 1,2 , A. Pesatori 1 , D. Consonni 3 , D.Patterson Jr. 4 , M. Bonzini 1 , B. Marinelli 1 , J. A. Grassman 5 ,P.A. Bertazzi 1 , M.T. Landi 2
Metodologie molecolari e genetiche nello studio degli effetti di agenti
occupazionali ed ambientali: l’esempio del “Seveso Molecular
Epidemiology Project”
1 Dipartimento di Medicina del Lavoro “Clinica L. Devoto”, Università degli Studi di Milano, Milano
2 Genetic Epidemiology Branch, Division of Cancer Epidemiology and Genetics, National Cancer Institute, NIH, DHHS, Bethesda, MD, USA
3 Unità Operativa di Epidemiologia, Azienda Ospedaliera Istituti Clinici di Perfezionamento, Milano
4 Division of Environmental Health Laboratory Science, National Center for Environmental Health, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta,
GA, USA
5 Health and Nutrition Sciences, Brooklyn College, CUNY, Brooklyn, NY, USA
RIASSUNTO. Nel 1997 la IARC ha classificato la 2,3,7,8tetraclorodibenzo-p-diossina
(TCDD) come un cancerogeno per l’uomo
sulla base di sufficienti evidenze da esperimenti animali e limitate evidenze
da studi epidemiologici. Un ruolo chiave fu attribuito alla presenza
di un meccanismo di azione ben definito che richiede l’attivazione del
recettore Aryl-hydrocarbon (AhR). Studi sperimentali negli animali ed in
vitro indicano che i livelli cellulari di AhR diminuiscono in seguito al legame
recettoriale della TCDD. Approssimativamente 20 anni dopo l’incidente
di Seveso, abbiamo osservato livelli diminuiti di trascrizione di
AhR nei soggetti esposti che erano correlate ai livelli di TCDD plasmatica.
Questi risultati suggeriscono la presenza di un fenomeno di down-regulation
di AhR, comparabile a quello osservabile in molti altri sistemi
recettoriali. Questi risultati dimostrano per la prima volta che i meccanismi
di regolazione indotti da TCDD nel sistema AhR osservati precedentemente
in studi sperimentali si verificano in maniera simile anche nei
soggetti esposti. I nostri dati sono fondamentali per estrapolare all’uomo
gli effetti conseguenti alla attivazione del sistema AhR osservati in modelli
sperimentali.
Parole chiave: 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-diossina (TCDD), recettore
Aryl-hydrocarbon, esposizione ambientale.
ABSTRACT. MOLECULAR AND GENETIC METHODS FOR STUDYING
THE EFFECTS OF OCCUPATIONAL AND ENVIRONMENTAL AGENTS: THE SE-
VESO MOLECULAR EPIDEMIOLOGY PROJECT. In 1997, IARC classified
2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) as carcinogenic to humans,
based on sufficient evidence from animal data and limited evidence from
human data. A key role in the IARC classification was played by the welldefined
mechanism of TCDD action involving the activation of the Arylhydrocarbon
Receptor (AhR). Experimental animal and in-vitro studies
indicate that AhR levels decrease following TCDD binding. Nearly 20
years after the Seveso accident, we found a decrease in AhR mRNA levels
in TCDD-exposed subjects. AhR transcript levels were correlated
with plasma TCDD concentrations. Our results may reflect a down-regulation
of AhR, similar to that observed in most receptorial systems. We
demonstrated, for the first time in humans, that TCDD-related regulation
of the AhR pathway, previously observed in experimental studies, may also
occur in exposed subjects. Our data are important for extrapolating
AhR-mediated effects from experimental models to humans.
Key words: 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), Aryl-hydrocarbon
Receptor, environmental exposure.
Introduzione
Nel 1997 la IARC ha classificato la 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-diossina
(TCDD) come un cancerogeno di classe 1
(cancerogeno per l’uomo) sulla base di sufficienti evidenze da
esperimenti animali e limitate evidenze da studi epidemiologici.
Un ruolo chiave fu attribuito dalla commissione alla presenza
di un meccanismo di azione ben definito che richiede
l’attivazione del recettore Aryl-hydrocarbon (AhR) per mediare
gli effetti tossici della TCDD. I componenti molecolari del
sistema AhR sono simili negli animali e nell’uomo. AhR è un
recettore nucleare che, in presenza di TCDD, forma un eterodimero
attivo con il cofattore ARNR ed induce la trascrizione
di enzimi, quali il citocromo P4501A1 (CYP1A1) e P4501B1
(CYP1B1) coinvolti nel metabolismo di xenobiotici. La
espressione prolungata di questi enzimi può provocare un aumento
di lesioni del DNA a causa della generazione di metaboliti
genotossici e di radicali reattivi dell’ossigeno. Gli effetti
sul sistema AhR della esposizione a diossine non è mai stata
studiata nell’uomo in vivo. Abbiamo disegnato e condotto uno
studio molecolare per indagare lo stato di attivazione del sistema
AhR su un campione di soggetti rappresentativo della popolazione
esposta a TCDD in seguito all’incidente di Seveso e
di una popolazione di controllo non esposta. Abbiamo campionato
casualmente 62 soggetti della popolazione delle zone altamente
contaminate (A+B) e 59 dalla zona circostante non
contaminata (non-ABR) (1). Nei soggetti di zona A e B, i livelli
di TCDD plasmatici erano ancora elevati con concentrazioni
che arrivavano fino a 90 ppt (2).
Materiali e metodi
I soggetti dello studio sono stati reclutati tra il dicembre 1992
ed il marzo 1994. I livelli di mRNA dei geni AhR, ARNT,
CYP1A1 e CYP1B1 e della attività EROD CYP1A1-dipendente
sono stati misurati in linfociti periferici (3, 4). Alcuni dei marcatori
del sistema AhR, come l’espressione di CYP1A1 e l’attività
EROD, sono presenti solo a livelli estremamente bassi in linfociti
non coltivati. Abbiamo quindi utilizzato, in aggiunta a linfociti
non coltivati, linfociti coltivati con mitogeno o con mitogeno +
10 nM TCDD. I livelli di mRNA di AhR, ARNT, CYP1A1, and
CYP1B1 sono stati misurati tramite quantitative competitive reverse
transcription PCR (RT-PCR).
Risultati
Livelli dei markers del sistema AhR nelle differenti condizioni
cellulari: Nelle cellule non coltivate, abbiamo analizzato
soltanto AhR, ARNT e CYP1B1. I livelli medi di mRNA erano
1.19 x 10 6 copie per AhR, 0.47 x 10 6 copie per ARNT e 0.11 x 10 6
copie per CYP1B1. L’espressione di ARNT non è stata misurata
in cellule coltivate perché la quantità di cellule disponibili era limitata.
Tutti gli altri markers, che includevano AhR, CYP1A1,
CYP1B1 e EROD, sono stati potentemente indotti quando le cellule
sono state coltivate con mitogeno o con mitogeno + TCDD.
TCDD plasmatica e il sistema AhR: Nei soggetti con più
alta esposizione a TCDD, i livelli di mRNA di AhR (in tutte le
condizioni cellulari utilizzate) e di ARNT tendevano ad essere
più bassi. Abbiamo utilizzato tecniche di analisi statistica multivariata
per correggere i risultati per la presenza di fattori indivi-

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Figura 1. Associazione tra livelli
di TCDD plasmatica e markers
del sistema AhR in cellule non
coltivate (riquadri in nero) ed in
cellule coltivate con mitogeno e
TCDD (10 nM, riquadri in bianco),
in un gruppo di soggetti
campionati casualmente dalla
popolazione delle zone ad alta
contaminazione (A+B) e della
zona circostante non contaminata
(non-ABR) di Seveso. La
correlazione tra i markers è
espressa utilizzando la statistica
t ed i valori di p del test di Wald
ottenuti da modelli di regressione
multipla aggiustati per età,
sesso, espressione di actina e
data dell’esperimento (cellule
non coltivate) o espressione di
actina, vitalità cellulare postcultura,
gruppo sperimentale,
data dell’esperimento e crescita
cellulare. Figura adattata da
Baccarelli et al. (4)
duali o di laboratorio potenzialmente in grado di alterare i risultati
(Figura 1) (3). L’associazione negativa tra TCDD plasmatica
ed AhR era statisticamente significativa in linfociti non coltivati
(t = -2.28, p = 0.03). La TCDD plasmatica non era significativamente
associata ai livelli di ARNT, CYP1A1 e CYP1B1. I
livelli di TCDD erano negativamente associati alla attività
EROD (t = -2.61, p = 0.01).
Associazione tra i markers all’interno del sistema AhR: In
cellule non coltivate, abbiamo osservato una forte correlazione
statistica tra l’espressione di AhR e ARNT (t=4.20; p

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
24 www.gimle.fsm.it
A. Basile 1 , A. Simonelli 2 , R. Moccaldi 3 , G. Spagnoli 4 , A. Acampora 2 , N. Sannolo 1
Studio preliminare mediante spettrometria di massa per la misura della
dose biologicamente efficace nell’esposizione professionale ad acrilammide
1 Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione di Medicina del Lavoro, Tossicologia ed Igiene Industriale, Seconda Università degli Studi di Napoli
2 Dipartimento di Medicina Pubblica e della Sicurezza Sociale, Università degli Studi di Napoli, “Federico II”
3 Servizio Medico Competente del CNR, Roma
4 Dipartimento di Igiene del Lavoro, Centro Ricerche ISPESL, Monte Porzio Catone, Roma
RIASSUNTO. L’Acrilammide (AA) è una molecola reattiva molto
utilizzata nell’industria chimica; è un agente neurotossico, è mutagena ed
è classificata dalla IARC come probabile cancerogeno per l’uomo. Il metabolismo
ossidativo della AA porta alla formazione del metabolita epossidico
glicidamide (GA) che è responsabile degli effetti mutageni e carcinogeni.
Sia l’AA che la GA formano addotti con macromolecole biologiche.
In questo lavoro sono stati caratterizzati gli addotti emoglobinici
dell’AA formati in vitro, con lo scopo di sviluppare un metodo analitico
sensibile per la rivelazione e la quantificazione degli addotti peptidici dell’AA,
basato su metodiche analitiche di spettrometria di massa tandem
accoppiata alla cromatografia liquida. È stata preliminarmente effettuata
la caratterizzazione degli addotti sia sulla globina intera, utilizzando uno
spettrometro di massa Q-Tof, sia sulla miscela triptica, evidenziando la
forte alchilazione del residuo di cisteina 93 della β-globina.
Parole chiave: acrilammide, glicidamide, addotti all’emoglobina.
ABSTRACT. PRELIMINARY STUDY USING MASS SPECTROMETRY FOR
MEASURING DOSES WHICH ARE BIOLOGICALLY EFFECTIVE IN TREATING
OCCUPATIONAL EXPOSURE TO ACRYLAMIDE. Acrylamide (AA) is a reactive
molecule extensively used in the chemicals industry; it is a neurotoxic
agent, causes germ cell mutagenicity and it is classified by the IARC as
a probable cancerogen for humans. Oxidative metabolism of AA leads to
its epoxide metabolite, glycidamide (GA) which is responsible for mutagenic
and carcinogenic effects. Both AA and GA form adducts with biological
macromolecules. This paper describes the characterization of the
hemoglobin adduct of AA formed in vitro with the purpose of developing
a sensitive method for the detection and quantification of peptide adducts
of AA based on tandem mass spectrometry coupled with LC. A preliminary
characterization of adduct was performed both on whole globin
chains by ESI-Q-T of mass spectrometer and on a tryptic mixture of peptides,
explaining the strong alkylation of cystein 93 residue of β-globin.
Key words: acrylamide, glycidamide, hemoglobin adducts.
Introduzione
L’Acrilammide (2-propenammide, AA) è un monomero utilizzato
principalmente come prodotto intermedio nell’industria
chimica per la produzione di poliacrilammide. L’AA viene anche
usata per la preparazione in loco di gel di poliacrilammide per la
separazione elettroforetica di macromolecole biologiche e come
agente di consolidamento del suolo. La poliacrilammide è utilizzata
principalmente nel trattamento delle acque reflue, nella lavorazione
della carta e dei minerali, come additivo cosmetico e
come ammendante (1). Ulteriore fonte di esposizione è la dieta in
quanto l’AA si forma durante la cottura di alcuni cibi, come risultato
della reazione di Maillard tra amminoacidi e zuccheri riducenti
(2).
L’esposizione professionale o sperimentale all’AA determina
una neuropatia caratterizzata da atassia, perdita di peso e danno
neuronale. L’AA è stata anche indicata come potenziale agente
mutageno e tossico per la riproduzione. L’AA è metabolizzata al
corrispondente epossido glicidamide (2,3-epossipropinammide,
GA) che è stata dimostrata essere mutagena e cancerogena. L’AA
è classificata dalla IARC come probabile cancerogeno per l’uomo
(gruppo 2A).
Poiché l’AA può provenire sia da fonti esterne che dalla dieta,
risulta necessario caratterizzare adeguatamente l’esposizione
ai fini di una corretta stima del rischio per la salute. Allo scopo di
individuare un biomarcatore basato su una matrice facilmente ottenibile
e rappresentativa dell’effettiva esposizione, la nostra attenzione
si è rivolta agli addotti emoglobinici. La strategia analitica
consiste in un’indagine preliminare su tutti i siti alchilati lungo
la sequenza delle globine, seguita dalla individuazione della
porzione maggiormente alchilata identificabile in un peptide facilmente
ottenibile che possa essere adottato quale biomarcatore
da quantificare nel monitoraggio biologico.
Materiali e metodi
Sono stati utilizzati reagenti di elevato grado di purezza: AA,
>99%, Biorad; tripsina Sigma-Aldrich. Campioni di sangue di soggetti
sani non fumatori e non esposti professionalmente ad AA sono
stati utilizzati per esperimenti di incubazione in vitro. L’analisi è stata
condotta in cromatografia liquida ad alta risoluzione avvalendosi
di HPLC della Kontron Instruments e della Agilent, usati tal quali o
in modalità on line con gli spettrometri di massa. Lo spettrometro di
massa utilizzato per l’analisi delle globine alchilate è un ibrido singolo
quadrupolo-tempo di volo Q-Tof (Waters); quello utilizzato per
l’analisi del digerito triptico delle globine è un electrospray dotato di
analizzatore a trappola ionica LCQdeca (Thermo).
L’incubazione emoglobina-acrilammide è stata condotta aggiungendo
una soluzione acquosa di AA al lisato eritrocitario in
modo da avere rapporti molari di incubazione Hb:AA di 1:1, 1:10
ed 1:100. Le catene globiniche sono state frazionate mediante
RP-HPLC ed analizzate con spettrometria di massa normale e
tandem. Le globine sono anche state sottoposte ad idrolisi triptica
e la risultante miscela peptidica è stata analizzata mediante
LC/ES/MS per individuare i peptidi alchilati. Analisi
LC/ES/MS/MS sono state condotte sui peptidi modificati al fine
di identificare il sito amminoacidico alchilato.
Risultati
Le analisi MS di globine incubate con AA hanno permesso di
stabilire che in seguito ad interazione Hb-AA si formano addotti
covalenti e stabili e che la β-globina é la catena più alchilata. L’analisi
mediante ES/MS/MS sulla globina intera e sull’idrolizzato
triptico individuano nel peptide 83-95 della β-globina la porzione
maggiormente alchilata. La cisteina 93 è risultata essere il sito
di alchilazione. Il peptide N-terminale della β-globina risulta
meno alchilato (su Val 1) rispetto al peptide a cisteina.
Discussione e Conclusioni
I metodi analitici finora disponibili per la determinazione degli
addotti emoglobinici con l’acrilammide sono riconducibili a
due categorie: la degradazione di Edman modificata per l’N-al-

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
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chile e l’idrolisi proteica acida (3, 4). Mediante degradazione di
Edman viene selettivamente estratta e quantificata l’estremità Nterminale
della proteina alchilata sotto forma di derivato pentafluorofeniltioidantoinico
rilevabile mediante GC/MS. Attraverso
l’idrolisi totale, invece, si determinano gli amminoacidi alchilati,
senza che si abbia alcuna informazione circa la loro posizione in
sequenza. La degradazione di Edman modificata per l’N-alchile,
pur presentando il vantaggio di determinare selettivamente l’amminoacido
N-terminale modificato, non considera la possibile
presenza, all’interno della sequenza globinica, di residui eventualmente
più alchilati rispetto alla valina N-terminale. Qualora
l’amminoacido N-terminale non fosse il residuo maggiormente
reattivo, alchilato anche a bassi livelli di esposizione, il monitoraggio
basato sul dosaggio del solo residuo amminoacidico Nterminale
potrebbe non rivelare o sottostimare la quantità di addotto
realmente presente e quindi non consentire l’accurata valutazione
dell’esposizione ad AA. Questa considerazione, unitamente
alla scarsa informazione derivante dalla determinazione
degli amminoacidi modificati rilasciati in seguito ad idrolisi totale
(metodo che non permette di distinguere gli addotti che si originano
per addizione dell’AA con quelli formati per addizione di
acrilonitrile), hanno spinto il nostro gruppo di ricerca allo sviluppo
di una metodica innovativa per una più corretta determinazione
degli addotti emoglobinici originatesi per esposizione ad AA.
Questo metodo, basato sulla preliminare indagine strutturale re-
RIASSUNTO. Il presente studio mira alla valutazione dell’influenza
dei polimorfismi genetici del citocromo P450 (CYP1A1), glutatione Stransferasi
µ (GSTM1) e θ (GSTT1) sui livelli dell’1-idrossipirene urinario
(1-IP) in lavoratori esposti ad idrocarburi policiclici aromatici (IPA).
Sono stati indagati 355 lavoratori di 3 batterie della cokeria di uno dei più
grandi stabilimenti siderurgici d’Europa, inclusi gli addetti alla manutenzione
ed alle pulizie industriali. Il valore mediano di 1-IP era pari a 1.05
µMol/Mol creat. . È stata osservata una differenza significativa tra i 5 gruppi
di lavoratori in studio, con i valori più alti nel gruppo dei manutentori
(mediana 1,71, range 0,06-14,69 µMol/Mol creat ). Il 25% dei lavoratori in
studio ha riportato valori di 1-IP eccedenti il valore limite proposto di 2.3
µMol/Mol creat. . Non è stata osservata differenza in relazione all’abitudine
al fumo. I lavoratori con genotipo GSTT1 null hanno mostrato livelli di
1-IP più alti rispetto al wild type (p=0,06). Sono necessari ulteriori studi
per chiarire meglio il ruolo di GSTT1 sui livelli di 1-IP.
Parole chiave: esposizione, IPA, cokeria, indicatori biologici, polimorfismi
genetici.
ABSTRACT. ASSESSMENT OF PAH EXPOSURE IN COKE-OVEN
WORKERS AND EVALUATION OF THE INFLUENCE OF METABOLIC POLY-
MORPHISMS ON EXPOSURE BIOMARKER. This study aims to investigate the
influence of genetic polymorphism of the cytochrome P450 1A1
(CYP1A1), glutathione S-transferases µ (GSTM1) and θ (GSTT1) on the
urinary levels of 1-hydroxypyrene (1-HOP) in workers exposed to
polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). 355 coke-oven workers exposed
to PAHs were selected from the 3 batteries of the coke-oven plant of
one of the largest European steel plants. Maintenance workers and indu-
lativa all’interazione AA-Hb, individua nel peptide maggiormente
alchilato il biomarcatore da quantificare nel monitoraggio biologico
dei soggetti esposti ad AA. In particolare, il peptide alchilato
individuato quale biomarcatore dell’esposizione ad AA è il
peptide 83-95 della β-globina.
Ringraziamenti
Lo studio in corso è parte di un progetto di ricerca codice
B71/DIL/03, finanziato dall’ISPESL dal titolo: “Valutazione del rischio
da esposizione professionale ad AA monomero attraverso la determinazione
della dose biologicamente efficace”.
Bibliografia
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Review. J. Agric. Food Chem 2003; 51: 4504-4526.
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L. Bisceglia 1 , G. de Nichilo 1 , M.E. Grassi 1 , T. Giannini 1 , P. Chiumarulo 1 , G. Elia 2 , N. Schiavulli 1 , G. Assennato 1
Valutazione dell’esposizione professionale ad IPA in lavoratori
di cokeria e dell’influenza di polimorfismi metabolici sui livelli
dell’indicatore di esposizione
1 Dipartimento di Medicina Interna e Medicina Pubblica - Università degli Studi di Bari, Bari
2 Fondazione “S. Maugeri”, Cassano Murge (Bari)
strial cleaners were included. The median value of urinary 1-HOP was
1.05 µMol/Mol creat . The difference between the groups was statistically
significant, with the highest value observed in the maintenance group
(median 1.71, range 0.06-14.69 µMol/Mol creat ). It is remarkable that 25%
of the workers exceeded the proposed benchmark guideline value of 2.3
µMol/Mol creat . No statistical difference was found in relation to smoking
habits. Workers with GSTT1 null genotype had higher 1-HOP levels than
those with wild type (p=0.06). Further observations are needed to clarify
the role of GSTT1 with regard to the 1-HOP levels.
Key words: exposure assessment, PAHs, coke-oven workers, biomarkers,
genetic polymorphisms.
Introduzione
Il presente studio è finalizzato alla valutazione dell’esposizione
professionale ad idrocarburi policiclici aromatici (IPA)
in lavoratori di cokeria mediante un programma di monitoraggio
biologico che prevede la misurazione dei livelli urinari
dell’1-idrossipirene (1-IP) quale indicatore di dose interna, verificando
l’affidabilità di tale biomarcatore nel discriminare
differenti situazioni operative comportanti diverse condizioni
di esposizione (1). Si è proceduto inoltre alla valutazione dell’eventuale
influenza di selezionati polimorfismi metabolici
del citocromo P450 1A1, e della glutatione S-transferasi µ
(GSTM1) e θ (GSTT1) sui livelli del biomarcatore, in quanto

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
26 www.gimle.fsm.it
la variabilità inter-individuale nella suscettibilità alle sostanze
cancerogene sembra dipendere in larga misura da fattori che
intervengono nella sequenza di metabolizzazione di tali composti
(2, 8, 9, 10).
Materiali e metodi
Sono stati arruolati 355 lavoratori professionalmente esposti
ad IPA in quanto operanti nella cokeria di uno dei più grandi stabilimenti
siderurgici europei. La cokeria consiste di 3 batterie,
denominate A, B e C, costruite in differenti epoche: la batteria A
è stata costruita negli anni 1964-1970 e fino alla sua chiusura -
avvenuta nell’agosto 2002 e disposta a seguito di indagini giudiziarie
- non è mai stata oggetto di interventi di manutenzione; la
batteria B è stata costruita negli anni ’80 e la batteria C alla fine
degli anni ’90. Era atteso che tale situazione corrispondesse ad un
miglioramento delle tecnologie che risultasse in un abbattimento
dei livelli ambientali di IPA e che questo si riflettesse nell’andamento
dei livelli medi di idrossipirene urinario. Sono stati inclusi
nello studio anche i lavoratori addetti alla manutenzione degli
impianti e alla pulizia industriale.
Al fine di controllare il ruolo di eventuali fattori confondenti,
ai lavoratori è stato somministrato da personale medico addestrato
un questionario standardizzato per la raccolta di informazioni
circa l’abitudine al fumo e il consumo di cibi cotti alla brace.
I campioni biologici sono stati raccolti alla fine del turno lavorativo.
La determinazione dell’idrossipirene urinario è stata
eseguita mediante il metodo HPLC/Fluorescenza descritto da
Jongeneelen.e coll. (3). I polimorfismi metabolici sono stati valutati
su linfociti di sangue periferico con tecnica PCR e successiva
ibridazione con oligopeptidi normali e mutati secondo i metodi
descritti da Hayashi e colleghi (4) per CYP1A1, da Brockmoller
e colleghi (5) per GSTM1 e GSTT1. L’analisi statistica
univariata e multivariata è stata condotta dopo log-trasformazione
dei valori di 1-IP, utilizzando il software STATA vs 8 (Stata-
Corporation).
Risultati
Il valore mediano di 1-IP è risultato pari a 1.05 µMol/Molcreat
. È stata osservata una differenza statisticamente significativa
tra i 5 gruppi di lavoratori in
studio, con i valori più alti riscontrati
nel gruppo dei manutentori
(mediana 1,71, range
0,06-14,69 µMol/Molcreat ), seguito
dai lavoratori della batteria
C (mediana 1.12, range
0.13-9.27 µMol/Molcreat ), batteria
A (mediana 1,10, range
0,13-31,04 µMol/Molcreat ),
batteria B (media,a 0,91, range
0,09-14,25 µMol/Molcreat ), e
quindi dal gruppo dei pulitori
(mediana 0,71, range 0,08-3,36
µMol/Molcreat ) (Fig.1). Applicando
i valori di riferimento
indicati da Jongeneelen (6, 7) è
notevole che il 25% dei lavoratori
superasse il terzo livello
proposto pari a 2,3 µMol/Mol-
Figura 1. Valori di 1-IP per
reparto di appartenenza
creat , corrispondente al TLV USA di 0,2 mg/m3 di BSM e stimato
corrispondere ad un rischio relativo di tumore polmonare di
1,3: in particolare tale limite era superato dal 35% dei manutentori,
dal 29% dei lavoratori della batteria A, dal 23% dei lavoratori
delle batterie B e C e dal 16% dei pulitori. Globalmente, il
41% dei lavoratori superava il secondo livello di Jongeneelen di
1,4 µMol/Mol creat , corrispondente al livello di non effetto genotossico.
Per quanto riguarda le mansioni, i manutentori hanno
mostrato i livelli di 1-IP più elevati (mediana 4,42, range 3,25-
5,58 µMol/Mol creat ), seguiti dagli operatori macchina della batteria
C (mediana 4,31, range 1,29-5,27 µMol/Mol creat ), e dagli
addetti a coperchi della batteria A (mediana 3,28, range 0,14-
7,06 µMol/Mol creat ). Non è stata riscontrata differenza statisticamente
significativa in relazione all’abitudine al fumo. Non sembrano
esercitare influenza sui livelli dell’indicatore di dose i polimorfismi
metabolici CYP1A1 e GSTM1. Èstato osservato che
i lavoratori con genotipo GSTT1 deleto mostravano livelli più
elevati di 1-IP dei soggetti con genotipo normale e che tale differenza
si poneva ai limiti della significatività statistica
(p=0,06). Il modello di regressione lineare multipla ha mostrato
che le concentrazioni di 1-IP erano associate con il polimorfismo
GSTT1, anche dopo aggiustamento per fumo, reparto di appartenenza
e mansione.
Conclusioni
Il programma di monitoraggio biologico appare uno strumento
efficace per l’implementazione di procedure di “exposure
assessment”, sulle quali fondare successive strategie di intervento
e prevenzione. L’indicatore di dose interna utilizzato, l’idrossipirene
urinario, sembra in grado di discriminare nelle condizioni
operative osservate differenti livelli di esposizione. I polimorfismi
metabolici indagati non sembrano di per sé in grado di spiegare
significativamente la variabilità interindividuale osservata:
ulteriori valutazioni sembrano necessarie per chiarire il ruolo del
GSTT1. Sono in corso ulteriori indagini che prevedono, accanto
al monitoraggio biologico, l’implementazione di un programma
di monitoraggio ambientale effettuato mediante campionatori
personali e determinazione dell’esposizione cutanea con pads, in
modo da definire una strategia integrata di valutazione dell’esposizione
professionale ad IPA.

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 27
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mutation in the glutathione S-transferase class Mu gene detected
by polymerase chain reaction. Biochem Pharmacol 1992; 43: 647-650.
RIASSUNTO. Approssimativamente 20 anni dopo l’incidente di
Seveso abbiamo condotto uno studio caso controllo su 101 soggetti che
hanno sviluppato cloracne in seguito all’esposizione a 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-diossina
(TCDD) e 211 controlli, per definire la relazione di
dose-risposta ed identificare fattori di suscettibilità agli effetti della diossina.
I soggetti con elevati livelli plasmatici correnti di diossina (>10 pg/g
lipidi) avevano un rischio circa 4 volte più elevato di cloracne. Il rischio
di cloracne era maggiore nei soggetti con elevata TCDD plasmatica e età
più giovane all’incidente (≤8 anni) o con colore chiaro dei capelli. Lo stato
di salute dei soggetti cloracneici a venti anni dall’incidente non era differente
da quello dei controlli.
Parole chiave: cloracne, diossina, suscettibilità, incidente di Seveso.
ABSTRACT. SUSCEPTIBILITY TO DIOXIN AMONG INDIVIDUALS
FROM SEVESO SUFFERING FROM CLORACNE. Approximately 20 years after
the Seveso accident, we designed a case-control study on 101 subjects
who developed chloracne after exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-pdioxin
and 211 controls from the same area, to establish the dose-exposure
relation and to identify dioxin susceptibility factors. Subjects with
elevated plasma TCDD levels (>10 pg/g fat) showed an almost 4 times
higher risk of developing chloracne. Chloracne risk was higher in
subjects with high TCDD plasma levels, young people (≤8 years) and/or
those with fair hair. The health status of chloracne cases twenty years after
the accident was not different from that of control subjects.
Key words: chloracne, dioxin, susceptibility, Seveso accident.
Introduzione
Tra il settembre 1976 ed il febbraio 1978, 193 soggetti esposti
in seguito all’incidente di Seveso a 2,3,7,8-tetraclorodibenzop-diossina
(TCDD) hanno presentato segni e sintomi di cloracne
(1, 2), la patologia cutanea tipicamente associata ad esposizione
occupazionale a idrocarburi alogenati (3). Di questi 193 soggetti,
170 (88%) avevano meno di 15 anni di età al momento della diagnosi.
La patologia è stata diagnosticata in meno dello 0.1% dei
6) Jongeneelen FJ. Biological exposure limit for occupational exposure
to coal tar pitch volatiles at cokeovens. Int Arch Occup Environ
Health 1992; 63(8): 511-6.
7) Jongeneelen FJ. Benchmark guideline for urinary 1-hydroxypyrene
as biomarker of occupational exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons.
Ann Occup Hyg. 2001; 45(1): 3-13.
8) Brescia G, Celotti L, Clonfero E et al. The influence of Cytochrome
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biomarker levels in coke-oven workers. Arch Toxicol 1999; 73 (8-
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9) Apostoli P, Neri G, Lucas D, Manno M, Berthou F. Influence of genetic
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10) Alexandrie AK, Warholm M, Carstensen U, Axmon A, Hagmar L,
Levin JO, Ostman C, Rannug A. CYP1A1 and GSTM1 polymorphisms
affect urinary 1-hydroxypyrene levels after PAH exposure. Carcinogenesis
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M. Bonzini 1 , A. Baccarelli 1,2 , A. Pesatori 1 , D. Consonni 3 , D. Patterson Jr. 4 , M. Rubagotti 1 , N.E. Caporaso 2 , P.A. Bertazzi 1 ,
M.T. Landi 2
Suscettibilità a diossina in soggetti cloracneici della popolazione di Seveso
1 Dipartimento di Medicina del Lavoro “Clinica L. Devoto”, Università degli Studi di Milano, Milano
2 Genetic Epidemiology Branch, Division of Cancer Epidemiology and Genetics, National Cancer Institute, NIH, DHHS, Bethesda, MD, USA
3 Unità Operativa di Epidemiologia, Azienda Ospedaliera Istituti Clinici di Perfezionamento, Milano
4 Division of Environmental Health Laboratory Science, National Center for Environmental Health, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta,
GA, USA
soggetti della coorte di Seveso, che include individui con differenti
livelli di esposizione. Fattori di suscettibilità individuale
possono aver contribuito a determinare quali dei soggetti esposti
hanno sviluppato cloracne. Approssimativamente 20 anni dopo
l’esposizione, abbiamo disegnato uno studio caso-controllo per
valutare i livelli di esposizione, alla luce di dati epidemiologici e
clinici, al fine di identificare fattori di suscettibilità a diossina e
definire la relazione tra TCDD e cloracne.
Materiali e metodi
Nel periodo 1993-1998, abbiamo reclutato 101 casi di cloracne
(56 maschi, 45 femmine) e 211 controlli (108 maschi, 103
femmine) provenienti dalla stessa area. Le diagnosi di cloracne
erano state formulate sulla base di criteri standard (4). Intervistatori
specificamente addestrati per lo studio hanno somministrato
a tutti i soggetti un questionario strutturato ed hanno determinato
le loro caratteristiche pigmentarie. I livelli di TCDD nel plasma
sono stati misurati utilizzando gas-cromatografia ad alta risoluzione/spettrometria
di massa ad alta risoluzione (5). I campioni di
3 casi e 16 controlli non erano adeguati e sono stati esclusi dalle
analisi basate sulle misurazioni plasmatiche. I livelli di TCDD
plasmatica sono stati categorizzati in due gruppi: ≤10 pg/g lipidi
(equivalente a parti per trilione, aggiustati per lipidi) o >10 pg/g
lipidi. Il cut-off di 10 pg/g lipidi è usato comunemente per separare
i livelli elevati da quelli di background.
Risultati
Caratteristiche dei soggetti e stato di salute
I soggetti cloracneici avevano tra 6 mesi e 46 anni di età al
momento dell’incidente (mediana: 8 anni). Lo stato di salute dei

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
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cloracneici non era differente da quello dei
controlli. Allo stesso modo, i figli dei soggetti
con cloracne non presentavano una
frequenza di condizioni patologiche superiore
a quella dei figli dei controlli.
Distribuzione dei livelli di TCDD plasmatica
I livelli di TCDD plasmatica variavano
da background a 475.0 pg/g lipidi ed erano
superiori a 10 pg/g lipidi in 78 (26.6%) dei
293 soggetti con campioni di plasma adeguati
per la misurazione. La frequenza di
malattie e di interventi chirurgici non erano
associate ad elevati livelli di TCDD plasmatica.
La residenza in prossimità al luogo
dell’incidente era un fattore determinante
di elevati livelli di TCDD (Tabella I).
Quando confrontati con i soggetti dell’area
non-contaminata, i residenti in zona A alla
data dell’incidente presentavano una probabilità
66 volte più alta di avere valori di
TCDD plasmatici >10 pg/g lipidi
(OR=65.9, 95% CI: 16.6-262.1). I soggetti
di zona B e R avevano OR per TCDD >10
pg/g lipidi rispettivamente di 25.8 (95%
CI: 7.0, 95.0) e 3.2 (95% CI: 0.5-18.4). I
soggetti di età superiore a 8 anni all’incidente
avevano una probabilità di elevata
TCDD plasmatica di circa 3 volte più alta
(OR=2.7, 95% CI: 1.4-5.2) rispetto ai soggetti
più giovani. In aggiunta, la frequenza
di elevati livelli di TCDD plasmatica era
maggiore nelle donne e nei soggetti con
elevato Body Mass Index (BMI).
Cloracne e livelli plasmatici di TCDD
La presenza di cloracne era di circa 4
volte più frequente nei soggetti con TCDD
plasmatica >10 pg/g lipidi (OR=3.7, 95%
CI: 1.6-8.8, aggiustato per zona di residenza
ed età all’incidente, e per sesso) (Tabella
II). Ventuno casi di cloracne e 12 controlli
avevano TCDD plasmatica >50 pg/g
lipidi con OR=20.4 (95% CI: 5.1-81.0) per
cloracne in confronto ai soggetti con
TCDD ≤10 pg/g lipidi. Il rischio di cloracne
era più alto nei soggetti più giovani (Tabella
II). I soggetti con TCDD elevata ed
età di 8 anni o più giovane avevano OR=7.4 (95% CI: 1.8-30.3)
per cloracne. Il rischio era significativamente più basso nei soggetti
con età superiore ad 8 anni (OR=1.3, 95% CI: 0.6-3.1;
p=0.02 per l’interazione tra età e TCDD plasmatica). Il rischio di
cloracne non era significativamente associato al colore degli occhi,
dei capelli, della cute o alla sensibilità all’esposizione solare.
Tuttavia, in presenza di livelli di TCDD plasmatica >10 pg/g lipidi
i soggetti con colore chiaro dei capelli avevano un rischio
più elevato di cloracne (OR=9.2, 95% CI: 2.6-32.5) rispetto ai
soggetti con colore scuro (OR=2.1, 95% CI: 0.7-6.1, p=0.04 per
l’interazione tra TCDD plasmatica e colore dei capelli).
Conclusioni
La relazione tra cloracne ed esposizione a TCDD è ancora
oggetto di intensa discussione. Alcuni ricercatori hanno suggeri-
Tabella I. Determinanti di livelli elevati (>10 pg/g lipidi) di 2,3,7,8tetraclorodibenzo-p-diossina
(TCDD) misurati in casi di cloracne e in controlli
non cloracneici della popolazione di Seveso negli anni 1993-1998
Tabella II. Odds Ratio per cloracne in soggetti con livelli elevati
(>10 pg/g lipidi) di 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-diossina (TCDD) plasmatica
misurata al momento dello studio*
to in passato che la cloracne sia un effetto sentinella che compare
prima di altri effetti sistemici. Altri hanno proposto che la cloracne
sia associata ad esposizioni molto intense, ben al di sopra
dei livelli necessari per indurre altri effetti sistemici (3). Nel nostro
studio, la frequenza e la distribuzione di condizioni patologiche
era simile nei casi di cloracne e nei controlli. Molti soggetti
cloracneici avevano livelli plasmatici di TCDD simili a quelli
dei controlli, indicando che la soglia per la presentazione della
cloracne può essere differente nei soggetti esposti e dipendere da
fattori di suscettibilità individuale. Abbiamo identificato un rischio
maggiore di cloracne nei soggetti di età inferiore ad 8 anni
ed in quelli con colore chiaro dei capelli.
In conclusione, i livelli correnti di TCDD plasmatica erano
correlati alla presentazione di cloracne. Questa associazione può
essere modificata dall’età e da caratteristiche di pigmentazione.
La tossicità della diossina appare confinata in questi soggetti agli
effetti acuti dermatotossici.

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 29
Bibliografia
1) Pesatori AC, Consonni D, Bachetti S, et al. Short- and long-term
morbidity and mortality in the population exposed to dioxin after the
“Seveso accident”. Ind. Health 2003; 41: 127-138.
2) Bertazzi PA, Consonni D, Bachetti S, et al. Health effects of dioxin
exposure: a 20-year mortality study. Am.J Epidemiol. 2001; 153:
1031-1044.
I. Borrelli 1,2 , M. Triggiani 3 , N. Sannolo 3 , G. Marone 2
RIASSUNTO. Obiettivo: Valutare gli effetti dell’idrochinone sui
basofili umani. METODI: i basofili sono stati separati e purificati e successivamente
incubati per tempi variabili e con concentrazioni crescenti
di idrochinone (HQ). Le cellule sono state quindi stimolate con diversi
agonisti. La secrezione di istamina è stata determinata attraverso una tecnica
fluorimetrica. RISULTATI: Nessun effetto è stato osservato esponendo
i basofili ad HQ; in presenza di Anti-IgE con una concentrazione
di 10 -4 M di HQ è presente una inibizione della secrezione di istamina
(circa 25%); utilizzando invece come stimolo l’A23187 l’effetto inibente
si osserva alla concentrazione di 3x10 -5 M; nei basofili stimolati con
FMLP non sono stati osservati effetti. Non si sono avute differenze sul
livello di inibizione del rilascio di istamina dei basofili stimolati con Anti-IgE
esponendo le cellule a tempi variabili. Conclusioni: l’idrochinone
interferisce con i meccanismi metabolici e biochimici dei basofili. Il tipo
di interferenza osservato non è collegato al tempo di esposizione. La
riduzione della secrezione di istamina può quindi, con l’esposizione cronica,
interferire con i meccanismi di infiammazione cronica delle vie aeree
negli esposti a benzene.
Parole chiave: idrochinone, basofili, immunotossicologia, istamina.
ABSTRACT. TOXICOLOGICAL STUDIES ON THE EFFECTS OF HIDRO-
QUINONE AND BENZOQUINONE ON HUMAN BASOPHYLS. The aim of the
study was to evaluate the effects of the Hydroquinone (HQ) on human basophils.
Methods: the basophils were separated and purified and subsequently
incubated for varying times with increasing concentrations of HQ.
The cells were therefore stimulated with different agonists. Histamine secretion
was determined using the fluorimetric technique. Results: no effect
was observed by exposing the basophils to HQ; by using Anti-IgE with a
concentration of 10 -4 M of HQ an inhibition of the histamine secretion is
present; by using A23187 with a concentration of 3x10 -5 M an inhibition
effect was observed; with FMLP no effects were observed. No difference
was observed by exposing cells to different times of incubation with HQ.
Conclusions: the HQ interferes with the metabolic mechanisms and biochemists
of the basophils. The type of interference observed is not connected
to the period of exposure. The reduction of histamine secretion
with chronic exposure is capable of interfering in chronic inflammation
mechanisms of the upper respiratory tract in subjects exposed to benzene.
Key words: hydroquinone, basophils, immunotoxicology, histamine.
Introduzione
L’obiettivo del lavoro di ricerca qui illustrato consiste nello studio
degli effetti dell’idrochinone sui meccanismi cellulari di rilascio
dei mediatori chimici che hanno la capacità di regolare i processi infiammatori
ed in particolar modo l’infiammazione allergica.
3) Silbergeld EK. Chemicals and chloracne. In: Marzulli FN, Maibach
HI, eds. Dermatotoxicology. Washington, DC: Taylor & Francis,
1996: 249-263.
4) Seveso Chloracne Panel. Report of the first meeting of the “Chloracne
Panel”. Milan, 11-12 July, 1977.
5) Patterson DG, Jr., Hampton L, Lapeza CR, Jr., et al. High-resolution
gas chromatographic/high-resolution mass spectrometric analysis of
human serum on a whole-weight and lipid basis for 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.
Anal.Chem. 1987; 59: 2000-2005.
Studi tossicologici sugli effetti dell’idrochinone e del benzochinone
sui basofili umani
1 Cattedra di Igiene Industriale, Seconda Università degli Studi di Napoli
2 Istituto di Medicina del Lavoro, Università Cattolica del Sacro Cuore di Roma
3 Cattedra di Immunologia, Università degli Studi Napoli Federico II
Negli esperimenti effettuati abbiamo preso in considerazione
primariamente le cellule umane granulocitarie (basofili) con lo scopo
di registrare gli effetti sul rilascio di istamina. L’analisi dei dati
ci condurrà ad elucidare i meccanismi di azione dell’idrochinone al
fine di comprendere meglio attraverso quali meccanismi si innescano
i processi di infiammazione e di danno imputabili al benzene.
Materiali e metodi
Determinazione del rilascio dell’istamina. Il sangue venoso è
stato ottenuto da donatori del Centro Trasfusionale del II Policlinico
di Napoli, Università Federico II. La separazione per la purificazione
dei leucociti dai globuli rossi è stata ottenuta sottoponendo
il buffy coat a gradiente di destrano e EDTA, utilizzato per evitare
la coagulazione, per circa 45’ a circa 22°C. Lo strato superiore
del gradiente è stato prelevato e lavato per 3 volte in Pipes 1X
in un volume di 50 ml. Il Pellet è stato poi risospeso in PCG e la
sospensione cellulare è stata trasferita in tubi Falcon di polipropilene
da 3 ml; i tubi così ottenuti, aventi un VF di 1 mL sono stati
messi a temperatura costante in bagnetto a 37°C. Dopo un
prewarm di 5’ è partito l’esperimento aggiungendo 100 µL di HQ
a varie concentrazioni (da 10 -7 M a 10 -4 M) e dopo un’esposizione
variabile (da 10’ a 120’) è stato aggiunta la stimolazione (100 µL)
effettuata attraverso Anti-IgE, FMLP ed A23187, si è testato anche
l’effetto dell’idrochinone senza alcuna stimolazione. Dopo il tempo
prestabilito è stato fermato l’esperimento e si sono centrifugati
i tubi (1000 x G, + 4°C, 5’); il supernatante così ottenuto è stato
raccolto per la determinazione del rilascio di istamina attraverso
una tecnica fluorimetrica. La percentuale di rilascio di istamina è
stata calcolata dal rilascio totale di istamina dalle cellule lisate con
acido perclorico al 2%, meno l’istamina rilasciata spontaneamente
dalle cellule non stimolate. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati
su donatori differenti e sono stati tutti condotti in duplicato.
Risultati
La prima serie di esperimenti è stata effettuata per valutare se
la secrezione di istamina veniva influenzata dalla presenza di HQ
senza utilizzare alcuna stimolazione con azione attivante la secrezione
di istamina dei basofili. L’idrochinone, usato a concentrazioni
variabili da 10 -7 M a 10 -4 M, non ha nessun effetto sulla
secrezione di istamina. A questo punto abbiamo deciso di valuta-

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
30 www.gimle.fsm.it
re se in seguito a stimolazione, praticata attraverso l’utilizzo di
Anti-IgE, A23187 e FMLP, si potessero vedere degli effetti sul rilascio
dell’Istamina, dopo avere esposto i basofili per un ora ad
HQ con concentrazioni tra 10 -7 M a 10 -4 M.
La Figura 1 mostra i valori della media dei risultati degli
esperimenti effettuati con Anti-IgE. Gli effetti dell’HQ sono presenti
alla concentrazione di 10 -4 M con una IC superiore al 25%
(Figura 1 bis). La Figura 2 mostra gli esperimenti con l’A23187:
in questo caso gli effetti inibitori mostrano una inibizione già presente
alla concentrazione di 3x10 -5 M con una IC superiore al
25% e a 10 -4 M una IC superiore al 50% (Figura 2 bis).
Alla prova con la stimolazione con FMLP non sono stati osservati
effetti (Figura 3).
La Figura 4 mostra i risultati ottenuti esponendo i Basofili ad
Idrochinone per tempi variabili tra 10’ e 120’. Dall’analisi dei risultati
si evince come il tempo di esposizione non influisca sul livello
di inibizione del rilascio di istamina dei Basofili stimolati
con Anti-IgE.
Discussione
Questi studi indicano che i Basofili sono cellule bersaglio
dell’Idrochinone, infatti il meccanismo cellulare indagato, la se-
Figura 1. Effetti dell’Idrochinone sul rilascio dell’Istamina nei
Basofili umani stimolati con Anti-IgE. Per ogni valore è riportato
l’errore standard
Figura 1 bis. Andamento dell’inibizione del rilascio di
Istamina da parte dei basofili dopo esposizione a concentrazioni
crescenti di Idrochinone (HQ) e stimolazione
con Anti-IgE. La IC 25% viene superata alla concentrazione
di 10 -4 M
crezione di istamina, viene ad essere influenzato dalla presenza
di idrochinone nei terreni di cultura utilizzati. La popolazione
cellulare scelta, i Granulociti Basofili, è stata selezionata nel nostro
studio in quanto essi hanno un ruolo fondamentale nei meccanismi
di difesa dell’organismo, ed essi attraverso mediatori
chimici, come l’istamina, sono in grado di attivare fini meccanismi
di difesa a livello delle vie respiratorie.
La prima osservazione importante è che l’idrochinone è in
grado di interferire con i meccanismi metabolici e biochimici
dei basofili, e che quindi non è un metabolita inerte sul sistema
immunitario in generale, e sui Basofili in specifico. Abbiamo
osservato, alla concentrazione di 10 -4 M, che vi è una inibizione
superiore al 25% della secrezione di Istamina per cellule trattate
con Anti-IgE e A23187, mentre nessun effetto è stato osservato
quando si è utilizzato come stimolo FMLP. Un dato importante
è stato quello che al variare con il tempo di esposizione
di Idrochinone non si è riscontrata nessuna differenza con il
tipo di inibizione.
Innanzi tutto bisogna evidenziare come l’Istamina, contribuisca,
insieme ad altri mediatori, nell’attivazione e nel mantenimento
dei meccanismi della clearance mucociliare e della secrezione
di muco, attraverso i quali si attivano i processi che permettono
l’azione di eliminazione di sostanze estranee sia biologiche
che chimiche dall’albero respiratorio, impedendo così l’ac-
Figura 2. Effetti dell’Idrochinone sul rilascio dell’Istamina nei
Basofili umani stimolati con A23187. Per ogni valore è riportato
l’errore standard
Figura 2 bis. Andamento dell’inibizione del rilascio di Istamina
da parte dei basofili dopo esposizione a concentrazioni
crescenti di Idrochinone (HQ) e dopo stimolazione con
A23187. La IC 25% viene superata alla concentrazione di
3*10 -5 M e sale oltre il 50% a 10 -4 M

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
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Figura 3. Effetti dell’Idrochinone sul rilascio dell’Istamina nei
Basofili umani stimolati con FMLP. Per ogni valore è riportato
l’errore standard
cumulo di agenti tossici. È quindi questo uno dei meccanismi di
tossicità del benzene che può innescarsi a livello polmonare, ovvero
la riduzione dell’efficacia del meccanismo di clearance, con
una riduzione dei meccanismi fisiologici di rimozione e protezione
delle vie aeree. Il perpetuarsi di questa riduzione dei meccanismi
di protezione può quindi, nel tempo, con l’esposizione
cronica, tipica del Benzene, contribuire al danno tessutale e quindi
all’infiammazione cronica delle vie aeree.
Conclusioni
In questo lavoro si è potuto utilizzare un modello altamente
rappresentativo per elucidare i meccanismi di azione dell’infiammazione
cronica delle vie aeree, infatti abbiamo potuto utilizzare
per gli esperimenti cellule umane prelevate da donatori sani. Abbiamo
quindi potuto mettere in luce con quale meccanismo l’I-
RIASSUNTO. L’obiettivo di questo studio era esaminare i profili di
un gruppo di lavoratori di un reparto di manutenzione di una azienda aeronautica
esposti a trichloroethilene (TCE) dopo il 2001/59/ce ed il DL n.
197 06/14/2002.
Parole chiave: monitoraggio biologico, trichloroetilene, biomarkers.
ABSTRACT. ASSESSING CHEMICAL EXPOSURE IN THE WORKPLACE:
THE ROLE OF BIOLOGICAL MONITORING IN WORKERS EXPOSED TO TRICH-
LOROETHYLENE. The objective of this study was to examine the profiles
of a group of workers exposed to trichloroethilene (TCE) in a group of
aircraft maintenance workers in the wake of European Directive
2001/59/CE and DL n. 197 06/14/2002.
Key words: biological monitoring, trichloroethylene, biomarkers.
Figura 4. Andamento dell’inibizione del rilascio di Istamina
da parte di Basofili umani in tempi differenti di esposizione
ad Idrochinone. Per ogni valore è riportato l’errore standard
drochinone agisca, scoprendo che la sua azione si estrinseca con
un meccanismo inibitorio sulla secrezione di istamina, e che questa
azione si può manifestare con una riduzione dei meccanismi
di difesa e di clearance mucociliare delle vie aeree, che con il perpetuarsi
dell’esposizione può comportare danno tissutale nelle
vie respiratorie.
Bibliografia
M. Bova 1 , A. Capri 1 , F. Cardoni 2 , S. Simonazzi 2 , G. Ricciardi-Tenore 1
1) Brugnone F et al. Benzene in environmental air and human blood.
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risposta immunitaria. Giorn it allergol immunol clin, 2001; 11:
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3) Carbonelle P et al. Effects of the Benzene Metabolite, Hydroquinone,
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Appl Pharmacol, 1995; 132: 220-226.
Valutazione dell’esposizione a sostanze chimiche: il ruolo
del monitoraggio biologico in lavoratori esposti a TCE
1 ALITALIA Gruppo, Servizio di Medicina Aeronautica e del Lavoro
2 Dipartimento di Medicina Legale e delle Assicurazioni, Medicina del Lavoro, 1a Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università degli Studi di Roma “La
Sapienza”
Introduzione
Con il decreto n. 197 del 14 giugno 2002 del Ministero della
Salute è stata recepita in Italia la Direttiva 2001/59/CE, che
prevede la riclassificazione del tricloroetilene (TCE) da “cancerogeno
di categoria 3” a “cancerogeno di categoria 2” (sostanza
che può essere considerata come potenzialmente cancerogena
per l’uomo). La nuova classificazione del TCE comporta
per le aziende, e di conseguenza per tutte le figure professionali
che concorrono alla salvaguardia della sicurezza e
della tutela della salute dei lavoratori esposti, una puntuale verifica
delle condizioni di igiene del lavoro e di sorveglianza sa-

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
32 www.gimle.fsm.it
nitaria ed una chiara definizione del livello di “rischio residuo
per la salute” (anche ai sensi e per gli effetti del disposto ex
artt. 72-quater, 72-quinquies, 72-sexies e 72-decies, del D.Lgs.
626/94, così come modificato ed integrato dal D.Lgs.
25/2002).
Lo scopo di questo contributo è di riportare pertanto i dati relativi
al risk assessment effettuato su un gruppo di lavoratori di
un’industria aeronautica esposti a TCE, ed altresì di verificare
l’utilità e la validità del monitoraggio biologico come fattore determinante
per la sicurezza degli operatori.
Materiali e metodi
Sono stati studiati 22 soggetti maschi, di cui 8 fumatori e
14 non fumatori, con un’età media di 37 anni (range 24-55 aa)
ed un’anzianità lavorativa media di 11 anni (range 2-35 aa),
appartenenti ad un reparto in cui si effettuano su due turni nelle
24 ore delle operazioni di incollaggio su lamiere e strutture
in honey comb metallico, con presenza di vasche contenenti
TCE, trattamenti quali primer attivatore incollaggi e film adesivi,
ed uso di altri prodotti contenenti sostanze classificate come
cancerogene quali i cromati. Gli ambienti di lavoro dei reparti
in questione sono dotati di sistemi “mobili” di aspirazione
localizzata per le diverse postazioni operative e di impianti
di captazione centralizzata (velocità di cattura: 9m/sec); le vasche
contenenti TCE, inoltre, sono provviste di una serpentina
per il raffreddamento dei vapori, pannello di chiusura, nonché
di un sistema di aspirazione lungo i bordi. Tutti i lavoratori, nel
corso dell’esposizione, sono altresì regolarmente dotati di idonei
DPI per le vie respiratorie e per la cute (maschera protettiva
a carboni attivi, schermo protettivo in plexiglass, guanti in
tela, camice usa e getta).
Dal momento in cui il TCE è stato classificato ex lege come
R45, pure a fronte dei bassi livelli di esposizione ambientale già
rilevati, si è ritenuto opportuno procedere anche alla determinazione
del tricloroetilene tal quale e dell’acido tricloroacetico
(TCA) nelle urine (come contemplato per i BEI individuati dall’ACGIH).
Per tutti i soggetti esaminati sono stati raccolti i dati
anamnestici, ritenuti utili per individuare ed interpretare
eventuali interferenze analitiche (abitudine al fumo, dieta, trattamenti
farmacologici, etc.); al contempo si è proceduto alla
consultazione delle cartelle sanitarie e di rischio, per la revisione
sia dei dati obbiettivi che di quelli scaturiti dalle indagini
integrative chimico-cliniche previste dallo specifico protocollo
di “sorveglianza sanitaria” comprendente: visita medica, esami
chimico-clinici annuali (emocromo, glicemia, azotemia, creatinemia,
acido urico, colesterolo tot. e HDL, trigliceridi, bilirubina
tot. e diretta, GGT, AST, ALT, fosfatasi alcalina, proteine totali,
albumina, es. urine completo), ECG ed audiometria biennali,
RX torace triennale (1).
Tenuto conto che Raaschou-Nielsen et al., nello studio condotto
su un gruppo di operatori esposti a TCE pubblicato nell’ottobre
del 2002, hanno individuato la “proteinuria” e la “piastrinopenia”
come indicatori di danno precoce in corso di esposizione
prolungata ad alte dosi di TCE, (2) si è proceduto con particolare
attenzione alla revisione dei dati relativi a tali parametri
- oltre ad osservare altre eventuali alterazione a carico del sistema
emopoietico e renale - raccolti nel corso degli ultimi tre anni
di sorveglianza sanitaria sulla popolazione lavorativa oggetto di
questo contributo.
Raccolta e conservazione dei campioni: i campioni di
urina sono stati raccolti all’inizio ed alla fine del turno di lavoro,
suddivisi in due aliquote, e congelati a -20° C fino al momento
della determinazione analitica (metodo: GC e colorimetrico).
Le indagini ambientali (campionamento statico con po-
stazione fissa e campionatori passivi) sono state mirate a valutare
l’eventuale esposizione dei lavoratori a concentrazioni di
vapori di TCE.
Risultati
Per quanto concerne il “monitoraggio biologico”, i risultati
dei dosaggi del TCE e del TCA nelle urine dei soggetti presi in
esame sono tutti collocati al di sotto del limite di rilevabilità della
metodica analitica impiegata (2,5µg/L - 1mg/L).
I risultati degli esami clinici, strumentali e di laboratorio, non
hanno messo in evidenza alcuna alterazione correlabile all’esposizione
al tricloroetilene nel gruppo di lavoratori indagato; la revisione
delle cartelle cliniche degli addetti al reparto honey comb
negli ultimi tre anni, infatti, non ha mostrato alcuna modificazione
in senso patologico nell’arco di tempo considerato, ad eccezione
di un solo caso che presentava una proteinuria riconducibile
alla patologia diabetica a cui era affetto, mentre i valori delle
piastrine erano compresi nel range di normalità (150.000-
400.000 µ/l).
Anche i dati ottenuti dalle indagini di “monitoraggio ambientale”
hanno confermato l’accettabilità dell’esposizione, risultando
contenuti nell’ambito del relativo TLV-TWA (170mg/m 3 ,
pari a 25 ppm); il valore limite di esposizione professionale per il
TCE, d’altro canto, non risulta attualmente inserito nella prima lista
contenuta nell’Allegato VIII-ter, ex art. 72-ter, D.Lgs. 626/94
(così come modificato ed integrato dal D.M. Lavoro del
26.02.2004).
Conclusioni
Nell’aggiornamento dell’elenco delle malattie professionali
contenuto nel D.M. Lavoro del 27.04.2004 (G.U. n. 134
del 10.06.2004), il TCE risulta inserito nella Lista I (elevata
probabilità di origine lavorativa), alla voce 32 quale fattore
causale per effetti “deterministici”; mentre per effetti di tipo
“stocastico” al TCE viene riconosciuta alla voce 15 la capacità
cancerogena nel contesto della Lista II (limitata probabilità
di origine lavorativa)(3). L’applicazione di “indicatori
biologici di esposizione”, quali il TCE ed il TCA urinari, congiuntamente
alle determinazioni ambientali, risulta innanzitutto
necessaria per una corretta ed obbiettiva definizione sia
del risk assessment che del “rischio moderato” per esposizioni
a basse dosi di sostanze chimiche (a conferma, tra l’altro,
della validità di tutte le misure collettive ed individuali di
protezione adottate). Trattandosi poi di un cancerogeno di categoria
2, si ritiene opportuno prevedere anche per il tricloroetilene
la definizione della dose biologicamente efficace,
mediante la determinazione degli “addotti alle proteine”, in
sostanziale applicazione comunque del disposto ex art. 63 del
D.Lgs. 626/94 per la valutazione dell’esposizione a sostanze
cancerogene.
Bibliografia
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sanitaria e caratterizzazione dell’esposizione a basse dosi
di cromo: risultati di un follow-up a dieci anni. G Ital Med Lav 2003;
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biological exposure index..Ind Health 2001; 39 (3): 225-30.

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 33
G. Brambilla 1 , F.M. Rubino 1 , S. Pulvirenti 1 , C. Verduci 1 , S. Fustinoni 2 , M. Buratti 2 , A. Colombi 1
Considerazioni sul ruolo dei coniugati mercuro-tiolici nella tossicità
cardiovascolare del metallo
1 Dipartimento di Medicina del Lavoro, Clinica L. Devoto, Università degli Studi di Milano, Sezione Ospedale San Paolo
2 Azienda Ospedaliera Istituti Clinici di Perfezionamento
RIASSUNTO. Nell’ambito di studi volti a definire i meccanismi
molecolari coinvolti nell’azione tossica del mercurio sugli apparati cardiovascolare,
nervoso, renale e immunitario, viene discusso il ruolo biologico
dei coniugati tiolici che il metallo è in grado di formare con i composti
della griglia metabolica del glutatione e con i gruppi tiolici delle
proteine funzionali, con particolare riferimento ad un loro coinvolgimento
nella perturbazione dei sistemi di signalling intracellulare (formazione
di S-nitroso ed S-glutationil emoglobina) dell’apparato cardiovascolare.
Parole chiave: mercurio, composti tiolici, meccanismi tossicità, effetti
cardiovascolari.
ABSTRACT. CONSIDERATIONS ON THE ROLE OF MERCURY THIOL
CONJUGATES IN THE CARDIVASCULAR TOXICITY OF MERCURY. Within the
framework of current studies aimed at highlighting the molecular basis of
the toxicity of mercury for the cardiovascular, nervous, renal and immune
systems, we discuss the biological role of mercury conjugates with
glutathione compounds and with functional proteins, with reference to
their ability to disturb the redox signalling pathways based on S-nitrous
and S-glutathionyl hemoglobin.
Key words: mercury, thiolic compounds, cardiovascular effects.
Introduzione
Il mercurio è un metallo la cui tossicità per l’uomo coinvolge
organi bersaglio quali il sistema nervoso centrale e il rene. Sono
state inoltre espresse preoccupazioni nei confronti dell’eventuale
coinvolgimento del mercurio quale agente tossico corresponsabile
della comparsa di alterazioni patologiche a carico del
sistema nervoso centrale e del sistema neuro-immunitario in soggetti
portatori di otturazioni dentarie in amalgama di mercurio e
in bambini sottoposti a vaccinazione con vaccini contenenti composti
organomercuriali quali agenti conservanti antibatterici. Recentemente
inoltre è stato rivalutato il suo possibile ruolo nell’eziopatogenesi
di alcune malattie cardiache. Lo studio delle forme
chimiche attraverso le quali il mercurio è distribuito nell’organismo
ed esercita le azioni tossiche selettive su recettori cellulari
specifici degli organi bersaglio rappresenta un attivo campo di ricerca
(1,2). In particolare, le forme coniugate del mercurio con i
composti appartenenti alla griglia metabolica del glutatione, costituiscono
i metaboliti di trasporto epatobiliare sia della specie
metilmercurio (MeHg + ) che dello ione mercurico (Hg 2+ ) e sono
responsabili dell’accumulo irreversibile del metallo all’interno
delle cellule del tubulo renale prossimale, causa prossima della
nefrotossicità del mercurio.
Tossicità nei confronti del sistema cardiovascolare
Già Ramazzini, alla fine del XVII secolo, aveva descritto la
morte per ‘sincope’ di lavoratori esposti a vapori di mercurio nella
fabbricazione di specchi e nella doratura dei mobili attraverso
la spalmatura di amalgami d’argento o d’oro sulle superfici e la
successiva evaporazione del mercurio ad elevata temperatura.
Numerosi lavori recenti concorrono a razionalizzare queste osservazioni,
suggerendo un ruolo specifico del mercurio nella patologia
cardiovascolare.
È stato infatti osservato un accumulo selettivo di mercurio
(concentrazioni di 1-800 µg/g di tessuto) in campioni di tessuto
miocardico prelevato dal ventricolo sinistro di pazienti affetti da
miocardiopatia dilatativa, mentre quelli di pazienti affetti da altre
patologie degenerative del muscolo, quale l’infarto miocardico, e
di soggetti normali mostravano valori di 0,05-0,5 µg/g (3). La
perfusione del cuore di ratto con un tampone contenente Hg 2+ a
concentazione nanomolare è risultata in grado di ridurre la forza
di contrazione del muscolo (4); questa osservazione può essere
posta in relazione con l’attività inibitoria mostrata dallo ione nei
confronti dell’ATP-asi Na + -K + -dipendente ouabaino-sensibile
(5). Recenti studi pongono in evidenza il ruolo di un pool di emoglobina
collocato in prossimità della membrana cellulare dell’eritrocita
nel regolare la vasodilatazione periferica attraverso la
formazione reversibile di coniugati nitroso-tiolici tra il residuo
tiolico della cisteina β-93 e l’ossido di azoto (NO) circolante (6),
responsabile del mantenimento del tono vascolare. Risulta pertanto
possibile che la quota intraeritrocitaria di Hg 2+ possa perturbare
questo sistema, in quanto in grado di degradare i nitrosotioli
(7) e di competere per il legame a queste molecole di emoglobina,
anche attraverso la formazione di specie con connettività
Hb-( 93 Cys)S-Hg-SGlutatione, che è a sua volta potenzialmente in
grado di mimare gli effetti dell’analogo glutationil-emoglobina,
una forma post-traduzionale fisiologicamente presente e i cui livelli
risultano incrementati in condizioni di stress ossidativo cellulare
(8).
Reattività dello ione Hg 2+ con composti bio-organici contenenti gruppi
tiolici liberi
Il mercurio dà origine a ‘sali’ con amminoacidi, peptidi e proteine
contenenti residui di cisteina, secondo il processo descritto
nell’equazione 1 seguente:
Hg2+ + R1-SH ↔ R1-S-Hg + + H +
R1-S-Hg + + R2-SH ↔ R1-S-Hg-S-R2 + H +
(1)
ovvero: Hg2+ + 2 R-SH ↔ R-S-Hg-S-R + 2 H +
I valori delle costanti di equilibrio per sistemi contenenti il
glutatione o la penicillamina sono risultati estremamente elevati
(superiori a 10 30 ), tali da dover ammettere che, in ambiente biologico
ed in presenza delle concentrazioni fisiologiche di gruppi
tiolici liberi, non possano sussistere in pratica ioni Hg 2+ liberi. Il
trasporto dello ione Hg 2+ tra i diversi compartimenti biologici
avviene quindi attraverso lo scambio dei loro residui tiolici
(equazione 2):
R 1 -S-Hg-S-R 1 + R 2 -SH ↔ R 1 -S-Hg-S-R 2 + R 1 -SH (2)
Alcuni aspetti della reattività dei coniugati mercuro-tiolici
sono stati inoltre desunti sulla base delle reazioni di frammentazione
osservate mediante spettrometria di massa (9). In particolare,
è stata evidenziata la possibilità che specie mercuro-cisteiniche
diano origine a intermedi alchilanti di tipo episulfonio, in
grado di modificare irreversibilmente le strutture biologiche. È
possibile pertanto ricondurre, almeno in termini ipotetici, il mec-

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
34 www.gimle.fsm.it
canismo dell’azione tossica selettiva del mercurio all’interazione
tra Hg 2+ e specifici bio-tioli che partecipano a sistemi di signalling
cellulare, quali non solamente i gruppi tiolici funzionali degli
enzimi, ma anche le proteine nitrosilate e glutationilate, nonché
alcuni mediatori neuroendocrini di natura peptidica, quali la
vasopressina e l’ossitocina, coinvolti in una vasta serie di fenomeni
biologici di regolazione.
Conclusioni
In conclusione, le conoscenze oggi in via di acquisizione sulla
reattività del mercurio nei confronti di amminoacidi, peptidi e
proteine contenenti gruppi tiolici liberi o ponti disolfuro possono
rendere ragione, almeno in termini speculativi, degli effetti biologici
del metallo su organi ed apparati dell’organismo umano
noti per essere bersagli elettivi della sua azione tossica.
Bibliografia
A. Caglieri 2 , M.V. Vettori 1,2 , M. Goldoni 1,2 , R. Alinovi 2 , D. Poli 1,2 , S. Ceccatelli 3 , A. Mutti 2
RIASSUNTO. In questo lavoro vengono presentate le variazioni dei
livelli di indicatori specifici di stress ossidativo misurati in una coltura
cellulare neuronale (SK-N-MC) esposta a stirene e 7,8-ossido (SO), 0.3
e 1mM per 16 ore. Il trattamento con SO provoca un significativo aumento
della perossidazione lipidica associato all’incremento dei livelli di
ossidazione del DNA e delle proteine. Inoltre l’esposizione a SO determina
la diminuzione dell’attività della GST, il calo di GSH (solo alla concentrazione
più alta) e l’incremento dell’attività dell’HO-1.
Parole chiave: stress ossidativo, danno al DNA, stirene 7,8-ossido,
cellule neuronali.
ABSTRACT. OXIDATIVE STRESS IN HUMAN NEURONAL CELLS INDU-
CED BY STYRENE 7,8-OXIDE. In this study, we report the alterations of several
markers of oxidative stress measured in a neuronal cell line (SK-N-
MC) exposed to styrene 7,8-oxide (SO), 0.3 and 1 mM for 16 h. SO treatment
induced a significant increase in lipid peroxidation associated with
an increase in the oxidation levels of DNA and proteins. In addition, SO
exposure caused the reduction in GSH levels (only at the 1 mM dose),
GST activity and an increased heme oxygenase (HO-1) activity.
Key words: oxidative stress, DNA damage, styrene 7,8-oxide, neuronal
cells.
Introduzione
Lo stirene è un composto organico volatile molto utilizzato
a livello industriale. L’esposizione a stirene provoca alterazioni
neurocomportamentali nei lavoratori, quali perdita di memoria,
fatica, cambiamenti d’umore e modificazioni neurologiche
che talvolta diventano permanenti (1-3). Ad oggi i meccanismi
dei danni provocati sul sistema nervoso centrale (SNC)
dallo stirene non sono stati completamente identificati. Lo stirene
7,8-ossido (SO), il principale metabolita dello stirene, è
citotossico per linee cellulari neuronali in vitro (4-6). In un recente
lavoro è stata dimostrata l’azione tossica dello SO in cellule
di neuroblastoma umano (SK-N-MC) ed in una cultura pri-
1) Sirois & Atchison: Neurotoxicology 1996; 17: 63-84.
2) RK Zalups: Pharmacol Rev 2000; 52: 113-43.
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8) Bursell SE, King GL. Clin Chem 2000; 46: 146-46.
9) Rubino FM, Verduci C, Giampiccolo R, Pulvirenti S, Brambilla G,
Colombi A. J Am Soc Mass Spectrom 2004; 15: 288-300.
Analisi dello stress ossidativo indotto dallo stirene 7,8-ossido
in cellule neuronali umane
1 Centro Studi e Ricerche ISPESL, Università degli Studi di Parma
2 Laboratorio di Tossicologia Industriale, Università degli Studi di Parma
3 Institute of Environmental Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Svezia
maria di granulociti cerebellari (7). Queste linee cellulari esposte
a diverse concentrazioni di SO manifestano contrazione
cellulare, riarrangiamenti cromatidici ed attivazione di alcune
proteasi (calpaina e caspasi), eventi caratteristici della “fase
esecutiva” dell’apoptosi (7). Scopo dello studio è di chiarire i
meccanismi dell’azione citotossica dello SO nella linea cellulare
SK-N-MC ipotizzando che l’esposizione provochi stress
ossidativo e questo possa determinare l’attivazione di enzimi
specifici per la morte cellulare. Poiché il trattamento delle cellule
SK-N-MC con SO 0,3 e 1 mM per 16 ore determina l’attivazione
di segnali apoptotici come il riarrangiamento cromatidico
e l’aumento dell’attività delle caspasi (7), queste stesse
concentrazioni sono state scelte per valutare anche i parametri
di stress ossidativo.
Materiali e metodi
Per chiarire quali siano gli eventi intracellulari che determinano
la morte delle cellule neuronali, sono stati valutati i seguenti
indicatori specifici per i diversi bersagli cellulari dello stress ossidativo
nella linea di neuroblastoma umano SK-N-MC:
1. le sostanze reattive dell’acido tiobarbiturico (TBARS), come
parametro del danno ossidativo alle membrane cellulari;
2. i gruppi carbonilici e gruppi sulfidrilici per valutare l’ossidazione
proteica;
3. i livelli di 8-idrossi-2’-desossiguanosina (8-OHdG), indicatore
del danno al DNA;
4. l’espressione e l’attività dell’eme-ossigenasi (HO-1) come
esempio di una risposta al danno ossidativo mediato dalla regolazione
genica.
Sono stati inoltre stimati altri indicatori per valutare la capacità
di “scavenging” delle cellule: i livelli di glutatione intracellulare
(GSH) e l’attività della glutatione S-transferasi(GST).

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 35
Risultati
Nella Tabella I sono riportati i valori dei parametri
cellulari stimati dopo esposizione delle cellule
SK-N-MC a SO 0,3 e 1 mM. Si evidenzia un significativo
aumento della perossidazione lipidica
(TBARS) associato all’incremento dei livelli di ossidazione
del DNA e delle proteine. Le dosi utilizzate
influenzano in modo significativo la capacità di
difesa della cellula diminuendo l’attività della Glutatione
S-Transferasi, mentre il calo di GSH è evidente
solo quando le cellule SK-N-MC vengono
esposte alla concentrazione più alta (1 mM). L’esposizione
a SO determina inoltre una crescita dell’attività
dell’eme ossigenasi 1 (HO-1). È bene sottolineare
che le dosi nominali a cui ci riferiamo sono
quelle misurate nel medium iniziale (0,3 e 1 mM
SO) che corrispondono, dopo il periodo di incubazione
di 16 h, a 0,15 e 0,51 mM rispettivamente.
Discussione e conclusioni
Sebbene sia stato ampiamente dimostrato come lo stress ossidativo
contribuisca in modo significativo a rendere effettiva
l’azione di molti agenti neurotossici, poca attenzione è stata posta
sul ruolo delle Sostanze Reattive dell’Ossigeno (ROS) nel
meccanismo di neurotossicità dello SO nelle culture cellulari in
vitro. In questo lavoro vengono presentate le variazioni dei livelli
di indicatori specifici di stress ossidativo misurati in una
linea neuronale esposta a SO. Valutando complessivamente
questi parametri, si comprende come la neurotossicità dello SO
si manifesti mediante l’ossidazione di diversi bersagli cellulari.
È evidente, inoltre, come lo stress ossidativo sia provocato dall’esposizione
a SO alle stesse concentrazioni che determinano
la morte cellulare per apoptosi. In un recente studio è stato valutato
quanto lo stress ossidativo sia determinante nella “fase
iniziale” dell’apoptosi indotta dallo SO. Risultati preliminari
dimostrano che il pre-trattamento con un antiossidante specifico
riduce l’attivazione delle caspasi e quindi la morte cellulare
per apoptosi (8). Alla luce di questi risultati si può quindi concludere
che lo stress ossidativo svolga un ruolo determinante
nella “fase iniziale” dell’apoptosi indotta da SO in cellule di
neuroblastoma umano.
Ringraziamenti
Questo studio è stato finanziato dalla Comunità Europea (contratto
QLK4-1999-01356).
RIASSUNTO. Scopo della ricerca è stato indagare il possibile utilizzo
dell’escrezione urinaria di idrocarburi policiclici aromatici (IPA)
non metabolizzati, come indicatori specifici di esposizione a IPA. Lo studio
è stato condotto su 24 esposti a fumi di bitume e 6 esposti a fumi diesel.
I risultati ottenuti mostrano che l’escrezione urinaria di IPA permette
Tabella I. Variazioni dei parametri di stress ossidativo in seguito
all’esposizione delle cellule SK-N-MC a SO
Bibliografia
1) Jéngaden D, Simon JF, Habault M, Legoux B, Galopin P. Study on
the neurobehavioral toxicity of styrene at low levels of exposure. Int
Arch Occup Environ Health 1993; 64: 527-531.
2) Viaene MK, Pauwels W, Veulemans H, Roels HA, Masschelein R.
Neurobehavioural changes and persistence of complaints in workers
exposed to styrene in a polyester boat building plant: influence of exposure
characteristics and microsomal epoxide hydrolase phenotype.
Occup Environ Med 2001; 58: 103-12.
3) Mutti A, Mazzucchi A, Rustichelli P, Frigeri G, Arfini G, Franchini
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exposure to styrene and neuropsychological functions. Am J
Ind Med 1984; 5: 275-286.
4) Boccellino M, Cuccovillo F, Napolitano M, Sannolo N, Balestrieri C,
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a complex apoptotic response in neuronal PC12 cell line. Carcinogenesis
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5) Dypbukt JM, Costa LG, Manzo L, Orrenius S, Nicotera P. Cytotoxic
and genotoxic effects of styrene-7,8-oxide in neuroadrenergic Pc 12
cells. Carcinogenesis 1992; 13: 417-24.
6) Kohn J, Minotti S, Durham H. Assessment of the neurotoxicity of
styrene, styrene oxide, and styrene glycol in primary cultures of motor
and sensory neurons. Toxicol Lett 1995; 75: 29-37.
7) Daré E, Tofighi R, Vettori MV, Momoi T, Poli D, Saido TC et al Dare
E, Tofighi R, Vettori MV, Momoi T, Poli D, Saido TC, Mutti A,
Ceccatelli S. Styrene 7,8-oxide induces caspase activation and regular
DNA fragmentation in neuronal cells. Brain Res 2002; 933: 12-22.
8) Daré E, Tofighi R, Nutt L, Vettori MV, Emgård M, Mutti A, Beccatelli
S. Styrene 7,8-oxide induces mitochondrial damage and oxidative
stress in neurons. Toxicology, in press.
L. Campo, L. Addario, L. Scibetta, M. Buratti, V. Foà, O. Longhi, P. Cirla, I. Martinotti, S. Fustinoni
Nuovi indicatori per il monitoraggio biologico dell’esposizione
a idrocarburi policiclici aromatici: gli IPA urinari
Dipartimento di Medicina del Lavoro, Università degli Studi di Milano e ICP, Milano
di discriminare le due casistiche e inoltre di osservare una differenza tra
campioni raccolti prima e dopo l’esposizione anche a bassi livelli di esposizione
ambientale.
Parole chiave: idrocarburi policicicli aromatici, escrezione urinaria,
esposizione professionale.

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
36 www.gimle.fsm.it
ABSTRACT. URINARY POLYCYCLIC ARO-
MATIC HYDROCARBONS (PAH) AS NEW BIO-
MARKERS FOR THE BIOMONITORING OF EXPOSURE
TO PAH. The aim of the research is the development
of new biomarkers of polycyclic aromatic
hydrocarbons (PAH) exposure, namely the determination
of unmetabolised compounds in urine.
Urine samples were obtained from 24 workers
exposed to bitumen fumes and from 6 workers
exposed to diesel exhaust. The results show that,
even at low levels of PAH exposure, urinary PAH
are suitable for discriminating the two groups
and, also, samples obtained before and after the
work shift.
Key words: polycyclic aromatic hydrocarbons,
urinary excretion, occupational exposure.
Introduzione
Gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) sono una famiglia
di composti organici ad alto peso molecolare, la cui struttura contiene
due o più anelli benzenici condensati. Gli IPA si formano durante
processi di pirolisi o di combustione incompleta di materiali
organici e sono perciò presenti nell’ambiente in modo ubiquitario,
sia in fase vapore che adsorbiti sul particolato atmosferico.
Nelle aree urbane la fonte principale di questi composti è rappresentata
dagli scarichi autoveicolari, mentre altre fonti di esposizione
a IPA, oltre quelle professionali, sono il fumo di tabacco e
il consumo di cibi affumicati o cotti alla griglia (1). La IARC classifica
alcuni IPA come probabili o possibili cancerogeni per l’uomo
(2A o 2B) (2). Per il monitoraggio biologico dell’esposizione
a IPA viene storicamente usato l’1-idrossipirene, il principale metabolita
urinario del pirene, un composto sempre presente nelle
miscele aerodisperse di IPA. La composizione delle diverse miscele
di IPA varia però in funzione dei differenti processi di combustione,
e l’1-idrossipirene può quindi fornire solo una stima indiretta
della esposizione complessiva a IPA (3,4). Scopo di questo
lavoro è stato indagare il possibile utilizzo dell’escrezione urinaria
di IPA tal quali come indicatori specifici di esposizione a IPA.
Materiali e metodi
Sono stati indagati due gruppi di lavoratori caratterizzati da
diversa esposizione a IPA: 24 esposti a fumi di bitume (gruppo A)
e 6 esposti a fumi diesel (gruppo B). Nessuno di questi era fumatore.
Ai soggetti è stato chiesto di astenersi dal consumo di cibi
ad elevato contenuto di IPA il giorno precedente e il giorno
stesso della raccolta del campione biologico. Per ciascun soggetto
sono stati raccolti tre campioni di urina: uno all’inizio del turno
di lavoro del primo giorno della settimana lavorativa (BL) e
gli altri due, uno a inizio (IT) e l’altro a fine turno (FT) di un giorno
scelto nella seconda metà della settimana lavorativa. La determinazione
di IPA urinari è stata effettuata, dopo campionamento
degli analiti nello spazio di testa tramite microestrazione
in fase solida (SPME), mediante gascromatografia accoppiata alla
spettrometria di massa (GC/MS). Sono stati così quantificati:
naftalene, acenaftene, acenaftilene, fluorene, fenantrene, antracene,
fluorantene e pirene urinari.
Risultati
Gli IPA sono stati trovati nelle urine di tutti i soggetti indagati.
I composti presenti in maggiore quantità sono naftalene, fenantrene,
pirene e fluorene. In Tabella I si riportano i valori di
escrezione osservati nei soggetti suddivisi in base alla mansione
lavorativa. L’escrezione urinaria di pirene, fluorantene, fenantre-
Tabella I. Valori di escrezione di alcuni IPA urinari misurati a fine turno
nei due gruppi di soggetti indagati
ne e acenaftilene del gruppo A è risultata più elevata di quella osservata
nel gruppo B. Nel gruppo A, inoltre, per tutti gli analiti si
osservano valori crescenti delle concentrazioni passando dal
campione BL, o IT, al campione FT. Questa tendenza non è stata
invece osservata per i soggetti del gruppo B.
In Figura 1 è riportata a titolo d’esempio la distribuzione dei
valori relativi al fenantrene urinario nei due gruppi di soggetti indagati.
I valori di escrezione dei diversi IPA sono risultati tra loro
correlati (r > 0.42, p

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 37
Ringraziamenti
Lo studio è stato possibile anche grazie al contributo ISPESL
per il progetto “Nuovi indicatori per il monitoraggio biologico
dell’esposizione a idrocarburi policiclici aromatici” (contratto
n°B/47/DML/03.)
Bibliografia
1) Brandt H.C.A.Watson W.P. Monitoring human occupational and environmental
exposures to polycyclic aromatic compounds. Ann. Occup.
Hyg. 2003; 47: 349-378.
2) International Agency for Research on Cancer. Polynuclear Aromatic
compounds, Part 1. Chemical, environmental and experimental data.
RIASSUNTO. Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare
l’esposizione a benzene dei lavoratori di una grande industria petrolchimica
e determinare quale indicatore biologico di esposizione tra benzene
urinario, acido trans,trans-muconico (t,t-MA) e acido S-fenilmercapturico
(S-PMA) sia meglio correlato con l’esposizione ambientale. I dati del
monitoraggio ambientale e biologico hanno evidenziato una contenuta
esposizione a benzene (medie: benzene ambientale 0,022 mg/m 3 ; benzene
urinario 1,22 µg/L; t,t-MA 81,9 µg/g creat; S-PMA 2,80 µg/g creat). Significative
correlazioni sono state riscontrate tra l’esposizione ambientale
e gli indicatori biologici, ma con notevole dispersione dei dati. Per livelli
di benzene così bassi il monitoraggio ambientale sembra essere il
metodo migliore per valutare l’esposizione individuale.
Parole chiave: esposizione ambientale, acido trans,trans-muconico,
acido S-fenilmercapturico, benzene urinario.
ABSTRACT. COMPARISON BETWEEN DIFFERENT METHODS OF ASSES-
SING OCCUPATIONAL EXPOSURE TO BENZENE. The aim of the study was to assess
the benzene exposure of workers in a large petrochemical plant and to
determine which biological exposure index, urinary benzene, trans,transmuconic
acid (t,t-MA) or S-phenylmercapturic acid (S-PMA), showed a better
correlation with the individual exposure. The environmental and biological
monitoring data show that benzene exposure is low (means: benzene
in air 0.022 mg/m 3 ; urinary benzene 1.22 µg/L; t,t-MA: 81.9 µg/g creat.;
S-PMA: 2.80 µg/g creat.). Significant correlations have been found between
exposure to benzene and biomarkers, but with significant scattering of the
data. For such low levels of benzene in the air, environmental monitoring
seems to be the best method of evaluating individual exposure.
Key words: environmental exposure, trans,trans-muconic acid, Sphenylmercapturic
acid, urinary benzene.
Introduzione
Il benzene, appartenente alla famiglia degli idrocarburi aromatici,
è il solvente organico per eccellenza e trova applicazione
sia come materiale di base per la sintesi di altri composti chimici
(come solvente del lattice nell’industria della gomma, solvente
di inchiostri nei processi di stampa, nella produzione di verni-
In: Evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to humans, vol.
32. Lyon: IARC.
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several factors on the 1-hydroxypyrene level in human urine as an indicator
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Health perspectives 2003; 111: 1760-1764.
M. Carrieri 1 , E. Bonfiglio 1 , G. Cancanelli 2 , O. Nardelotto 3 , A. Pasqua di Bisceglie 1 , S. Serraino 1 , G. Gori 1 , M.L. Scapellato 1 ,
I Maccà 1 , G.B. Bartolucci 1
Confronto tra differenti metodi di valutazione dell’esposizione
occupazionale a benzene
1 Dipartimento di Medicina Ambientale e Sanità Pubblica, Università degli Studi di Padova
2 Syndial, Medicina e Igiene Industriale, Milano
3 Syndial, Servizio Sanitario, Porto Marghera (VE)
ci e di materiali plastici, ecc.). Una stima OSHA negli ambienti
di lavoro indica che circa 2 milioni di lavoratori sono esposti al
benzene. Scopo del nostro studio è stato quello di misurare, attraverso
tecniche di monitoraggio ambientale e biologico, l’esposizione
a benzene dei lavoratori di una grande industria petrolchimica.
Per il monitoraggio biologico, l’obiettivo è stato in particolare
quello di valutare l’utilizzo di diversi indicatori biologici
di esposizione: il benzene tal quale e i suoi metaboliti, gli acidi
trans,trans-muconico (t,t-MA) e S-fenilmercapturico (S-
PMA), dosati su campioni urinari raccolti a fine turno.
Materiali e metodi
Lo studio è stato condotto dosando il livello individuale di
esposizione a benzene rispettivamente di 151 lavoratori (59 fumatori
e 92 non fumatori). Il prelievo dei campioni ambientali è
stato eseguito con l’ausilio di dosimetri personali diffusivi (Radiello®),
la cui affidabilità sul campo è stata precedentemente
validata (1), collocati in prossimità della zona respiratoria dei
soggetti monitorati. Il campionamento è stato effettuato per l’intera
durata del turno lavorativo. La determinazione quantitativa
del benzene ambientale è stata condotta per via gascromatografica
previo desorbimento chimico dell’analita con solfuro di carbonio
(2 ml) direttamente nella cartuccia del Radiello®. Le analisi
sono state effettuate con gas-cromatografo equipaggiato con
rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID).
Su tutti i soggetti è stata valutata l’escrezione urinaria del solvente
tal quale e dei suoi metaboliti t,t-MA e S-PMA su campioni
raccolti al termine della giornata lavorativa. Il dosaggio del
benzene urinario è stato effettuato in gascromatografia-FID con
metodo dello spazio di testa; il dosaggio del t,t-MA è stato effettuato
con una metodica HPLC e rivelatore UV mentre la determinazione
dell’S-PMA è stata effettuata con metodica immunoenzimatica
in chemiluminescenza. La concentrazione dei due
metaboliti è stata espressa in funzione della creatinina urinaria.

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
38 www.gimle.fsm.it
Risultati e Discussione
I livelli di benzene ambientale
riscontrati sono risultati decisamente
contenuti rispetto al
TLV dell’ACGIH (2) e quindi
anche rispetto al limite italiano,
nonché a quanto riscontrato in
passato per questa categoria professionale
(3, 4). In Tabella I
vengono riportate le medie aritmetiche,
le mediane ed il range
dei livelli di esposizione a benzene
dei soggetti, differenziati
inoltre tra fumatori e non fumatori,
da cui si evidenzia come l’abitudine
al fumo non comporti
alcun incremento dell’esposizione:
il valore medio lievemente
superiore è infatti imputabile ad
un singolo valore elevato, di
0.534 mg/m 3 , che è però attribuibile
all’esposizione lavorativa.
Come per l’esposizione ambientale,
anche i livelli urinari dei metaboliti sono risultati sostanzialmente
contenuti se confrontati coi corrispondenti limiti biologici
di esposizione (BEI).
Al fine di valutare la validità degli indicatori biologici abbiamo
messo a confronto le concentrazioni ambientali di benzene
con i relativi livelli di escrezione dei due metaboliti, nonché con
l’escrezione urinaria del solvente tal quale. Abbiamo evidenziato
una correlazione bassa ma statisticamente significativa tra l’esposizione
ambientale e l’escrezione urinaria del solvente
(r=0,39; p

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
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P. Carta 1 , C. Flore 1 , A. Ibba 1 , M.G. Tocco 1 , G. Aru 1 , S. Caracoi 2 , F. Sanna Randaccio 1
Esposizione ambientale a metalli in residenti in un’area industriale
della Sardegna
1 Dipartimento di Sanità Pubblica, Sezione di Medicina del Lavoro, Università di Cagliari,
2 ASL N° 7, Carbonia
RIASSUNTO. Lo studio riporta i valori di dose interna di piombo, di
cadmio e di mercurio osservati in un campione di residenti del comune di
Portoscuso, situato a meno di 2 Km da un importante polo industriale
comprendente anche una fonderia di piombo e zinco, a confronto con i dati
osservati in altri due comuni distanti oltre 20 Km dal polo industriale. I
risultati mostrano che a Portoscuso i livelli ematici ed urinari dei metalli
studiati ed in particolare del piombo, sono, specialmente nelle donne, significativamente
superiori a quanto osservato negli altre due località. Il risiedere
a ridosso del polo industriale di Portoscuso ed in particolare l’assunzione
di vino sfuso di produzione locale e non controllato per il suo
contenuto in piombo, così come il fumo di sigaretta rappresentano i fattori
più rilevanti che spiegano le differenze osservate tra i tre comuni studiati
relativamente alla dose interna di piombo. L’effetto residenza appare rilevante
anche per la dose interna di cadmio, su cui è particolarmente evidente
l’effetto del fumo di tabacco, e per quella di mercurio su cui ha un
ruolo significativo il consumo di pescato locale ed in particolare di tonno.
Parole chiave: piombo inorganico, cadmio, mercurio, inquinamento
ambientale.
ABSTRACT. ENVIRONMENTAL EXPOSURE TO METALS IN AN INDU-
STRIALISED AREA OF SARDINIA, ITALY. Blood lead and cadmium concentration
and urinary cadmium and mercury excretion were analysed in a
sample of inhabitants of Portoscuso, a town less than 2 km from a lead
and zinc smelting works in Sardinia, and were compared to those observed
in a control group of subjects living in two towns located more than
20 km from the industrialised area. Compared to the control group, blood
and urinary levels of the analysed metals, and the blood lead concentrations
in particular, were significantly higher among females in Portoscuso.
In the multivariate analysis of individual data, living near the lead and
zinc smelting works and particularly the consumption of local home-made
wine, as well as cigarette smoking, were found to be the main factors
underlying increases in the blood lead levels. Living in Portoscuso together
with cigarette smoking were found to be the main factors causing
increases in individual blood and urinary levels of cadmium, while urinary
mercury was strictly dependent on the consumption of locally caught
fish, particularly tuna.
Key words: inorganic lead, cadmium, mercury, environmental pollution.
Introduzione
Dai risultati di numerose indagini (1-3) svolte a più riprese
nel territorio del centro abitato di Portoscuso e frazioni limitrofe
appare evidente il rilevante impatto ambientale, dell’attività delle
principali industrie primarie insediate nel polo di Portovesme
con particolare riguardo all’inquinamento da metalli pesanti.
Le sorgenti di inquinamento sono costituite dai camini degli
stabilimenti e dalle aree di stoccaggio e movimentazione delle
materie prime (operazioni di scarico dalle navi, abbancamento
sul molo, carico e trasporto su autoarticolati) e delle scorie ubicate
sia all’interno degli stessi stabilimenti che in discariche o bacini
di decantazione. I metalli pesanti si ritrovano come componenti
del particolato aerodisperso e tendono a depositarsi sulle
superfici del terreno o dei vegetali e quindi nella catena alimentare.
Il carico inquinante da metalli, ed in particolare da piombo,
derivante dal traffico automobilistico nell’area di Portoscuso è da
considerare meno importante rispetto a quello derivante dalle
sorgenti industriali.
Il presente studio è complementare alle indagini ambientali
svolte in questa area industriale nei comparti aria, acqua e suolo ed
è basato sull’analisi della dose interna di alcuni metalli (Piombo,
Cadmio e Mercurio) in un campione di adulti della popolazione generale
non professionalmente esposta a metalli residente nel comune
di Portoscuso, situato a meno di 2 chilometri dal polo industriale
di Portovesme, a confronto con gruppi di controllo residenti
in altri due comuni distanti circa 20 Km dal polo industriale.
Materiali e metodi
Gli accertamenti comprendevano:
a) un prelievo di sangue venoso per la determinazione dei valori
ematici di piombo (PbE µg/dl), di cadmio (CdE µg/dl) e dei
valori dell’ALA-Deidratasi (ALAD mu/ml eritrociti);
b) la raccolta di un campione di urine per la determinazione dell’escrezione
urinaria di cadmio (CdU) e di mercurio (HgU) i
cui valori sono stati espressi in unità di concentrazione per
grammo di creatinina (µg/g di creatinina), contestualmente
misurata sullo stesso campione di urine;
c) l’applicazione di un questionario per la rilevazione di informazioni
sulle abitudini di vita (fumo, alcol, consumo di vino sfuso
di produzione locale, dieta prevalente, consumo di pesce, hobbies),
sulla storia occupazionale, sulle caratteristiche abitative.
Le determinazioni di PbE, CdE e CdU sono state effettuate
mediante spettrofotometro in assorbimento atomico (VARIAN
SpectrAA-300) fornito di fornetto di grafite (Zeeman GTA), autocampionatore
e lampade a catodo cavo specifiche. Il mercurio
nelle urine è stato determinato tramite spettrofotometria di assorbimento
atomico dei vapori freddi di Mercurio (Cold Vapor Atomic
Absorption Spectrometry, CVAAS). L’ALAD è stata determinata
con metodo colorimetrico ed i valori sono stati espressi in
milliunità per ml di eritrociti.
Per l’analisi statistica sono stati utilizzati test non parametrici, il
test T di Student e l’analisi della varianza per il confronto tra gruppi
e tecniche di regressione multipla e logistica stepwise per valutare la
relazione tra gli indicatori biologici di dose ed il fattore residenziale,
controllando per l’età, il fumo di sigaretta, il consumo di alcol, e per
variabili categoriche desunte dall’analisi del questionario.
Risultati
La popolazione studiata comprende 212 soggetti di età compresa
tra i 18 e gli 88 anni, 102 femmine (età media 47,5 + 11,9)
e 110 maschi (età media 48,2 + 11,1) di cui 108 residenti stabilmente
a Portoscuso (70 femmine e 38 maschi), 53 residenti a S.
Antioco (18 femmine e 35 maschi) e 51 residenti a Villaperuccio
(14 femmine e 37 maschi). All’interno di ciascun campione studiato
l’età è risultata confrontabile tra femmine e maschi, così come
non si sono osservate sostanziali differenze di età tra i residenti
di Portoscuso e il gruppo di controllo. La prevalenza degli ex fumatori
e dei fumatori è risultata in ciascun gruppo decisamente
più elevata tra gli uomini così come più elevato risulta il valore
medio dell’indice cumulativo di fumo espresso come Pacchetti-

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Anni (P-A). Il consumo di vino sfuso prodotto localmente in proprio
risulta in modo statisticamente significativo più frequente tra
i residenti a Villaperuccio ed in particolare tra gli uomini, che riferivano
tale abitudine nel 56.8% dei casi intervistati.
Nella Tabella I si possono osservare i valori centrali ed il range
della piombemia e dell’ALAD rilevati nei tre gruppi analizzati,
separatamente per le donne e gli uomini. All’interno di ciascun
gruppo le differenze tra i due sessi sono risultate statisticamente
significative: PbE più basso ed ALAD più elevato nelle donne rispetto
agli uomini.
Nel complesso dei casi i valori individuali di ALAD sono risultati
ben correlati con i valori di piombemia (r: 0,51, P

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
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Il consumo di vino sfuso locale non influenza statisticamente
la significatività del modello che nel complesso spiega il 45% della
varianza totale dei valori individuali di tale parametro (P

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ABSTRACT. IODIOCYCLOPHOSPHAMIDE AS A POSSIBLE INTERNAL
STANDARD IN THE ANALYSIS OF ANTINEOPLASTIC DRUGS USING MASS SPEC-
TROMETRY. Cyclophosphamide is one of the most widely used antineoplastic
agents in therapy and the evaluation of occupational exposure requires
the dosage of the molecule in complex matrices. An internal standard
is necessary for quantitative analysis in order to obtain analytical results
which are free from errors in the processing phases. This study
shows the synthesis and characterization of mono- and di-iodiocyclophosphamide,
which are suggested as optimal internal standards. The results
show that both the molecules have the same instrumental behaviour of the
analyte. Therefore, monoiodide is particularly suitable for LC/MS analysis,
while diiodide is appropriate for GC/MS analysis.
Key words: iodiocyclophosphamide, internal standard, antineoplastic
drugs, mass spectrometry.
Introduzione
La valutazione dell’esposizione professionale a ciclofosfamide
(CP), farmaco antiblastico largamente adoperato in terapie tumorali,
prevede il dosaggio della molecola tal quale in matrici
complesse (1, 2). Dopo estrazione, gli analiti sono rivelati mediante
cromatografia liquida/spettrometria di massa (LC/MS) (3)
oppure, previa derivatizzazione, in gas cromatografia/spettrometria
di massa (GC/MS) (4, 5). La quantificazione prevede l’uso di
standard interni che rendano i risultati indipendenti da qualsiasi
errore di processamento. Attualmente, in alternativa alla ciclofosfamide
deuterata (standard interno ottimale ma molto costoso)
sono state proposte due molecole: ifosfamide (IP) e trofosfamide
(TP). L’IP, usata anche come farmaco antitumorale in terapie pediatriche,
è essa stessa fonte di inquinamento ambientale e di potenziale
assorbimento da parte dell’operatore durante l’allestimento
del farmaco; la TP, pur essendo strutturalmente simile alla
CP, mostra diverse proprietà chimico-fisiche: scarsa solubilità
in acqua e differente comportamento cromatografico. Inoltre, non
avendo funzioni nucleofile libere, non risulta derivatizzabile;
quindi, l’analisi GC/MS non è ottimale, in quanto non tiene conto
della resa di reazione. La ricerca di uno standard interno adatto
al dosaggio della CP ha determinato la necessità di sintetizzare
una molecola strutturalmente analoga alla ciclofosfamide, sostituendo
uno o più atomi di cloro presenti nella molecola con un
altro alogeno: qui è riportata la sintesi e la caratterizzazione di ciclofosfamide
mono e diiodurata (CPI e CPI 2 ).
Figura 1. Spettri di massa LC/MS full scan. a) ciclofosfamide; b) ciclofosfamide monoiodurata; c) ciclofosfamide diiodurata.
Spettri di massa degli ioni prodotto derivanti dalla frammentazione degli ioni quasi molecolari della ciclofosfamide (d); ciclofosfamide
monoiodurata (e); ciclofosfamide diiodurata (f)
Metodi
La iodurazione della ciclofosfamide é stata condotta facendo
reagire la CP con ioduro di sodio in diversi rapporti stechiometrici
(1:4, 1:10) per 4h a 55°C. Dopo allontanamento del solvente di
reazione, il residuo è stato estratto adoperando solfato di sodio come
agente essiccante e la miscela di sintesi purificata in cromatografia
a fase inversa con una colonna C 18 . Le frazioni relative ai
prodotti di reazione (CP, CPI, CPI 2 ) sono state raccolte ed analizzate
in LC/MS (direttamente) e GC/MS (previa derivatizzazione
degli analiti con anidride eptafluorobutirrica), e mediante colonna
capillare di uso generale. Entrambe le analisi hanno previsto l’utilizzo
di spettrometri di massa a trappola ionica dotati di sorgenti
di ionizzazione electrospray ed elettronica, rispettivamente.
Risultati
Gli spettri di massa fullscan relativi all’analisi LC/MS presentano,
per gli ioni quasi molecolari della CP e della CPI, la tipica intensità relativa
dei picchi isotopici, dovuta alla presenza di atomi di cloro nella
struttura, rispecchiandone l’abbondanza naturale; la CPI 2 , priva di cloro,
dà luogo ad un unico segnale. Gli spettri di massa tandem mostrano
un’analogia tra le tre molecole (perdita di 28 Da dallo ione quasi molecolare);
tuttavia, la CP e la CPI presentano una netta similitudine. Al
contrario, la CPI 2 mostra uno spettro di massa degli ioni prodotto dif-

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
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Figura 2. Ionizzazione elettronica. Spettri di massa full scan di ciclofosfamide (a); ciclofosfamide monoiodurata (b); ciclofosfamide
diiodurata (c). Analisi EI/MS 2 . Spettri di massa degli ioni prodotto. Ioni precursori: d) ciclofosfamide: [M-CH 2 Cl] + ,
m/z 407 e 409; e) ciclofosfamide monoiodurata: [M-I] + , m/z 421 e 423; f): ciclofosfamide diiodurata: [M-I] + , m/z 513
ferente (Figura 1). Nell’analisi GC/MS la ciclofosfamide dà luogo ad
un frammento corrispondente alla perdita di un radicale clorometilico
dalla molecola. La CPI e la CPI 2 frammentano in maniera analoga; tuttavia,
la monoiodurata contiene, nella propria struttura due alogeni diversi;
quindi, perde sia un radicale clorometilico sia uno iodometilico,
originando due frammenti a diversi valori di m/z. Inoltre, la presenza
dello iodio influenza la frammentazione; pertanto, entrambe le molecole
subiscono ulteriori processi di frammentazione con perdita di radicali
iodoetilici e, nel caso della monoiodurata, anche cloroetilici. La
monoiodurata presenta, quindi, rispetto alla diiodurata, un elevato numero
di frammenti ionici. Gli spettri di massa tandem mostrano in tutti
e tre i casi perdita di 195 Da con formazione dei frammenti contenenti
un atomo di cloro e/o un atomo di iodio. CPI e CPI 2 , inoltre, formano
ulteriori segnali dovuti a processi di riarrangiamento (Figura 2).
Discussione
In teoria la sostituzione di uno o più atomi di cloro presenti
nella molecola di ciclofosfamide con un altro alogeno dovrebbe
portare alla formazione di strutture del tutto analoghe, senza mutare
in maniera rilevante le proprietà chimico-fisiche dell’analita.
Fra gli alogeni, è stato scelto lo iodio, in quanto la iodurazione è
di facile realizzazione e poco costosa; quindi, consente una semplice
e rapida preparazione del prodotto da adoperare quale standard
interno in analisi routinarie di monitoraggio. Entrambi i prodotti
iodurati ottenuti hanno la maggior parte dei requisiti necessari
alla definizione di standard interno; infatti, mostrano proprietà
chimico-fisiche di solubilità, reattività e comportamento
cromatografico simili a quelle della ciclofosfamide; sono del tutto
assenti dalle matrici reali, ambientali o biologiche e sono facilmente
sintetizzabili in quantità notevole. Uno standard interno
risulta ottimale quando mostra una risposta strumentale quanto
più possibile analoga a quella dell’analita; la risposta strumentale
è caratterizzata dal pattern di frammentazione (perdita di frammenti
analoghi) e, quindi, dal numero di segnali presenti nello
spettro di massa e dalla loro intensità relativa. Dai risultati si
evince che: la CPI può essere ottimale per analisi condotte mediante
LC/MS; la CPI 2 qualora si utilizzino tecniche di GC/MS.
Bibliografia
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COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
44 www.gimle.fsm.it
D. Cavallo 1 , C.L. Ursini 1 , M. Gismondi 2 , S. Iavicoli 1
Valutazione degli effetti genotossici ed ossidativi indotti su cellule
esfoliate della mucosa orale dall’esposizione ad IPA in lavoratori
operanti nel settore aeroportuale
1 ISPESL, Dipartimento Medicina del Lavoro, Monteporzio Catone, Roma
2 Servizio di Medicina del Lavoro di Aeroporti di Roma, Roma
RIASSUNTO. Il personale operante nel settore aeroportuale è occupazionalmente
esposto a diversi idrocarburi policiclici aromatici (IPA)
prodotti dal combustibile degli aeromobili e dai motori diesel e benzina
dei mezzi operanti sulle piste. Scopo del nostro studio è stato valutare gli
effetti precoci genotossici ed ossidativi in personale aeroportuale professionalmente
esposto a miscele complesse di IPA (n=16) rispetto ad un selezionato
gruppo di controllo (n=12), utilizzando il test del micronucleo
e il Comet test (CT) modificato con l’uso dell’enzima Formamidopirimidin-glicosilasi
(Fpg) su cellule esfoliate della mucosa orale. I risultati
hanno evidenziato nel gruppo degli esposti un più alto valore medio della
frequenza di micronuclei in percentuale (0,080) rispetto ai controlli
(0,071). Il CT modificato con Fpg ha mostrato negli esposti un valore medio
più elevato del tail moment TM (il prodotto della lunghezza della coda
della cometa per la relativa intensità di fluorescenza calcolato su 50
comete scelte random), sia in cellule trattate con l’enzima TMenz (114,52
vs 89,81 dei controlli) (p=0,12) che fornisce un parametro di danno ossidativo
al DNA, sia su cellule non trattate con l’enzima TM (90,22 vs
81,85) (p=0,24) che fornisce un parametro di danno diretto al DNA. La
presenza di danno ossidativo al DNA è stato valutato in ciascun soggetto
considerando il rapporto TMenz/TM. Quando tale rapporto era superiore
a 2 il soggetto era considerato portatore di danno ossidativo. È stata individuata
la presenza di danno ossidativo nel 12,5% dei soggetti esposti rispetto
all’assenza di danno ossidativo nel gruppo di controllo. I risultati
dimostrano l’elevata sensibilità del CT nel valutare il danno precoce sia
diretto che ossidativo al DNA. Inoltre, suggeriscono l’utilizzo delle cellule
esfoliate della mucosa orale, ottenute mediante procedura non invasiva,
per valutare l’esposizione professionale a miscele di sostanze chimiche
inalabili a basse dosi poiché rappresentano il tessuto target per
questo tipo di esposizione ed appare essere un utile strumentoper studiare
popolazioni cronicamente esposte ad IPA.
Parole chiave: Idrocarburi policiclici aromatici, danno ossidativo al
DNA, test del micronucleo, comet test, esposizione professionale.
ABSTRACT. ASSESSMENT OF GENOTOXIC AND OXIDATIVE EFFECTS
IN AIRCRAFT MAINTENANCE WORKERS OCCUPATIONALLY EXPOSED TO
POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS (PAH). Airport personnel are
occupationally exposed, on flight lines and during aircraft routine maintenance
procedures, to several polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH)
produced by jet fuel, diesel fuel or kerosene combustion. The aim of this
study was to evaluate early genotoxic and oxidative effects in airport
personnel (No.=16) occupationally exposed to complex mixtures of
PAH in comparison to a selected control group (No.=12). We used a micronucleus
test and an Fpg modified Comet assay to study early genotoxicity
and oxidative DNA damage on exfoliated buccal cells. The exposed
group showed a higher mean value of micronuclei frequency (%)
with respect to controls (0.080 vs 0.071). For the exposed group, the Fpg
modified Comet test revealed a higher value of mean tail moment TM
(the product of comet relative tail intensity and length, calculated on 50
randomly selected comets) both for enzyme treated cells TMenz (114.52
vs 89.81), which provide a parameter of oxidative DNA damage, and for
cells untreated with enzyme TM (90.22 vs 81.85), which provide a parameter
of direct DNA damage. The presence of oxidative DNA damage
was evaluated in each subject using the TMenz/TM ratio. When this ratio
was higher than 2.0, the subject was estimated to have oxidative
DNA damage. We found the presence of oxidative DNA damage in
12.5% of those exposed with respect to the absence of oxidative damage
of controls. These results demonstrate the high degree of sensitivity
of exfoliated buccal cell for indicating early genotoxic effects of PAH
exposure and confirm the high sensitivity of the Comet assay for assessing
early direct and oxidative DNA damage. The results obtained on
exfoliated buccal cells suggest the use of this sampling, obtained using
a non-invasive procedure, for assessing the occupational exposure to a
mixture of chemicals at low doses since they represent the target tissue
for this exposure and appear to be a useful tool in the study of populations
chronically exposed to PAH.
Key words: polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), DNA oxidative
damage, micronuclei, Comet test, occupational exposure.
Introduzione
I lavoratori operanti nel settore aeroportuale possono essere
esposti durante le attività di rifornimento del carburante, di manutenzione
routinaria degli aeromobili, di operazioni di parcheggio/traino
di aeromobili e di carico-scarico bagagli, a diversi IPA
provenienti dai vapori del combustibile per aerei e dai prodotti di
combustione del carburante così come dalla combustione di motori
diesel e benzina dei mezzi operanti sulle piste utilizzati prevalentemente
nelle operazioni di carico-scarico bagagli. Tale tipo
di esposizione che consiste di miscele complesse di sostanze inalabili
presenti in basse dosi, tra cui alcune notoriamente cancerogene,
non è stata ancora adeguatamente caratterizzata e i pochi
studi presenti in letteratura (1) riguardano prevalentemente l’aviazione
militare che utilizza un diverso tipo di carburante (2).
Il presente lavoro si propone quindi di valutare i potenziali
effetti genotossici precoci dell’esposizione a tali complesse miscele
di IPA mediante l’utilizzo di metodiche molto sensibili quali
il Comet test (CT) (3) modificato con Fpg che consente di valutare
il danno sia diretto che ossidativo al DNA, applicandolo su
cellule di sfaldamento della mucosa orale. Sullo stesso tipo cellulare
è stato inoltre utilizzato il test dei micronuclei per valutare
la possibile specificità di effetto genotossico all’organo bersaglio
nell’esposizione inalatoria di miscele complesse a basse dosi.
Materiali e metodi
Lo studio è stato condotto su 16 lavoratori aeroportuali addetti
alle operazioni di manutenzione degli aeromobili e al carico-scarico
bagagli con età media 46,1 + 8,5 anni e su un gruppo
di controllo (n=12) costituito da personale amministrativo della
stessa struttura con età media 39 ± 6,2 anni. A ciascun soggetto è
stato chiesto il consenso informato e somministrato un questionario
conoscitivo anamnestico. Il test dei micronuclei è stato effettuato
su cellule di sfaldamento della mucosa orale mediante
colorazione con arancio di acridina. È stata quindi calcolata per
ciascun soggetto la frequenza di micronuclei spontanei su almeno
2000 cellule esfoliate. Sullo stesso tipo cellulare è stato valutato
il danno sia diretto che ossidativo al DNA mediante test della
cometa modificato con l’uso dell’enzima Fpg. Tale test prevede
la determinazione mediante uno specifico software del valore
di Tail moment (dato dal prodotto dell’intensità di fluorescenza
per la lunghezza della coda della cometa) su 50 comete per cia-

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
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scun soggetto, sia su cellule trattate con
l’enzima (TMenz), parametro che indica il
danno ossidativo al DNA, sia su cellule non
trattate con Fpg (TM) che indica il danno di
tipo non ossidativo al DNA. Per ciascun
soggetto è stata definita la presenza o meno
di danno ossidativo al DNA in base al valore
del rapporto tra TMenz e TM: se tale rapporto
era >2 il soggetto era definito portatore
di danno ossidativo.
Risultati
I risultati ottenuti hanno evidenziato (Tabella I) un valore significativamente
superiore della frequenza di micronuclei (%)
nelle cellule esfoliate della mucosa orale degli esposti rispetto ai
controlli (0,080 vs 0,071; p= 0,04). Il CT ha evidenziato negli
esposti rispetto ai controlli un incremento del valore medio di tail
moment sia per le cellule trattate con l’Fpg (specifico per le basi
ossidate) TMenz (114,52 vs 89,81) (p= 0,012) sia per le cellule
non trattate con l’Fpg TM (90,22 vs 81,85; p=0,024). Inoltre è stato
evidenziato nel gruppo degli esposti il 12.5% di casi con danno
ossidativo al DNA rispetto all’assenza di danno nei controlli.
Discussione
I risultati ottenuti sembrano suggerire una elevata sensibilità
delle cellule esfoliate della mucosa orale nell’evidenziare danni
di tipo genotossico quali induzione di micronuclei e danno sia
diretto che ossidativo al DNA indotti da sostanze presenti nella
miscela di IPA a cui sono esposti i soggetti in studio, in quanto
rappresentano il primo sito d’interazione delle sostanze inalabili.
Tali risultati mostrano che i test utilizzati rappresentano buoni
indicatori biologici di danno precoce al DNA e potrebbero dare
utili indicazioni in termini di prevenzione e gestione del ri-
Tabella I. Risultati relativi al test del micronucleo (MN) e al comet test (Tail
moment) su cellule di sfaldamento della mucosa orale di personale aeroportuale
schio nell’esposizione professionale a miscele di sostanze potenzialmente
cancerogene. In particolare evidenziano l’elevata
sensibilità del CT nel valutare il danno precoce sia diretto che
ossidativo al DNA.
In conclusione, i risultati di questo studio suggeriscono l’utilizzo
delle cellule esfoliate della mucosa orale, ottenute mediante
procedura non invasiva, per valutare l’esposizione occupazionale
a miscele di sostanze chimiche inalabili a basse dosi poiché
rappresenta il tessuto target per questo tipo di esposizione ed appare
essere un utile strumento per studiare popolazioni cronicamente
esposte ad IPA.
Bibliografia
A. Colombi 1 , F. M. Rubino 1 , M. Buratti 2 , S. Fustinoni 2 , C. Verduci 1 , L. Neri 1 , G. Brambilla 1
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Carcinogenesis 14: 1733-1735, 1993.
Il metabonoma e il metaboloma come indicatori di dose e di effetto
nella moderna tossicologia industriale
1 Dipartimento di Medicina del Lavoro, Clinica ‘L.Devoto’, Università degli Studi di Milano, polo ‘Ospedale San Paolo’
2 Azienda Ospedaliera ‘Istituti Clinici di Perfezionamento’, Milano
RIASSUNTO. Vengono discusse le potenzialità delle moderne tecniche
di indagine biochimica denominate metabonomica e metabolomica
nell’ambito della tossicologia industriale contemporanea, in riferimento
al loro impiego nello studio della relazione che agenti stressori legati ai
mutati stili di vita e di lavoro possono avere nel modificare in senso patologico
le condizioni dei soggetti.
Parole chiave: invecchiamento, metaboliti endogeni, lavoro a turni.
ABSTRACT. METABONOME AND METABOLOME AS DOSE AND EF-
FECT INDICATORS IN CONTEMPORARY INDUSTRIAL TOXICOLOGY. This
paper briefly describes the potential of the metabonomic/metabolomic
approach in present-day industrial toxicology as a tool for studying
the relationship that occupational stressors linked to changed working
and living conditions can have on the health status of exposed
workers.
Key words: ageing, endogenous metabolites, shiftwork.
Introduzione
L’impiego estensivo delle moderne tecniche di chimica e biochimica
analitica e l’introduzione della bio-informatica per l’interpretazione
sinottica dei dati prodotti hanno determinato lo sviluppo
di nuove discipline nell’ambito della farmacologia industriale
ad elevata resa (high-throughput), volte ad identificare
nuovi bersagli farmacologici e potenziali effetti avversi dei candidati
farmaci già sulla base della sperimentazione in vitro. La loro
applicazione si è estesa anche alla biologia cellulare, attraverso
l’impiego estensivo delle tecnologie ‘-omiche’, fondate sull’analisi
differenziale di caratteristiche quali la presenza di eterogeneità
nel DNA cellulare (genomica), della sua trascrizione in
RNA (trascrittomica), della biosintesi delle proteine (proteomica)
ed infine del metabolismo cellulare (metabonomica) (1).

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Metabonomica, metabolomica e tossicologia industriale.
L’approccio metabonomico misura l’entità della perturbazione
indotta sull’insieme dei processi metabolici di un sistema biologico
da parte di agenti chimici endogeni o xenobiotici o da stimoli
fisici. Queste informazioni vengono desunte dal confronto,
effettuato mediante analisi multivariata, delle concentrazioni di
un numero molto elevato di prodotti del metabolismo cellulare di
base ed intermedio, in funzione dell’entità dello stimolo applicato
e del suo variare nel tempo. Ciò consente di esprimere indicatori
sinottici di effetto, in funzione della variazione dose-dipendente
del livello non di un singolo prodotto (o gruppo di prodotti
biochimicamente omogenei), come nell’approccio tradizionale
(2), ma del complesso dei prodotti del metabolismo cellulare, il
cui funzionamento è influenzato, in verso inibitorio o stimolatorio,
dalla dose dell’agente tossico considerato.
L’approccio metabonomico non si limita tuttavia allo studio
delle modificazioni del metabolismo di base, ma si estende anche
alle modificazioni indotte nella funzionalità delle strutture biologiche
dai mutamenti nella loro composizione o struttura chimica
(ad es., delle membrane cellulari: lipidomica; localizzazione intracellulare
delle proteine: glicomica) e ai processi di modulazione
dell’attività enzimatica e recettoriale posti in evidenza attraverso
le modificazioni post-traduzionali delle proteine (fosforilazione,
prenilazione, tiolazione, formazione non-enzimatica di addotti
covalenti: proteomica post-traduzionale).
L’approccio metabolomico rappresenta un settore specializzato
della metabonomica e identifica la griglia completa dei
prodotti di biotrasformazione, di norma dello xenobiotico cui il
sistema biologico è esposto. I livelli assoluti e i rapporti quantitativi
dei suoi metaboliti rispecchiano, in funzione della dose e
del tempo, la presenza di genotipi mutanti a maggiore o minore
efficienza catalitica degli enzimi responsabili delle singole tappe
della biotrasformazione: il ruolo del metaboloma nella moderna
tossicologia industriale risulta pertanto duplice, in quanto
esprime un indicatore sinottico sia di dose sia, in termini parziali,
di suscettibilità.
Da questo punto di vista, il ruolo delle nuove discipline ‘omiche’
nell’ambito della tossicologia industriale è ancora, in
larga misura, confinato all’epidemiologia molecolare, che studia
l’influenza delle differenze individuali dei geni codificanti
gli enzimi del metabolismo di prima e seconda fase sulla dose
biologicamente attiva degli xenobiotici, con lo scopo di prevedere,
a parità di dose assorbita, il maggiore o minore rischio di
comparsa di malattia associato al possesso, da parte del singolo
soggetto, di geni che codificano enzimi con funzionalità ridotta
o aumentata (tossicogenomica), ovvero, nei termini della tossicologia
tradizionale, all’esistenza della suscettibilità individuale
(3, 4). Nei termini della relazione globale tra la dose esterna
(concentrazione ambientale dell’agente lesivo) e gli eventi ad
essa causalmente correlati (intesi come dose interna biologica-
mente efficace; entità / frequenza degli effetti biologici reversibili
ed effetti dannosi conseguenti), il ricorso alla tossicogenomica
può concorrere nel definire solo in parte l’entità della dose
interna (approccio metabolomico), ma non la natura e l’entità
delle modificazioni che, a livello individuale, l’esposizione
all’agente chimico provoca nella fisiologia cellulare (approccio
metabonomico).
L’utilità di impiegare l’approccio metabonomico/metabolomico
nella tossicologia industriale risiede nella possibilità di
prendere in esame effetti multipli, derivanti dall’esposizione dell’organismo
umano a stimoli di natura eterogenea, non necessariamente
esprimibili in funzione di un singolo agente chimico caratterizzato
in termini molecolari.
Conclusioni
Le peculiari caratteristiche dell’approccio metabolomico/metabonomico
lo rendono applicabile ai numerosi problemi
che il mutamento degli scenari lavorativi pone alla Medicina
del Lavoro, caratterizzati più che dall’esigenza di prevenire gli
effetti lesivi conseguenti all’esposizione a singoli xenobiotici
di origine industriale o alle ‘basse dosi’ di agenti chimici dotati
di proprietà cancerogene o neurotossiche, dalla necessità di
promuovere la salute in collettività lavorative il cui invecchiamento
fisiologico deve essere procrastinato dalla necessità di
prolungare nel tempo il loro ruolo sociale. In questo caso, l’esposizione
alle sostanze lesive è quella che consegue ai composti
naturalmente originati dal metabolismo umano e della
flora batterica simbionte nelle diverse condizioni determinate
dagli eventi fisiologici del ciclo di vita umano, dalle abitudini
di vita dei singoli soggetti e da condizioni lavorative stressanti
o fisiologicamente anomale, quali il lavoro a turni, che la
moderna organizzazione sociale rende inevitabili ed il cui ruolo
nel mantenimento dello stato di salute è ora indagabile con
approcci integrati e globali.
Bibliografia
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G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 47
C. Colosio1 , S Birindelli1 , L. Campo2 , S. Fustinoni2 , G. De Paschale3 , M. Tiramani1 , S. Visentin1 , M.Maroni1, 4
Monitoraggio biologico dell’esposizione professionale a mancozeb
in agricoltura
1 International Centre for Pesticides and Health Risk Prevention, Azienda Ospedaliera L. Sacco, Polo Universitario, Milano
2 Dipartimento di Medicina del Lavoro, Milano
3 Azienda Sanitaria Locale di Pavia
4 Università degli Studi di Milano
RIASSUNTO. Questo studio, condotto per misurare i livelli di
escrezione urinaria di etilentiourea (ETU) in un gruppo di 46 agricoltori
esposti a mancozeb e in 36 controlli, ha mostrato un incremento significativo
della concentrazione urinaria di ETU nei campioni raccolti a fine
turno (mediana: 10 µg/g creatinina). I livelli basali dei lavoratori e i controlli
non hanno mostrato differenze, con valori mediani inferiori a 1 µg/g
creatinina. Le esposizioni più elevate sono state osservate negli assistenti
degli elicotteristi, negli addetti all’applicazione con trattore aperto e
negli addetti al rientro.
Parole chiave: mancozeb, etilentiourea urinaria, esposizione professionale
ABSTRACT. BIOLOGICAL MONITORING OF OCCUPATIONAL EXPOSU-
RE TO MANCOZEB IN AGRICULTURE. This study, carried out to measure the
levels of urine excretion of ethylenethiourea (ETU) in a group of 46 agricultural
workers exposed to mancozeb and 36 controls, has shown a statistically
significant increase of ETU excretion in workers, after the
workshift (median: 10 µg ETU/g creatinine); baseline determinations in
workers and controls did not show any statistically significant difference,
with median values less than 1 µg ETU/g creatinine. The highest levels
of exposure were observed, respectively, in helicopter assistants, tractor
applicators and re-entry workers.
Key words: mancozeb, ethylenthiourea excretion, occupational exposure.
Introduzione
I fungicidi etilenbisditiocarbammati (EBDC) subiscono un
metabolismo complesso, con principale produzione di etilentiourea
(ETU), alla quale sono state attribuite, nel modello sperimentale,
proprietà cancerogene e teratogene (1). Gli effetti
cancerogeni sono conseguenti all’inibizione della sintesi di ormoni
tiroidei, con iperincrezione di TSH e gozzo, talora evolvente
in neoplasia (2). In lavoratori esposti sono state sporadicamente
osservate alterazioni tiroidee, ma non neoplasie (2, 3).
Recentemente, la IARC ha rivalutato l’ETU, trasferendola da
classe 2B a classe 3, poiché gli effetti can-
cerogeni osservati erano conseguenti ad
una peculiare suscettibilità dei roditori e insorgevano
solo per dosi gozzigene (2). Dato
che l’ETU viene prevalentemente escreta
con le urine, è stata proposta come indicatore
per il monitoraggio biologico dell’esposizione
ad EBDC (4, 5). Scopo dello
studio è stato misurare i livelli di esposizione
ad un EBDC, il mancozeb, di un gruppo
di viticoltori dell’Oltrepò Pavese, impegnati
in diverse mansioni tipiche.
Materiali e metodi
Lo studio è stato condotto su 46 viticoltori
e 36 controlli. Tra i lavoratori, che prestavano
la loro opera in 11 aziende agricole e
4 basi di elicotteri, 2 svolgevano attività di pesatore, 18 erano trattoristi,
18 addetti al rientro, e 8 erano elicotteristi (piloti e “uomini
a terra”). Per ogni lavoratore è stato raccolto un campione di urine
prima dell’inizio della campagna di applicazioni; un secondo campione
è stato raccolto al mattino del giorno di lavoro successivo all’ultima
applicazione della stagione, mentre un solo campione è
stato raccolto nei soggetti di controllo. I campioni sono stati congelati
subito dopo la raccolta. L’analisi è stata effettuata in GC-MS
con detector ad impatto di elettroni (5), con limite di rilevabilità di
0,5 µg/g creatinina. L’analisi statistica dei risultati è stata realizzata
utilizzando il programma “SPSS per Windows”.
Risultati e Discussione
Le concentrazioni urinarie di ETU a fine-turno erano significativamente
più elevate sia rispetto ai campioni basali, sia rispetto
ai controlli; questi ultimi non mostravano valori di concentrazione
urinaria di ETU significativamente diversi da quelli basali
dei lavoratori (Tabella I). I valori di escrezione urinaria di ETU
(post esposizione), suddivisi per mansione, illustrati in Tabella II,
mostrano che le mansioni comportanti i livelli di esposizione più
elevati sono quelle di “uomo a terra”, assistente dell’elicotterista,
e trattorista. Per quanto concerne quest’ultimo gruppo, l’elaborazione
dei dati ha mostrato i livelli più elevati nei trattoristi che
hanno fatto uso di trattori aperti, mentre i soggetti equipaggiati
con trattore condizionato non hanno mostrato livelli di concentrazione
urinaria di ETU più elevati dei controlli. Anche gli addetti
ad attività di rientro sono risultati esposti a mancozeb.
Conclusioni
L’indagine ha portato a conclusioni significative: in particolare,
la concentrazione urinaria di ETU si conferma un buon in-
Tabella I. Escrezione urinaria di ETU negli agricoltori e nei controlli
(µg/g creatinina)
Tabella II. Livelli di escrezione urinaria di ETU nei diversi gruppi di lavoratori,
a fine turno (µg/g creatinina)

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
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dicatore di dose per il monitoraggio biologico dell’esposizione
professionale ed ambientale a mancozeb, ed il suo impiego potrà
a breve essere introdotto in attività di sorveglianza sanitaria condotte
su base routinaria. Dati preliminari ottenuti da altri nostri
studi suggeriscono che i valori di riferimento per questo indicatore
possono essere indicativamente compresi tra 1,21 - 1,54 µg/g
creatinina (95%, intervallo di confidenza), con valori al 95° percentile
di 3,84-6,2 µg/g creatinina (95%, intervallo di confidenza).
Le attività di applicazione di antiparassitari connesse alla
coltura della vite comportano esposizione dei lavoratori addetti.
Tra questi, l’”uomo a terra” che assiste l’elicotterista preparando
le miscele, mostra i livelli di esposizione più elevati. Tale dato
può essere attribuito all’elevato numero di miscelazioni effettuato
in una giornata ed all’impiego di miscele più concentrate rispetto
a quelle destinate all’applicazione a terra. Per quanto concerne
i trattoristi, i livelli di esposizione dipendono in modo pressoché
esclusivo dal tipo di trattore impiegato, risultando non significativamente
diversi da quelli dei controlli negli utilizzatori
di trattore chiuso e condizionato. Anche gli addetti alle attività di
rientro possono essere esposti: tale dato indica la necessità di verificare
con attenzione i tempi di rientro, e di dotare questi soggetti
di guanti protettivi. I dati raccolti da questa indagine po-
tranno essere utilizzati nella definizione di “profili di esposizione/rischio”
per i viticoltori.
Bibliografia
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3rd international IUPAC congress on pesticide chemistry, Helsinki,
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A. Cristaudo 1 , R. Foddis 1 , A. Vivaldi 1 , R. Buselli 1 , V. Gattini 1 , G. Guglielmi 1 , F. Cosentino 1 , F. Ottenga 1 , E. Ciancia 2 ,
R. Libener 3 , R. Filiberti 4 , M. Neri 4 , P.G. Betta 3 , M. Tognon 6 , L. Mutti 5 , R. Puntoni 4
Studio del ruolo combinato dell’amianto e di SV40 nella patogenesi
del mesotelioma maligno
1 Dipartimento di Endocrinologia e Metabolismo, Ortopedia e Traumatologia, Medicina del Lavoro, Università di Pisa
2 Servizio di Anatomia Patologica, Ospedale S.Chiara, Pisa
3 Dipartimento di Oncologia, unità di Patologia, Azienda Sanitaria Ospedaliera, Alessandria
4 Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Unità Epidemiologia ambientale, Genova
5 Ospedale S.Pietro e Paolo, ASL 11 Borgosesia e S.Maugeri Fondazione di Ricerca e Cura, Pavia
6 Dipartimento di Morfologia e Embriologia, Sezione di Istologia ed Embriologia, Università di Ferrara
RIASSUNTO. Sono riportati i dati preliminari di uno studio casocontrollo
condotto su 11 mesoteliomi maligni (MMs) e 18 uroteliomi della
vescica (BUs). Sequenze di DNA del Simian Virus 40 (SV40) sono state
riscontrate in 7 MMs (63,6%) e in 6 BUs (33,3%). Una esposizione ad
amianto è stata accertata in 8 pazienti con MM (72,7%) ed in 4 con BU
(22,2%). Nel nostro studio, l’associazione tra SV40 e MM risultava positiva
quando valutata nell’ambito dell’intera popolazione in studio (OR
9,0; CL 0,5-143,8), ma non quando era valutata tra i pazienti senza esposizione
ad amianto (OR 0,9; CL 0,06-12,5). L’associazione tra amianto ed
MM era chiaramente positiva se valutata nell’intera popolazione in studio
(OR 9,3; CL 1,6-52,7). La forza di tale associazione era ancora più alta
se valutata nel gruppo dei pazienti SV40 positivi (30,0; CL 1,4-611,8).
I risultati del nostro studio suggeriscono che l’SV40 giuochi un ruolo come
cofattore dell’amianto nella patogenesi del MM.
Parole chiave: SV40, asbesto, mesotelioma maligno.
ABSTRACT. STUDY OF THE COMBINED ROLE OF ASBESTOS AND
SV40 IN THE PATHOGENESIS OF MALIGNANT MESOTHELIOMA. The preliminary
results of a case-control study on asbestos exposure and SV40 in
11 malignant mesotheliomas (MMs) and 18 bladder urotheliomas (BUs)
are reported. SV40 DNA was found in 7 (63.6%) MMs and in 6 (33.3%)
BUs. A history of asbestos exposure was established in the cases of 8 MM
patients (72.7%) and 4 BU patients (22.2%). In our small scale study,
SV40 was positively associated with MMs from asbestos-exposed patients
(OR 9.0, CL 0.5-143.8), but not with MMs from patients without
asbestos exposure (OR 0.9, CL 0.06-12.5). The association between asbestos
and MM in the whole population under study was clearly positive
(OR 9.3, CL 1.6-52.7) and the strength of the association was higher
when evaluated for SV40-positive MMs (30.0, CL 1.4-611.8). Our study
suggests that SV40 plays a role as a co-factor with asbestos in MM pathogenesis.
Key words: SV40, asbestos, malignant mesothelioma.
Introduzione
Nonostante la frequente associazione con una pregressa
esposizione ad asbesto, il cui ruolo eziopatogenetico è indiscusso,
solo una relativamente piccola frazione di esposti sviluppa un
mesotelioma maligno (MM) (1). Questa osservazione associata
alla tipica lunga latenza (2) del MM suggeriscono, così come per
molti altri tumori, un’evoluzione multistadiale ed una patogenesi
multifattoriale.
Negli ultimi anni, numerosi sono stati gli studi mirati ad individuare
potenziali co-fattori dell’asbesto. L’individuazione di
fattori di rischio che possano identificare più precisamente gruppi
di persone a maggior probabilità di sviluppare un MM sia nell’ambito
degli ex esposti ad amianto, che rappresentano sicuramente
la maggior parte dei soggetti a rischio, ma anche nel gruppo
dei non esposti che pure svilupperanno un MM è divenuto l’obiettivo
di diversi gruppi di ricerca.
Da circa dieci anni un virus chiamato Simian Virus 40
(SV40) si è guadagnato credibilità scientifica come potenziale

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
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agente co-cancerogeno dell’amianto (3-6). SV40 è un virus a
DNA appartenente ai Polyomavirus, sottogruppo della famiglia
Papovavirus. Il suo genoma codifica due oncoproteine, il Large T
antigen (Tag) e lo Small t antigen (tag), che sono responsabili di
numerose attività intracellulari orientate verso la perdita del controllo
cellulare e l’acquisizione di una capacità replicativa tipica
dei fenotipi tumorali. Sebbene l’ospite naturale del virus SV40
sia la scimmia, la presenza del virus è stata dimostrata anche nella
specie umana, in alcuni tumori ed in misura minore, in portatori
sani. Numerose sono le evidenze biologiche a favore di un
ruolo eziopatogenetico dell’SV40 nello sviluppo del MM (biologia
molecolare e esperimenti su animali) (3,7,8). L’epidemiologia
classica, invece, non ha ad oggi fornito dati univoci sul ruolo dell’SV40.
Alcune difficoltà intrinseche all’argomento come la lunga
latenza naturale della malattia e l’inevitabile imprecisione nella
definizione dei soggetti esposti ad SV40, sulla base di un presunto
contatto con vaccini contaminati dal virus possono spiegare
i risultati di questi studi.
Il presente lavoro presenta i risultati di uno studio basato su
un approccio combinato di epidemiologia biomolecolare mirato a
valutare l’associazione fra esposizione ad amianto e SV40 nel determinismo
del MM.
Materiali e metodi
Sono stati reclutati 11 casi di MM (37,9%) e 18 controlli di
urotelioma (62,1%) della vescica (BU). Casi e controlli non differivano
significativamente per età media alla diagnosi (69,2 anni,
DS +/- 12,9 per i casi; 71,3 anni, DS +/- 9,2 per i controlli),
né per distribuzione di sesso: i casi erano 8 maschi (72,7%) e 3
femmine (27,3%) ed i controlli erano 15 maschi (83,3%) e 3
femmine (16,7%). Il protocollo per l’estrazione del DNA, l’amplificazione
di un segmento della regione regolatrice (R.Reg.) virale
e le metodiche di visualizzazione dell’amplificato sono descritte
in letteratura (9).
Informazioni dettagliate su esposizioni occupazionali o non
ad asbesto sono state acquisite attraverso un questionario specifico
somministrato telefonicamente ai pazienti, quando possibile, o
a stretti familiari, qualora il paziente fosse deceduto. La classificazione
dell’esposizione ad amianto è stata effettuata in accordo
con i criteri adottati da alcuni Registri Regionali del Mesotelioma
ed approvati dall’ISPESL. Attraverso l’elaborazione statistica
è stata valutata sia indipendente che in combinazione l’associazione
tra amianto/SV40 ed il MM (software statistico EpiInfo
versione 3.2, CDC, Atlanta, USA).
Risultati
La Tabella I riporta la numerosità dei MM e dei BU nei casi
considerati, in presenza o in assenza rispettivamente di SV40 e
dell’esposizione ad amianto. La tabella
riporta inoltre l’OR calcolato
sull’associazione fra Sv40 e amianto
nei MM rispetto ai BU.
Dalla Tabella I si nota che sequenze
di DNA della Regione Regolatrice
di SV40 sono state riscontrate
in 7 MM (63,6%) e in 6 BU (33,3%).
Una esposizione ad amianto è stata
accertata in 8 pazienti con MM
(72,7%) ed in 4 con BU (22,2%). Nel
nostro studio, l’associazione tra SV40
e MM risultava positiva quando valutata
nell’ambito dell’intera popola-
zione in studio (OR 9.0; CL 0,5-143,8), ma non quando era valutata
tra i pazienti senza esposizione ad amianto (OR 0,9; CL 0,06-
12,5). L’associazione tra amianto ed MM era chiaramente positiva
se valutata nell’intera popolazione in studio (OR 9,3; CL 1,6-
52,7). La forza di tale associazione era ancora più alta se valutata
nel gruppo dei pazienti SV40 positivi (OR 30,0; CL 1,4-611,8).
Discussione e Conclusioni
L’amianto è indiscutibilmente il principale fattore eziologico
del MM. Fino ad oggi, il ruolo dell’SV40 non è mai stato
confermato da dati epidemiologici. Dal 1994 più di 50 laboratori
indipendenti in vari paesi del mondo hanno riportato la presenza
di SV40 in campioni di MM e dato conferme sul ruolo
dello stesso nella patogenesi del MM. Alcuni degli autori del
presente lavoro sono stati i primi in Europa a riscontrare DNA
virale nei MM. La misura (o quantificazione) di una associazione
rappresenta un passo importante nell’investigazione sul
rapporto patogenetico di un fattore con una malattia. L’O.R.
rappresenta una buona stima del rischio relativo e quindi dell’associazione
fra i fattori causali o concausali ed un tumore negli
studi caso-controllo, soprattutto quando si tratta di una malattia
particolarmente rara.
Il presente lavoro per la prima volta ha permesso di valutare
l’apporto eziologico di SV40 come cofattore dell’amianto. I risultati
della nostra ricerca suggeriscono che l’SV40 non abbia un
ruolo causale diretto nella patogenesi del MM, bensì svolga un
ruolo di fattore concausale in grado di rafforzare notevolmente il
rischio di sviluppare un MM tra i soggetti che abbiano avuto
un’esposizione ad amianto. Molti aspetti della presente ricerca, a
partire dalla numerosità del campione studiato, permettono di
considerare i dati dello studio solo come preliminari. Ciò non toglie
valore ed importanza ai risultati ottenuti e richiama la necessità
di approfondire lo ricerca sull’interazione tra SV40 ed
amianto.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dall’ISPESL. Ringraziamenti per
l’aiuto fornito vanno alla Unità di Epidemiologia Occupazionale ed Ambientale
del CSPO di Firenze.
Bibliografia
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Tabella I. Numerosità dei MM e dei BU in rapporto a SV40 e all’esposizione
all’asbesto e relativi OR

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Neurotrasmettitori nelle vie aeree: caratterizzazione farmacologica del
sistema non adrenergico non colinergico inibitorio nella trachea di cavia
1 Dipartimento di Medicina Preventiva Occupazionale e di Comunità, Università degli Studi di Pavia
2 Dipartimento di Scienze Fisiologiche e Farmacologiche, Università degli Studi di Pavia
3 Dipartimento di Medicina Interna e Terapia Medica, Università degli Studi di Pavia
RIASSUNTO. È stato caratterizzato il ruolo di ossido nitrico (NO),
polipeptide intestinale vasoattivo (VIP), ATP e monossido di carbonio
(CO) nel rilasciamento neuromediato indotto dalla stimolazione elettrica
di campo nella trachea isolata di cavia, valutando le risposte di rilasciamento
prima e dopo il trattamento con inibitori della sintesi o dell’azione
di ciascun mediatore. È stato mostrato un ruolo significativo e quantitativamente
simile del NO e della componente purinergica. Non è stato evidenziato
un ruolo significativo di mediatori peptidici. Il ruolo del CO è
stato evidenziato solo in presenza di blocco delle altre componenti della
risposta. In conclusione, oltre i mediatori considerati più importanti, almeno
altri due mediatori, tra cui l’ATP, o altra sostanza purino-simile, e
il CO, sono implicati nel rilasciamento NANC della trachea di cavia.
Parole chiave: neurotrasmettitori, trachea di cavia, rilasciamento
delle vie aeree.
ABSTRACT. NEUROTRANSMITTERS IN THE AIRWAYS: PHARMACO-
LOGICAL CHARACTERIZATION OF THE NON- ADRENERGIC NON-CHOLINER-
GIC INIBITORY SYSTEM IN GUINEA-PIG TRACHEA. In order to characterize
the role of nitric oxide (NO), vasoactive intestinal peptide (VIP), ATP and
carbon monoxide (CO) in the neurally mediated EFS-induced relaxation
of isolated guinea-pig trachea, we evaluated the relaxing responses before
and after treatment with known blockers of either synthesis or action
of each mediator. The role of NO and ATP was shown to be both significant
and similar. Peptide mediators did not show a significant role. The
role of CO was shown only incases of blockage of the other mediators. In
conclusion, apart from the most well-known mediators, at least two other
mediators, i.e. ATP, or a related purine, and CO, are involved in the
NANC relaxation of guinea-pig trachea.
Key words: neurotrasmitters, guinea-pig trachea, airway relaxation.
Introduzione
Il controllo nervoso non adrenergico, non colinergico
(NANC) regola in maniera importante il tono delle vie aeree (1,
2). Il monossido di azoto (NO) e il polipeptide intestinale vasoattivo
(VIP) sono considerati i principali neurotrasmettitori
delle risposte inibitorie NANC (2, 4). In altri apparati viene attribuito
tale ruolo anche a ATP (5, 7) e monossido di carbonio (CO)
(8, 9), quest’ultimo noto per indurre broncodilatazione in vivo
(10). Il CO è prodotto nei neuroni dalla eme-ossigenasi 2 (HO-2)
(11) e agisce sul muscolo liscio attraverso il sistema della guanilato
ciclasi solubile intracellulare (GCS) (10).
Scopo di questo studio è stato di caratterizzare il ruolo di NO,
VIP, ATP e CO nel rilasciamento neuromediato indotto dalla stimolazione
elettrica di campo nella trachea di cavia.
Materiali e metodi
Preparati in toto di trachea di cavia sono stati mpolipeptide
intestinale vasoattivoontati in un bagno termostatato e ossigenato
e stimolati con treni di impulsi a frequenze da 3 a 10
Hz, in presenza di ioscina. Le risposte di rilasciamento, misurate
come diminuzioni della pressione intratracheale, sono state
valutate prima e dopo il trattamento in vitro con le seguenti
sostanze: alfa-chimotripsina (2 U/ml), che inattiva i mediatori
peptidici, L-NAME (10 -4 M), un inibitore della sintesi di
NO, suramina (10 -4 M), un antagonista dei recettori purinergici,
apamina (10 -7 M), un bloccante dei canali Ca 2+ -dipendenti
del potassio, attivati dall’ATP, zinco-protoporfirina IX (ZnPP
IX) (10 -5 M), un inibitore della HO-2, e 1H-[1,2,4]oxadiazolo-[4,3-a]quinoxalin-1-one
(ODQ) (10 -5 M), un inibitore della
GCS. L’analisi statistica è stata effettuata mediante analisi
della varianza a una e a due vie e mediante test t di Student per
dati appaiati.
Risultati
Il trattamento con L-NAME, apamina e ODQ, somministrati
singolarmente, ha ridotto (p

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
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Discussione e Conclusioni
La riduzione dei rilasciamenti causata da L-NAME e apamina
mostra un ruolo significativo e quantitativamente simile del NO e
della componente purinergica nel rilasciamento neuromediato indotto
dalla stimolazione elettrica di campo nella trachea di cavia. La
componente dovuta al NO appare quantitativamente meno importante
di quanto descritto in precedenza (2, 3) nella stessa specie. Non
sono state invece evidenziate significative componenti dovute a mediatori
peptidici, come mostrato dall’inefficacia dell’alfa-chimotripsina.
Il ruolo della via dipendente dalla HO-2 è stato messo in luce
solo in presenza di blocco delle altre componenti della risposta inibitoria.
Il mediatore implicato è verosimilmente il CO, come suggerito
dai dati sul trattamento combinato con ZnPP IX e con ODQ.
I nostri dati mostrano che il sistema NANC inibitorio nella
trachea di cavia è formato da due componenti principali, identificate
dalla loro sensibilità all’ODQ o all’apamina: una ha come
neurotrasmettitori NO e CO e come secondo messaggero intracellulare
il GMPc, l’altra agisce attraverso l’attivazione di canali
ionici ed ha come neurotrasmettitore un derivato purinico. Una
terza componente, comprendente agenti che abbiano come secondo
messaggero intracellulare l’AMPc, cioè soprattutto VIP e
peptidi correlati, non ha mostrato di avere un ruolo significativo
nel nostro modello sperimentale.
In conclusione, il presente studio mostra che, oltre i mediatori
considerati più importanti, almeno altri due mediatori, tra cui
l’ATP, o altra sostanza purino-simile, e il CO, sono implicati nel
rilasciamento NANC della trachea di cavia. Il CO appare avere
un ruolo in condizioni che riducano l’efficienza delle altre vie di
controllo inibitorio.
Questi dati contribuiscono a chiarire il funzionamento di un
sistema fondamentale di controllo del tono delle vie aeree. Ulteriori
studi potranno valutare un eventuale coinvolgimento differenziale
delle componenti identificate del sistema NANC inibitorio
in condizioni patologiche.
Bibliografia
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Impiego della cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria
di massa per la definizione di valori di riferimento di metaboliti di
solventi in campioni biologici: acido mandelico e acido fenilgliossilico
1 Centro Studi e Ricerche ISPESL, Università di Parma
2 Laboratorio di Tossicologia Industriale, Dip. di Clinica Medica, Nefrologia e Scienze della Prevenzione, Università degli Studi di Parma
RIASSUNTO. Le concentrazioni degli acidi mandelico (AM) e fenilgliossilico
(AFG) sono state determinate nei campioni di urina di 129
soggetti sani non professionalmente esposti a stirene mediante cromatografia
liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem. Le distribuzioni
dei metaboliti dello stirene sono risultate essere log-normali, con
medie geometriche (e deviazioni standard geometriche) pari a 0,443
(2,33) e 0,107 (3,49) mg/g creatinina rispettivamente per AM e AFG. Gli
intervalli di riferimento stimati per AM e AFG sono risultati rispettivamente
0,084-2,339 e 0,009-1,238 mg/g creatinina.
Parole chiave: acido mandelico, acido fenilgliossilico, valori di riferimento,
cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa.
ABSTRACT. USE OF LIQUID CHROMATOGRAPHY-TANDEM MASS
SPECTROMETRY TO DETERMINE REFERENCE VALUES FOR METABOLITES OF
SOLVENTS IN BIOLOGICAL SAMPLES: MANDELIC ACID AND PHENYL-
GLYOXYLIC ACID. Urinary levels of mandelic acid (MA) and phenyl-
glyoxylic acid (PGA) were determined by liquid chromatography-tandem
mass spectrometry in samples from 129 healthy Italian subjects, not occupationally
exposed to styrene (67 men, 37% smokers). The distribution
of styrene metabolites was log-normal. The geometric means (and geometric
standard deviations) of MA and PGA concentrations were 0.443
mg/g creatinine (GSD, 2.34) and 0.107 (GSD 3.49) mg/g creatinine, respectively.
The reference intervals estimated for MA and PGA were
0.084-2.339 and 0.009-1.238 mg/g creatinine, respectively.
Key words: mandelic acid, phenylglyoxylic acid, reference values,
liquid chromatography-tandem mass spectrometry.
Introduzione
Il largo impiego dello stirene nella produzione della gomma
sintetica e di molteplici polimeri e copolimeri, rende probabile

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
52 www.gimle.fsm.it
un’esposizione al solvente della popolazione
generale. In effetti, in alcune città
europee, sono state rilevate concentrazioni
atmosferiche di stirene non trascurabili
più elevate negli ambienti interni
(0,771 µg/m 3 ) rispetto all’esterno (0,296
µg/m 3 ) (1). Le informazioni relative ai
valori di riferimento dei due metaboliti
principali dello stirene, gli acidi mandelico
(AM) e fenigliossilico (AFG), sono
però scarse a causa dell’insufficiente sensibilità e selettività delle
tecniche analitiche comunemente utilizzate per il monitoraggio
biologico dell’esposizione a stirene. Negli anni Ottanta, Elia e
coll. (2) hanno trovato in 34 soggetti della popolazione generale
una concentrazione media di AM di 3,8 mg/g creatinina, determinabile
però solo nel 22% dei casi. Mürer e coll. (3) hanno successivamente
rilevato su 59 soggetti concentrazioni di AM inferiori
al limite di rivelazione (LR, 11 mg/l) nell’80% dei campioni,
con un valor medio di 7,3 mg/g creatinina; negli stessi campioni,
l’AFG è risultato inferiore al LR (5,2 mg/l) nel 66% dei casi,
con un valore medio di 4,3 mg/g creatinina. Recentemente,
l’impiego della cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria
di massa tandem (LC-MS/MS) ha permesso di caratterizzare
l’escrezione di metaboliti coniugati dello stirene nell’uomo, consentendo
inoltre un notevole miglioramento in termini di sensibilità
nella determinazione dei metaboliti principali (4). Scopo del
presente lavoro era l’applicazione di tecniche analitiche basate
sulla spettrometria di massa per la determinazione delle concentrazioni
urinarie di metaboliti di solventi organici, quali lo stirene,
nella popolazione generale.
Materiali e metodi
Soggetti. Il gruppo in studio era costituito da 129 soggetti sani
(67 maschi), di età media 39,1 ± 10,7 anni, non professionalmente
esposti a stirene, reclutati come gruppo di controllo di una
popolazione di addetti alla realizzazione di manufatti in materiale
plastico rinforzato con fibra di vetro. A ciascun soggetto è
stato chiesto di completare un questionario per la raccolta di
informazioni riguardanti sesso, età, abitudine al fumo, consumo
di alcool e di farmaci. Dei soggetti in esame, 48 erano fumatori
e rappresentavano il 42% dei maschi ed il 36% delle femmine,
mentre 72 dichiaravano di bere almeno un bicchiere di vino al
giorno. Il protocollo dello studio è stato approvato dal locale Comitato
Etico.
Monitoraggio biologico. I metaboliti principali dello stirene
(AM e AFG) sono stati determinati mediante cromatografia liquida
accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC-
MS/MS) (3) su campioni estemporanei di urina (10 ml) raccolti
tra le 8:00 e le 9:00 del mattino. Il LR della tecnica ottenuto nella
modalità più sensibile e selettiva, denominata “selected reaction
monitoring” (SRM) è risultato essere 0,010 mg/l per entrambi
gli analiti. L’imprecisione analitica è risultata essere
120) ed
alla loro distribuzione log-normale, i dati sono stati trattati applicando
test parametrici per la stima dei frattili. È stata scelta la
frazione centrale (0,95), poiché tutte le determinazioni cadevano
al di sopra dello “zero analitico”. I valori di riferimento (limiti superiori)
deteminati in questo modo per AM e AFG sono risultati
di circa 20 volte più bassi rispetto a quelli proposti 10 anni fa da
Mürer e coll. per la popolazione danese (3)(31 µmol/mol creatinina
e 20 µmol/mol creatinina), stimati su un numero limitato di
campioni ed applicando test non parametrici (intervallo di tolleranza
unilaterale).
Conclusione
I risultati del presente studio dimostrano come l’applicazione
della cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa
possa essere di rilevante utilità non solo per una migliore caratterizzazione
di esposizioni professionali a basse concentrazioni
ma anche nella determinazione dei valori di riferimento per i
metaboliti di solventi organici.
Bibliografia
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G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
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G.F. Desogus 1 , S. Fois 2 , R. Carta 2 , R. Cantone 3 , C. Usai
Monitoraggio ambientale e biologico dell’esposizione lavorativa
ad anestetici volatili
1 Servizio Qualità, Ambiente e Sicurezza, Azienda USL 7 di Carbonia
2 Servizio Medico competente, Azienda USL 7 di Carbonia
3 Direzione sanitaria, Azienda USL 7 di Carbonia
RIASSUNTO. 56 addetti di sala operatoria sono stati sottoposti a
studio tossicologico e sorveglianza sanitaria per il rischio da esposizione
ad anestetici volatili. Lo studio include l’acquisizione di dati clinicoanamnestici
relativi alla patologia renale, epatica, emopoietica e a livello
del SNC e un monitoraggio ambientale e biologico. L’analisi dei risultati
non dimostra una significativa alterazione dei parametri ematochimici
e dei test neurocomportamentali tra esposti a gas anestetici e controlli.
Nell’esposizione lavorativa ad anestetici volatili diventa una necessità
sperimentare nuovi metodi di valutazione per una corretta ponderazione
del rischio residuo.
Parole chiave: anestetici volatili, monitoraggio ambientale, biomonitoraggio.
ABSTRACT. ENVIRONMENTAL AND BIOLOGICAL MONITORING OF
OCCUPATIONAL EXPOSURE TO VOLATILE ANAESTHETICS. Fifty six operating
theater staff were recruited for a toxicological and health surveillance
study aimed at assessing the risk of exposure to volatile anaesthetics. The
study also aimed to obtain clinical-anamnestic data related to renal, liver,
haematopoietic and central nervous system disorders as well as to conduct
environmental and biological monitoring. The analysis of the results
shows no significant differences in the results of the parameters and of the
neurobehavioural tests among exposed workers and controls. In assessing
the health impact of occupational exposure to volatile anaesthetics, it is
necessary to try out new methods of evaluation of the residual risk.
Key words: volatile anaesthetics, environmental monitoring, biomonitoring.
Introduzione
L’esposizione ad anestetici volatili è un potenziale rischio
per gli addetti alla sala operatoria, essendo note alterazioni a li-
vello del SNC (alterazione dei test neurocomportamentali),
del sistema linfoemopoietico
(ridotta sintesi midollare dei leucociti),
del fegato (aumento di SGOT, SGPT e
γ-GT) e del rene (modifica dei meccanismi
di riassorbimento tubulare) (1, 2, 3, 4). Gli
anestetici volatili hanno un coefficiente di
ripartizione influenzato dalla temperatura,
dall’età e da costituenti plasmatici che formano
legami con i gruppi polari di proteine
ematiche, in particolare con l’albumina. In
questo studio si analizzano gli effetti dell’esposizione
a gas anestetici (N 2 O, sevoflurane,
desflurane) sulla funzione emopoietica,
renale ed epatica in lavoratori
esposti professionalmente.
Metodi
Il campione esaminato era costituito da
35 esposti, Gruppo A [anestesisti e chirurghi:
28 maschi (età media: 47 ± 5 anni;
A.L. 15 ± 6 anni), 17 femmine (e.m.: 43 ±
4; A.L. 11 ± 7)] e 11 non esposti, Gruppo
B [medici di reparto: 8 maschi (età media: 44 ± 6; A.L. 6 ± 5),
3 femmine (età media: 44 ± 5; A.L. 12 ± 7)]. Nei periodi corrispondenti
alla fascia A (periodo di esposizione 1998-2000) e B
(2001-2004, dopo attuazione di misure di adeguamento di componenti
impiantistiche ed organizzative) è stato eseguito un monitoraggio
ambientale degli anestetici volatili con l’uso di un
Monitor analizzatore automatico Pollution 2002P (metodo gascromatografico
e rilievo in tempo reale di TLV-TWA). Ogni lavoratore
è stato sottoposto a visita medica e prelievo ematico
per l’analisi di specifici indicatori di funzionalità epatica
(SGOT, SGPT, γ-GT), renale (creatinemia, azotemia) ed esame
emocromocitometrico e delle sieroproteine e sono rilevati i sintomi
soggettivi di tipo neurocomportamentale. I risultati sono
stati espressi come medie e deviazioni standard, eseguendo test
di significatività statistica (p < 0.05).
Risultati
I dati ambientali sono riportati nella Tabella I.
L’analisi dei dati evidenzia una riduzione significativa dei
livelli ambientali di N 2 O ed alogenati volatili nella fascia B,
così come l’indice di rischio, espressione del rapporto tra
esposizione ponderata e limite ambientale. Dai dati del monitoraggio
biologico, riportati nella Tabella II, non si evidenziano
variazioni significative tra esposti e controlli specificatamente
per i test di funzionalità renale ed epatica. I parametri
ematochimici e i livelli ematici delle proteine e albumina rientrano
nei limiti fiduciali della popolazione per entrambi i
gruppi in esame.
Tabella I. Tipologia del campione e dati del monitoraggio ambientale
degli anestetici volatili
Tabella II. Dati del monitoraggio biologico negli esposti ad anestetici volatili

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
54 www.gimle.fsm.it
L’analisi dei sintomi soggettivi legati a disturbi neurocomportamentali
(tremori muscolari, capogiri, insonnia, inappetenza,
bocca amara, digestione lenta, disturbi del ritmo cardiaco e dell’attenzione,
cefalea, sonnolenza, astenia, vertigini, irritabilità,
depressione), riportati nella tabella III, mostra una inversione significativa
del quadro clinico correlato all’esposizione lavorativa
nella fascia B e una riduzione dell’indice di rischio relativo.
Discussione
Tabella III. Sintomi soggettivi legati ad esposizione professionale
ad anestetici volatili
Nessun effetto nocivo rilevante è stato osservato a carico della
funzionalità epatica, renale, a livello del SNC, per esposizione
ambientale a gas anestetici. Ciò non esclude l’impegno a ridurre
i fattori di rischio residui, anche con la sperimentazione di nuove
sostanze e l’uso di migliori tecniche anestesiologiche. Un approccio
corretto per caratterizzare il rischio associato all’esposizione
ad anestetici deve tener conto del principio di additività
d’esposizione, per azione di diversi agenti sullo stesso sito con
meccanismi tossicocinetici simili e così gli effetti si sommano in
relazione a specifici rapporti di conversione nell’ambito di una
stessa relazione dose-risposta.
Nella stima dell’indice di rischio HI,
funzione dell’additività e proporzionalità di
esposizione di N 2 O ed alogenati volatili, è
necessario integrare i parametri di altri inquinanti
aerodispersi per essere rappresentativo
del metodo di caratterizzazione dei rischi
associati all’esposizione. Un obiettivo
scientifico è lo studio dei processi d’interazione
tra le diverse sostanze impiegate che ci
permette di modificare il calcolo di HI con
l’introduzione di fattori di sicurezza rappresentativi dell’incertezza
complessiva dei metodi e della significatività degli effetti tossicologici
dei componenti della miscela utilizzata in anestesia. È
evidente come le condizioni operative ed ambientali presenti nelle
sale operatorie rende difficile una valutazione del nesso di causalità
che, invece, deve basarsi sull’applicazione di metodi di analisi
standardizzati per ridurre distorsioni o confondimenti.
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Modulazione di selenio, zinco e rame su effetti immunotossici
del cadmio
1 Sezione di Medicina del Lavoro, Allergologia ed Immunologia Clinica, Dipartimento di Medicina e Scienze dell’Invecchiamento, Università
“G. D’Annunzio”, Chieti
2 Dipartimento di Neuroscienze ed Oncologia, Università “G. D’Annunzio”, Chieti
RIASSUNTO. Questo studio ha lo scopo di valutare gli effetti del
Cd sulla proliferazione cellulare ed il rilascio di citochine da PBMC stimolate
da PHA in presenza di sali di Se, Zn e Cu. A dosi 10 -4 e 10 -5 M il
Cd aveva un effetto dose-risposta inibitorio mentre il rame era blandamente
immunotossico e lo Zn ed il Se 10 -4 avevano un effetto stimolante.
I sali di tutti i metalli a concentrazione 10 -6 M non inducevano modificazioni
significative. Inoltre, lo Zn ed il Se, presenti nelle colture cellulari
assieme al Cd, esercitavano un’azione protettiva sugli effetti immunotossici
del Cd probabilmente con meccanismi metabolici differenti.
Parole chiave: immunotossicità, cadmio, proliferazione cellulare,
citochine.
ABSTRACT. MODULATION OF SELENIUM, ZINC AND COPPER ON IMMU-
NOTOXIC EFFECTS OF CADMIUM. The effects of Cd, on PHA stimulated proliferation
and cytokine release from human PBMC in presence of Se, Zn and
Cu salts were the object of this study. 10 -4 and 10 -5 M Cd exerted an inhibitory
action, while Cu was slightly immunotoxic and 10 -4 and 10 -5 M. Se and
Zn exerted a stimulatory effect; 10 -6 M salts did not exert significant immune
effects. Moreover, 10 -4 and 10 -5 M Se or Zn counteracted the immunotoxic
effects of 10 -5 M Cd possibly with different metabolic mechanisms.
Key words: immunotoxicity, cadmium, cell proliferation, cytokines.
Introduzione
L’esposizione ambientale ed occupazionale a cadmio (Cd)
può provocare gravi danni alla salute includenti neoplasie, nefropatia
ed ipertensione arteriosa (1). L’organismo contrasta gli effetti
citotossici del metallo sintetizzando metallotioneina, proteina
a basso peso molecolare in grado di legare anche il mercurio
(Hg), lo zinco (Zn) ed il rame (Cu) (1). Il Cd ha un effetto competitivo
con lo Zn a livello intracellulare, ad es. sui fattori di trascrizione
(2). È pure noto che il selenio (Se), con azione anti-ossidante,
può proteggere dagli effetti citotossici del Cd (3).
Scopo di questo studio è quello di verificare se sali di Se, Zn
e Cu sono in grado di contrastare “in vitro” l’effetto tossico del
Cd sul sistema immunitario.
Materiali e metodi
Cellule mononucleate di sangue periferico (PBMC) di nove
donatori sono state utilizzate per determinare la prolifera-

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 55
zione cellulare ed il rilascio di interferone-γ
(IFN-γ) e Tumor-Necrosis-Factor
(TNF) α nelle seguenti
condizioni:
a) con o senza stimolazione con
PHA (10 o 20 µg/ml) senza
sali di metalli (campioni di
controllo);
b) in presenza di 10 -4 , 10 -5 e 10 -6
M solfato di cadmio, selenito di
sodio, solfato di zinco e solfato
di rame;
c) in presenza di solfato di cadmio
10 -5 M in combinazione
con i sali di Se, Zn o Cu 10 -4 o
10 -5 M con o senza 20 µg/ml di
PHA (per determinare la proliferazione
cellulare per 72 ore)
o 10 µg/ml di PHA (per determinare
il rilascio di citochine
per 32 ore).
I metodi dettagliati per l’incubazione
delle PBMC e per determinare
la proliferazione cellulare ed il
rilascio di citochine sono riportati in
un lavoro del nostro gruppo (4).
Risultati e Discussione
A dosi 10 -4 e 10 -5 M il Cd aveva un effetto inibitorio dose-dipendente
sulla proliferazione cellulare mentre lo Zn ed il Se 10 -4 e
10 -5 M avevano un effetto stimolante non dose-dipendente (Tabella
I). I sali di Cu a tutte le concentrazioni, ed i sali di tutti i metalli a
concentrazione 10 -6 M non avevano effetti significativi sulla proliferazione
cellulare. Il rilascio di IFN-γ e TNF-α dalle PBMC era generalmente
correlato con i valori di proliferazione cellulare in presenza
di sali di Zn e Se, mentre il rame aveva un blando effetto inibitorio
sul rilascio di citochine. Lo Zn ed il Se, al contrario del rame,
esercitavano un effetto protettivo sull’inibizione della proliferazione
cellulare ed il rilascio di citochine indotte dal Cd 10 -5 M (Tabella II).
La nostra indagine conferma che il Cd, a dosi elevate, ha un
effetto immunotossico (5). Vengono anche confermati i risultati
di un recente studio del nostro gruppo evidenziante un effetto stimolante
dello Zn sulla risposta immunitaria di individui atopici
(6). Infine si evidenzia che il Se (ma non il Cu) stimolano la proliferazione
cellulare ed il rilascio di citochine. I meccanismi attraverso
i quali Se e Zn proteggono dagli effetti immunotossici
del Cd necessitano di essere ulteriormente indagati.
S. Dragoni 1 , P. Franceschetti 2 , D. Doria 2 , M. Valoti 1 , M.E. Fracasso 2
Tabella I. Percentuale di proliferazione delle PBMC stimolate da PHA in presenza
di sali di Cd, Se, Zn e Cu a diverse concentrazioni, rispetto ai controlli senza metalli
Tabella II. Attività proliferativa e rilascio di citochine dalle PBMC in
presenza di cadmio solfato (Cd) 10 -5 M da solo e in combinazione con sali
di Se, Cu e Zn 10 -5 M in % rispetto ai controlli senza metalli
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Effetto del trattamento subcronico con benzene in topi C57/Bl
1 Dipartimento di Scienze Biomediche, Università degli Studi di Siena
2 Dipartimento di Medicina e Salute Pubblica, Sezione di Farmacologia, Università degli Studi di Verona
RIASSUNTO. Il benzene è un composto ampiamente utilizzato
nell’industria in grado di determinare la comparsa di anemia aplastica
e leucemia mieloide acuta nell’uomo e forme diverse di cancro nei roditori.
Il benzene è metabolizzato nel fegato, ad opera del citocromo P450
2E1, in fenolo, catecolo ed idrochinone. I derivati fenolici, successivamen-
te, ad opera della mieloperossidasi (MPO) presente a nel midollo osseo, possono
originare radicali semichinonici responsabili della tossicità del benzene.
Lo scopo di questo lavoro è stato studiare l’effetto del trattamento con
benzene a basse ed alte dosi (5 e 100 mg/Kg) in topi C57BL. L’osservazione
che il trattamento ad alte dosi determinava un aumento dell’attività della

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
56 www.gimle.fsm.it
MPO, nei mielociti, suggerisce che il benzene promuova una
modulazione positiva della propria bioattivazione. L’induzione
di MPO può svolgere, quindi, un ruolo importante nel
danno al DNA, osservato nelle cellule del midollo con il test
“comet assay”, ad entrambe le dosi di benzene utilizzate.
Parole chiave: benzene, mieloperossidasi.
ABSTRACT. EFFECTS ON C57/BL MICE OF SUBCH-
RONIC TREATMENT WITH BENZENE. Benzene, a chemical
widely used in industry, is capable of causing aplastic anemia
and acute myelogenous leukemia in humans and multiple
forms of cancer in rodents. Hepatic cytochrome P450
2E1 catalyzes the formation of phenolic metabolites of
benzene. Mielopeoxidase (MPO), present in bone marrow,
may further convert the phenolic metabolites to free radicals,
which are responsible for in situ bioactivation of benezene.
The aim of this work was to study the effects of
low and high doses of benzene (5 and 100 mg/Kg) in subchronically
treated mice. Treatment with 100 mg/Kg led to
a significative increase in MPO and in NAD(P)H:quinoneoxidoreductase
(NADHQ). Furthermore “comet assay” in
myelocytes revealed DNA damage for both types of benzene treatment.
Key words: benzene, mieloperoxidase.
Introduzione
L’esposizione a benzene è in grado di determinare la comparsa
di anemia aplastica e leucemia mieloide acuta nell’uomo e
di diverse forme di cancro nei roditori. Tuttavia, il composto è
ancora utilizzato in alcuni processi industriali e lo si trova a basse
concentrazioni nella benzina, nel fumo di sigaretta ed in vari
prodotti di consumo (5). Il benzene è metabolizzato nel fegato a
fenolo ad opera del citocromo P450 2E1. Il fenolo, a sua volta,
può essere trasformato in catecolo ed idrochinone che si accumulano
a livello del midollo osseo. A questo livello possono essere
trasformati dalla mieloperossidasi (MPO) a radicali semichinonici
responsabili della genotossicità (6, 4).
Lo scopo di questo lavoro è stato mettere a punto un modello
animale di esposizione al benzene in topi C57BL nei quali sono
stati monitorati il danno genotossico e la variazioni di alcune
attività enzimatiche.
Materiali e metodi
Animali. Topi C57BL maschi del peso di 20-25 g sono stati suddivisi
in 3 gruppi (n = 4) ciascuno dei quali è stato trattato per 15
giorni per os con il veicolo o con benzene alle dosi di 5 o 100 mg/kg
p.c. Alla fine del trattamento il fegato ed il midollo sono stati prelevati
da ciascun animale ed utilizzati per il dosaggio delle attività enzimatiche
e per la stima della genotossicità tramite “comet assay”.
Comet Assay. Il saggio del comet veniva effettuato come descritto
da Faccioni et al. (2).
Dosaggi Enzimatici. L’attività della MPO veniva dosata su
omogenato di midollo osseo con guaiacolo secondo Valoti et al.
(8). La glutatione transfersi (GSH-T) era determinata su frazioni
di citosol epatico, utilizzando il metodo di Habig et al. (3). La
NAD(P)H:chinone ossidoreduttasi (NADHQ) era determinata su
frazioni di citosol epatico secondo Benson et al. (1).
Risultati
L’attività della MPO subiva un significativo incremento del
55% in topi trattati con alte dosi di benzene, mentre nessuna differenza
rispetto al controllo veniva osservata alla dose di 5 mg/kg
(Tabella I). Analogamente, l’attività enzimatica della NADHQ a
livello epatico era incrementata significativamente del 50% solo
alla più alta dose di benzene testata. La GSH-T, pur presentando
Tabella I. Parametri descrittivi del comet assay in cellule del midollo
osseo in topi C57Bl dopo somministrazione subcronica di benzene
Tabella II. Attività enzimatiche in citosol epatico (GSH-T e NADHQ)
e midollo osseo (MPO) di topi trattati subcronicamente con benzene
un aumento rispetto al controllo, non raggiungeva valori statisticamente
significativi (Tabella I).
Il “comet assay” mostrava un aumento dei parametri descrittivi
della cometa già alla minima dose di benzene (Tabella II).
Discussione
L’osservazione che il trattamento con il benzene determina
un aumento dell’attività della MPO suggerisce che il composto
promuova una modulazione positiva della propria bioattivazione.
L’incremento di questa attività può spiegare, inoltre, il danno al
DNA evidenziato dal “comet assay” dopo trattamento con il benzene.
Il dosaggio di ulteriori attività enzimatiche e la determinazione
dei metaboliti fenolici, in animali trattati cronicamente con
benzene, dovrà chiarire l’effettivo ruolo del benzene nella modulazione
della propria tossicità.
Ringraziamenti
Il presente studio è stato finanziato con fondi MIUR (PRIN
2003) e dell’Università degli Studi di Siena.
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G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 57
D. Fanin, S. Ferrazzoni, S. Ferrarese, R. Accordino, A. Visentin, P. Maestrelli
Valori di riferimento delle concentrazioni di ossido nitrico
esalato nella popolazione adulta
Dipartimento di Medicina Ambientale e Sanità Pubblica, Sede di Medicina del Lavoro, Università degli Studi di Padova
RIASSUNTO. In 124 soggetti normali (77M, 47F; età 40 anni ±11)
sono stai esaminati i determinanti fisiologici delle concentrazioni di NO
esalato (ENO). Concentrazioni più elevate di ENO sono state rilevate nei
maschi rispetto alle femmine e nei non fumatori rispetto ai fumatori. Tuttavia
il determinante principale della concentrazione di ENO nei soggetti
normali è risultato essere il peso corporeo. Pertanto i valori di riferimento
delle concentrazioni di ENO nella popolazione adulta possono essere calcolati
con una semplice formula che comprende il peso del soggetto.
Parole chiave: valori di riferimento, ossido nitrico esalato, popolazione
adulta.
ABSTRACT. REFERENCE VALUES OF EXHALED NITRIC OXIDE CON-
CENTRATIONS IN ADULT SUBJECTS. Physiological determinants of exhaled
nitric oxide (ENO) concentrations were examined in 124 normal subjects
(77 M, 47 F) aged 40 yr. ± 11. Higher concentrations of ENO were detected
in males compared with females and in non-smokers compared to
smokers. However, the predominant determinant of ENO in normal
subjects was the body mass. Based on this observation, the predicted values
of ENO in adult population can be calculated by a simple equation
including body weight.
Key words: reference values, exhaled nitric oxide, adult population.
Introduzione
L’ossido nitrico (NO) rappresenta un importante mediatore
biologico prodotto dall’enzima NO-sintetasi di cui sono state
identificate due isoforme costitutive ed una inducibile (iNOS).
La iNOS è espressa prevalentemente in cellule infiammatorie come
macrofagi, eosinofili, neutrofili e mastociti, nelle cellule epiteliali
delle vie respiratorie e nei pneumociti di tipo II (1, 2). L’i-
NOS è indotto da stimoli infiammatori quali alcune citochine come
TNFα, IL-1β, INFγ, endotossine ed altri prodotti batterici.
Per questi motivi la misura della concentrazione di NO nell’aria
esalata (ENO) è usata come indicatore non invasivo di infiammazione
bronchiale. In particolare, i valori di ENO risultano ben
correlati con l’eosinofilia delle vie aeree che costituisce la caratteristica
più costante della flogosi bronchiale nell’asma. L’infiammazione
bronchiale nell’asma professionale, anche da composti
a basso peso molecolare, non differisce da quella che si riscontra
nell’asma di altra origine. Tuttavia i metodi per valutare
questo aspetto anatomopatologico della malattia sono difficilmente
applicabili nella sorveglianza sanitaria di lavoratori esposti
a tossici inalatori o a rischio asmogeno. La misura dell’ENO
può rappresentare una valida alternativa a metodi invasivi quali
biopsie, lavaggio bronco alveolare o minimamente invasivi, ma
indaginosi, come l’analisi dell’espettorato indotto. Nel campo
della Medicina del Lavoro la misura dell’ENO è stata utilizzata
in pochi studi per valutare la risposta delle vie
aeree dopo esposizione sperimentale ad asmogeni
professionali (3, 4). Non esistono al momento
valori di riferimento dell’ENO validati per gli
adulti, pertanto in questo studio ci siamo proposti
di stabilire i valori di normalità dell’ENO in
una popolazione adulta sana e di determinare
l’influsso di vari parametri fisiologici, di funzionalità
respiratoria e dell’abitudine al fumo di sigaretta
su questa misura.
Metodi
Il campione di riferimento studiato era costituito da soggetti
senza storia clinica di malattie respiratorie, né di virosi respiratorie
recenti, che non avessero ingerito cibi o bevande nell’ora precedente
la misurazione e che non fossero in terapia farmacologia
da almeno 4 settimane, essendo questi fattori in grado di influenzare
l’ENO. Tutti avevano valori spirometrici nella norma ed erano
non fumatori. Sono stati reclutati soggetti di età compresa tra
i 20 e i 65 anni in modo che tutte le classi di età fossero rappresentate.
A tutti, prima dei parametri di funzionalità respiratoria
(CV,VEMS), è stato misurato l’ENO mediante un analizzatore a
chemiluminescenza secondo le linee guida dell’American Thoracic
Society (1), a un flusso espiratorio costante di 0,05 litri/sec.
Per ciascuno è stato calcolato il Body Mass Index (BMI) e la
Body Surface Area (BSA), estrapolata da normogrammi standardizzati
a partire dall’altezza e dal peso. È stato esaminato inoltre
un gruppo di 25 soggetti normali, con le caratteristiche di cui sopra,
ma fumatori. Poiché la distribuzione delle concentrazioni di
ENO risulta logaritmica, per l’analisi statistica i dati sono stati
trasformati nel loro logaritmo. L’influenza dei vari fattori sull’E-
NO è stata valutata mediante regressione semplice e multipla. Per
confrontare i valori di ENO tra maschi e femmine e tra fumatori
e non fumatori è stata eseguita l’analisi della covarianza.
Risultati
La casistica studiata comprendeva 124 soggetti normali (77M,
47F) con età media di 40 anni ±11,3. Le concentrazioni di ENO
mostravano una distribuzione normale logaritmica, la cui media
geometrica era di 19,5 ppb (5°percentile = 7 ppb; 95° percentile =
40 ppb). L’ENO correlava in maniera significativa con tutti i parametri
antropometrici considerati: età (r = 0,27; p

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
58 www.gimle.fsm.it
I maschi dimostravano valori medi di ENO significativamente
superiori alle femmine (21,6 vs 16,2 ppb; p

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 59
Figura 1. Decorso delle concentrazioni di NO esalato e FEV 1 dopo esposizione ad isocianati
Risultati
Dei 10 soggetti studiati, 5 sono risultati
positivi al test di stimolazione bronchiale specifico,
di cui 2 a TDI, 2 ad MDI ed 1 a HDI.
I 5 soggetti negativi al test sono stati esposti
ad HDI (n.=3), TDI (n.=1) ed MDI (n.=1).
Tutti i soggetti positivi hanno presentato una
reazione di tipo ritardato; in un caso è stata
osservata anche una reazione di tipo immediato.
Il massimo decremento di FEV 1 è stato osservato tra la 5°
e 6° ora dopo esposizione ad isocianato, mentre alla 24° ora i valori
erano tornati pressoché a norma. (Figura 1B). Nel giorno di
controllo il coefficiente di variazione dell’NO esalato era del
10±5,4%. Nei soggetti negativi al test di stimolazione bronchiale
specifico non si è osservata alcuna variazione significativa della
concentrazione di NO esalato, mentre nei soggetti positivi si è osservato
un marcato incremento alla 24° ora (p

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
60 www.gimle.fsm.it
R. Foddis 1 , A.Vivaldi 1 , R. Buselli 1 , V. Gattini 1 , G. Guglielmi 1 , F. Cosentino 1 , F. Ottenga 1 , E. Ciancia 2 , R. Libener 3 ,R. Filiberti 4 ,
M. Neri 4 , P.G. Betta 3 , M. Tognon 6 , L. Mutti 5 , R. Puntoni 4 , A. Cristaudo 1
Ricerca di anticorpi anti-SV40 come marker di infezione nello screening
di fattori di rischio aggiuntivi in soggetti ex-esposti ad amianto
1 Dipartimento di Endocrinologia e Metabolismo, Ortopedia e Traumatologia, Medicina del Lavoro, Università di Pisa
2 Unità Operativa Anatomia Patologica, Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana
3 Unità Operativa Anatomia Patologica, Azienda Sanitaria Ospedaliera, Alessandria
4 Istituto Nazionale Ricerca sul Cancro, Unità Operativa di Epidemiologia Ambientale, Genova
5 Ospedale S.Pietro e Paolo, ASL 11 Borgosesia e Fondazione Maugeri, Pavia
6 Dipartimento di Morfologia e Embriologia, Sezione di Istologia e Embriologia, Università di Ferrara
RIASSUNTO. Ad oggi tra gli ipotizzati cofattori dell’amiato nella
patogenesi del mesotelioma maligno (MM) il più accreditato, sulla base
di dati di biologia molecolare, è il Simian Virus 40 (SV40). Lo scopo del
presente studio era quello di valutare la prevalenza e la affidabilità del dosaggio
di anticorpi anti-SV40 come marker di infezione con finalità preventive.
Solo 1 paziente con MM (2,7%) ed 1 lavoratore sano con pregressa
esposizione ad amianto (1,3%) sono risultati positivi alla ricerca di
anticorpi anti-SV40. Nessuno dei 71 pazienti con patologie non neoplastiche
inclusi nello studio era positivo per gli anticorpi.
Parole chiave: SV40, asbesto, mesotelioma maligno.
ABSTRACT. ANTI-SV40 ANTIBODIES AS INFECTION MARKERS FOR
ASSESSING ADDITIONAL RISK FACTORS IN WORKERS PREVIOUSLY EXPOSED
TO ASBESTOS. Although the prevalence of asbestos exposure among malignant
mesothelioma (MM) patients is very high, only a relatively small
percentage of workers previously exposed to asbestos develop a MM.
This observation suggests that some tumoral agents may act as a co-factor
together with asbestos in MM pathogenesis. To date, among the hypothesized
cofactors, the Simian Virus 40 (SV40) is one of the most widely
investigated and is supported by biomolecular findings. The aim of
this study was to evaluate the incidence and feasibility of Anti-SV40 Antibodies
as an infection marker with preventive application. We found
that only 1 MM patient out of 44 (2.7%) and 1 out of 75 workers previosly
exposed to asbestos (1.3%) were positive for the detection of Anti-
SV40 antibodies. None of the 71 patients with non-neoplastic diseases
were positive.
Key words: SV40, asbestos, malignant mesothelioma.
Introduzione
La discrepanza tra l’elevata prevalenza di anamnesi lavorativa
positiva per esposizione ad amianto tra i pazienti con mesotelioma
maligno della pleura (MM) e la relativamente bassa incidenza
di MM nella popolazione degli ex esposti suggerisce l’esistenza
di un ruolo cofattoriale di altri agenti cancerogeni con attività
additiva, sinergica od eventualmente moltiplicativa. Tra gli
ipotetici cofattori, uno dei più accreditati negli ultimi dieci anni è
il Simian Virus 40 (SV40). Una mole impressionante di dati di laboratorio
(1-5) supporta l’ipotesi di un’attività cancerogenetica
del virus nella specie umana. Dal punto di vista epidemiologico,
invece, non ci sono ad oggi dati univoci. A fronte di studi longitudinali
o storici retrospettivi che non hanno fornito evidenze di
associazioni significative con la patologia tumorale, alcuni autori
hanno rilevato un incremento di mortalità per alcuni dei tumori
compreso il MM (6) per cui l’SV40 è responsabile in esperimenti
con animali. Un recente studio caso-controllo condotto dal
nostro gruppo di ricerca ha permesso, per la prima volta, di calcolare
una stima del rischio relativo alla combinazione
SV40/amianto che risulterebbe più alta anche della somma della
stima calcolata per i due singoli fattori separatamente. Il presente
studio si poneva l’obiettivo di effettuare una titolazione nel siero
di anticorpi anti-SV40 (Ab Anti-SV40) al fine di verificare che
questi ultimi potessero costituire un fattore predittivo utilizzabile
a scopo preventivo nello screening di popolazioni di lavoratori ex
esposti ad amianto.
Materiali e metodi
Sono stati stoccati a -80°C campioni di siero derivanti da soggetti
con diagnosi di MM, di malattia polmonare non neoplastica
(BPCO, silicosi, asbestosi, etc.) e da soggetti con pregressa esposizione
professionale ad amianto, nonché da soggetti sani o comunque
privi di patologie polmonari (donatori di sangue, pazienti
oculistici od ortopedici non oncologici). In un laboratorio
statunitense (Dipartimento di Microbiologia e Virologia Molecolare,
Baylor College of Medicine di Houston, TX) sono stati titolati
i livelli sierici di anticorpi contro una oncoproteina virale,
chiamata Large T Antigen (LTAg). È stata utilizzata la tecnica
dell’immuno-fluorescenza indiretta (IFI).
Risultati
Nel gruppo dei soggetti con patologie polmonari, oculari od
ortopediche non neoplastiche non si è riscontrata positività alcuna
per anticorpi anti-SV40. Un solo paziente tra i 44 affetti da
MM (2,3%), così come un solo soggetto su 75 lavoratori ex-esposti
ad amianto (1,3%) presentavano Ab anti-SV40 titolabili nel
siero. I due campioni positivi appartenenti ad un paziente affetto
da MM ed ad lavoratore ex esposto ad amianto, si caratterizzavano
per una titolazione di 1:50 e di 1:10, rispettivamente.
Discussione
L’insieme dei dati di biologia molecolare accumulati nell’ultimo
decennio, confermati dai risultati di un recente studio casocontrollo
di epidemiologia biomolecolare condotto dal nostro
gruppo di ricerca che ha evidenziato un’interazione più che additiva
tra i due fattori, rendono sempre più credibile il ruolo dell’-
SV40 come cofattore dell’amianto nella patogenesi del MM. Sulla
base di questo convincimento, la scoperta di un marker attendibile
di infezione da SV40 potrebbe costituire un elemento di
screening in grado di delineare subpopolazioni di soggetti ex
esposti ad amianto a più alto rischio (7). Il primo obiettivo di questo
studio, quindi, era quello di verificare che la ricerca di anticorpi
anti-SV40 (LTAg), con la metodica dell’IFI, potesse essere
un buon “indicatore di infezione virale”. Fino ad oggi non erano
disponibili dati di letteratura significativi sulla distribuzione di
sieropositività all’SV40 in popolazioni normali o di soggetti con
MM (8), né erano disponibili dati sulla durata media della sieropositività
a seguito di una prima infezione. La prevalenza osservata
nei pazienti con MM (1 caso/44, 2,27%) ci fa ipotizzare che

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 61
questa tecnica sottostimi la reale prevalenza di infezione attuale
o pregressa. Infatti, nonostante non sia stata ancora indagata la
presenza di DNA virale nei MMs dello studio, sulla base dei dati
di letteratura (1, 3-6) si può ipotizzare che almeno il 50% dei
pazienti italiani con MM abbiano avuto un contatto con il virus.
Supponendo che la verifica con PCR dia i risultati attesi, è
possibile avanzare alcune ipotesi riguardo il significato biologico
dei dati del presente studio. Nelle scimmie, al contrario di quanto
accade nei roditori, a seguito di infezione con SV40 non si osservano
titoli elevati di anticorpi a meno che tali animali non siano
infettati con quantità molto alta di virus. Analogamente si può
ipotizzare che nella specie umana all’infezione con SV40, qualunque
sia la via di ingresso, non faccia seguito una produzione
di LTAg quantitativamente sufficiente per stimolare una risposta
immunitaria. Il virus si comporterebbe in vivo come si osserva in
vitro, dove si replica a bassi livelli nelle cellule mesoteliali permettendo
così la permanenza nella cellula ospite con la piena
espressione delle sue capacità oncogene.
Concludendo, la determinazione del titolo anticorpale anti-
LTAg con la tecnica dell’IFI, non può essere proposta come metodo
di screening per l’individuazione di una popolazione di soggetti
infettati da SV40. Infatti, questa tecnica, pur garantendo
un’elevata specificità ed un costo contenuto, risulta dotata di
scarsa sensibilità.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dall’ISPESL. Si ringrazia l’Unità di
Epidemiologia Occupazionale ed Ambientale del CSPO di Firenze.
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Valutazione di danno e riparo del DNA mediante comet assay in linfociti
di soggetti non-fumatori ed ex-fumatori esposti a fumo passivo
1 Dipartimento di Medicina e Sanità Pubblica, Sezione di Medicina del Lavoro, Università di Verona
2 Sezione di Farmacologia, Sezione di Medicina del Lavoro, Università di Verona
RIASSUNTO. Il comet assay è un metodo che è in grado di riconosce
varie forme di danni al DNA in singole cellule e può valutare la loro
capacità riparativa. I linfociti di fumatori presentano danni al DNA significativamente
superiori ai controlli, ed il danno è correlato con il numero
di sigarette fumate. Il danno cellulare è presente anche nei soggetti esposti
a fumo passivo (ex- e non-fumatori). La capacità di riparare i danni indotti
dall’H 2 O 2 è gravemente ed ugualmente compromessa nei fumatori
attivi e passivi.
Parole chiave: danno al DNA, riparazione del DNA, test della cometa,
fumo passivo.
ABSTRACT. ASSESSMENT OF DNA DAMAGE AND REPAIR BY THE
COMET ASSAY IN LYMPHOCYTES OF NON-SMOKERS AND EX-SMOKERS EX-
POSED TO ENVIRONMENTAL TOBACCO SMOKE. Assessment of DNA damage
and repair by comet assay in peripheral blood lymphocytes of nonsmokers
and ex-smokers exposed to passive smoking. DNA damage was
assessed in the lymphocytes of active and passive smokers by comet assay.
Smokers, as well as passive smokers, showed higher basal DNA damage
compared to a control group. The cellular damage was significantly
correlated with smoking habits. The lymphocyte capacity to repair
H 2 O 2 -induced damage was seriously decreased in both groups, while the
same damage in the control lymphocytes was repaired in a short time.
Key words: DNA damage, DNA repair, comet assay, environmental
tobacco smoke.
Introduzione
Il fumo passivo o involontario consiste in una miscela di fumo
esalato dal fumatore e di fumo liberato dalla sigaretta accesa,
che viene diluito nell’aria ambientale (secondhand smoke o
environmental tabacco smoke). Il fumo passivo o involontario
contiene carcinogeni inalanti altamente volatili come il benzene,
l’1,3-butadiene, il benzo(α)pirene, il 4-metilnitrosamina,
l’1,3-piril-1-butanone e molti altri, ed è anche costituito da una
fase di particolato disperso nell’aria ambientale (1). La cotinina
ed il composto parente, la nicotina, sono considerati attendibili
biomarcatori di esposizione, soprattutto in caso di recente esposizione
(2). Nell’uomo il fumo passivo è associato a mutagenicità
urinaria ed è stata dimostrata una correlazione tra mutagenicità
urinaria e concentrazione di cotinina nelle urine di soggetti
esposti (3).
Un metodo particolarmente sensibile che dà informazioni su
esposizioni biologicamente attive è il test della cometa che riconosce
varie forme di danni al DNA in singole cellule (rotture in
singolo e/o doppio filamento, eventi di inefficienza nei processi
riparativi) (4). L’attività riparativa è un meccanismo di difesa
presente in tutte le cellule, ed è noto che la capacità di riparare i

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
62 www.gimle.fsm.it
danni del DNA è strettamente legata alla suscettibilità soggettiva
di sviluppare tumori. Recentemente, la versione del comet test a
pH alcalino si è rivelata particolarmente utile nel valutare simultaneamente
danni al DNA e capacità di riparo in campioni biologici
di facile reperibilità come i linfociti (5).
In base a queste considerazioni e sull’esperienza acquisita nel
nostro laboratorio nelle diverse applicazioni di tale test, è stato
condotto uno studio rivolto alla valutazione del danno e dell’efficienza
riparativa del DNA in linfociti di soggetti non-fumatori,
fumatori e fumatori passivi (non- ed ex-fumatori). I linfociti, dopo
aver registrato i parametri basali di danno, vengono opportunamente
trattati in vitro con H 2 O 2 e successivamente sulle cellule,
messe in condizioni di poter riparare i danni subiti, viene determinata
una cinetica di capacità riparativa.
Materiali e metodi
Lo studio è stato eseguito su linfociti di 165 soggetti sani, lavoratori
d’ufficio (29-56 anni). Di questi, 41 erano fumatori
(21±8 sigarette/die), 47 non fumatori (controlli) e 67 esposti a fumo
passivo (43 non- e 24 ex-fumatori). Ciascun soggetto ha compilato
un questionario in cui venivano registrati modalità e durata
dell’abitudine al fumo, durata di esposizione a fumo passivo,
abitudini alimentari. L’esposizione a fumo attivo e passivo è stata
verificata determinando la nicotina e cotonina urinarie.
Il danno al DNA indotto dall’esposizione è stato stimato mediante
comet test in linfociti isolati da sangue intero eparinizzato.
Dopo aver eseguito la conta e la vitalità cellulare, i linfociti sono
stati stratificati su un vetrino con tecnica “sandwich”, quindi sottoposti
ad elettroforesi submarine. I parametri di danno sono stati
valutati al microscopio in fluorescenza mediante softwere (Comet
Assay II, Perceptive Instruments, UK). Ogni cellula danneggiata
si presenta come una cometa con testa e coda. La lunghezza
e l’intensità di fluorescenza della coda sono correlate al danno
del DNA. I parametri caratterizzanti il danno considerati sono: il
numero di comete, la lunghezza della coda (TL), % di DNA nella
coda (TI), tail moment (TM); quest’ultimo è il prodotto integrato
dei due precedenti parametri. Per ogni soggetto sono state
lette 50 cellule random in due esperimenti separati.
La capacità riparativa viene valutata mediante comet test trattando
i linfociti con H 2 O 2 (0-100-200 µM) per 5 min.; quindi le
cellule vengono mantenute a 37° C per 20 e 60 min per favorire
la riparazione. Il contenuto di GSH totale nei linfociti di ciascun
soggetto è stato determinato mediante test colorimetrico (Calbiochem,
Gluthatione Assay Kit).
Risultati
I risultati ottenuti indicano che i fumatori presentano di base
parametri di danno significativamente superiori ai controlli e
che TM, TI e numero di comete sono positivamente e significativamente
correlati con il numero di sigarette/die. I soggetti
esposti a fumo passivo mostrano livelli dosabili di nicotina e cotinina
nelle urine. Il danno cellulare (TM, TI e numero di comete)
è presente anche nei soggetti esposti a fumo passivo, sia exche
non-fumatori. Gli ex-fumatori esposti a fumo passivo mostrano
una correlazione inversa statisticamente significativa tra
numero di comete e anni di astinenza dal fumo. Il contenuto cellulare
di GSH non differisce medialmente nei diversi gruppi, ma
solo nei fumatori il GSH linfocitario è inversamente e significativamente
correlato con TM e TL. La capacità di riparare i danni
indotti da diverse dosi di H 2 O 2 è stata valutata mediante una
cinetica riparativa (T0, T20 e T60 min). I risultati indicano che i
controlli riparano il danno indotto dall’H 2 O 2 a 100 µM in breve
tempo (T20 min) e dopo 60 min a 200 µM. I linfociti provenienti
dai fumatori attivi e passivi (ex- e non-fumatori) risultano gravemente
danneggiati da ambedue le dosi di H 2 O 2 : i danni non
vengono riparati neanche dopo 60 min.
Discussione
Numerosi e noti sono i dati della letteratura che indicano che
i linfociti di soggetti fumatori presentano danni al DNA misurabili
mediante diversi test genetici (SCE, CA, micronuclei, comet
test). I risultati di questo studio confermano gli effetti genotossici
del fumo, e dimostrano che i parametri di danno cellulare sono
correlati con il numero di sigarette fumate e con la presenza di
nicotina nelle urine, mentre sono inversamente correlati con il
contenuto di GSH, molecola attiva nei processi molecolari di detossificazione.
È da notare che un soggetto dichiaratosi non fumatore,
che presentava bassi livelli di nicotina e cotinina nelle
urine, ma con parametri di danno cellulare al comet test paragonabili
ad un fumatore, ad una successiva intervista affermava di
aver smesso di fumare da cinque giorni. Tale dato fornisce un’ulteriore
conferma che il comet test è particolarmente sensibile nel
rilevare i danni indotti dal fumo di sigaretta.
Recentemente si è dimostrato che anche l’inalazione passiva
di fumo di sigaretta costituisce un fattore di rischio per neoplasie
polmonari. Meno noti sono i dati che indicano che esposizioni a
fumo passivo, di soggetti che non hanno mai fumato o che sono
degli ex-fumatori, possono indurre danni al DNA dei linfociti. I
dati ottenuti evidenziano che i non-fumatori esposti presentano
un danno basale medialmente superiore del 30% rispetto ai controlli,
mentre negli ex-fumatori il danno raggiunge circa il 48%.
Interessante è il dato emerso nel gruppo degli ex-fumatori esposti,
questi presentano una minor percentuale di cellule con cometa
aumentando il tempo trascorso dalla sospensione dal fumo.
Drammatico è il risultato ottenuto riguardo l’efficienza riparativa
dei linfociti provenienti dai fumatori attivi e dai non- ed ex-fumatori
esposti: i tre gruppi non riescono a riparare i danni indotti
dall’H 2 O 2 , e i dati indicano che i soggetti che presentano il danno
più consistente sono gli esposti non-fumatori.
Ringraziamenti
Parzialmente supportato da 2003063319-005 MIUR-COFIN 2003.
Bibliografia
1) Vineis P., Caporaso N., Tobacco and cancer: epidemiology and the
laboratory. Environ. Health Perspect. 1995; 103: 156-160.
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and repair in individual fibtroblasts cultured on microscope slides.
Mutat. Res 1991; 252: 289-296.
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G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 63
S. Fustinoni, R. Mercadante, L. Campo, L. Scibetta, C. Valla, V. Foà
Confronto tra orto-cresolo e toluene urinari come indicatori biologici
di esposizione a toluene aerodisperso
Dipartimento di Medicina del Lavoro, Università degli Studi di Milano e ICP, Milano
RIASSUNTO. In questo studio sono confrontati,
come indicatori biologici di esposizione a toluene,
l’orto-cresolo e il toluene urinari. Lo studio
è stato condotto su 100 lavoratori dell’industria rotocalcografica
e 87 controlli. Entrambi gli indicatori
discriminano i due gruppi a diversa esposizione.
Sia nei controlli che negli esposti l’abitudine al
fumo di sigaretta influenza l’escrezione di ortocresolo,
ma non quella di toluene urinario. I nostri
risultati dimostrano che il toluene urinario è preferibile
all’orto-cresolo per il monitoraggio biologico
dell’esposizione professionale a toluene.
Parole chiave: toluene, orto-cresolo, esposizione
professionale, rotocalcografia.
ABSTRACT. COMPARISON BETWEEN ORTHO-CRESOL AND TOLUENE
IN URINE AS BIOLOGICAL MARKERS OF EXPOSURE TO TOLUENE IN AIR. Two
different biological markers of exposure to toluene are compared: urinary
ortho-cresol and toluene. The study was performed on 100 rotogravure
workers and 87 employees as controls. Significant differences were
found for the two groups using both markers. Smoking habits affect the
excretion of ortho-cresol but not of urinary toluene. For this reason, urinary
toluene is a better marker of occupational exposure than toluene.
Key words: toluene, ortho-cresol, occupational exposure, rotogravure
industry.
Introduzione
Il toluene è uno dei solventi a maggiore uso industriale al
mondo. Essendo una sostanza neurotossica, la sua esposizione
negli ambienti di lavoro è regolamentata, ed un valore limite pari
a 188 mg/m3 , come valore medio ponderato nel turno di lavoro
(TWA), è consigliato o prescritto da diverse agenzie regolatorie
(1, 2). Il toluene è anche un inquinante ubiquitario degli ambienti
di vita, essendo emesso insieme al gas di scarico dagli autoveicoli.
In questa indagine l’orto-cresolo, un indicatore biologico
di uso consolidato (1, 2), ed il toluene urinario, suggerito da
numerosi autori come specifico e sensibile indicatore di esposizione
a breve termine (3-5), sono stati confrontati come indicatori
biologici di esposizione a toluene.
Materiali e metodi
Lo studio è stato condotto su 100 lavoratori dell’industria rotocalcografica,
esposti a toluene aerodisperso durante la stampa,
a seguito dell’asciugatura degli inchiostri, ed in 87 soggetti che
svolgono mansioni di ufficio, designati come controlli. L’esposizione
a toluene aerodisperso è stata valutata attraverso un campionamento
personale durante il turno di lavoro. Nello stesso
giorno è stato raccolto un campione di urina a fine turno. Il toluene
e l’orto-cresolo urinario sono stati misurati utilizzando sensibili
procedure analitiche basate sull’estrazione degli analiti dello
spazio di testa del campione, utilizzano la microestrazione in
fase solida, e successiva analisi in gascromatografia-spettrometria
di massa (GC/MS).
Risultati
In Tabella I si riportano i principali parametri statistici ri-
Tabella I. Principali parametri statistici per o-cresolo urinario,
toluene urinario ed esposizione personale a toluene aerodisperso
nelle due categorie di soggetti indagati
guardanti l’esposizione personale a toluene aerodisperso, l’escrezione
di orto-cresolo e di toluene urinari nei soggetti suddivisi
in esposti e controlli. Tutti gli indicatori utilizzati consentono
di discriminare i due gruppi a diversa esposizione. Gli indicatori
biologici sono significativamente correlati con l’esposizione
ambientale (r = 0,64 per orto-cresolo e 0,82 per il toluene
urinario), e tra loro (r = 0,61). Sia nei soggetti di controllo che
negli esposti l’abitudine al fumo di sigaretta influenza l’escrezione
di orto-cresolo, ma non quella di toluene urinario, come
mostrato nella Figura 1.
Figura 1. Orto-Cresolo urinario (mg/g creat) in tutti i soggetti
indagati, suddivisi in base all’esposizione occupazionale e
all’abitudine al fumo di sigaretta
Discussione
Sia l’orto-cresolo che il toluene urinario sono in grado di discriminare
l’esposizione nei due gruppi indagati. Ciononostante,
sebbene l’uso del toluene urinario imponga alcune restrizioni
procedurali relative alla raccolta e preparazione del campione,
esso presenta caratteristiche di maggiore sensibilità e specificità
rispetto all’orto-cresolo, come confermano la mancanza

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
64 www.gimle.fsm.it
di sovrapposizione delle distribuzioni dei valori nei soggetti
esposti e di controllo e la migliore correlazione con l’esposizione
personale a toluene. Inoltre, si conferma che l’orto-cresolo
è influenzato dall’abitudine al fumo di sigaretta, come già
noto in letteratura (6), mentre il toluene urinario non appare influenzato.
I nostri risultati dimostrano che il toluene urinario è
preferibile all’orto-cresolo per il monitoraggio biologico dell’esposizione
a toluene.
Bibliografia
1) American Conference of Governmental Industrial Hygienists, Threshold
Limit Values for chemical substances and physical agents and
Biological Exposure Indices. Cincinnati USA, ACGIH 2004.
F. Giannandrea, P. Marini Bettolo, F. Chirico, P. Bernardini
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1992; 63: 377-381.
Ruolo dei marcatori di turnover osseo nella valutazione del low back pain
Istituto di Medicina del Lavoro, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma
RIASSUNTO. I biomarcatori sono stati utilizzati per decenni nella
ricerca epidemiologica della tossicologia ambientale e occupazionale.
Recentemente si è introdotto l’uso dei biomarcatori anche nello studio
delle patologie muscoloscheletriche lavoro-correlate. È stato sperimentato
che marcatori sufficientemente definiti possono individuare le fasi iniziali
precliniche dei disordini muscoloscheletrici e monitorarne la evoluzione.
L’obbiettivo di questo studio è di valutare il possibile utilizzo di alcuni
marcatori di turnover osseo nella valutazione del low back pain lavoro-correlato.
Parole chiave: biomarcatori di turnover osseo; professionale; lombalgia.
ABSTRACT. USE OF BIOMARKERS OF BONE TURNOVER IN THE AS-
SESSMENT OF LOW BACK PAIN. Biomarkers have been used for decades in
epidemiologic research in environmental and occupational toxicology.
During recent years, the concept of biomarkers for studying mechanisms
of occupational musculoskeletal disorders has gained support. It has been
stated that sufficiently defined biomarkers have the potential to detect
musculoskeletal disorders at an early, preclinical stage and to monitor the
severity in people and populations. The objective of this study is to investigate
the potential of the use of some markers of bone turnover in the
assessment of work-related low back pain.
Key words: biomarkers of bone turnover; occupational; low back
pain.
Introduzione
Il corretto inquadramento diagnostico del low back pain
(LBP) rimane tuttora un problema complesso, tanto più se si
considera il gran numero di lavoratori che ne sono affetti essendo
esposti a rischio di movimentazione manuale dei carichi
(MMC). L’approccio corretto deve essere multispecialistico
con contributi di ambito neurologico, fisiatrico, ortopedico,
reumatologico. Le aspettative riposte nella diagnosi radiologica
sono migliorate solo con la RM che estende la valutazione
radiologica tradizionale limitata alle strutture ossee. Sull’enciclopedia
del BIT, a testimonianza della complessità del problema,
si legge: “è raro che Rx e TC siano d’aiuto nella diagnosi
dato che nella maggior parte dei casi l’origine risiede nei muscoli
e nei legamenti piuttosto che nelle strutture ossee. Di fatto
è molto frequente trovare anomalie ossee in individui che
non hanno mai avuto il mal di schiena. Ascrivere il mal di
schiena ad un assottigliamento del disco o a spondilosi, può
portare ad inutili trattamenti eroici”.
Un ulteriore elemento diagnostico di recente impiego è costituito
dai marcatori bioumorali per la valutazione del danno nelle
artropatie lavoro-correlate. Infatti in quest’ultimo decennio numerose
sono state le segnalazioni di marcatori biologici di alterazioni
a carico dell’apparato osteo-articolare che potrebbero essere
utilizzati come indici predittivi della fase di attività delle
osteoartropatie, capaci di monitorarne la evolutività, della sua
stabilizzazione e della risposta alla terapia (1).
Un biomarcatore può essere definito come un indicatore di
alterazioni biochimiche o molecolari che interessano un sistema
biologico, in grado di riflettere un evento o una sequenza di eventi
e che può essere dosato in mezzi biologici come i fluidi corporei.
I biomarcatori sono stati usati per decenni nella ricerca epidemiologica
della tossicologia ambientale e fanno parte del patrimonio
dottrinale della Medicina del Lavoro nella convenzionale
accezione di indicatori di esposizione, di effetto e di suscettibilità
(2).
Un biomarcatore per essere utile nella ricerca epidemiologica
e nello screening diagnostico deve essere sensibile, ovvero capace
di individuare alterazioni in fase precoce, specifico, ovvero
indipendente da altri fattori confondenti come l’alimentazione o
disordini metabolici, economico. Marcatori sierologici sensibili e
specifici che valutano l’entità del danno a livello della cartilagine,
del tessuto sinoviale ed osseo di pazienti affetti da artrite reumatoide
(AR) e da osteoartrosi, a fini di prognosi e di monitoraggio
delle varie fasi della malattia, sono utilizzati da molti anni
(1). Recentemente alcuni ricercatori hanno valutato il possibile
impiego di tali biomarcatori quali ad esempio il cheratan solfato,
il PICP e il CTX su popolazioni di lavoratori sottoposti a
stress meccanico del rachide (3, 4). Questi marcatori si dividono
in tre gruppi a seconda della struttura anatomica dell’articolazione
di cui indicano l’alterazione: 1) Marcatori di alterazione ossea;
2) Marcatori di alterazione sinoviale; 3) Marcatori di alterazione
cartilaginea (1).
Nella Tabella I sono riportati, sinteticamente, per apparato
e per tipo alterazione segnalata (a seconda se indicano la sintesi
di nuova matrice o il rimaneggiamento della matrice) i marcatori
più importanti, le note caratteristiche e il loro significato
clinico.

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 65
In pazienti affetti da osteoartrosi
del ginocchio, ad esempio, Garnero
e coll. hanno riscontrato un
diminuito turnover osseo, ma un
aumentato turnover sinoviale e cartilagineo:
l’U-Glc-Gal-PYD, specifico
marcatore dell’attività sinoviale,
si rivelò un buon indice predittivo
del dolore e della funzionalità
articolare, mentre elevati livelli di
U-CTX-II, S-PIIINP, e U-Glc-Gal-
PYD si associavano ad un aumentata
perdita di cartilagine (1). Questo
studio confermava i risultati di
altre indagini su forme di artrosi
diverse per eziologia e localizzazione.
L’utilizzo del cheratan-solfato
come biomarcatore degli effetti
di un eccessivo stress meccanico
sul disco intervertebrale, anche in
ambito occupazionale per la valutazione
diagnostica e preventiva
delle low back pain, sono proposti
da diversi autori (3).
Questi ed altri studi recenti hanno
permesso di distinguere gli eventi
infiammatori da quelli degenerativi
in molte patologie articolari. Ad
esempio, Cunnane e coll. hanno dimostrato
che i livelli di MMP-3 sierica
permettono di studiare gli eventi infiammatori in corso di
AR, mentre le concentrazioni di MMP-1 si correlano con l’andamento
della distruzione ossea e cartilaginea in questa come di altre
patologie articolari (1).
I dati presentati nella tabella indicano che c’è un consistente
fondamento razionale che spinge a ritenere che i marcatori bioumorali
di turnover osseo, cartilagineo e sinoviale siano utilizzabili
in Medicina del Lavoro nell’ambito della valutazione di condizioni
di sovraccarico della colonna vertebrale, quali la MMC,
l’impiego di strumenti vibranti, vibrazioni trasmesse a tutto il
corpo. Più promettenti sembrano essere il propeptide amino-terminale
del procollagene di tipo I (PINP) e il telopeptide carbossi-terminale
(ICTP) (4).
F. Gobba 1, 2 , M. Scaringi 1 , L. Roccatto 2
Bibliografia
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principles, problems, and potential. Ann Rheum Dis 2001;
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markers of collagen metabolism. Scand J Work Environ Health 2002;
28(3): 168-175.
Effetto della esposizione occupazionale a campi magnetici a 50 Hz
sulla escrezione urinaria di 6-idrossimelatonina solfato
1 Cattedra di Medicina del Lavoro, Dipartimento di Scienze Igienistiche, Università di Modena e Reggio Emilia
2 Dottorato di Ricerca in Sanità Pubblica, Università di Modena e Reggio Emilia
RIASSUNTO. In 73 lavoratori è stata stimata la esposizione a campi
magnetici ELF con dosimetri personali, e la secrezione di melatonina mediante
dosaggio della 6-idrossimelatonina solfato (6-OHMS) in campioni
di urina raccolti il venerdì mattina e il lunedì mattina successivo. Nei campioni
del venerdì non è stata osservata alcuna variazione della melatonina
in funzione dell’esposizione; né è stata rilevata alcuna variazione del 6-
OHMS tra venerdì, in corso di esposizione, e lunedì, in assenza di esposizione
professionale. I risultati non evidenziano alcuna relazione tra indicatore
biologico ed esposizione professionale a campi magnetici ELF.
Tabella I. Marcatori biochimici di turnover osseo, cartilagineo e sinoviale
Legenda: PINP, propeptide amino-terminale del procollagene di tipo I; PICP, propeptide carbossi-terminale; ALP ossea,
fosfatasi alcalina ossea; DPYD, deossi-piridolina; PYD, piridolina; Glc-Gal-PYD, glucosil-galattosil-piridolina;
NTX, telopeptide N-terminale del collageno di tipo I-2; CTX, telopeptide C-terminale del collageno di tipo I-1; BSP,
sialoproteina ossea; PIICP, propeptide carbossi-terminale del procollageno di tipo II; PIIANP, propeptide amino-terminale
del procollageno di tipo IIA; YKL-40, frammenti della proteina core di aggrecano; CTX-II, telopeptide C-terminale
del collageno di tipo II; COMP, proteina oligomerica della cartilagine; MMP, metalloproteinasi della matrice;
TIMP, inibitori delle metalloproteinasi della matrice; PIIIINP, propeptide amino-terminale del procollageno di tipo III.
Parole chiave: campi magnetici ELF, 6-idrossimelatonina solfato,
escrezione urinaria, esposizione professionale.
ABSTRACT. EFFECT OF THE OCCUPATIONAL EXPOSURE TO ELF-MF
ON THE URINARY EXTRETION OF 6-HYDROXYMELATONIN SULFATE. In 73
workers, extremely low frequency- magnetic fields (ELF-MF) exposure
was monitored during 3 consecutive work-shifts using personal dosimeters.
Melatonin secretion was evaluated by measuring 6-hydroxymelatonin
sulfate (6-OHMS) in samples of urine collected on Friday morning

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
66 www.gimle.fsm.it
and on the following Monday morning. No relation between 6-OHMS and
exposure was observed in the Friday samples. No difference was observed
in 6-OHMS values on Friday, during exposure, and on Monday, in absence
of occupational exposure. The results do not support the hypothesis that
ELF-MF occupational exposure may affect melatonin excretion.
Key words: ELF electromagnetic fields, 6-hydroxymelatonin sulfate,
urinary excretion, occupational exposure.
Introduzione
Sebbene alcuni studi epidemiologici suggeriscano un aumento
del rischio di talune patologie, quali le leucemie o la depressione,
in relazione alla esposizione occupazionale a campi magnetici
indotti dalla corrente elettrica (Extremely Low Frequency
o ELF), i risultati della ricerca sono molto contrastanti (1). Uno
dei principali problemi nella valutazione complessiva dei dati è
la mancata dimostrazione di un meccanismo patogenetico. Tra i
meccanismi ipotizzati, quello che ha destato maggiore interesse è
una possibile interferenza degli ELF sul picco notturno della melatonina;
i risultati degli studi finora condotti, però, sono contrastanti
ed inconclusivi (1). Una delle principali critiche mosse agli
studi sugli effetti degli ELF, che potrebbe spiegare la scarsa coerenza
dei risultati, è una inaccuratezza nella valutazione dell’esposizione,
spesso basata su dati qualitativi o su misurazioni inadeguate
(2). Per superare tale problema può essere adottata la dosimetria
personale che, sebbene relativamente costosa e complessa
dal punto di vista organizzativo, è certamente molto più
rappresentativa della esposizione individuale. In questo lavoro
presentiamo i risultati di uno studio sugli effetti della esposizione
occupazionale a campi magnetici ELF a carico della secrezione
di melatonina. L’esposizione è stata misurata mediante campionamento
personale protratto per più turni lavorativi.
Materiali e metodi
Sono stati studiati 73 lavoratori, addetti a 17 diverse mansioni
in vari comparti produttivi e nei servizi. L’anamnesi lavorativa,
fisiologica e patologica è stata raccolta mediante questionario. Sono
stati esclusi i lavoratori con forme neoplastiche anche pregresse
e quelli con patologie, o che facevano uso di farmaci in grado
di interferire con la melatonina, od addetti a turni notturni. L’esposizione
ai campi magnetici ELF è stata misurata con campionatori
personali EMDEX LITE (Enertech Consultants, Cambpell,
CA, USA) indossati alla cintura per tre turni lavorativi (intervallo
di campionamento: 10 secondi). I valori di esposizione sono
espressi come Time Weighted Average (TWA). La secrezione di
melatonina è stata valutata attraverso il dosaggio del suo principale
metabolita, la 6-idrossimelatonina solfato (6-OHMS), in
campioni della prima urina del venerdì mattina (per valutare l’eventuale
effetto correlato alla esposizione professionale ad ELF),
e del lunedì successivo (al fine di verificare i valori in assenza di
esposizione professionale). I dosaggi sono stati effettuati con il
metodo radioimmunologico di Aldous e Arendt (3). È stata misurata
anche la creatinina. L’escrezione di 6-OHMS è stata espressa
in funzione della creatinina urinaria (ng/mg di creatinina).
Risultati
I lavoratori sono stati suddivisi in 3 gruppi in funzione dell’esposizione:
≤ 0,2 µT, 0,2 - 1 µT e ≥ 1 µT. Non è stata osservata
alcuna differenza significativa nei valori di 6-OHMS urinario
tra i gruppi a differente esposizione nei campioni raccolti al venerdì
né in quelli del lunedì (Tabella 1). Mediante analisi per dati
appaiati è stata anche esclusa una variazione significativa tra i
valori di 6-OHMS al venerdì ed al lunedì nello stesso individuo.
L’assenza di una relazione tra valori di 6-OHMS ed esposizione
è confermata anche con analisi della regressione multipla. Infine,
un’eventuale relazione tra variazione lunedì/venerdì della melatonina
ed esposizione è stata ulteriormente studiata calcolando,
per ogni lavoratore, il rapporto tra i valori del 6-OHMS al venerdì
ed al lunedì ed i valori di esposizione TWA: anche in questo caso,
però, non è stata riscontrata alcuna differenza significativa tra
i gruppi a differente esposizione (Tabella 1). L’assenza di una tale
relazione significativa è stata confermata mediante analisi della
regressione multipla.
Discussione e Conclusioni
L’esposizione a campi magnetici ELF non sembra influenzare
l’escrezione di 6-OHMS urinaria. I risultati non possono essere
stati influenzati da fattori noti in grado di interferire sulla melatonina,
quali turni notturni, malattie e/o uso di farmaci, che sono
stati esclusi mediante selezione preliminare del campione.
Anche l’interferenza di fattori quali età, sesso, durata del sonno,
fumo ed alcool è stata controllata mediante studio dell’analisi
multivariata. Il problema della inaccuratezza della stima dell’esposizione
è stato affrontato effettuando un campionamento personale
per più turni lavorativi completi. La secrezione di melatonina
è stata stimata mediante dosaggio RIA della 6-OHMS, che
rappresenta la metodica applicata negli studi recenti sulla melatonina
e sulle sue variazioni connesse a fattori ambientali. Per tutte
queste ragioni riteniamo che i risultati ottenuti riflettano correttamente
l’effettivo fenomeno biologico. Il possibile effetto dei
campi magnetici ELF sulla melatonina rimane controverso (1, 2):
i nostri dati non sono indicativi di alcuna interferenza della esposizione
professionale sulla secrezione di quest’ormone.
Bibliografia
Tabella I. Valori di 6-OHMS (ng/mg di creatinina)
misurati il venerdì e lunedì mattina in lavoratori
a diversa esposizione a ELF
ESPOSIZIONE VENERDI LUNEDI
RAPP.
LUN/VEN
N media ± DS N media ± DS N media ± DS
≤ 0,2 µT 31 27,75 8,97 31 28,93 11,23 26 1,04 0,49
0,2 µT < 1 µT 21 33,46 13,80 15 31,01 12,61 14 1,16 0,33
≥ 1 µT 8 33,84 8,01 13 37,51 12,46 7 1,00 0,45
I valori si riferiscono a campioni di urina raccolti il venerdi mattina ed il lunedì successivo
e al rapporto tra i valori del venerdì e del lunedì. Né i valori di 6-OHMS al
Venerdì e al Lunedì, né il loro rapporto differiscono significativamente tra i gruppi
a differente esposizione.
1) NRPB: ELF Electromagnetic Fields and the Risk of Cancer. National
Radiological Protection Board, Doc NRPB 2001;12(1).
2) ICNIRP. International Commission for Non Ionizing Radiation Protection.
Standing Committee on Epidemiology: Review of the Epidemiologic
Literature on EMF and Health. Environ Health Perspect.
2001; 109 (Suppl 6): 911-33.
3) Aldous M.E., Arendt J. Radioimmunoassay for 6-sulphatoxymelatonin
in urine using an iodinated tracer. Ann.Clin.Biochem.1988; 25:
298-303.

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 67
M. Goldoni 1,2 , S. Catalani 3 , G. De Palma 1,2 , P. Manini 1,2 , O. Acampa 2 , M. Corradi 1,2 , R. Bergonzi 3 , P. Apostoli 3 , A. Mutti 2
Il condensato dell’aria espirata come nuova matrice per la determinazione
d’indicatori di dose e d’effetto in lavoratori esposti a cobalto e tungsteno
1 Centro Studi e Ricerche I.S.P.E.S.L., Università di Parma
2 Dipartimento di Clinica Medica, Nefrologia e Scienze della Prevenzione, Università di Parma
3 Dipartimento di Medicina Sperimentale ed Applicata, Università di Brescia
RIASSUNTO. Lo scopo dello studio era valutare se il condensato
dell’aria espirata (CAE) possa essere proposto come nuova matrice biologica
per valutare indicatori di dose ed effetto in lavoratori esposti a metalli
duri, quali cobalto (Co) e tungsteno (W), usando la malondialdeide
(MDA) come indicatore di danno ossidativo polmonare. I livelli di Co e
W nel CAE a fine turno erano più elevati rispetto ai livelli osservati prima
del turno lavorativo. I livelli di MDA nel CAE erano positivamente
correlati con la concentrazione di Co nel CAE ma non con i livelli di Co
nell’urina. Questi dati indicano la utilità del CAE per integrare le procedure
di monitoraggio biologico sui lavoratori esposti.
Parole chiave: espirato condensato, cobalto, tungsteno, malondialdeide,
monitoraggio biologico.
ABSTRACT. EXHALED BREATH CONDENSATE AS A NEW MATRIX FOR
ASSESSING DOSE AND EFFECT MARKERS IN WORKERS EXPOSED TO COBALT
AND TUNGSTEN. The study was performed to assess whether exhaled
breath condensate (EBC) could be used as a suitable matrix for evaluating
tissue dose and effects in workers exposed to cobalt (Co) and tungsten
(W), using EBC malondialdehyde (MDA) as a biomarker of lung
oxidative stress. Co and W in EBC were higher at the end of the work
shift in comparison to pre-exposure values and MDA levels were correlated
with Co levels in EBC. This correlation, however, was not observed
with urinary concentration of either element. The results suggest the usefulness
of EBC for integrating traditional biomonitoring among exposed
workers.
Key words: exhaled breath condensate (EBC), cobalt, tungsten, malondialdehyde,
biological monitoring.
Introduzione
L’esposizione professionale a cobalto (Co) può portare a
varie affezioni polmonari, quali la polmonite, la fibrosi e l’asma
bronchiale. Anche se i meccanismi della tossicità polmonare
indotta dal Co non sono completamente noti, dati sia in
vivo che in vitro sembrano dimostrare che il Co induca la generazione
di specie reattive dell’ossigeno (ROS), con conseguente
stress ossidativo. Inoltre, sembra che la generazione di
ROS indotta dal Co sia potenziata dalla co-esposizione a tungsteno
(W), in particolare a carburo di W, attraverso un mecca-
nismo fisico-chimico di
interazione. Il Co e il W
sono essenzialmente assorbiti
per via inalatoria,
ed in minor parte per via
cutanea e digestiva. I
metalli sono poi escreti
per via urinaria, e la loro
determinazione è attualmente
utilizzata per il
monitoraggio biologico
nei lavoratori esposti.
Tuttavia, i livelli di Co e
W nell’urina costituiscono
un indicatore di
dose sistemica, e non di
dose al bersaglio, in questo caso il polmone. Il condensato
dell’aria espirata (CAE), liquido che si forma raffreddando
l’esalato, è stato proposto come nuovo metodo per campionare
il fluido di rivestimento bronco-polmonare, quindi potenzialmente
utile per ottenere informazioni sulla dose e sull’effetto
al bersaglio.
Lo scopo del presente studio è stato valutare se il CAE possa
essere utilizzato per la determinazione di indicatori di esposizione,
come Co e W, e di effetto, come la malondialdeide (MDA)
quale indicatore di stress ossidativo, in lavoratori esposti a metalli
duri.
Materiali e metodi
Trentatrè lavoratori esposti a Co e W nella lavorazione di
utensili diamantati e di parti meccaniche hanno partecipato a questo
studio. Ogni soggetto è stato valutato all’inizio e alla fine di
una tipica giornata lavorativa. Durante ogni valutazione i soggetti
hanno raccolto il CAE ed un campione di urina. Campioni di
urina e di CAE sono anche stati raccolti in un gruppo di soggetti
sani professionalmente non esposti a metalli duri (gruppo di controllo).
Il CAE è stato raccolto raffreddando l’aria espirata a volume
corrente in un apposito “device” di polipropilene. Il Co, il
We la MDA nel CAE sono stati analizzati con i metodi analitici
basati sulla spettrometria di massa.
Risultati
La Tabella I riassume i dati relativi al monitoraggio biologico.
Nel CAE dei soggetti di controllo, il Co era rilevabile a livelli
molto bassi, mentre il W non era dosabile. Nei lavoratori esposti,
i livelli di Co nel CAE variavano da alcuni a diverse centinaia
di nmol/L. I corrispettivi livelli di W nel CAE andavano da livelli
non dosabili a parecchie decine di nmol/L. I livelli sia di Co che
di W nel CAE e nell’urina erano più alti alla fine del turno lavorativo
rispetto all’inizio del turno.
Tabella I. Livelli di indicatori biologici a fine turno lavorativo nel CAE e nell’urina
dei lavoratori esposti e dei controlli. I dati sono espressi come mediana e interquartili

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
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Figura 1. Correlazione tra concentrazione di MDA e quella
di Co nel CAE di lavoratori
Nel CAE, i livelli di MDA erano positivamente correlati
con i rispettivi livelli di Co, e laddove era presente co-esposizione
a W, questa determinava un ulteriore incremento nei livelli
di MDA (Figura 1). Al contrario, i livelli di MDA nel
CAE non correlavano con le concentrazioni urinarie di Co
(Figura 2).
C. Grandi, N. Vonesch, S. Signorini
Figura 2. Correlazione tra concentrazione di MDA nel CAE e
quella di Co nell’urina dei lavoratori
Conclusioni
Questi risultati indicano l’utilità potenziale del CAE come
nuova matrice da utilizzare per il monitoraggio biologico e per le
procedure di controllo sanitario fra i lavoratori esposti alle miscele
di metalli duri.
Impiego di biosensori nel monitoraggio dell’esposizione lavorativa
ad agenti biologici: analisi della letteratura
ISPESL, Dipartimento Medicina del Lavoro, Monteporzio Catone (RM)
RIASSUNTO. L’aria rappresenta uno dei principali veicoli per le infezioni
nosocomiali, il cui controllo può porre problemi in parte simili a quelli
relativi all’identificazione e al monitoraggio dei contaminanti biologici aerodispersi
negli ambienti confinati. Le attuali metodologie di campionamento
e quantificazione degli agenti biologici nell’aria ambiente presentano
una serie di limitazioni che possono essere superate dall’impiego di metodi
innovativi. Tra questi, i biosensori sono i più promettenti. Al momento, sono
stati allestiti una serie di immunosensori e di sensori a DNA per rilevare
specifici ceppi batterici e virali, ma tutti evidenziano alcuni tipi di limitazione.
La sfida è rappresentata dalla messa a punto di biosensori in grado di
operare in fase gassosa, con elevata specificità e sensibilità, possibilità di misure
ripetute, controllo in remoto, rapidità di misura e bassi costi.
Parole chiave: biosensori, agenti biologici, infezioni nosocomiali.
ABSTRACT. USE OF BIOSENSORS IN THE ASSESSMENT OF OCCUPA-
TIONAL EXPOSURE TO BIOLOGICAL AGENTS: REVIEW OF THE LITERATURE.
Air is one of the most important vehicle for nosocomial infections, whose
control may pose problems partly similar to those concerning the identification
and monitoring of airborne biological contaminants in indoor
environments. The current methodologies for sampling and quantifying
biological agents in ambient air have various limitations which can be
overcome by innovative methods, of which biosensors are the most promising.
A series of immunosensors and DNA sensors have been set up to
monitor specific strains of bacteria and viruses, but all demonstrate some
disadvantages. The challenge is to create biosensors capable of operating
in gaseous phase, with high specificity and sensitivity, capable of repeated
and rapid measures, remote control, and low costs.
Key words: biosensors, biological agents, nosocomial infections.
Introduzione
Negli ambienti di lavoro l’aria rappresenta un importante veicolo
per agenti biologici. In particolare negli ambienti di lavoro
confinati è importante rilevare sia la carica microbica totale (indice
di tipo igienistico) sia la ricerca di specie o ceppi che possono
assumere rilevanza per quanto riguarda il rischio di infezioni
in relazione al settore di attività. I metodi di determinazione disponibili
(soprattutto quelli basati sul campionamento attivo dell’aria
e sulla messa in coltura, identificazione e conta microbica)
per quanto ruotinariamente utilizzati non sono ancora in molti casi
standardizzati e validati (1) e presentano limitazioni in riferimento
ad accuratezza, precisione, tempi di esecuzione, necessità
di strutture laboratoristiche adeguate, costi. Metodi innovativi basati
su campionamento e misura di costituenti macromolecolari
microbici non sono ancora stati validati, necessitano di dotazioni
laboratoristiche e possono presentare costi elevati (2).
Le infezioni nosocomiali sono definite come infezioni acquisite
durante la degenza in ospedale, che non sono presenti o in fase
di incubazione al momento dell’ammissione nella struttura sanitaria.
Tali infezioni interessano prevalentemente i pazienti ospedalizzati,
ma possono anche essere acquisite, meno frequentemente, dal
personale sanitario coinvolto nell’assistenza (3). Il controllo delle
infezioni ospedaliere è parte del più generale programma di controllo
delle contaminazioni biologiche in ambiente sanitario. Parte
imprescindibile di tale programma è rappresentata dal monitoraggio
dei livelli di contaminazione, sia generali (cariche microbiche)
sia specifici (ricerca di singole specie e/o ceppi), non solo per
quanto riguarda le matrici biologiche del paziente, gli indumenti, i
supporti e presidi sanitari e le superfici esposte, ma anche in relazione
all’aria ambiente, che rappresenta un veicolo non secondario
per numerosi agenti infettanti e investe le problematiche più generali
del controllo microbiologico negli ambienti confinati (indoor).
In questo contesto si ritiene che un approccio di svolta ai problemi
posti dal monitoraggio microbico in aria possa essere rap-

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 69
presentato dalla messa a punto di biosensori per la determinazione
diretta di agenti biologici nell’aria ambiente.
Biosensori per la determinazione di agenti biologici
Per biosensore si intende un dispositivo analitico costituito da
un elemento sensibile di natura biologica (sensore) accoppiato ad
un trasduttore di segnale. Il sensore può essere rappresentato da
un enzima che catalizza una specifica reazione che coinvolge la
molecola dell’analita, da un anticorpo che lega in modo specifico
la molecola dell’analita, da cellule batteriche in grado di utilizzare
l’analita come substrato, da sequenze oligonucleotidiche in grado
di legare sequenze complementari o di subire modificazioni
chimiche a contatto con alcune classi di analiti (genotossici), etc.
Il trasduttore è interfacciato direttamente all’elemento sensibile
ed è in grado di convertire il segnale biochimico di quest’ultimo
in un segnale di tipo diverso, elettrico o ottico (elaborato e visualizzato
su display o trasmesso a postazioni remote). I vantaggi potenziali
connessi all’impiego di biosensori nelle determinazioni
analitiche sono riassumibili in: 1) elevata specificità e sensibilità;
2) rapidità di risposta; 3) eliminazione della fase di pretrattamento
del campione; 4) possibilità di determinazione ripetute o, al limite,
in continuo; 5) compattezza e portatilità del dispositivo; 6) possibilità
di trasmissione dei dati a distanza on line; 7) costi ridotti.
Numerose rassegne sono disponibili in letteratura sullo stato
dell’arte o sugli sviluppi di ricerca per quanto riguarda specifici
ambiti di impiego (fondamentalmente clinico, del controllo alimentare
e della ricerca di inquinanti nelle acque e dei suoli) o categorie
di biosensori (4, 5). Relativamente a biosensori per rilevare
microrganismi, virus e agenti biologici in generale l’ambito
che ha ricevuto maggior impulso è quello legato alla sicurezza
alimentare, in relazione all’identificazione di contaminazioni microbiche
di alimenti come latte e carni da parte di specie quali E.
coli e Salmonella. Anche le acque reflue (controllo ambientale) e
i fluidi biologici (diagnostica clinica) sono sempre più oggetto di
ricerca in relazione alla messa a punto di biosensori per l’identificazione
e la quantificazione di agenti biologici (6).
I biosensori per agenti biologici allestiti fino ad ora sono riconducibili
a due fondamentali classi: ad anticorpi e ad acidi nucleici.
In relazione ai primi si dispone dell’esperienza più consolidata.
Anticorpi specifici nei confronti di antigeni di superficie
(proteine batteriche e/o virali) sono immobilizzati su supporto e
accoppiati ad un sistema di trasduzione. Le prestazioni, soprattutto
in termini di sensibilità, di intervallo dinamico e di rigenerazione
dell’elemento sensibile sono molto variabili, in relazione
alla natura del complesso antigene-anticorpo, al sistema di trasduzione
e alla matrice di indagine. In alcuni casi sono confrontabili
con quelle di metodi ormai consolidati (es. saggio ELISA)
o addirittura superiori (7). Attualmente la messa a punto di sensori
capaci di operare in aria è ostacolata dalla necessità della
presenza di una matrice liquida a livello della quale possa avvenire
il legame antigene-anticorpo.
I biosensori ad acidi nucleici hanno una struttura di base costituita
da sequenze oligonucleotidiche a singolo filamento immobilizzate
su supporto (che può fungere o meno da trasduttore). Il legame
a dette sequenze di sequenze complementari o di parti di sequenze
complementari (sequenze target) determina una modificazione
(aumento di massa, variazione di potenziale, variazione della
frequenza basale di oscillazione) che può essere trasdotta in segnale
elettrico o ottico. Le problematiche operative connesse alla
preparazione di sensori ad acidi nucleici (genosensori) sono state
recentemente prese in rassegna (8). La sequenza complementare da
rilevare è costituita nella maggior parte dei casi dalla sequenza di
un gene caratteristico di una determinata specie o ceppo microbico
o da una sequenza di DNA virale. Di solito il sensore è accoppiato
con un elettrodo, ma sono stati realizzati sensori a DNA abbinati a
sistemi di trasduzione diversi. I biosensori ad acidi nucleici hanno
il vantaggio di un’elevatissima specificità e richiedono tempi ridotti.
Possono però presentare problemi per quanto riguarda la rigenerazione
dell’elemento sensibile: è infatti necessario dissociare
l’ibrido formatosi tra la sequenza bersaglio e la sequenza sensing.
Idealmente la sensibilità di questi dispositivi consente di rilevare la
presenza di una singola sequenza target presente nella matrice liquida.
La sequenza bersaglio deve però trovarsi libera nel mezzo:
ciò implica di solito la necessità di una fase di estrazione degli acidi
nucleici dalle cellule batteriche o dalle particelle virali. L’estrazione
potrebbe non essere necessaria se nel mezzo è presente acido
nucleico libero derivato da morte e sfaldamento di alcuni dei
corpi cellulari batterici o da disgregazione di particelle virali. In secondo
luogo, per la maggior parte dei sistemi realizzati finora è in
pratica necessaria una fase di amplificazione preanalitica della sequenza
bersaglio eventualmente presente tramite PCR. Infine la sequenza
bersaglio deve essere a singolo filamento, allo scopo di permettere
l’ibridazione con la sequenza sensing: ciò implica una fase
di denaturazione post-amplificazione.
Conclusioni
Il panorama tracciato è in rapida evoluzione. La miniaturizzazione
dei dispositivi e l’ottimizzazione delle fasi di realizzazione
e montaggio della componentistica stanno portando anche
ad una progressiva contrazione dei costi. Nell’insieme i sensori a
DNA per agenti biologici realizzati assicurano per ora un importante
vantaggio: l’eliminazione della corsa elettroforetica degli
amplificati e della successiva identificazione delle bande, con sostanziale
riduzione dei tempi di analisi e della dotazione strumentale
necessaria.
Un ambito gravido di rapidi sviluppi è rappresentato dalla
realizzazione di sensori multisequenza tramite l’allestimento di
DNA arrays, in grado di rilevare simultaneamente più sequenze
di acido nucleico e quindi potenzialmente più di un agente biologico
in contemporanea. L’altro ambito (di difficile percorso ma
fortemente innovativo) è dato dall’allestimento di sensori a DNA
per la determinazione di sequenze di acido nucleico libere in aria,
indispensabile sulla base dell’insieme delle considerazioni fin qui
formulate per il monitoraggio di agenti microbici, inclusi quelli
responsabili di infezioni nosocomiali. Dai dati emersi fino ad oggi
per entrambe le categorie di biosensori (ad acido nucleico o ad
anticorpi) si evidenziano in ogni caso prospettive interessanti a
fronte delle criticità riscontrate.
Bibliografia
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J Hosp Infect 2000; 46: 241-256.
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and exposure assessment: progress and prospects. Ann Occup Hyg
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3) World Health Organization. Prevention of hospital-acquired infections.
A practical guide 2 nd edition. WHO, 2002:
http://www.who.int/emc.
4) Nakamura H, Karube I. Current research activity in biosensors. Anal
Bioanal Chem 2003; 377: 446-468.
5) Rodriguez-Mozaz S, Marco MP, Lopez de Alda MJ, Barcelo’ D. Biosensors
for environmental monitoring of endocrine disruptors: a review
article. Anal Bioanal Chem 2004; 378: 588-598.
6) D’souza SF. Microbial biosensors. Biosens Bioelectron 2001; 16:
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7) Mello LD, Kubota LT. Review of the use of biosensors as analytical
tools in the food and drink industries. Food Chem 2002; 77: 237-256.
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electrodes as electrochemical transducers for DNA hybridisation
sensors. Biosens Bioelectron 2004; 19: 515-530.

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
70 www.gimle.fsm.it
G. Lacca 2 , A. Provenzani 2 , S. Schillaci 1 , M.G. Verso 1 , D. Picciotto 1
Prevalenza di anticorpi anti-HCV ed anti-HBV nei lavoratori
della sanità di un nosocomio palermitano
1 Sezione di Medicina del Lavoro, Dipartimento di Medicina Clinica e delle Patologie Emergenti Università degli Studi di Palermo
2 Dipartimento di Scienze Farmacologiche, Università degli Studi di Palermo
RIASSUNTO. Scopo del presente lavoro è quello di stimare la prevalenza
del rischio dell’infezione da HCV ed HBV del personale sanitario
di un ospedale di Palermo confrontando tale risultato con un gruppo
di controllo costituito da donatori di sangue italiani. Dallo studio è emerso
che la prevalenza nei lavoratori della sanità è risultato inferiore di circa
la metà rispetto a quella dei donatori di sangue. È nostra opinione,
quindi, che le misure preventive, già attuate tra il personale sanitario, siano
state efficaci ed attente.
Parole chiave: HCV e HBV prevalenza, personale sanitario.
ABSTRACT. PREVALENCE OF ANTI-HCV AND ANTI-HBV ANTI-
BODY IN A HOSPITAL’S SANITARY PERSONNEL
The project aim is to estimate HCV and HBV infection risk prevalence,
in a hospital’s sanitary personnel, in comparison with a control
group consisting in Italian blood donors. We conclude that the sanitary
personnel prevalence is lower than blood donors one.We are of opinion
that preventive measures, carried out in sanitary personnel, are efficacious
and accurate.
Key words: HCV and HBV prevalence, sanitary personnel.
Introduzione
Il virus dell’epatite B è il principale rischio infettivo in ambiente
ospedaliero, sia per frequenza che per gravità. È ormai ampiamente
documentato nella letteratura scientifica che l’epatite virale
B insorge negli operatori sanitari con una frequenza maggiore rispetto
alla popolazione generale (3). In particolare il rischio di contrarre
un’epatite virale è maggiore per il personale di laboratorio,
per coloro che lavorano in sala autoptica e per chi opera in ambiente
chirurgico rispetto a coloro che operano in ambiente medico. Il
pericolo è legato all’esposizione ed alla manipolazione di materiale
biologico (derivati ematici) di pazienti infetti. I veicoli più importanti
dell’infezione sono rappresentati dal sangue e dai suoi derivati.
Oltre alla via parenterale apparente (ferite con aghi, bisturi, forbici
e/o altro materiale infetto) è ammessa una via parenterale inapparente
da penetrazione del virus attraverso lesioni di continuo difficilmente
individuabili di cute e mucose venute a contatto con materiale
biologico infetto (1). Anche lo sperma e le secrezioni vaginali,
la saliva, le lacrime ed il sudore dei soggetti infetti possono
contenere quantità potenzialmente infettanti di virus (3).
La trasmissione del virus C avviene per via parenterale. La
maggiore fonte di infezione è costituita dalla trasfusioni di sangue
e di derivati (concentrati piastrinici, fattori della coagulazione).
L’HCV è responsabile del 75% dei casi di epatite post-trasfusionale
(1). Il virus dell’epatite C non sembra dotato della
stessa pericolosità dell’HBV per gli operatori sanitari: il suo potere
infettante, soprattutto attraverso le mucose è minore, ed in
ambito sanitario la via di trasmissione più frequente è il contatto
del sangue infetto con il sangue dell’operatore.
Lo scopo del presente lavoro è stato quello di stimare la prevalenza
del rischio dell’infezione da HCV ed HBV nel personale
sanitario di un ospedale della città di Palermo confrontando tale
risultato con un gruppo di controllo costituito da donatori di sangue
italiani. Dall’analisi di precedenti studi analoghi e sovrapponibili,
si evince come il rischio occupazionale di trasmissione dei
virus sopra citati non ha una considerazione quantitativa univoca.
Materiali e metodi
Tutti i lavoratori della sanità (medici, infermieri professionali,
ausiliari socio-sanitari) di un nosocomio palermitano, potenzialmente
esposti al rischio biologico, sono stati sottoposti nel corso
del 2002 a sorveglianza sanitaria comprendente oltre l’anamnesi,
l’esame obiettivo, gli esami emato-chimici ed esami strumentali,
quali ECG, spirometria, audiometria, anche l’esecuzione di tests
evidenzianti anticorpi anti-HCV ed anti-HBV (anti-HBc, anti HBs
e anti-Hbe) dosati tramite tecnica ELISA di III generazione.
I tassi di sieroprevalenza del personale sanitario sono stati poi
comparati con i tassi provenienti dallo screening anti-HBV ed anti-HCV
dei donatori di sangue della popolazione italiana.
Risultati
Gli operatori sanitari esaminati nel corso dell’anno 2002 sono
stati 840. La prevalenza assoluta di soggetti anti-HCV positivi
è stata di 6 persone, cioè lo 0.71%; invece per quanto riguarda
l’HBV la prevalenza è stata di 10 soggetti, quindi l’1.19%. L’età
media dei primi era 51,16 aa con DS di 6,24 aa, quella dei secondi
48,12 aa con DS di 6,77 aa.
I soggetti positivi per HCV presentavano un’anzianità lavorativa
media di 22 aa e fra costoro vi erano: un ausiliario sociosanitario
del reparto di oculistica, un infermiere professionale di
sala operatoria del reparto di chirurgia pediatrica, un ferrista di
sala operatoria del reparto di ortopedia, un ausiliario socio-sanitario
del reparto di cardiologia, un infermiere professionale del
reparto di chirurgia oncologica ed un infermiere professionale del
reparto di chirurgia generale.
I soggetti positivi per HBV avevano un’anzianità lavorativa
di 14,5 aa e fra loro vi erano: un infermiere professionale del reparto
di chirurgia vascolare, un tecnico di laboratorio del servizio
immuno-trasfusionale, un caposala dell’unità di terapia intensiva
metabolica, un medico ed un infermiere professionale del reparto
di neurologia, un infermiere professionale del reparto di dermatologia,
un infermiere professionale del reparto di chirurgia toracica,
un agente socio-sanitario ed un infermiere professionale
del servizio AIDS, una infermiera professionale di sala operatoria
del reparto di ostetricia.
Inoltre come già accennato, sono stati valutati i tassi di prevalenza
di anticorpi anti-virus B e C dei donatori di sangue della
popolazione italiana, che sono risultati essere:
• 1.3% prevalenza di anticorpi antivirus C nei donatori di sangue;
• 2% prevalenza di anticorpi antivirus B nei donatori di sangue
del Nord d’Italia;
• 4% prevalenza di anticorpi antivirus B nei donatori di sangue
del Sud d’Italia.
Considerazioni e Conclusioni
Alla luce degli accertamenti effettuati nell’ambito della sorveglianza
sanitaria di soggetti esposti a rischio biologico di un
ospedale palermitano è emerso che la prevalenza nei lavoratori

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 71
della sanità è risultata inferiore di circa la metà rispetto a quella
dei donatori di sangue della popolazione italiana. È nostra opinione
quindi che le misure preventive, già attuate tra il personale
sanitario esposto a rischio biologico, siano state efficaci ed attente.
Le 2 strategie adottate per evitare il contagio da epatite sono:
la prevenzione generica, analoga a tutte le malattie a trasmissione
parenterale e la prevenzione specifica, solo però nel caso dell’HBV,
basata sull’immunizzazione attiva; purtroppo non esiste
al momento alcun vaccino o immunoglobulina contro l’HCV (3).
Quindi la prevenzione si basa sul controllo e sulla educazione sanitaria,
sullo screening del sangue e dei suoi derivati nell’ambito
della sorveglianza sanitaria effettuata dal medico competente e
sulla immunoprofilassi nel caso del virus dell’epatite B, che si
avvale di un efficace vaccino prodotto con DNA ricombinante.
Lo schema vaccinale prevede la somministrazione di 1 ml di vaccino
i.m. o sottocute (braccio, deltoide o coscia) ai tempi di 0, 1,
6 mesi. La risposta è considerata buona se il titolo anticorpale anti-HBsAg
è maggiore di 100 UI/l; accettabile con titolo tra 100 e
A. Lai, A. Gaiardo, A. Pulliero, E. Clonfero, S. Pavanello
10 UI/l; insufficiente se il titolo è inferiore a 10 UI/l. In tema di
profilassi da epatite C è indispensabile eseguire test immunologici
pretrasfusionali; va ricordato infatti che il test dell’anticorpo
anti-HCV è stato reso obbligatorio su tutte le unità di sangue nei
centri trasfusionali italiani fin dall’Agosto del 1990 (2).
Bibliografia
1) Terrana T, L’Abbate N. Il lavoro degli operatori della sanità. In L.
Ambrosi, V. Foà: Trattato di Medicina del Lavoro, UTET, Torino,
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3) Sali D. I fattori di rischio microbiologici. In F. Gobba, D. Sali: Rischi
professionali in ambito ospedaliero, McGraw-Hill, Milano,
1995; pp 13-41.
Influenza della riduzione del nucleotide excision repair e del genotipo GSTM1
nullo sui livelli di addotti al DNA nei leucociti mononucleati in lavoratori di
cokeria con elevate esposizioni ad idrocarburi policiclici aromatici
Sezione di Medicina del Lavoro, Dipartimento di Medicina Ambientale e Sanità Pubblica, Università degli Studi di Padova
RIASSUNTO. Abbiamo valutato l’influenza di quattro polimorfismi
dei geni nucleotide excision repair (NER) e quella del glutatione S-transferasi
µ 1 (GSTM1-attivo o nullo) sui livelli di addotti al DNA dell’anti-benzo[a]pirene
diol epossido (BPDE) dalla frazione di linfociti e monociti
(LMF) di 67 lavoratori di cokeria esposti ad elevati livelli di idrocarburi
policiclici aromatici (PAH). I livelli di addotti al DNA anti-BPDE
sono stati determinati tramite l’analisi HPLC/fluorescenza. I genotipi sono
stati determinati tramite PCR sul DNA genomico di ogni soggetto. Abbiamo
trovato che i livelli di addotti al DNA anti-BPDE nella LMF dei
lavoratori della cokeria erano significatimente aumentati dalla bassa capacità
di riparazione del DNA dei genotipi XPC-PAT+/+ e XPA-A23A.
Inoltre, gli addotti al DNA sono fortemente influenzati dal genotipo
GSTM1. La frequenza più elevata di lavoratori con genotipo NER sfavorevole
XPC-PAT+/+ e XPA- A23A, solo o combinato con il genotipo
GSTM1-nullo, apparteneva al terzile con il più alto livello di addotti, essendo
XPC-PAT +/+ e XPA-A23A significativamente presenti in circa 2/3
dei soggetti. La minoranza di soggetti con il genotipo NER sfavorevole
XPC-PAT +/+ e XPA- A23A insieme con GSTM1 nullo appartengono tutti
ai due terzili più alti di addotti e nel 75% a quello più alto. L’analisi della
regressione lineare multipla mostrava che i livelli di addotti al DNA anti-BPDE
nella LMF erano significativamente correlati all’esposizione
PAH, alla mancanza di attività di GSTM1 e alla bassa capacità di riparazione
del DNA del genotipo XPC-PAT +/+. L’influenza del genotipo
XPA-A23A non è stata evidenziata in questa analisi statistica e non è stata
trovata nessuna associazione di polimorfismi XPD, abitudini alimentari
e fumo di tabacco con gli addotti al DNA anti-BPDE. La modulazione
degli addotti al DNA anti-BPDE nella frazione linfomonocitica da parte
di GSTM1-nullo e di alcuni genotipi NER a bassa attività può essere considerata
come potenziale fattore di suscettibilità genetica capace di modulare
la risposta individuale all’esposizione genotossica a PAH e un conseguente
rischio di cancro nei lavoratori di cokeria.
Parole chiave: polimorfismo genetico, glutatione-S-transferasi µ1
(GSTM1), addotti al DNA, anti-benzo[a]pirene diol epossido (BPDE),
idrocarburi policiclici aromatici, lavoratori di cokeria.
ABSTRACT. EFFECT OF NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR AND GSTM1
NULL POLYMORPHISMS ON THE LEVELS OF DNA ADDUCTS IN LYMPHOCYTES
OF COKE-OVEN WORKERS HIGHLY EXPOSED TO PAH. We evaluated the influence
of four polymorphisms of nucleotide excision repair (NER) genes
and that of glutathione S-transferase µ 1 (GSTM1-active or -null) on antibenzo[a]pyrene
diol epoxide (BPDE)-DNA adduct levels from the
lymphocyte plus monocyte fraction (LMF) of 67 highly PAH (polycyclic
aromatic hydrocarbons)-exposed coke oven workers. The bulky anti-BP-
DE-DNA adduct levels were detected by HPLC/fluorescence analysis.
Genotypes were determined by PCR on the genomic DNA of each subject.
We found that anti-BPDE-DNA adduct levels in the LMF of coke oven
workers were significantly increased by the low DNA repair capacity of
XPC- PAT +/+ and XPA- A23A genotypes. Moreover, DNA adducts are
strongly influenced by GSTM1 genotype. The higher frequencies of
workers with unfavourable XPC- PAT +/+ and XPA- A23A NER genotypes,
alone or combined with GSTM1-null genotype belonged to the tertile
with the highest adduct level, XPC- PAT +/+ and XPA- A23A being significantly
present in about two-thirds of the subjects. The few subjects with
unfavourable XPC- PAT +/+ and XPA- A23A NER genotypes, together
with GSTM1-null deletion, all belonged to the two higher adduct tertiles
and in 75% to the highest one. Multiple linear regression analysis showed
that anti-BPDE-DNA adduct levels in LMF were significantly related to
PAH exposure, to the lack of GSTM1 activity and to the low DNA repair
capacity of XPC- PAT +/+ genotype. The influence of the XPA-A23A genotype
was not evident in this statistical analysis, and no association of
XPD polymorphisms, dietary habits and tobacco smoking with anti-BP-
DE-DNA adducts was found. The modulation of anti-BPDE-DNA adducts
in the LMF by GSTM1-null and some low-activity NER genotypes may be
considered as potential genetic susceptibility factors capable of modulating
the individual response to PAH (BaP: benzo[a]pyrene) genotoxic exposure
and a consequent risk of cancer in coke oven workers.
Key words: genetic polymorphism, glutathione-S-transferase µ1
(GSTM1), DNA adducts, anti-benzo[a]pyrene diol epoxide (BPDE),
polycyclic aromatic hydrocarbons, coke oven workers.

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
72 www.gimle.fsm.it
Introduzione
Nell’uomo esiste una considerevole variabilità interindividuale
in risposta all’esposizione a PAH genotossici e conseguente rischio
di cancro. Gli addotti al DNA indotti dal BaP nei leucociti
mononucleati possono essere considerati un marker non solo di
esposizione genotossica a BaP ma anche delle capacità individuali
di metabolizzarlo e di riparare il DNA. L’attivazione del BaP genera
anti-BPDE, l’intermedio più reattivo; la reazione di detossificazione,
catalizzata da GSTM1 può prevenire il suo legame al
DNA, fase critica nel processo di cancerogenesi. Gli addotti al
DNA possono essere rimossi dal meccanismo nucleotide excision
repair (NER), uno dei vari processi di riparazione del DNA di cui
recentemente sono stati identificati alcuni polimorfismi (1). Nel
nostro studio abbiamo valutato l’influenza di quattro polimorfismi
dei geni NER insieme con quello del GSTM1 sugli addotti al DNA
anti-BPDE di lavoratori della cokeria esposti ad alti livelli di PAH.
Materiali e metodi
Da una popolazione di 95 soggetti è stato
estratto un campione di 67 lavoratori maschi
che presentavano un livello urinario post turno
di 1-pirenolo superiore al BEI (2.28 µmoli/mol
di creatinina). Per ogni soggetto sono
state raccolte, mediante questionario, informazioni
riguardo età, fumo di tabacco, consumo
di carne cotta alla brace, esposizione occupazionale
e ambientale a PAH e uso di pomate e
shampoo a base di catrame. Sono stati raccolti
campioni di urine (50 ml) e sangue (20 ml)
alla fine del turno di lavoro dopo almeno tre
giorni consecutivi di lavoro. I campioni di urine
sono stati usati per la determinazione
dell’1-pirenolo e i campioni di sangue per la
genotipizzazione e la rilevazione degli addotti
al DNA anti-BPDE tramite l’analisi
HPLC/fluorescenza dell’anti-BPDE tetrol I-1
rilasciato dopo idrolisi acida dei campioni di
DNA di linfomonociti (2). Dopo l’isolamento
del DNA dalle cellule è stata valutata la presenza
o assenza del gene GSTM1 tramite metodo
PCR e sono stati determinati quattro polimorfismi
NER con tecnica PCR-RFLP.
L’analisi statistica tra i vari gruppi è stata
eseguita usando il test non parametrico
Mann-Whitney o il test Chi quadrato. L’analisi
mediante regressione multipla è stata
usata per stimare l’influenza dell’esposizione
professionale a PAH, del GSTM1 e di
quattro polimorfismi dei geni NER sui livelli
di addotti al DNA anti-BPDE.
Risultati e Discussione
La Tabella I mostra le frequenze di
GSTM1 attivo e nullo e i polimorfismi del
gene NER con i relativi livelli di 1-pirenolo
e di addotti al DNA anti-BPDE. Il genotipo
GSTM1 nullo è strettamente associato alla
formazione degli addotti. Inoltre, soggetti
omozigoti per XPC-PAT +/+ e genotipo
XPA-A23A mostravano un significativo incremento
nei livelli di addotti rispetto a
quelli con nessuna o solo 1 copia di questi
polimorfismi. L’altro sottogruppo di lavoratori con la variante
XPD-312Asn e XPD-751Gln presentava livelli di addotti al DNA
più alti rispetto a quelli con alleli wild-type ma la differenza non
era statisticamente significativa.
La Tabella II mostra le frequenze di genotipi NER sfavorevoli,
soli o in combinazione con GSTM1 nullo, secondo i tre livelli di addotti.
Soggetti con genotipo XPC-PAT +/+ e XPA-A23A appartenevano
al livello di addotti più alto. I pochi soggetti con genotipo sfavorevole
XPC-PAT +/+ e XPA-A23A insieme con GSTM1 nullo
appartenevano ai due livelli di addotti più elevati e il 75% al più elevato.
Non è stata invece osservata una distribuzione anomala dei
soggetti nei tre livelli di addotti nel caso di polimorfismi XPD.
La Tabella III mostra i risultati dell’analisi mediante la regressione
lineare multipla dell’influenza dell’esposizione occupazionale
a PAH, della dieta e della abitudine al fumo, dei genotipi
NER e del GSTM1 sui livelli di addotti al DNA anti-BPDE.
L’aumento dei livelli di addotti era significativamente correlato
Tabella I. Livelli di addotti al DNA anti-BPDE in LMF di lavoratori della cokeria
esposti ad alti livelli di PAH, rapportati a genotipi GSTM1 e NER
a Un valore di 1 addotto/108 nucleotidi è stato assegnato all’unico soggetto con addotti non-rilevabili
(≤1 addotto/108 nucleotidi).
* Comparazione statistica: Mann-Whitney U-test tra sottogruppi GSTM1, p=0.0246, z= 2.247; XPC - PAT
-/-versus +/+ z=2.24 p=0.02, XPA - A23G GG versus AA e AG versus AA z=2.65 p= 0.01 e z=2.15 p=0.03.
Tabella II. Frequenza di genotipi non favorevoli NER (XPC- PAT +/+, XPA-
A23A; XPD-Asn312Asn e XPD- Gln751Gln), soli o in combinazione con GSTM1
nullo, rapportati ai livelli di addotti al DNA anti-BPDE
a Terzili dei livelli di addotti: 1° terzile (≤2.27 addotti/ 10 8 nucleotidi), 2° terzile (>2.27 ≤4.11 addotti/
10 8 nucleotidi) e 3° terzile(>4.11 addotti/ 10 8 nucleotidi).
* Confronto Statistico: Chi 2 test tra le frequenze del 1° e 3° terzile XPC- PAT +/+ e XPA- A23A Chi 2
=5.85, p= 0.0156 e Chi 2 =5.40, p= 0.01.

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 73
Tabella III. Influenza dell’esposizione occupazionale a PAH, fumo, dieta, GSTM1 e genotipi NER sui livelli di addotti
al DNA anti-BPDE (in valore) in LMF di 67 lavoratori della cokeria: analisi della regressione lineare multipla
a Esposizione a PAH valutata tramite l’escrezione urinaria di 1-pirenolo.
b Genotipi GSTM1, abitudine al fumo, e dieta sono considerate variabili dicotomiche; è stato attribuito un valore 1 o 0, riferendoci a GSTM1 attivo o nullo in fumatori
o non fumatori, consumo di carne cotta alla brace più o meno di 1 volta a settimana, rispettivamente.
c Per ogni genotipo NER è stato attribuito un valore di 2, 1 o 0 in base alla presenza di 2, 1 o nessuna copia di alleli XPC- PAT +, XPA- 23A, XPD- 312 Asn e
XPD- 751 Gln.
F= 2.928, p=0.0081
all’intensità dell’esposizione occupazionale a PAH di ogni soggetto,
alla mancanza di attività di GSTM1 e alla bassa capacità di
riparare il DNA del genotipo XPC-PAT +/+. Gli altri tre polimorfismi
NER non sembrano modificare in maniera significativa i livelli
di addotti in questa analisi statistica. Né una dieta ricca in
PAH né il fumo influenzavano il marker.
La modulazione degli addotti al DNA anti-BPDE nella frazione
linfomonocitica da parte di GSTM1-nullo e di alcuni genotipi
NER a bassa attività può essere considerata come potenziale
fattore di suscettibilità genetica capace di modulare la risposta individuale
all’esposizione genotossica a PAH e un conseguente rischio
di cancro nei lavoratori di cokeria (3).
Bibliografia
F. Larese 1 , M. Sarnico 2 , P. Apostoli 2 , M. Venier 3 , E. Pontieri 1 , Adami 3 , G. Maina 4
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null genotype as a risk factor for anti-BPDE-DNA adduct formation
in mononuclear white blood cells of coke-oven workers, Mutat Res,
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La cute come barriera bidirezionale: via di assorbimento ma anche di
escrezione degli xenobiotici. Risultati preliminari di uno studio in vitro
1 Unità Clinico Operativa di Medicina del Lavoro, Dipartimento di Scienze di Medicina Pubblica-Università degli Studi di Trieste
2 Cattedra di Igiene Industriale, Università degli Studi di Brescia
3 Dipartimento di Scienze Chimiche, Università di Trieste
4 Servizio di Tossicologia ed Epidemiologia Industriale, Dipartimento di Traumatologia, Ortopedia e Medicina del Lavoro, Università degli Studi di
Torino
RIASSUNTO. La valutazione delle sostanze tossiche presenti nel
sudore o nello strato corneo potrebbe essere un’importante prospettiva
per il monitoraggio biologico nei lavoratori esposti. Gli autori dimostrano
in vitro l’escrezione di Co usando Franz cell rovesciate. L’applicazione
di una soluzione di Co (150 ppb in soluzione fisiologica) sul lato dermico
della cute determina un flusso di Co dall’interno all’esterno della
cute di 0,0166 ± 0,02 µg/cm 2 /ora. Questo rilievo prova in vitro che la cute
può essere considerata come una barriera bidirezionale con un ruolo sia
nell’assorbimento ma anche nell’escrezione dei tossici.
Parole chiave: cute, assorbimento, escrezione, sudore, cobalto, barriera
bidirezionale.
ABSTRACT. SKIN AS A BIDIRECTIONAL BARRIER FOR THE ABSORP-
TION AND EXCRETION OF XENOBIOTICS. PRELIMINARY IN VITRO DATA. The
evaluation of toxic substances in the sweat or in the stratum corneum
could have interesting future implications for biological monitoring in exposed
workers. The authors demonstrated in vitro skin secrection of cobalt
using reversed Franz cells. The application of a Co solution to the dermal
site of the skin caused a flux of Co toward the external site of the skin of
0,0166 ± 0,02 µg/cm 2 /hour. The in-vitro model proved that in vivo the skin
can have a role both in the absorption and in the secrection of toxicants.
Key words: skin, absorption, excretion, sweat, cobalt, bidirectional
barrier.
Introduzione
Le cute può essere considerata una barriera permeabile bidirezionale
con un ruolo nell’assorbimento di tossici (1) ma anche nell’escrezione.
Negli anni recenti è stata posta maggiore attenzione
alla cute e al suo ruolo di interfaccia con l’esterno e numerosi studi
hanno provato in vivo (2) e in vitro (3, 4) il suo ruolo nell’assorbimento
dei tossici. La cute come via di escrezione è stata valutata
ed utilizzata in passato per il trattamento degli intossicati da
Pb: l’aumento di secrezione sudorale ottenuta con l’esposizione a
caldo permetteva di eliminare per via cutanea una parte significativa
del metallo (5). Oggi la valutazione della concentrazione di alcuni
tossici nel sudore viene utilizzata per il monitoraggio degli alcoolisti
in trattamento (6) al fine di controllare l’astensione dall’assunzione
delle bevande alcoliche o in ambito professionale per
accertare l’assenza di assunzione di alcol o di sostanze stupefacenti
in piloti militari. L’uso di un patch con rivelatore permette quindi
agilmente di avere informazioni sull’assunzione di questo tipo di
tossici. Per il monitoraggio biologico dei professionalmente esposti
la cute e i suoi annessi non vengono utilizzati in modo routina-

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
74 www.gimle.fsm.it
rio, ma vi sono evidenze sperimentali che il sudore o lo strato corneo
possano essere utilizzati per monitorare l’esposizione professionale
ad alcuni tossici, ed in particolare ai metalli: Omokhodion
(7, 8) e Lilley (9) hanno riportato che le concentrazioni di Pb nel
sudore sono proporzionali a quelle ematiche e Stauber nel 1988
(10) ha studiato la presenza di rame, piombo, cadmio e zinco nel
sudore e nel sangue. È noto inoltre che lo strato corneo ha una funzione
di “riserva” sia per i metalli assorbiti (11) e per quelli escreti.
Tale rilievo apre interessanti prospettive di ricerca e di applicazione
pratica per la facilità con cui è possibile rimuovere parte dello
strato corneo (stripping con cerotto) e raccogliere sudore per
monitorare la concentrazione di un tossico.
Scopo del nostro lavoro è stato quello di studiare con il metodo
in vitro delle Franz cell (12) l’escrezione di un metallo (cobalto)
attraverso la cute con l’obiettivo di dimostrare che la cute
svolge un ruolo di barriera permeabile bidirezionale.
Materiali e metodi
Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando celle di Franz in
vetro e lembi di cute proveniente da scarti di chirurgia plastica (12).
La cute è stata pretrattata con rimozione dello strato corneo con la
metodica dello stripping (11) ed è stata montata rovesciata sulle celle
di Franz (14 celle) in modo che il lato dermico sia esposto alla soluzione
donatrice. Come soluzione ricevente è stato utilizzato sudore
sintetico (13). Una soluzione di Co in soluzione fisiologica (150
ppb) è stata applicata (2 mL) su ogni cella e 2mL di soluzione ricevente
è stata rimossa a 2-4-8-6-8-20-22-24 ore. La concentrazione
del Co nella soluzione ricevente è stata valutata con tecnica analitica
total-quant in ICP-MS (inductively coupled plasma mass spectrometry),
utilizzando il metodo di calibrazione esterna (14). Per la taratura
dello strumento viene utilizzata una soluzione contenente Co
(Perkin Elmer Calibration Standard 3 10 µg/ml) alla concentrazione
di 10 µg/L. Accuratezza e precisione sono correlate a parametri strumentali
quali bontà della calibrazione e calibrazione del rivelatore,
nel caso di concentrazioni elevate. Èstato utilizzato per l’analisi dei
campioni materiale certificato Nist 1640 (trace elements in water).
La precisione espressa come coefficiente di variazione (CV) varia
del 4-8% intra-serie e del 6-12% inter-serie. Il limite di rilevabilità è
di 0,003 µg/L. I risultati ottenuti sono stati corretti in foglio elettronico
Excell per compensare l’effetto della diluizione.
Risultati
Il flusso di escrezione del Cobalto è riportato nella figura 1 ed è
stato calcolato di 0,0166 ± 0,02 µg/cm 2 /ora. In particolare, è possibile
notare un incremento progressivo del passaggio del metallo con
una curva rettilinea che aumenta la sua pendenza dalle 16 ore in poi.
Le curve ottenute dai 14 esperimenti risultano riproducibili e le deviazioni
standard (riportate nel grafico di Figura 1) sono contenute.
Figura 1. Flusso di escrezione del Co (µg/cm 2 ) in funzione
del tempo
Discussione
Gli esperimenti da noi condotti hanno dimostrato per la prima
volta che in una condizione standard in vitro è possibile un passaggio
percutaneo con diffusione passiva dall’interno della cute
verso l’esterno. Ciò conferma la possibilità di utilizzare la via cutanea
come matrice per il monitoraggio biologico e il ruolo della
cute come barriera semipermeabile bidirezionale con flusso di assorbimento
e di escrezione che può avvenire in modo passivo nelle
condizioni in vitro e anche attivo nelle condizioni in vivo. Il sistema
in vitro ha confermato quanto è stato osservato nei professionalmente
esposti, nei quali la concentrazione di alcuni metalli
nel sudore è proporzionale a quella presente nel siero: un esempio
caratteristico è quello del Pb le cui concentrazioni sono simili nel
siero e nel sudore (10) e nelle urine e nel sudore (15). Per il Ni e
il Cd sono stati invece riscontrati livelli più elevati nel sudore rispetto
alle urine (15), in questo caso si deve ipotizzare la presenza
anche di un sistema attivo di escrezione attraverso questa via.
Per il Cu invece la concentrazione rilevata nel sudore risulta più
bassa che nel siero, e questo può essere spiegato con il forte legame
di questo metallo con le proteine plasmatiche (10).
Il flusso di escrezione da noi rilevato per il Co risulta pressoché
sovrapponibile a quello ottenuto da studi di assorbimento in
vitro: in particolare Larese (4) riporta un flusso di Co attraverso
la cute intera di 0,0123 ± 0,0054 µg/cm 2 /ora, valori che risultano
sovrapponibili a quelli ottenuti per l’escrezione. Tale dato, insieme
ai rilievi su lavori esposti, conferma ulteriormente il ruolo
della cute come sistema di assorbimento/escrezione ed è una pietra
miliare per l’approfondimento di questa matrice per il monitoraggio
biologico nei professionalmente esposti.
Bibliografia
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G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
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R Lucchini, E. Albini, L. Benedetti, L. Alessio
La tossicologia neurocomportamentale nello studio dei meccanismi
d’azione e nella definizione dei valori limite di sostanze neurotossiche:
attuali problematiche
Cattedra di Medicina del Lavoro, Università degli Studi di Brescia
RIASSUNTO. I metodi di valutazione della tossicologia neuro-comportamentale
sono utilizzati in maniera crescente nella ricerca sugli effetti
da esposizione ad agenti neurotossici, sia in campo occupazionale che
più estesamente extra-professionale e, più recentemente, anche pediatrico.
I risultati di questi studi vengono sempre più impiegati nella individuazione
dei valori limite di esposizione. Scopo di questa presentazione
è quello di illustrare le tendenze attuali accanto alle problematiche emergenti,
per le quali è necessario prospettare soluzioni finalizzate all’affinamento
ed allo sviluppo di questa disciplina.
Parole chiave: neurotossicologia, metodi neurocomportamentali,
valutazione del rischio, limiti di esposizione.
ABSTRACT. ROLE OF NEUROBEHAVIOURAL TOXICOLOGY IN THE
STUDY OF MECHANISMS OF ACTION AND FOR SETTING THRESHOLD LIMITS
FOR NEUROTOXIC AGENTS: THE STATE OF THE ART. Neurobehavioral
methods are increasingly used in research to evaluate the effects derived
from exposure to neurotoxic agents in occupational settings, in the
community and in children. Results from these studies are being used
for risk assessment procedures by regulatory agencies. The aim of this
presentation is to illustrate the current trends and future challenges that
have to be addressed in order to facilitate the future development of this
discipline.
Key words: neurotoxicology, neurobehavioral methods, occupational
risk assessment.
Introduzione
Le prime valutazioni neurocomportamentali vennero utilizzate
su lavoratori affetti da intossicazioni da solfuro di carbonio
(1), applicando test che la neuropsicologia tradizionale
aveva sviluppato per la diagnostica clinica dei danni cerebrali.
Con la progressiva riduzione dei livelli di esposizione occupazionale
a neurotossici, ed il graduale aumento dei livelli di
esposizione negli ambienti di vita, divenne necessario affinare
gli strumenti di valutazione, aumentando la loro sensibilità e
diminuendo, parallelamente, il grado di specificità. L’evoluzione
delle metodiche ebbe un notevole impulso grazie all’automazione,
che offrì la possibilità di sviluppare nuove tecniche
di misurazione e di applicarle in casistiche più estese. Un notevole
contributo venne fornito dalla Clinica del Lavoro di Milano
nell’allestimento di strumenti di valutazione che sono stati
impiegati in questi anni a livello internazionale (2, 3). In
questo studio viene presentata una analisi della letteratura e
delle problematiche emergenti per lo sviluppo futuro di questa
disciplina.
Metodi
È stata condotta una analisi della letteratura sia per mezzo
delle citazioni bibliografiche recensite su MEDLINE con i sistemi
OVID e PUBMED, che consultando gli atti di congressi
specifici, fra cui i simposi internazionali organizzati triennalmente
dal Comitato Scientifico dell’International Commission
on Occupational Health (ICOH) su “Neurotoxicology and Psychophysiology”.
Risultati
Il numero di pubblicazioni scientifiche riguardanti gli effetti
neurocomportamentali dovuti alla esposizione occupazionale,
ambientale ed a farmaci ha subito un notevole incremento (da 1
articolo pubblicato nel 1975 a circa 180 articoli pubblicati annualmente
negli ultimi 4 anni). Il numero totale di lavori identificati
è 2371, di cui 56% in studi sull’uomo e 44% in studi su animali
da esperimento. Gli agenti neurotossici più frequentemente
studiati sono stati, fino agli anni ’80, i solventi,, mentre i metalli
ed i pesticidi risultano più indagati negli anni successivi. Gli argomenti
trattati possono essere raggruppati in due aspetti principali:
l’identificazione di proprietà neurotossiche in precedenza
non conosciute nell’ambito di agenti presenti negli ambienti di
vita e di lavoro, e lo studio dei meccanismi d’azione di neurotossici
noti. Nella maggior parte dei casi vengono impiegati studi
trasversali, più raramente longitudinali.
I risultati di studi neurocomportamentali sono utilizzati da
numerose istituzioni preposte alla identificazione dei valori limite.
Su 588 sostanze chimiche contenute nella lista dei TLV dell’ACGIH
nel 1984, 167 (pari al 28%) erano basati su effetti neurologici
e neurocomportamentali (4). In un progetto di aggiornamento
dei valori limite occupazionali condotto nel 1989 dall’O-
SHA, 172 sostanze su 428 (pari a circa il 40%) sono state identificate
sulla base di effetti neurologici e neurocomportamentali
(5). L’analisi del Integrated Risk Information System (IRIS) dell’EPA
condotta nel 1994, evidenziò che circa il 20% degli standard
erano basati su effetti neurologici e neurocomportamentali.
Le percentuali sopra riportate concordano con una stima fornita
dall’Office of Technology Assessment (6) statunitense secondo la
quale il 28% circa delle sostanze chimiche è dotato di proprietà
neurotossiche. I dati neurocomportamentali sono stati utilizzati
per l’identificazione dei valori limite delle più importanti e diffuse
sostanze chimiche fra le quali piombo, mercurio, manganese e
alluminio per i metalli, stirene, toluene, e xilene per i solventi, il
protossido d’azoto per i gas anestetici. Due congressi internazionali
sono stati organizzati nell’intento di promuovere una più
stretta collaborazione fra ricercatori ed esperti di risk assessment.
Il meeting “Risk Assessment for Neurobehavioral Toxicity” venne
organizzato nel 1994 a Rochester, USA, dallo Scientific
Group on the Methodologies for the Safety Evaluation of Chemicals
(SGOMSEC) (7). Due anni dopo, la HSE sponsorizzò il
workshop “The Role of Human Neurobehavioral Tests in Regulatory
Activity on Chemicals” ad Egham, Surrey, GB. In entrambi
i meeting venne espressa la necessità di stabilire criteri per il
riconoscimento della validità degli studi neurocomportamentali.
Venne inoltre accettato il concetto secondo il quale gli effetti neurocomportamentali
per i quali si dimostra una relazione con la
dose di esposizione possono essere considerati “avversi” e pertanto
utilizzabili per la definizione degli standard (5).
L’analisi della letteratura ha inoltre permesso di evidenziare
le problematiche emergenti. Esse comprendono tre aree principali:
a) aspetti tecnici relativi alla rapida evoluzione dei supporti
informatici, che non consente un adeguamento efficace delle bat-

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
76 www.gimle.fsm.it
terie di test; b) aspetti epidemiologici e statistici, che rendono necessari
studi multicentrici e di meta-analisi, per i quali i modelli
di elaborazione devono consentire il controllo di una sempre crescente
variabilità; c) necessità di consenso sul significato degli
effetti neurocomportamentali in termini di protezione della salute
delle popolazioni esposte.
Conclusioni
Le metodiche di valutazione appartenenti alla tossicologia
neurocomportamentale rappresentano utili strumenti per la ricerca
degli effetti dovuti alla esposizione ad agenti dotati di proprietà
neurotossiche. I risultati della ricerca in questo campo, oltre
che allo studio dei meccanismi d’azione, sono rivolti alla
identificazione dei valori limite e rivestono pertanto un notevole
valore preventivo. Risulta pertanto necessario e auspicabile che
vengano individuate le soluzioni più adeguate che consentano di
affrontare le problematiche emergenti e di favorire l’ulteriore sviluppo
della disciplina.
G. Maina 1 , F. Larese Filon 2 , M. Manzari 1 , E. Pontieri 2
Problemi interpretativi della cobalturia
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1 UOADU Servizio di Tossicologia ed Epidemiologia Industriale, Dipartimento di Traumatologia, Ortopedia e Medicina del Lavoro, Università degli
Studi di Torino
2 UCO Medicina del Lavoro, Università di Trieste
RIASSUNTO. Il dosaggio del cobalto nell’urina (cobalturia) è un
buon indicatore di esposizione corrente a cobalto la cui interpretazione richiede
tuttavia una precisa conoscenza delle condizioni di esposizione e
delle propietà chimico-fisiche del composto di cobalto cui si riferisce l’esposizione.
Per il suo impiego nel monitoraggio biologico è necessario
definire con attenzione il tempo di campionamento e considerare il possibile
contributo che l’assorbimento del metallo attraverso la cute può determinare
in termini di valutazione integrata dell’esposizione.
Parole chiave: cobalto urinario, assorbimento percutaneo, tempo di
campionamento.
ABSTRACT. CORRECT INTERPRETATION OF COBALT URINARY LE-
VELS. To interpret the urinary cobalt values in the biological monitoring
of exposed workers correctly, the exposure conditions and the chemicalphysical
properties of the Co compounds have to be known precisely.
Sampling time plays a critical role in understanding the relashionship
between Co exposure levels and urinary Co values, but percutaneous absorption
of Co must be also taken into consideration.
Key words: urinary cobalt, percutaneous absorption, sampling time.
Introduzione
La relazione tra concentrazioni di cobalto ambientale (CoA)
e valori di cobalto urinario (CoU) presenta aspetti interpretativi
complessi ed ancora non completamente chiariti: una buona correlazione
è stata osservata in esposti nell’industria di metalli duri
(6, 7), mentre altri Autori (8) segnalano che il solo l’incremento
del CoU tra fine ed inizio turno si correla all’esposizione giornaliera.
Tale correlazione sembra presente solo ad inizio ed al termine
della settimana lavorativa e non, invece, a metà della settimana
(9). Tale fenomeno viene attribuito alla cinetica di escrezione
bifasica del CoU (2, 4): il cobalto assorbito per via inalatoria
viene eliminato a livello urinario mediante una prima fase di
escrezione rapida (della durata di circa 48 ore) cui segue una fase
di escrezione prolungata di bassi livelli. I risultati di studi su
volontari hanno evidenziato che la cute può essere una via di assorbimento
del cobalto (6, 10) e recenti esperimenti in vitro (5)
confermano tale osservazione.
Il presente studio, condotto in condizioni di esposizione a solo
polvere di Co, è stato realizzato per verificare le più recenti osservazioni
sperimentali al riguardo.
Materiali e metodi
Lo studio, condotto in un’azienda di medie dimensioni che
fabbrica mole diamantate, è stato realizzato dopo un periodo di
15 giorni di non esposizione, in tre giorni (mercoledi’, venerdì e
venerdì successivo) determinando l’esposizione a polveri di Co
ed eseguendo il monitoraggio biologico mediante cobalturia
(CoU). I campionamenti personali sono stati eseguiti impiegando
campionatori Du-Pont Alpha-1 in esteri di cellulosa (diametro:
37 mm; porosità: 0.45 um) operanti a flusso 3,5 L/min per 8 ore:
i filtri sono stati trattati con HNO 3 . Le concentrazioni di Co sia
sui filtri che sui campioni di urina sono stati analizzati mediante
Perkin-Elmer 5100 AAS con HGA 600 in fornetto di grafite, AS-
60 con correttore di fondo ad effetto Zeeman.
Sono stati analizzati in microscopia elettronica a scansione
(SEM) (Philips XL-30 ESEM) corredato di microanalisi a dispersione
di energia (EDX Digital controller) campioni di polvere
di diamante, campioni di polvere di cobalto e campioni di polvere
dell’ambiente di lavoro. Il 95% del particolato dell’aria ambiente
presenta un diametro < 5 µm, di cui l’85% con diametro
compreso tra 2 e 2.7 µm: questo particolato è rappresentato pressoché
esclusivamente da Co.

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 77
Risultati
Ventitre campionamenti ambientali personali su 27 eccedono il
TLV-TWA (1) e 11 su 27 il TRK (3): il maggior numero di tali superamenti
si verifica il terzo giorno dell’indagine (venerdì). I valori
più elevati si registrano nella zona di miscelazione dei prodotti,
dove il valore limite viene superato di uno-due ordini di grandezza.
I valori di CoU presentano un progressivo incremento da inizio
turno del primo giorno a fine turno del decimo giorno, come chiaramento
evidenziato dall’andamento dei valori della mediana. I valori
di CoU presentano un incremento significativo tra inizio turno
del primo giorno e fine turno del terzo giorno (t = 3,52; p > 0,01)
e tra inizio turno del primo giorno e fine turno dell’ultimo giorno
(t = 4,48, p < 0,01). Non si osservano differenze significative né tra
fine turno del primo giorno e fine turno del terzo giorno, né tra fine
turno del terzo giorno e fine turno dell’ultimo giorno.
Complessivamente, 32 valori di CoU su 44 eccedono il BEI
(15 µg/L), mentre l’EKA (60 µg/L) viene superato da 16 misure
di CoU su 44. Ad inizio turno del primo giorno 2 campioni su 11
di CoU eccedono il BEI (15 µg/L), mentre i rimanenti 9 risultano
più elevati dei valori di riferimento (1,5 µg/L). Nessuna correlazione
è stata osservata tra valori di CoU ed i corrispondenti
valori di esposizione personale a Co.
Discussione e Conclusioni
Le condizioni di esposizione della lavorazione oggetto dello
studio risultano di particolare interesse dal momento che l’esposizione
è rappresentata eslcusivamente da polvere di cobalto respirabile
le cui concentrazioni eccedono il TLV-TWA nell’80% dei campionamenti
eseguiti. La fase dove si raggiungono i valori di esposizione
più elevati è quella della miscelazione dei componenti dove il
TLV-TWA viene superato di uno-due ordini di grandezza.
I valori di cobalturia, che presentano un significativo incremento
con il procedere della settimana lavorativa, risultano an-
cora superiori al BEI ad inizio turno della settimana di lavoro, a
conferma del fatto che 15 giorni non sono suficienti per completare
la fase di eliminazione lenta del cobalto assorbito.
L’assenza di correlazione tra valori di Co ambientale e cobalturia
osservata nello studio può trovare due ordini di spiegazione:
la scelta del momento della raccolta del campione biologico
da un lato e il potenziale contributo che l’assorbimento percutaneo
del metallo può offrire alla dose interna totale dall’altro.
Bibliografia
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A. Sanduzzi 4 , S. Faraone 3 , A. Zedda 3 , M. Manno 2
Condensato dell’aria espirata: nuova tecnica per il monitoraggio
dell’esposizione a toluene in soggetti sani
1 Cattedra di Malattie dell’Apparato Respiratorio, A.O. Monaldi, Università degli Studi di Napoli Federico II
2 Cattedra di Medicina del Lavoro, Università degli Studi di Napoli Federico II
3 Sezione di Malattie dell’Apparato Respiratorio, Ospedale S. Maria della Pietà, Casoria, Napoli
4 Cattedra d’Igiene, Università degli Studi di Napoli Federico II
RIASSUNTO. L’esposizione al toluene, un idrocarburo aromatico
ampiamente utilizzato nell’industria chimica come solvente, rappresenta
una situazione di rischio professionale di particolare rilevanza, dal momento
che recenti evidenze scientifiche hanno indicato che può determinare
tossicità cronica. La determinazione e il controllo dell’esposizione al
toluene tra i lavoratori a rischio hanno pertanto grande importanza. Tra gli
indicatori biologici di esposizione al toluene, la ricerca nell’aria espirata è
una metodica particolarmente vantaggiosa, pur con le difficoltà connesse
ai suoi costi elevati ed ad una sensibilità bassa. Recentemente il condensato
di aria espirata (EBC, Exhaled Breath Condensate), che si ottiene raffreddando
l’aria espirata durante respirazione spontanea, è stato introdotto
come nuova metodica per quantificare la presenza di sostanze tossiche
nei lavoratori esposti professionalmente. Scopo del nostro studio pilota è
stato quello di osservare se l’EBC può essere utilizzato come metodo di
analisi quantitativa dell’esposizione a toluene. Sei soggetti volontari sani
sono stati esposti ad una concentrazione di toluene di 50-100 ppm, simulando
una attività lavorativa. L’EBC è stato raccolto prima e dopo l’esposizione.
In tutti i soggetti i livelli di toluene nell’EBC prima dell’esposizione
sono risultati più bassi del limite minimo di rilevabilità. Il toluene
era invece dosabile in tutti i campioni di EBC dopo l’esposizione e il valore
mediano era 35 µg/L (range 0.22-0.55 µg/L). I livelli di toluene ambientali
e nell’EBC risultavano infine significativamente correlati. In conclusione,
il dosaggio di toluene su EBC risulta una metodica utilizzabile
per valutare l’esposizione lavorativa umana alla sostanza.
Parole chiave: toluene, solventi, espirata, aria condensata, spazio di
testa.

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
78 www.gimle.fsm.it
ABSTRACT. EXHALED BREATH CONDENSATE: A NEW TECHNIQUE
FOR MONITORING EXPOSURE TO TOLUENE AMONG HEALTHY INDIVIDUALS.
Exposure to toluene, an aromatic hydrocarbon widely used as an industrial
solvent, is of particular concern since recent research work indicated
that this solvent can result in chronic toxicity. Establishing and monitoring
toluene exposure among workers who are at risk is therefore of the
greatest importance. Of the various biological indicators of exposure, toluene
breath sampling is one of the best as it provides an accurate estimate
of its concentration in target tissues. However, the monitoring of
exhaled toluene is not easy due to the expense and the low level of sensitivity.
Exhaled breath condensate (EBC), which is obtained by freezing
exhaled air under conditions of spontaneous breathing, has recently been
used as a new matrix for quantifying the lung tissue dose of toxic metals
in occupationally exposed workers. The aim of the present pilot study
was to investigate whether EBC can also be used as a suitable matrix for
toluene quantitative analyses. Six healthy non-smokers were exposed to
a known concentration of toluene while simulating an occupational activity.
EBC were collected before and after exposure (50-100 ppm). The
environmental levels of toluene in the air were also measured. Toluene levels
in EBC were lower than the detection limit before exposure in all the
subjects. Detectable levels of toluene were found in all EBC samples collected
after, but not before exposure with a median value was 0.35 µg/L
(range 0.22 - 0.55 µg/L). A significant correlation was found between toluene
levels in EBC and those in the air. In summary, the present pilot
study shows that EBC analysis is a promising matrix for assessing occupational
exposure to toluene.
Key words: toluene, exhaled breath condensate, head-space.
Introduzione
Il toluene è uno dei solventi organici più utilizzati (1), costituendo
più dell’80% dei solventi usati nelle vernici, il 62% negli
inchiostri, il 56% nei diluenti, e il 51% negli adesivi (2, 3). L’esposizione
cronica a toluene, una condizione che coinvolge milioni
di lavoratori negli impianti industriali, si manifesta con irritazione
delle mucose, riduzione della funzione del sistema nervoso
centrale ed alterazioni endocrine (4). Per questo motivo il
monitoraggio dei livelli di esposizione a toluene riveste un ruolo
primario in medicina del lavoro. Sia il toluene che i suoi metaboliti
sono usati come biomarkers di esposizione e la misurazione
diretta dei livelli di toluene circolanti, urinari e nell’aria espirata
sono tra gli indicatori di esposizione più usati (5). In particolare,
la misurazione del toluene nell’aria espirata riflette accuratamente
le concentrazioni tissutali e quindi la sua potenziale
tossicità (6). Tuttavia, la raccolta diretta del toluene nell’aria
espirata non è privo di difficoltà, dal momento che richiede ad
esempio campionatori adeguati ed un’analisi immediata (6).
Il condensato di aria espirata (EBC), ottenuto attraverso il
raffreddamento dell’aria esalata durante una respirazione tidalica
spontanea, è un nuovo metodo per raccogliere sostanze volatili e
non-volatili dalle vie aeree inferiori (7). Non è tuttavia ancora noto
se l’EBC possa essere effettivamente utilizzato anche per identificare
e monitorare i livelli dei solventi organici. Lo scopo del
nostro studio pilota è stato quello di osservare se il EBC può essere
utilizzato come un facile metodo di analisi quantitativa del
toluene in soggetti professionalmente esposti a tale solvente.
Materiali e metodi
Soggetti: Sei soggetti volontari sani con età media di 35 anni
(27-50) e un peso corporeo medio di 80 kg (68-90) hanno partecipato
allo studio. Tutti i soggetti erano non fumatori e non esposti
lavorativamente o in altro modo a solventi organici. L’esperimento
è stato condotto dopo aver ottenuto il consenso informato dei
partecipanti e dopo l’approvazione del Comitato Etico.
Disegno dello studio: Ai soggetti è stato chiesto di simulare le
condizioni lavorative di pulitura di scarpe con il toluene per 20 minu-
ti. Tutti i soggetti utilizzavano guanti protettivi in lattice. L’esposizione
è stata condotta in una camera di 40 mq senza ricambio di aria. La
temperatura e l’umidità relativa sono state continuamente misurate.
La concentrazione del solvente nell’aria è stata continuamente monitorata
da uno spettrofotometro ad infrarossi Sapphire CONTEC
Enginering. Le misurazioni sono state compiute a 13.77 mcm (con
una lunghezza d’onda di riferimento di 3.66 mcm) e le concentrazioni
di toluene sono state registrate ogni 3 minuti. L’EBC è stato
raccolto immediatamente prima e subito dopo l’esposizione.
Raccolta di EBC: L’EBC è stato raccolto utilizzando un condensatore,
che permette una raccolta non invasiva dei componenti
non gassosi dell’aria espirata (EcoScreen, Jaeger, Wyrzburg,
Germany). I soggetti in studio hanno respirato attraverso un
boccaglio fornito di una valvola di non re-breathing a due vie e
di una trappola salivare. È stato chiesto loro di respirare a frequenza
e volume tidalico, indossando uno stringinaso, per un periodo
di 15 minuti. Il condensato (2 ml in totale) è stato immediatamente
trasferito in una provetta di vetro (volume 10 ml) per
l’analisi. Appena dopo l’introduzione del campione, le provette
sono state chiuse con setti di 20 mm di nastro butilico gommato
con PTFE e sigillate con un tappo di alluminio.
Analisi del toluene: Il toluene è stato analizzato mediante
tecnica gas-cromatografica in spazio di testa statico con rivelatore
di massa (Shimadzu GC-17° infrarossi con spettrometro di
massa GCMS-QP 5000). Le condizioni del cromotografo erano:
SP-B 20 di 60 m di lunghezza e di 0.25 mm di diametro con uno
spessore del film di 0.25 µm. Come gas di trasporto è stato usato
l’elio; il flusso di colonna è stato di 1.3 ml/min; la temperatura
iniettore è stata di 280 °C mentre la temperatura dell’interfaccia
di 250 °C; il rapporto di splintaggio 1/10; tensione al detector di
1.5 kV; la temperatura del forno di 50 °C per 2 minuti poi a 10
°C/min fino al raggiungimento di 100°C. Il modo di acquisizione
è stato in SIM (91 e 92 m/z). Il campione di EBC è stato posto
in bagnomaria a 50 °C. Dopo 3 minuti di condizionamento,
con una siringa per gas sono stati prelevati 250 µl dallo spazio di
testa ed iniettati nel gas-cromatografo. Il tempo di ritenzione del
toluene è stato approssimativamente di 7.20 minuti.
Calibrazione e valutazione di riproducibilità del test: Il toluene
(purificato in laboratorio) è stato acquistato dalla Carlo Erba
(Milano, Italia). Le curve standard sono state preparate giornalmente,
aggiungendo quantità variabili di toluene (0.1 a 0.6
µg/L) a 2 mL di acqua distillata. Inoltre, al fine di valutare la riproducibilità
della metodica e di effettuare una corretta calibrazione,
sono stati utilizzati quattro campioni di EBC di soggetti
non esposti, corretti con 0.01, 0.15, 0.30, 0.60 µg/L di toluene.
Statistica: È stata utilizzata l’analisi di regressione lineare al
minimo-quadrato per valutare la pendenza e (b) l’intercetta della
curva di calibrazione y = bx + a, dove per y si intende l’area cromatografia
dell’analita e per x la concentrazione del campione
dell’analita (µg/L). Il limite di rilevamento (LOD, limit of detection)
del campione è stato calcolato secondo tale espressione
Risultati
Le curve ottenute dall’analisi del EBC erano simili a quelle
delle calibrazioni standard e risultavano lineari nel range di analisi
del toluene (Figura 1). Le curve di calibrazione ottenute in altri
giorni lavorativi in due differenti settimane si presentavano simili
tra loro. L’errore di metodo, espresso dalla deviazione standard
relativa, è stato calcolato da 6 identici campioni dal 1.9% ad
alta concentrazione di toluene di 0.6 µg/ al 2.5% a basse concentrazioni
di toluene 0.1 µg/L. Il LOD era 0.05 µg/L.
Durante l’esposizione dei soggetti, le concentrazioni lavorative
di toluene erano sempre più basse di 100 ppm (valore medio
77 ppm). Nell’EBC di tutti i soggetti i livelli di toluene erano più
alti del limite minimo rintracciabile prima dell’esposizione.

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 79
Figura 1. Curva di calibrazione per il toluene nel condensato
dell’aria espirata (in ordinata unità arbitrarie)
Figura 2. Correlazione tra toluene nell’aria e nel condensato
dell’aria espirata in 6 soggetti sani non fumatori
Il toluene era rintracciabile in tutti i campioni di EBC dei nostri
soggetti dopo l’esposizione. Il valore mediano era 0,35 µg/L (range
0,22 - 0,55 µg/L). La figura 2 mostra i cromatogrammi di massa a
singolo ione corrispondenti al campione di EBC di un soggetto dopo
l’esposizione e lo stesso campione corretto con 0,1 µg/L del campione
standard. L’analita è univocamente interpretabile sulla base del
tempo di ritenzione e del rapporto massa/peso. Una significativa correlazione
è stata rilevata tra i livelli ambientali di toluene e quelli ritrovati
nell’EBC alla fine dell’esposizione (r = 0,82, p = 0,04).
Discussione
Il toluene è un idrocarburo aromatico ampiamente utilizzato
dall’industria chimica come solvente (1). Una esposizione prolungata
può causare tossicità cronica, specialmente a carico del
sistema nervoso centrale e dell’apparato endocrino (1). Esistono
in Letteratura numerosi studi sulla tossicità della sostanza, di cui
viene raccomandato il monitoraggio dell’esposizione nei gruppi
a rischio. Per tale motivo, in molti Paesi viene attuata una stretta
sorveglianza delle concentrazioni di toluene negli ambienti di lavoro.
Comunque, nella valutazione dell’esposizione e del rischio,
il monitoraggio biologico del toluene ha numerosi vantaggi rispetto
alle tecniche di rilevazione ambientale. Sono stati utilizzati
numerosi indicatori biologici di esposizione, quali i livelli circolanti
ed urinari, i metaboliti urinari o gli effetti preclinici dell’esposizione
alla sostanza.
I tre principali obiettivi per un indicatore biologico di esposizione
sono: a) un’accurata misurazione della dose assorbita; b)
un metodo di raccolta di campioni rapido, non invasivo e tempoindipendente;
c) una misurazione non influenzata dalle abitudini
alimentari o da fonti di contaminazione endogena. Raccogliere
campioni di toluene nell’aria espirata risponde a queste esigenze,
dal momento che riflette accuratamente le reali concentrazioni
tessutali del toluene.
Il presente studio pilota dimostra la validità di un metodo alternativo
di rilevazione del toluene, quale la sua misurazione nell’EBC
di soggetti esposti, suggerendone l’impiego come nuovo
metodo di rilevazione e monitoraggio dell’esposizione al solvente.
Rispetto ad altri metodi (ad esempio la raccolta di campioni di
sangue), l’EBC è una metodica non invasiva e non richiede particolare
collaborazione o abilità del probando. Esso può essere raccolto
in qualsiasi momento e praticamente in qualsiasi ambiente;
infine, esso rappresenta una matrice biologica più semplice, rispetto
al sangue o alle urine, in quanto costituita in larga parte da
acqua. Rispetto ai campioni di aria espirata, infine, i livelli di toluene
ritrovati nell’EBC dopo una esposizione al toluene breve ed
acuta appaiono nel nostro studio più alti di quanto riferito da altri
Autori, risultando fino a cento volte più alti in confronto a soggetti
non esposti professionalmente (8, 9, 10). Va peraltro sottolineato
che i soggetti in studio risultavano rappresentativi dei lavoratori
esposti acutamente al toluene, dal momento che simulavano
un’attività lavorativa a diretto e costante contatto con il solvente.
I livelli di toluene nell’aria ambiente erano sempre più bassi dei
limiti accettati. È interessante notare che è stata ritrovata una stretta
correlazione tra i livelli ambientali di toluene e i livelli nell’EBC.
In conclusione, i risultati del presente studio sembrano indicare
l’analisi dell’EBC come un metodo promettente per rintracciare
solventi organici presenti a livello tissutale in soggetti esposti ad
ambienti lavorativi inquinati o non sufficientemente controllati.
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COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
80 www.gimle.fsm.it
M. Maniscalco 1 , M. Di Mare 2 , L. Padovano 2 , C. Sbordone 2 , S. Di Tonno 2 , M. Mormile 1 , P. Carratù 3 , L. Carratù 1 , M. Sofia 1 ,
M. Manno 2
Ossido nitrico nasale nel monitoraggio della rinite occupazionale
1 Cattedra di Malattie dell’Apparato Respiratorio, A.O. Monaldi, Università degli Studi di Napoli Federico II
2 Cattedra di Medicina del Lavoro, Università degli Studi di Napoli Federico II
3 Cattedra di Malattie dell’Apparato Respiratorio, Università degli Studi di Bari
RIASSUNTO. Il dosaggio di ossido nitrico (NO) su aria espirata è
stato recentemente proposto quale strumento non invasivo di monitoraggio
della flogosi delle vie aeree in corso di patologie delle alte e basse vie
aeree come l’asma bronchiale e la rinite allergica. L’utilità di tale metodica
per la valutazione dell’infiammazione in corso di patologie occupazionali
non è ben conosciuta. Scopo del presente studio è stato quello di
valutare i livelli di NO orali e nasali in pazienti affetti da rinite occupazionale
rispetto a pazienti affetti da rinite allergica stagionale ed a controlli
sani. Abbiamo misurato tramite chemiluminescenza i livelli di NO
nasale in sei pazienti con diagnosi di rinite occupazionale (RO), in 15 pazienti
con rinite allergica stagionale (RA) e in 18 controlli sani (CS). Nei
pazienti con RO e RA i livelli nasali di NO sono stati inoltre correlati con
lo score clinico. I livelli di NO nasale nei pazienti affetti da RO erano
comparabili con i valori dei pazienti con RA: mediana (95% CI) rispettivamente
di 60,5 ppb (47,8-69,8) e di 46,2 ppb (39,1 - 54,3). Entrambi i
gruppi presentavano valori di NO nasale più alti rispetto ai controlli sani
27,5 ppb (24,2-33,0) (p

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 81
lizzatore è stato calibrato con una miscela di NO (200 parti per miliardo).
I livelli di NO sono stati misurati durante respiro orale e nasale.
Una maschera nasale è stata usata per la misurazione nasale
ed un boccaglio per quella orale. I pazienti espiravano lentamente
attraverso il naso o attraverso la bocca a flusso costante (50 ml/s)
per 10 secondi. Le misurazioni sono state effettuate in duplicato.
I dati sono espressi come mediana (95% dell’intervallo di
confidenza). L’analisi statistica è stata effettuata tramite test non
parametrici: U-Mann Whitney test e Spearman test. Una p inferiore
a 0.05 è stata considerata statisticamente significativa.
Risultati
La visita ORL evidenziava in tutti pazienti, sia RO che RA, segni
in atto o pregressi di rinite vasomotoria di vario grado e tutti
erano sintomatici al momento del dosaggio di NO sebbene in misura
diversa. I livelli orali di NO nei pazienti affetti da RO o RA
erano rispettivamente di 12,6 ppb (7,9-16,7) e 10,4 ppb (8,5-15,5)
ed erano significativamente maggiori rispetto ai CS, 6,6 ppb (5,2 -
8.1) p

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
82 www.gimle.fsm.it
Introduzione
La sorveglianza sanitaria dei lavoratori ex esposti ad amianto
rappresenta uno dei problemi più rilevanti di sanità pubblica
(1). Molto si discute sulla efficacia delle attività di sorveglianza
condotte in relazione ai possibili esiti neoplastici della esposizione
al rischio, dal momento che gli attuali possibili indicatori
precoci di effetto sono confinati alla diagnostica per immagini
condotta attraverso la TC a spirale, metodica ancora in fase
di validazione (2). Si tratta in Campania (3), ad oggi, di
12.225 persone la cui sorveglianza è affidata alla gestione del
Servizio Sanitario Regionale attraverso la costituzione di Unità
Operative Amianto da insediare a livello di ogni singola ASL
della Campania. Il coordinamento scientifico della attività di
sorveglianza sanitaria è delegato, dal Piano Regionale Amianto,
al Registro Regionale Mesoteliomi istituito presso la Sezione di
Medicina del Lavoro del Dipartimento di Medicina Sperimentale
della Seconda Università di Napoli, struttura promotrice di
questa ricerca.
Il Progetto di ricerca
L’obiettivo della ricerca proposta è di identificare specifici
biomarcatori precoci in grado di definire:
1. la esistenza, all’interno del gruppo dei lavoratori ex esposti
ad amianto, di biomarcatori precoci di predisposizione capaci
di identificare, all’interno della coorte degli ex esposti, una
specifica sotto-coorte di soggetti ad “alto rischio”, caratterizzata
da uno specifico profilo di espressione genica per il mesotelioma
pleurico (4, 5); in questo modo sarebbe ragionevole
predisporre, per questa coorte ad alto rischio, una particolare
forma di sorveglianza attiva, caratterizzata da un protocollo
di monitoraggio biologico periodico;
2. la esistenza di biomarcatori precoci, individuabili attraverso
le attività di monitoraggio biologico, in grado di cogliere nelle
primissime fasi la formazione di un mesotelioma pleurico.
Tale diagnosi precoce è oggi fondamentale per la applicazione
di protocolli terapeutici trimodali (chirurgia + chemioterapia
+ radioterapia) che determinerebbero, per i casi precoci e
per gli istotipi epiteliomorfi sopravvivenze di 5 anni per il
50% della coorte, rispetto alla attuale sopravvivenza media di
8-12 mesi (6).
Il progetto di ricerca si basa sullo studio di due tipologie di
possibili biomarcatori precoci:
a) Ricerca di uno specifico profilo di espressione genica:
La tecnica utilizzata è quella della analisi di espressione genica
mediante Genechip Expression Arrays (Affymetrix) che
permette di analizzare su di un unico supporto, con una unica
analisi l’intero genoma umano.
Lo studio sarà condotto su queste tipologie di tessuto:
tessuto pleurico normale;
tessuto pleurico di soggetti esposti ad amianto senza patologia
in atto;
tessuto pleurico “normale” di pazienti ammalati di mesotelioma;
tessuto di mesotelioma appartenente ai seguenti istotipi:
• epitelioide;
• sarcomatoide;
• misto.
b) Ricerca di biomarcatori precoci a livello serico:
La identificazione di biomarcatori precoci a livello serico
rappresenta un traguardo di rilevante interesse, dal momento
che potrebbe rappresentare un biomarcatore di facile applicabilità,
e di basso costo (umano e finanziario), rispetto agli attuali
biomarkers in fase di incerta validazione quali la TC a
spirale.
Recenti studi hanno messo in evidenza il possibile utilizzo
come biomarcatore precoce della SMRP (serum mesothelinrelated
protein) per la identificazione di:
sottogruppo di ex esposti con predisposizione a produrre
mesotelioma;
diagnosi precoce del mesotelioma precedente anche la fase
clinica conclamata;
evoluzione prognostica della malattia.
Gli studi preliminari di Robinson e coll. (7) richiedono una
validazione su larghi numeri, ma l’approccio preliminare appare
di rilevante interesse.
Operativamente il progetto di ricerca sarà condotto su una
coorte di ex lavoratori esposti ad amianto selezionata con la collaborazione
della Unità operativa Amianto costituita all’interno
della ASL NA2.
Saranno monitorati circa 500 lavoratori con significativa e rilevante
pregressa esposizione ad amianto, arruolati dalla ASL
NA2 per le operazioni di sorveglianza sanitaria già in atto. Verranno
conservati i sieri a - 80°C per la successiva valutazione di
biomarcatori serici per tumori amianto correlati (carcinoma polmonare,
mesotelioma pleurico).
I valori dei biomarcatori saranno confrontati con gli altri parametri
analizzati (prove di funzionalità respiratoria, diagnostica
per immagini, andamento clinico) al fine di determinarne il grado
di affidabilità.
Bibliografia
1) Mastrantonio M, Belli S, Binazzi A, Carboni M, Comba P, Fusco P,
Grignoli M, Iavarone I, Martuzzi M, Nesti M, Trinca S, Uccelli R. La
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G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 83
F. Mocci 1 , G. Sechi 1 , R. Bardino 2
Alterazioni visive ed esposizione a solventi organici a basse concentrazioni:
studio attraverso l’utilizzo del Functional acuity contrast test (FACT)
1 Istituto di Medicina Legale e di Medicina del Lavoro, Università di Sassari
2 Servizio Sanitario Syndial, Porto Torres
RIASSUNTO. Abbiamo studiato le alterazioni della sensibilità al
contrasto visivo con il FACT (Functional Acuity Contrast Test) in 110 soggetti
esposti a una miscela di solventi organici con concentrazioni inferiori
a TLV; il test è stato effettuato durante l’attività lavorativa ed al rientro
da un periodo di ferie. Il test di Wilcoxon ha evidenziato una differenza significativa
alle frequenze 6, 12 and 18 Hz (P 20 anni (F=12,04; d.f.=3,102; P

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
84 www.gimle.fsm.it
zianità lavorativa è stata pertanto stratificata in quattro gruppi
(Tabella II). L’analisi dei contrasti ha rivelato una differenza statisticamente
significativa tra i due test (CS1 e CS2) del primo
gruppo (aa. 1-9) con il terzo (aa. 20-25) ed il quarto (aa. >25), ma
non col secondo (aa.10-19) (F=12 04; d.f.=3,102; P

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 85
S. Morandi, A. Bassi, A. Nunziata C. Andreoli
Ruolo del polimorfismo del gene CYP2A6 nell’instaurarsi della
dipendenza da nicotina e nella valutazione del rischio del cancro
al polmone: un’analisi degli studi
Centro Ricerche British American Tabacco Italia SpA, Napoli
RIASSUNTO. Il gene CYP2A6, la principale ossidasi della nicotina,
nonché attivatore delle nitrosammine, altamente polimorfico (ad oggi
sono stati descritti più di 11 alleli), sembrerebbe svolgere un ruolo importante
nella variabilità interindividuale del comportamento del fumatore
e nella suscettibilità al cancro al polmone. CYP2A6 è implicato nel
metabolismo della nicotina a cotinina e nell’attivazione delle nitrosammine
a prodotti cancerogeni. Lo scopo di questo lavoro è provare a chiarire,
attraverso l’analisi degli studi presenti in letteratura, l’effettivo ruolo
del polimorfismo del gene CYP2A6 su queste due caratteristiche.
Parole chiave: polimorfismo del gene CYP2A6, dipendenza da nicotina,
cancro al polmone.
ABSTRACT. THE ROLE OF CYP2A6 POLYMORPHISM IN ESTABLI-
SHING TOBACCO DEPENDENCE AND MODULATING LUNG CANCER RISK: AN
ANALYSIS OF THE LITERATURE. CYP2A6 is a highly polymorphic gene
(more than 11 alleles have been described so far) that seems to play an
important role in modulating the interindividual variability of smoker
behaviour and susceptibility to lung cancer. CYP2A6 is an enzyme involved
in the nicotine-cotinine metabolism and in the activation of nitrosamines
to ultimate carcinogens. In this study we analysed results from
the literature in order to shed light on the role of CYP2A6 gene polymorphism
in the two variables reported above.
Key words: CYP2A6 polymorphisms, nicotine addiction, lung cancer.
Introduzione
I citocromi P450 (CYP) sono responsabili del metabolismo e
delle reazioni di detossificazione sia di composti endogeni che
esogeni. Tali reazioni possono talvolta condurre all’attivazione
metabolica di precancerogeni a cancerogeni. Negli ultimi anni
sono state descritte diverse forme polimorfiche dei geni che codificano
per i citocromi P450 che possono portare a forme enzimatiche
con attività soppressa, ridotta, alterata qualitativamente
o rafforzata (1). In riferimento alle possibili forme polimorfiche
del CYP e alle loro differenti capacità metaboliche, l’enzima
CYP2A6, la principale ossidasi della nicotina nonché attivatore
delle nitrosammine, rappresenta un esempio molto interessante.
Recenti lavori di letteratura hanno studiato la relazione tra il
metabolismo deficitario di nicotina e delle nitrosammine specifiche
del tabacco (TSNA) da un lato ed il polimorfismo nel gene
CYP2A6 umano dall’altro (2). Alcuni di questi studi riportano
che i fumatori adattano il loro comportamento durante il fumo
(numero di sigarette fumate, profondità di inalazione, volume di
ciascun puff) per mantenere i livelli di nicotina nel circolo periferico
e centrale. Soggetti portatori di alleli polimorfici del
CYP2A6, ed in particolar modo della forma allelica CYP2A6*4
(forma deleta che si traduce in una ridotta o assente attività catalitica),
avrebbero una minore probabilità di diventare dipendenti
da nicotina, perché nel loro organismo il metabolismo difettivo
ne garantisce una permanenza nel sangue più lunga e a livelli più
elevati rispetto ai soggetti portatori della forma selvatica. Un altro
aspetto interessante è rappresentato dal fatto che generalmente
le prime esperienze con il fumo sono molto spesso spiacevoli
in quanto provocano, tra l’altro, nausea e giramenti di testa. Nei
soggetti difettivi tali effetti spiacevoli potrebbero essere esaltati,
funzionando così da deterrente nei confronti di ulteriori esperien-
ze con il tabacco. Inoltre, dal momento che il fumo di tabacco
contiene nitrosammine che possono essere attivate a cancerogeni
dal CYP2A6, gli individui portatori dell’allele difettivo potrebbero
avere un fattore di protezione dall’azione cancerogena del
fumo di sigaretta.
Analisi degli studi sul polimorfismo del gene CYP2A6
Tra i primi lavori che hanno focalizzato la loro attenzione
verso questo campo di applicazione vi sono i gruppi di M.L. Pianezza
(Nicotine metabolism defect reduces smoking) (4) e di R.F.
Tyndale e E.M. Sellers dell’Universirà di Toronto (Variable
CYP2A6-mediated nicotine metabolism alters smoking behaviour
and risk) (5) che, studiando in particolare i geni che esprimono
i sistemi enzimatici deputati alla trasformazione metabolica
della nicotina, al fine di verificare se esista o meno una relazione
tra il fumo e la capacità geneticamente predeterminata di
inattivare la nicotina, hanno riscontrato che in una popolazione di
non fumatori la presenza di copie difettose del gene che sintetizza
l’enzima CYP2A6, è significativamente inferiore rispetto a
quella dei fumatori abituali. Molti lavori di letteratura successivi
concordano con questa tesi, altri invece, come quelli di Stephanie
J. London et al. (Genetic variation of CYP2A6, smoking and risk
cancer) (6) e quello di Marie-Anne Loriot et al. (Genetic polymorphisms
of cytochrome P4502A6 in a case-control study on
lung cancer in a French population) (7), sono giunti a risultati discordanti.
Per quel che riguarda l’influenza del polimorfismo del gene
CYP2A6 nel modulare il rischio di cancro al polmone, è stato osservato
quanto segue:
1) una ridotta o assente capacità di metabolizzare la nicotina e,
quindi di fumare un numero minore di sigarette, che è di per
sé un fattore protettivo;
2) una frequenza maggiore di individui che hanno una duplicazione
del gene CYP2A6 tra i pazienti affetti da cancro al
polmone.
Queste osservazioni suggeriscono che gli individui che hanno
un’attività ridotta del CYP2A6 presentano una probabilità più
bassa di attivare i precancerogeni presenti nel fumo di sigaretta a
cancerogeni.
Discussione
Un importante aspetto da considerare quando si studia il polimorfismo
dei CYP è che le tecniche di genotipizzazione impiegate
per la determinazione delle mutazioni a livello genomico
siano appropriate e corrette. A tal proposito le discrepanze tra lo
studio di Pianezza e quello di M.A. Loriot potrebbero essere dovute
proprio a differenti metodi di genotipizzazione. Infatti, il
metodo adottato dalla Loriot è probabilmente più specifico portando
ad una frequenza inferiore di alleli polimorfici rispetto a
quelli individuati col metodo di Pianezza.
Inoltre i due lavori risultano difficilmente comparabili per i
seguenti motivi:

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
86 www.gimle.fsm.it
Nello studio di Pianezza soggetti dipendenti dall’alcool e soggetti
con dipendenza dal tabacco sono stati studiati insieme. Il
consumo di etanolo potrebbe essere un fattore di confondimento,
influenzando la dipendenza da tabacco e/o il metabolismo.
I due approcci non presentano la stessa finalità: infatti la dipendenza
da tabacco rappresenta il principale interesse dello
studio di Pianezza, mentre lo studio della Loriot è mirato a
misurare più accuratamente il consumo di sigarette ed il periodo
di fumo.
Il consumo di sigarette è stato valutato da Pianezza solo nei
soggetti tabacco-dipendenti, mentre nello studio della Loriot
è stata considerata l’intera popolazione.
Lo stesso Jeffrey R. Idle, autore del gruppo della Loriot, ha
reso nota in una lettera sulla rivista “The Lancet” (1999) la sua
discordanza di opinioni con i co-autori, riguardo l’approccio al
lavoro svolto. Infatti, secondo l’autore:
1) la classificazione in fumatori e non fumatori non permette di
identificare i soggetti che potrebbero presentare un’intolleranza
alle sigarette di natura genetica o metabolica;
2) a fronte delle evidenze sperimentali che il fumo è la principale
causa di cancro al polmone, non viene riconosciuto il
R. Morreale 1 , M. Dall’Olio 2 , A. Gelormini 2 , D. Tolentino 2
giusto peso delle prove epidemiologiche che attribuiscono un
importante ruolo anche alla dieta (8).
In conclusione, il ruolo del polimorfismo del CYP2A6 nella
dipendenza da tabacco e nel rischio del cancro al polmone richiede
ulteriori indagini. La standardizzazione dei metodi di genotipizzazione
ed una classificazione inequivocabile dei soggetti
nelle categorie “fumatori” e “non fumatori” sono necessari
allo scopo di comparare correttamente studi differenti e comprendere
l’effettiva relazione tra CYP2A6 e comportamento del
fumatore.
Bibliografia
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7) M-A. Loriot et al. Pharmacogenetics. 2001; 11: 39-44
8) J.R.Idle, The Lancet. 1999; 353: 2073.
Utilizzo degli indicatori biologici per esposizione a toluene:
acido ippurico e orto-cresolo
1 Servizio Sanitario IFM FERRARA S.c.ar.l. “Integrated Facility Management”, Ferrara
2 Direzione Salute Sicurezza e Ambiente, MEDL, Polimeri Europa
RIASSUNTO. Un gruppo di 66 lavoratori di un impianto di produzione
di gomme elastomeriche EP(D)M è stato oggetto di una indagine
biologica con l’obiettivo di verificare la potenziale esposizione a toluene,
attraverso la contemporanea determinazione, nelle urine raccolte a fine
turno di lavoro, dell’acido ippurico e dell’orto-cresolo (o-cresolo) urinari.
I nostri risultati, per la maggior parte dei casi inferiori ai limiti biologici
di esposizione, confermano le basse concentrazioni ambientali di toluene.
L’o-cresolo è risultato l’indicatore biologico meno influenzabile
dai fattori di confondimento, come ad esempio fumo, dieta, etc., e più attendibile
in presenza di basse esposizioni a toluene.
Parole chiave: rischio chimico, toluene, monitoraggio biologico,
esposizione professionale.
ABSTRACT. USE OF IPPURIC ACID AND O-CRESOL AS BIOLOGICAL
MARKERS OF OCCUPATIONAL EXPOSURE TO TOLUENE. A group of 66
workers of an industrial elastomeric rubber plant were subjected to biological
monitoring. The aim of the research was to verify the potential exposure
to toluene, through the analysis of ippuric acid and o-cresol present
in urine, collected at the end of the work shift. The results, which for
the most part were lower than allowed BEIs, confirm low environmental
concentrations of toluene. It was demonstrated that o-cresol is the most
precise biological index when there are low levels of environmental toluene.
Key words: chemical risk, toluene, biological monitoring, occupational
exposure.
Introduzione
L’evoluzione legislativa del concetto di sorveglianza sanitaria,
dalle prime visite mediche (D.P.R. 303/56) agli attuali accertamenti
sanitari preventivi e periodici (D.Lgs 626/94 e 25/02), ha
contribuito sensibilmente alla necessità di un continuo sviluppo
ed aggiornamento tecnico-scientifico sull’utilizzo di nuovi indicatori
biologici nel controllo dell’esposizione ad agenti chimici.
Il monitoraggio biologico delle urine raccolte a fine turno di lavoro
è una tecnica non invasiva, ormai largamente applicata proprio
per evitare che si instaurino condizioni di rischio di esposizione
e di eventuale assorbimento di tossici.
Materiali e metodi
L’indagine biologica, oggetto del nostro studio, è stata condotta
sui lavoratori di un impianto di produzione di gomme elastomeriche
EP(D)M, nelle regolari condizioni di assetto produttivo,
con l’obiettivo di verificare la potenziale esposizione a
toluene (1). La tradizionale determinazione dell’acido ippurico
urinario, a fine turno di lavoro, è stata affiancata, per la prima
volta, allo studio dell’escrezione urinaria di orto-cresolo (o-cresolo),
metabolita più specifico e più sensibile per le basse esposizioni
a toluene (2). Nel corso degli incontri informativi/formativi
“on the job” i lavoratori hanno ricevuto istruzioni sulle
caratteristiche degli indicatori biologici ricercati, sulle modalità
e sui tempi di campionamento e sulla necessità di compilare un
questionario personale in cui raccogliere i dati anagrafici e le
abitudini voluttuarie. I campioni urinari sono stati raccolti a fine
turno di lavoro, temporaneamente stoccati a 4°C e consegnati
per le analisi al Centro Interdipartimentale di Tossicologia
e Farmacologia Umana ed Ambientale dell’Università di Ferrara.
La determinazione dell’acido ippurico urinario ha utilizzato
la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC), con detector
UV. Per l’o-cresolo è stata impiegata la tecnica strumentale
HPLC con fluorimetro.

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 87
Figura 1. Risultati del metabolita acido ippurico Figura 2. Risultati del metabolita o-cresolo
Risultati e Discussione
I nostri risultati sono relativi a 66 campioni di urine, raccolti
a fine turno di lavoro, nelle regolari condizioni di assetto impiantistico.
Su ogni singolo campione sono state eseguite due
determinazioni analitiche: una per l’acido ippurico, l’altra per
l’o-cresolo. I risultati ottenuti indicano un’esposizione a toluene
che possiamo definire assai modesta; su un campione di 66
analisi, sia l’acido ippurico (Figura 1) che l’o-cresolo (Figura 2)
risultano, per la maggior parte dei casi, inferiori ai limiti biologici
di esposizione. Per quanto riguarda l’acido ippurico, esistono
5 situazioni in cui le concentrazioni analizzate risultano
superiori al valore limite biologico di 1.6 g/g di creatinina; pertanto
sono state verificate le possibili cause tecnico/organizzative
e comportamentali per adottare gli eventuali e opportuni
provvedimenti di prevenzione. Il medico competente ha informato
individualmente i lavoratori interessati e il datore di lavoro
del superamento del valore biologico dell’acido ippurico, approfondendone
la correlazione con le attività lavorative ed extralavorative
(3). L’esame critico delle mansioni, l’analisi delle
procedure operative e dei possibili interventi tecnici, la revisione
dei dati voluttuari non hanno fatto emergere aspetti significativi
da correlare al superamento del valore limite biologico. I
cinque campioni analitici, il cui valore limite biologico è risultato
superiore alle indicazioni dell’ACGIH, appartengono a lavoratori
che ricoprono mansioni di lavoro differenti tra loro: tre
di essi non svolgono, di regola, funzioni operative nelle aree di
rischio considerate. I rimanenti due, presenti statisticamente in
giornate e circostanze diverse, svolgono attività lavorativa in
due diverse zone esterne dell’impianto. Le contemporanee misure
del campionamento ambientale, effettuato nei punti fissi di
tali zone, sono risultate negative. Gli indicatori biologici di
esposizione per questi 5 lavoratori sono stati successivamente
ripetuti e sono risultati nei limiti consentiti. Tuttavia i valori
elevati di acido ippurico potrebbero essere tali anche per motivi
extraprofessionali, a causa della scarsa specificità di questo
indicatore biologico ai bassi livelli di esposizione a toluene, in
quanto la concentrazione urinaria di acido ippurico può essere
grandemente influenzata dalla dieta. I valori dell’o-cresolo invece
sono tutti risultati entro il BEI. Le concentrazioni urinarie
di o-cresolo sono in accordo con i dati ambientali, che avevano
sempre evidenziato bassa esposizione.
Conclusioni
La nostra indagine ha, in realtà, confermato i bassi valori
espositivi a toluene già conosciuti. Negli ultimi anni infatti, nella
quasi totalità dei punti monitorati, le concentrazioni rilevate
sono inferiori al 10% del corrispondente limite espositivo AC-
GIH. L’escrezione urinaria di acido ippurico, come è già da tempo
noto, risulta spesso influenzata dalla dieta, dal ritmo circadiano,
dal fumo di tabacco, dal sesso, etc. A causa della forte ingerenza
di tali fattori di confondimento e in considerazione delle
basse esposizioni a toluene, riteniamo l’o-cresolo l’indicatore
biologico più significativo e attendibile, in alternativa alla tradizionale
ippuricuria, per le prossime campagne biologiche (4).
L’ACGIH, già a partire dal 1998, aveva indicato, tra le proposte
di cambiamento, l’introduzione della misura dell’o-cresolo urinario
a fine turno di lavoro nei lavoratori professionalmente
esposti a toluene.
Ringraziamenti
Ringraziamo vivamente il Prof. Edoardo De Rosa, esperto e cultore
degli argomenti trattati.
Bibliografia
1) Sigma, Aldrich e Fulka chimica, divisione della Sigma-Aldrich Srl:
Scheda di Sicurezza del Toluene.
2) Perbellini L, Berri A, Turci R, Gardinali F, Sciarra G, Bartolucci GB,
Sala C, Bosio C, Carrer P, Maroni M, Minoia C. Solventi I. Minoia
C, Perbellini L, Eds. Monitoraggio ambientale e biologico dell’esposizione
professionale a xenobiotici, Volume 5. Morgan Edizioni Tecniche,
Milano, 2001.
3) Apostoli P, Bartolucci GB, Imbriani M. Sempre a proposito di D.Lgs
25/02: la sorveglianza sanitaria prevista e quella necessaria per i rischi
chimici. G ItalMedLavErg 2003; 25: 3-11.
4) Apostoli P. I valori guida necessari all’interpretazione del monitoraggio
biologico. G ItalMedLavErg 2003; 25: 22-27.

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
88 www.gimle.fsm.it
B. Papaleo, L. Caporossi, M. De Rosa, A. Pera
Il taxolo plasmatico quale indicatore biologico di esposizione a taxolo
ISPESL, Dipartimento di Medicina del Lavoro, Roma
RIASSUNTO. Per l’impostazione di un programma di monitoraggio
biologico di infermieri professionalmente esposti a Taxolo (Paclitaxel) è
stato messo a punto un metodo di analisi, semplice e veloce, per la determinazione
del Taxolo nel plasma, attraverso l’utilizzo della cromatografia
liquida ad alta prestazione equipaggiata con un rivelatore a serie di
diodi. Il metodo è stato validato e ha permesso la quantificazione fino ai
10 ng/ml di plasma.
Parole chiave: taxolo, livelli plasmatici, monitoraggio biologico.
ABSTRACT. TAXOL IN PLASMA AS A BIOLOGICAL MARKER OF EX-
POSURE TO TAXOL. We present a fast and simple method for the analytical
determination of Paclitaxel in human plasma. The analytical instrument
is a high performance liquid chromatograph equipped with a diode
array detector. The assay was validated and it was applied to plasma samples
of nurses occupationally exposed to taxol and the results have been
excellent, allowing evaluations of up to 10 ng/ml of plasma.
Key words: taxol, plasma levels, biological monitoring.
Introduzione
L’importanza farmacologia del Taxolo (tax-11-en-9one,4β,20-epoxy-1,2α,4,7β,10β,13α-hexahydroxy-4,10-diacetate-2-benzoato-13-(α-phenylhippurate)
iniziò ad evidenziarsi dopo
l’imponente lavoro svolto nei primi anni ’60 dal Development
Therapeutics Program (DTP), nella divisione del Cancer treatment,
per l’individuazione di nuove molecole clinicamente utili.
Il suo meccanismo d’azione a livello cellulare consente un legame
con i microtubuli cellulari, promuovendone l’assemblamento
e prevenendo la divisione cellulare senza interferire nella sintesi
delle proteine (1). Studi clinici hanno mostrato come il Taxolo
possa essere utilmente impiegato per contrastare una varietà di tumori:
alle ovaie, ai polmoni, alla mammella, al cervello, melanoma
e leucemia (2), classificandosi tra gli agenti antimitotici antitumorali
con una potente inibizione della replicazione cellulare.
È un agente antiblastico con un’alta tossicità (3), ciò nonostante,
una classificazione in base ai suoi eventuali effetti cancerogeni,
mutageni e teratogenici ancora non è stata definita. La cinetica
plasmatica del taxolo ha emivite di eliminazione molto variabili,
comprese tra le 6h e le 20h, si lega saldamente alle proteine
plasmatiche, in particolare a albumina, α-1-glicoproteina e
lipoproteine, in una quota pari circa al 95% della dose assorbita.
La principale via di eliminazione del farmaco è quella epatica,
seguita dall’escrezione biliare e accumulo nei tessuti; la quota
eliminata per via urinaria è risultata appena del 10% rispetto
alla dose assunta. Da studi condotti sul farmaco radiomercato si
è osservato che il 75% della dose è rinvenuto nelle feci (4).
Partendo da queste informazioni, in letteratura, l’indicatore
biologico risultato maggiormente sensibile per valutare la dose assorbita
è stato il taxolo plasmatico. C’è da sottolineare come non
siano ancora presenti studi su esposizioni professionali bensì
esclusivamente studi di farmacocinetica e farmacodinamica (5, 6,
7) o di valutazione delle condizioni di pazienti trattati terapeuticamente
(8) per completare il quadro delle informazioni cliniche.
Materiali e metodi
Campionamento: sono stati raccolti campioni ematici di 8
operatori addetti alla preparazione di chemioterapici antiblastici.
Il prelievo è stato effettuato alla fine del turno lavorativo setti-
manale. A ciascun operatore è stato somministrato un questionario
per la raccolta delle informazioni sulle condizioni di lavoro
con particolare attenzione alle procedure utilizzate nelle fasi di
preparazione, somministrazione e smaltimento del taxolo, con riferimento
alla frequenza ed ai DPI adottati; si sono raccolte informazioni
sulle esatte quantità di farmaco manipolate e sulla eventuale
necessità di operare preparazioni in casi di emergenza.
Procedura di analisi: i campioni biologici, sia di controllo che
di studio, sono stati raccolti in provette eparinizzate, il plasma è stato
prontamente separato dal sangue per centrifugazione e conservato
in provette di polipropilene a -20°C prima dell’analisi. Al momento
dell’analisi, dopo aver portato i campioni a temperatura ambiente,
ad una aliquota di plasma è stato aggiunto un eguale volume
di tampone acetico (pH=5.5), dopo centrifugazione a il sovranatante
è stato raccolto e analizzato. Si è eseguita una preventiva estrazione
in fase solida dell’analita dal plasma con l’utilizzo di colonnine
SPE Cyanopropyl silica. Le colonnine impaccate sono state condizionate
con una sequenza di solventi (metanolo, acqua e tampone
acetico 0.01M, pH=5.5), quindi è stato applicato il campione e si è
fatta seguire una fase di pulizia sempre con tampone acetico 0.01M
(pH=5.5) e una miscela acqua/metanolo 90:10 (v/v).l’eluizione del
taxolo è stata eseguita con 2 ml di acetonitrile/trietilammina 1000:1
(v/v) in provette di vetro, quindi evaporato sotto un leggere flusso di
azoto a 50°C. Il residuo è stato ripreso con 200 µl CH 3 OH/tampone
acetico 0.4M 3:5 v/v e iniettato in HPLC. La corsa cromatografica
è stata eseguita con una colonna C8, in condizioni isocratiche, la fase
mobile è consistita in una miscela CH 3 CN/CH 3 OH/tampone acetico
0.05M 56:14:30, con un flusso 1.0 ml/min. La rivelazione è stata
compiuta con un rivelatore a serie di diodi, monitorando l’assorbimento
alla lunghezza d’onda di 227 nm. Il taxolo ha mostrato un
tempo di ritenzione di 3.36 minuti.
Risultati e Discussione
Studio di validazione: il metodo è stato validato. La curva di
calibrazione ha indicato un’ottima linearità di risposta nel range
5-500 ng/ml (coefficiente di correlazione R=0.9998); i recuperi
sono risultati tutti superiori all’87%; il limite di rilevabilità è stato
fissato a 10 ng/ml. Precisione e accuratezza sono stati calcolati
intra-day e inter-day per quattro campioni di controllo in quadruplicato
dando ottimi risultati (maggiori del 94%).
Esiti del monitoraggio: i campioni analizzati sono stati raccolti
in tre ospedali diversi, per avere una eventuale indicazione
sui potenziali effetti delle differenti condizioni di lavoro. In quelle
strutture sanitarie di più recente costruzione, in cui le strategie
di prevenzione, ed in particolare l’adozione delle misure di protezione
collettiva ed individuale, sono più organizzate l’esito del dosaggio
plasmatico di taxolo non ha evidenziato esposizioni particolari,
come prevedibile. Solo in un caso si è ottenuto un dato superiore
al nostro limite di rilevabilità; questo risultato è stato interpretato
come condizionato dalla storia lavorativa dell’infermiera
in esame, caratterizzata da una elevata anzianità lavorativa.
Conclusioni
Il metodo presentato risulta essere facilmente applicabile, veloce
e realizzabile con costi notevolmente contenuti rispetto ad

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 89
altre tecniche presentate in letteratura. Può essere agevolmente
applicato per il monitoraggio biologico di operatori professionalmente
esposti permettendo di valutare fino a 10 ng/ml di plasma,
e seppur non sono ancora disponibili dei limiti di esposizione
professionale, questa concentrazione può essere utilmente impiegata
per evidenziare una avvenuta esposizione nonché un eventuale
accumulo.
Bibliografia
1) Foa R, Norton L, Seidman A. Taxol (paclitaxel): a novel antimicrotubule
agent with remarkable anti-neoplastic activit. Int J Clin Lab
Res 1994; 24: 6-14.
2) Arbuck SG, Christian MC, Fisherman JS. Clinical development of
Taxol. Monogr Natl Cancer Inst 1993; 15: 11-24.
L. Perbellini 1 , G. Maccacaro 2 , F. Marano 2
3) Donehower RC. Clinical toxicities encountered with paclitaxel. Semin
Oncol 1993; 20 (suppl.3): 1-15.
4) Minoia C, Perbellini L. Il monitoraggio ambientale e biologico dell’esposizione
professionale a xenobiotici- I chemioterapici antiblastici,
vol.3, Morgan edizioni tecniche.
5) Beijnen JH, Huizing MT, ten Bokkel Huinink WW, Veenhof CH,
Vermorken JB, Giaccone G, Pinedo HM. Bioanalysis, pharmacokinetics,
and pharmacodynamics of the novel anticancer drug paclitaxel
(taxol). Semin Oncol 1994, 21 (5 suppl 8): 53-62.
6) Martin N, Catalin J, Blachon MF, Durand A. Assay of paclitaxel
(Taxol) in plasma and urine by high-performance liquid chromatography.
J Chromatogr B 1998, 709(2): 281-8.
7) Alexander MS, Kiser MM, Culley T, Kern JR, Dolan JW, McChesney
JD, Zygmunt J, Bannister SJ. Measurament of paclitaxel in biological
matrices: high-throughput liquid chromatographic-tandem
mass spectrometric quantification of paclitaxel and metabolites in
human and dog plasma. J Chromatogr B 2003, 785: 253-261.
Monitoraggio biologico per l’esposizione a vapori di benzina
nel personale addetto all’erogazione di carburanti
1 Dipartimento di Medicina e Sanità Pubblica, Università degli Studi di Verona
2 Servizio di Medicina del Lavoro, Bolzano
RIASSUNTO. L’esposizione a vapori di benzina rappresenta un rischio
di non facile valutazione per la presenza di alcuni cancerogeni (benzene)
e di molteplici altri solventi. Tra questi il Metil-Ter-Butil-Etere
(MtBE) viene aggiunto, in proporzione di circa il 15%, per migliorarne le
caratteristiche. La misura contemporanea del MtBE e del benzene in
campioni ambientali e biologici permette una valutazione piuttosto precisa
del rischio di esposizione a vapori di benzina e a benzene. Il nostro studio
evidenzia che il personale addetto all’erogazione di carburanti è modicamente
esposto a vapori di benzina: i livelli di MtBE nelle urine sono
comunque nettamente maggiori rispetto quelli della popolazione generale
e aumentano considerevolmente durante l’esposizione; i livelli urinari
di benzene, seppur più elevati di quelli della popolazione generale, non
presentano differenze tra l’inizio del lavoro e fasi successive.
Parole chiave: benzene, metil-ter-butil-etere, benzina, monitoraggio
biologico.
ABSTRACT. BIOLOGICAL MONITORING OF EXPOSURE TO PETROL
FUMES IN PETROL STATION WORKERS. The exposure to petrol fumes representes
a risk which is difficult to assess because of the presence of carcinogenic
chemicals (i.e. benzene) and many other organic solvents.
Among these, methyl-tert-butyl ether (MtBE) is added to petrol (it represents
about 15% in volume) in order to improve its performance as a fuel.
The measurement of MtBE and benzene in environmental and biological
(urine) samples allows a good risk assessment for exposure to petrol fumes.
Our research shows that workers in petrol stations are not highly exposed
to petrol fumes: their urinary concentrations of MtBE, however,
are higher than that found in the general population and increase during
the working day. In the same way the urinary concentration of benzene in
workers is higher than that found in the non-exposed subjects, but it does
not increase during the work shift.
Key words: benzene, methyl-tert-butyl ether, petrol, biological monitoring.
Introduzione
Le benzine sono miscele piuttosto complesse costituite da
numerosi idrocarburi alifatici ed aromatici naturali a cui vengono
aggiunti alcuni prodotti per modificarne le caratteristiche finali.
Tra questi vi è il metil-ter-butil-etere (MtBE) che spesso rappresenta
circa il 15% della benzina. Miscelato alla benzina l’MtBE
ne aumenta il numero di ottani e migliora la combustione nel motore,
riducendo le emissioni di sostanze inquinanti presenti nei
gas di scarico dei motori. Quale inquinante il MtBE tende a non
rimanere disperso nell’aria ma, essendo abbastanza solubile nell’acqua,
viene trascinato nei terreni e nei corsi d’acqua dove vi
resta per tempi indefiniti, in quanto scarsamente degradabile. Dal
punto di vista cancerogeno il MtBE è inserito dall’Agenzia Internazionale
per la Ricerca sul Cancro nella Categoria 3 (“non classificabile”).
Tra i prodotti “naturali” presenti nelle benzine è da
segnalare il benzene che attualmente è rilevabile in proporzioni
inferiori all’1%, ma è un sicuro cancerogeno. L’esposizione a vapori
di benzina è quindi considerata pericolosa perché rappresenta
un rischio di inalazione di vapori di benzene.
Lo studio che presentiamo ha come principale obiettivo quello
di valutare l’esposizione a vapori di benzina di un gruppo di
addetti all’erogazione di carburante. A questo fine abbiamo misurato
le concentrazioni di benzene e di MtBE nell’aria ambiente
e in campioni biologici raccolti prima dell’inizio del lavoro e
al termine di un mezzo turno di lavoro. Per ridurre i fattori di
confondimento abbiamo selezionato solo soggetti non fumatori.
Materiali e metodi
Un gruppo di soggetti addetti all’erogazione del carburante
(44 soggetti) e un analogo gruppo di controllo (n. 45), tutti non
fumatori, hanno partecipato allo studio. I lavoratori hanno fornito
un campione di urine prima dell’inizio (ore 7.30) ed a metà del
loro turno di lavoro (ore 12,30), mentre i soggetti di controllo
hanno raccolto il campione biologico solo al mattino. Per gli addetti
all’erogazione di carburante, l’esposizione individuale a vapori
di benzina è stata valutata applicando un campionatore passivo
a diffusione radiale (“Radiello”) sul colletto della loro tuta
per 5 ore. L’analisi dei MtBE e del benzene nei campioni ambientali
e biologici è stata effettuata con metodica gas cromato-

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
90 www.gimle.fsm.it
grafica utilizzando un rivelatore a spettrometria di massa
(CG/MS). I campioni biologici sono stati raccolti in provette di
vetro con tappo a vite e setto in Teflon e analizzati con tecnica
“head space”. Il carbone attivo dei “Radiello” è stato desorbito
con percloroetilene prima dell’analisi in GC/MS.
Risultati e Discussione
L’esposizione ai prodotti in studio degli addetti alla distribuzione
a carburanti è così sintetizzabile: il benzene era presente a concentrazioni
comprese tra 0,004 mg/m 3 (4 µg/m 3 ) e 0,172 mg/m 3
(172 µg/m 3 ) con una media geometrica (MG) di 60 µg/m 3 , mentre
le concentrazioni di MtBE avevano un range di 0,006-1,399 mg/m 3
ed una media geometrica di 0,437 mg/m 3 (437 µg/m 3 ). L’esposizione
a benzene per la popolazione generale nella città in studio presenta
un valore di fondo medio pari a 0,7 µg/m 3 che è particolarmente
basso rispetto a quanto si rileva in molte altre città.
La Figura 1 riporta i risultati riguardanti il MtBE misurato
nelle urine. Nei soggetti di controllo le concentrazioni medie del
solvente (MG) erano di 40 ng/L. I soggetti addetti alla distribuzione
di carburanti avevano concentrazioni urinarie medie pari a
142 ng/L (media geometrica) che aumentavano considerevolmente
(MG = 1012 ng/L) a metà-turno. Le differenze erano statisticamente
significative nei tre gruppi di dati. Nei soggetti di
controllo le concentrazioni urinarie di benzene (MG) erano di 42
ng/L. I soggetti delle stazioni di servizio avevano concentrazioni
significativamente maggiori sia all’inizio (MG = 142 ng/L) che a
metà-turno (MG = 232 ng/L). Questi ultimi dati però non erano
statisticamente differenti tra loro, a significare che la dose di benzene
assorbita durante il lavoro era molto modesta. Le concentrazioni
ambientali di MtBE sono risultate correlate in modo lineare
con le concentrazioni del MtBE nelle urine di metà-turno
L. Perbellini, A. Princivalle, A. Caprini
(p

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 91
mercapturico (AMMA) che in precedenza non era mai stato
identificato neppure nell’animale (1). Tale metabolita è presente
nelle urine di soggetti esposti a DMA in quantità rilevanti
(dell’ordine di varie decine di mg/l). Scopo del presente lavoro
è quello di riportare i primi dati disponibili sull’AMMA
nel monitoraggio biologico delle esposizioni professionali a
DMA e confrontarli con quelli della N-metilacetammide
(NMA) per la quale è disponibile da anni un valore valore limite
biologico. Le concentrazioni della DMA nell’ambiente di
lavoro controllato erano così basse da essere difficilmente
quantificabili; durante la fase preparatoria dello studio ci si era
peraltro resi conto che una certa quota di DMA veniva assorbita
dai lavoratori per via percutanea.
Materiali e metodi
Un gruppo di lavoratori di un’azienda che produce fibre
sintetiche di tipo acrilico ha collaborato per valutare l’intensità
dell‘esposizione personale a DMA attraverso il monitoraggio
biologico. Con questa logica ciascuno di loro ha raccolto una
serie di campioni di urina secondo il seguente schema: a) all’inizio
e alla fine di un turno di lavoro dopo 2 giorni di riposo,
b) all’inizio e alla fine del turno di lavoro del giorno seguente,
e c) prima dell’inizio del terzo giorno di lavoro. Tenendo presente
che la DMA aderita sulla cute poteva essere assorbita anche
dopo il termine del turno di lavoro, i dipendenti che hanno
partecipato allo studio si sono sottoposti a doccia e a cambio di
tutti gli indumenti al termine di ogni turno di lavoro. I campioni
di urina sono stati raccolti in flaconi di vetro e posti a -
20° C fino all’analisi. La quantificazione della NMA è avvenuta
con metodica gascromatografica con rivelatore di massa.
Dopo purificazione dei singoli campioni di urina con colonnine
SPE C18, l’AMMA è stato analizzato utilizzando un micro-
HPLC con trappola ionica e spettrometria di massa. Le concentrazioni
di AMMA e NMA sono state rapportate alle concentrazioni
urinarie della creatinina.
Risultati e Discussione
Nella figura 1 sono riportati i valori medi (in mg/g creat)
delle concentrazioni di NMA e di AMMA nei campioni di urina
raccolti all’inizio e alla fine del turno di lavoro nei vari giorni
considerati.
Come si nota, all’inizio del turno di lavoro dopo 2 giorni di
riposo, le concentrazioni di NMA e di AMMA presentavano valori
più bassi di quanto rilevato in fasi successive. Le concentrazioni
di NMA tendevano ad aumentare considerevolmente durante
il lavoro, per tornare a livelli piuttosto modesti prima dell’inizio
di un nuovo turno di lavoro. L’AMMA ha presentato un
comportamento molto differente rispetto quello della NMA. All’inizio
del turno di lavoro dopo 2 giorni di riposo era a livelli
medi di 7,5 mg/g creat. che aumentavano a 9,3 mg/g creat. al termine
del turno di lavoro. Tale incremento continuava anche nei
Figura 1. Concentrazioni medie di NMA (colonne grigie) e di
AMMA (colonne chiare) nelle urine raccolte all’inizio (I.T.) e
alla fine di un turno di lavoro (F.T.) dopo 2 giorni di riposo,
e nei due successivi giorni di lavoro
giorni successivi con valori di 20,1, 14,9 e 19,3 mg/g/creat. rispettivamente
all’inizio e alla fine del 2° giorno di lavoro e all’inizio
del 3° giorno. È evidente che la cinetica biologica dei 2
metaboliti è considerevolmente diversa. L’emivita urinaria della
NMA calcolata con i valori medi delle concentrazioni di NMA
nei campioni raccolti al termine del 2° giorno di lavoro rispetto
a quelle rilevate all’inizio del 3° giorno di lavoro è risultata pari
a 8,6 ore. Lo stesso calcolo non è stato possibile per l’AMMA
le cui concentrazioni urinarie hanno continuato ad aumentare
durante i 3 giorni di raccolta dei campioni. In modo approssimativo,
utilizzando i dati delle concentrazioni del 3° giorno di
lavoro e quelli dell’inizio del turno di lavoro dopo 2 giorni di riposo
si ottiene una emivita di circa 35 ore. L’emivita biologica
della NMA, che come abbiamo segnalato è piuttosto rapida, trova
conferme dai dati sperimentali di Nomiyama e coll. (2000).
Tali autori hanno organizzato un’esposizione controllata a DMA
di alcuni soggetti con la raccolta di campioni di urine ogni 3-6
ore. Tale studio ha permesso di calcolare in modo accurato l’emivita
urinaria della NMA che è risultata pari a 5,6 ore.
Per quanto riguarda l’AMMA non vi sono dati della letteratura
che rappresentino un supporto ai nostri calcoli, ma non vi è
dubbio che tale metabolita venga sintetizzato ed escreto in modo
più lento della NMA come risulta ben evidente dalla Figura 1. È
possibile pertanto che questi mercapturati permettano di valutare
esposizioni di più giorni consecutivi; ulteriori studi sono comunque
necessari per confermare queste ipotesi.
Bibliografia
1) Perbellini L, Princivalle A, Caivano M, Montanari R. Biological monitoring
of occupational exposure to N,N-dimethylacetamide with
identification of a new metabolite. Occup Environ Med 2003; 60:
746-751.
2) Nomiyama T,Omae K, Ishizuka C, Yamauchi T, Kawasumi Y, Yamada
K, Endoh H, Sakurai H. Dermal absorption of N,N-dimethylacetamide
in human volunteers. Int Arch Occup Envir Health 2000; 73:
121-126.

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
92 www.gimle.fsm.it
P. Piccoli 1 , F. Foresto 2 , M. Carrieri 2 , L. Padovano 1 , M. Di Mare 1 , G.B. Bartolucci 2 , M. Manno 1
Fenotipizzazione del CYP 2E1 in vivo come biomarker di esposizione,
effetto e suscettibilità a xenobiotici: una nuova metodica
1 Dipartimento di Scienze Mediche Preventive, Sezione di Medicina del Lavoro, Università degli Studi di Napoli Federico II, Napoli
2 Dipartimento di Medicina Ambientale e Sanità Pubblica, Università degli Studi di Padova, Padova
RIASSUNTO. Scopo del nostro lavoro è stato la modifica di un metodo
per la quantificazione del clorzoxazone(CHZ) e del suo principale
metabolita 6-idrossiclorzoxazone (6-OH-CHZ) nel siero come indicatore
biologico di esposizione, effetti o suscettibilità a xenobiotici. I due analiti
e la fenacetina, utilizzata come standard interno, sono stati estratti mediante
il ter-butl metil etere. Il campione è stato quindi analizzato in
HPLC/UV su una colonna C18 ODS 5 µm con una fase mobile costituita
da acetonitrile e acido acetico 0.5% (30:70 v/v, rispettivamente) a lunghezza
d’onda 287 nm. Le rette di calibrazione presentano un coefficiente
di correlazione altamente significativo, pari a 0.9994 nell’intervallo di
concentrazione 0.05-5 µg/mL per il 6-OH-CHZ e di 0.9996 nell’intervallo
0.25-5 µg/mL per il CHZ. I coefficienti di variazione interday e intraday
sono rispettivamente

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 93
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Ad ogni aliquota di siero (0.3 ml) vengono aggiunti 0.3 ml di
tampone acetato (2M, pH 5.2), 10 µl di fenacetina (1 mg/ml) quale
standard interno (IS) (5) e 12 µl di β-glucuronidasi (110.2
unità/ml), lasciando quindi idrolizzare il campione per una notte
a 37° C (tale ultima procedura risulta superflua nella messa a
punto del metodo, per la quale viene utilizzato siero drug free al
quale vengono aggiunte quantità note di CHZ e 6-OH-CHZ). Al
siero così trattato si aggiungono 2 ml di acido perclorico 0.6 M
allo scopo di far precipitare le proteine. Dopo aver centrifugato
per 5 minuti a 10.000 RPM, i due analiti vengono estratti dal surnatante
con 10 ml di ter-butil metil etere in due estrazioni successive
per la durata di 10 minuti ciascuna. Il ter-butil metil etere
viene quindi tirato a secco a 40°C in centrifuga UNIVAPO 100
(durata circa 15 minuti), e il residuo ripreso con 200 µl di fase
mobile (acido acetico 0.5%/acetonitrile, 70/30 vv) ed analizzato
in HPLC con rivelatore UV.
CONDIZIONI LC-UV
Le condizioni analitiche per il metodo HPLC sono le seguenti:
– pre colonna Beckman ODS 4.6 mm (diametro interno) x 4.5
cm (lunghezza)
– colonna C18 Beckman ODS 5 µm ∅, 4.6 mm, 25 cm
– fase mobile: acido acetico 0.5%/acetonitrile (70/30 vv)
– flusso: 1 ml/minuto
Figura 1. Rese percentuali di estrazione di 6-OH-CHZ e CHZ con diversi solventi organici
– λ detector: 287 nm
– volume iniettato: 20 µl.
I tempi di ritenzione di 6-OH-CHZ, IS, e CHZ sono rispettivamente
di 5, 9 e 14 minuti.
Risultati e Discussione
La presente metodica è stata messa a punto partendo da quella,
già validata, descritta da Lucas et al.(1993) (6). La fase di estrazione
liquido-liquido è stata mantenuta immodificata, tuttavia si e`
sostituito l’etilacetato con il ter-butil metil etere, solvente che, oltre
a garantire un recupero paragonabile se non superiore a quello
dell’etilacetato, è estremamente volatile e pertanto riduce notevolmente
i tempi di estrazione. L’estratto così ottenuto risulta poi molto
pulito e non presenta emulsioni inquinanti che possono dare interferenze
nella determinazione del 6-OH-CHZ o del CHZ che
comprometterebbero l’efficienza della colonna e di tutto il sistema
cromatografico. In figura 1 sono riportate le tipiche rese di estrazione
ottenute utilizzando diversi solventi organici.
Un’ulteriore modifica da noi apportata è stata l’introduzione di
uno standard interno (5), la fenacetina, per ovviare agli inevitabili
errori dovuti ad estrazione parziale, recupero incompleto del solvente
di estrazione, agitazione disomogenea del campione, ecc.,
tutti fattori che possono inficiare la determinazione quantitativa dei
due analiti. A tale proposito possiamo vedere nella Figura 2 come
l’introduzione dello standard interno migliori notevolmente la linearità
della retta di calibrazione.
A B
Figura 2. Rette di calibrazione di 6-OH-CHZ e CHZ, con e senza standard interno. Le rette ottenute dal rapporto delle aree
di ciascuno dei due analiti con quella dello standard interno risultano maggiormente lineari (A, r 2 = 0.9994 per il 6-OH-CHZ
e = 0.9996 per il CHZ) di quelle ottenute tabulando direttamente le aree di 6-OH-CHZ e CHZ (B, r 2 = 0.9951 per il 6-OH-CHZ
e di 0.9949 per il CHZ)

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Ulteriore modifica apportata alla metodica di Lucas et al. è
stata la sostituzione della colonna nuclosil ODS 5 µm Interchim
con la colonna C 18 ODS 5 µm Beckman. Questo ci ha permesso
di ottenere un cromatogramma più pulito e più veloce (circa 7
minuti in meno per ogni campione) di quello ottenuto da Lucas
et al. (Figura 3), peraltro da campioni incubati overnight e quindi
qualitativamente diversi dai nostri.
Infine, l’evaporazione sotto flusso di azoto è stata sostituita
con quella a sistema chiuso sottovuoto: l’uso di tale apparato ha
permesso di portare a secco un numero maggiore di campioni in
minor tempo e, fattore non trascurabile, ha ridotto il possibile rischio
di esposizione dell’analista. Inoltre, trattandosi di una centrifuga,
il campione viene concentrato sul fondo della provetta
evitandone la dispersione sulle pareti.
Le prestazioni del metodo da noi messo a punto sono:
– Separazione cromatografica: 6-OH-CHZ, CHZ e fenacetina
(IS) sono state completamente separate e non sono state osservate
interferenze con altri composti endogeni (Figura 4).
– Precisione: è stata determinata sia in termini di ripetibilità
che di riproducibilità ed espressa come coefficiente di varia-
Figura 3. Cromatogramma in UV 287 di 6-OH-CHZ (t = 6’) e
CHZ (t = 19’) ottenuto da siero dopo somministrazione orale
di CHZ 500 mg con il metodo di Lucas et al. (1993)
Figura 4. Cromatogramma in UV 287 di 6-OH-CHZ (t = 4’), fenacetina
(IS) (t = 8.3’) e CHZ (t = 14’) ottenuto col nuovo metodo;
le aree ottenute coi due metodi non sono quantitativamente
confrontabili
zione percentuale. La ripetibilità, determinata mediante misure
ripetute nell’intervallo di concentrazione 0.5-5 µg/ml, ha
dato un coefficiente di variazione compreso tra il 2 e il 6%
per il 6-OH-CHZ e tra il 4 e il 9% per il CHZ. La riproducibilità,
determinata ripetendo l’analisi dei campioni in giornate
diverse, ha dato, nello stesso intervallo di concentrazione,
un coefficiente di variazione compreso tra il 4 e il 12% per il
6-OH-CHZ e tra il 7 e il 12% per il CHZ.
– Accuratezza: è stata determinata nello stesso intervallo di
concentrazione ed è risultata variabile dal 96 al 107% per il
6-OH-CHZ e dal 93% al 110% per il CHZ.
– Sensibilità: il limite di sensibilità analitica è risultato pari a
0.05 µg/ml per il 6-OH-CHZ e a 0.25 µg/ml per il CHZ.
– Linearità: la retta di calibrazione ottenuta mostra una buona linearità
della risposta strumentale per entrambi gli analiti:
r 2 =0.9994 per il 6-OH-CHZ e r 2 =0.9996 per il CHZ (Figura 2).
Conclusioni
Il nostro metodo per la determinazione analitica contemporanea
di 6-OH-CHZ e CHZ, si è rivelato rapido, semplice e sensibile,
e pertanto più adatto ad un uso in ambito occupazionale del
metodo originario (6). L’introduzione di uno standard interno ha
notevolmente migliorato la linearità della retta di taratura, compensando
le piccole perdite di solvente durante la procedura di
estrazione. L’utilizzo di un sistema di evaporazione sotto vuoto,
nonché la sostituzione del solvente organico per l’estrazione liquido-liquido,
ha permesso di velocizzare l’analisi aumentando il
numero di campioni analizzabili in una giornata e la sicurezza
dell’operatore.
Ringraziamenti
Gli Autori ringraziano il supporto finanziario del progetto MIUR-
PRIN 2003 N.2003063319_003.
Bibliografia
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6-hydroxychychlorzoxazone in serum: a tool for indirect evaluation
of cytochrome P 450 2E1 activity in humans. J Chromat 1993; 622:
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G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 95
M. Pieri 1 , L. Soleo 2 , N. Miraglia 2 , A.G. Perrotta 1 , P. Basilicata 3 , A. Acampora 3 , N. Sannolo 1
Incremento dei livelli di sensibilità nell’analisi di addotti emoglobinici
mediante digestione selettiva con calpaina
1 Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione di Medicina del Lavoro, Igiene e Tossicologia Industriale, Seconda Università di Napoli.
2 Dipartimento di Medicina Interna e Medicina Pubblica, Università di Bari
3 Dipartimento di Medicina Pubblica e Sicurezza Sociale - Sezione di Medicina Legale, Università di Napoli “Federico II”
RIASSUNTO. Nell’ambito del monitoraggio biologico di soggetti
esposti ad agenti cancerogeni uno strumento di analisi molto efficace è
rappresentato dalla quantificazione degli addotti emoglobinici, che richiede,
al fine di ottenere risultati accurati, lo sviluppo di metodiche di
purificazione selettiva della frazione emoglobinica alchilata. A tal fine,
nel presente lavoro è stata realizzata una digestione con calpaina, i cui risultati
preliminari hanno evidenziato una diversa reattività dell’enzima
nei confronti di emoglobina nativa ed alchilata con epicloridrina in quanto
viene digerita solo l’emoglobina normale, con un conseguente arricchimento
della frazione alchilata.
Parole chiave: addotti all’emoglobina, emoglobina alchilata, purificazione
selettiva, cromatografia liquida/spettrometria di massa.
ABSTRACT. HIGHER LEVELS OF SENSITIVITY FOR THE ANALYSIS OF
HB ADDUCTS BY CALPAIN DIGESTION. Biological monitoring of subjects
exposed to carcinogenic agents can be efficiently carried out through the
quantitative measurement of hemoglobin adducts. This procedure requires
the development of selective purification methods of the alkylated hemoglobin
fraction in order to achieve high levels of accuracy. Digestion
with calpain was conducted for the purposes of the present paper. The
preliminary results showed different reactivity of the enzyme with respect
to normal and alkylated hemoglobin: only a normal fraction was digested,
with consequent concentration of the alkylated one.
Key words: hemoglobin adducts, alkylated hemoglobin, selective
purification, liquid chromatography/mass spectrometry.
Introduzione
L’interesse per i rischi connessi all’impiego di agenti alchilanti
in diversi settori dell’attività umana è progressivamente aumentato
negli ultimi anni. Particolarmente rilevante è il ruolo
giocato dal monitoraggio biologico dei soggetti professionalmente
esposti a tali agenti. Una procedura di monitoraggio biologico
ideale prevederebbe lo studio e la determinazione degli addotti
tra agenti alchilanti e DNA del tessuto bersaglio, ma una valida
alternativa è costituita dalla quantificazione di addotti emoglobinici
(1, 2). Recentemente è stata proposta una nuova metodologia
basata sulla determinazione e quantificazione di peptidi interni
modificati, ottenuti in seguito ad idrolisi triptica delle catene
emoglobiniche, analizzati mediante Cromatografia Liquida/Spettrometria
di Massa (3). La possibilità di utilizzare peptidi modificati,
anziché singoli amminoacidi alchilati, quali appropriati
biomarcatori per il monitoraggio biologico, è stata ampiamente
dimostrata (4, 5). Una limitazione della procedura proposta deriva
dal fatto che ai livelli espositivi attuali corrisponde un ammontare
estremamente basso di peptidi modificati rispetto a quelli
nativi. Di qui nasce la necessità di sviluppare tecniche di purificazione
per arricchire selettivamente i campioni e consentire la
rivelazione quantitativa degli addotti emoglobinici anche in presenza
di bassi livelli di alchilazione.
Lo scopo del presente lavoro è volto alla messa a punto di
una metodica di arricchimento selettivo degli addotti emoglobinici
mediante idrolisi con calpaina I (una cisteina proteasi calcio
dipendente) di campioni di emoglobina (Hb) alchilata con epicloridrina
(ECH), un agente alchilante utilizzato nell’industria di
sintesi.
Metodi
Campioni di Hb ed Hb-ECH sono stati ottenuti mediante procedura
riportata in letteratura (6). L’idrolisi con calpaina (Calbiochem)
è stata realizzata a 26° C, in tampone 100µM CaCl 2 e 100
mM H 3 BO 4 (1:1, v:v), variando i rapporti di digestione ed i tempi
di reazione. I campioni sono stati successivamente analizzati
mediante LC/ESI-MS ed MS-MS secondo le procedure descritte
in letteratura (6).
Risultati
L’idrolisi dei campioni di Hb è stata condotta con rapporti
Hb:calpaina pari a 200:1 e 25:1. Mediante analisi LC/ESI-MS si
è verificato che all’aumentare della quantità di enzima si ottengono
peptidi dal peso molecolare decrescente, a testimonianza di
un maggiore grado di digestione delle catene globiniche. Gli stessi
rapporti di idrolisi sono stati usati su campioni di Hb-ECH contenenti
anche globina non alchilata. L’analisi LC/ESI-MS ed MS-
MS ha permesso di evidenziare la formazione degli stessi peptidi
ottenuti digerendo Hb nativa (Figura 1), dimostrando che la
calpaina agisce sulle sole catene globiniche non alchilate, con un
complessivo arricchimento della frazione Hb-ECH. Risultati analoghi
sono stati ottenuti variando il tempo di reazione (1, 5, 16 e
48 h): all’aumentare del tempo cresce il grado di idrolisi delle catene
di Hb, mentre la frazione Hb-ECH non viene digerita. L’entità
dell’arricchimento è stata valutata calcolando i rapporti αE- CH /α e βECH /β in un campione di Hb-ECH non digerito (A) e nei
campioni di Hb-ECH:calpaina pari a 200:1 (B) ed a 25:1 (C). Il
rapporto αECH /α è risultato pari a 0,860 per il campione A, a
0,759 per B ed a 1,056 per C, conducendo la reazione a 26° C per
18 h. Nelle stesse condizioni il rapporto βECH /β era pari a 0,606
per A, 0,496 per B e 0,446 per C.
Discussione
La ricerca dell’enzima più adatto all’idrolisi selettiva delle
catene globiniche normali è scaturita dalla constatazione che la
maggior parte degli agenti alchilanti reagisce con i residui istidinici
e cisteinici interni, oltre che con i residui N-terminali, delle
catene globiniche. È stata utilizzata calpaina, un enzima che
presenta nel sito catalitico residui di cisteina ed istidina prossimali,
il gruppo -SH della cisteina e quello imidazolico dell’istidina
formano una diade tiolato-imidazolica, che interagisce con
il substrato formando intermedi tetraedrici instabili prima della
digestione. Se il substrato presenta i residui di cisteina e/o istidina
alchilati, l’interazione con il sito catalitico dell’enzima dovrebbe
in ipotesi essere più difficile rispetto a quanto accade per
le globine non alchilate. Per valutare ciò le prime prove sono state
condotte utilizzando campioni di Hb ed Hb-ECH a diversi
rapporti e tempi di digestione. All’aumentare della quantità di
enzima o del tempo di reazione si è registrato un aumento del
grado di digestione dell’Hb, ottenendo peptidi via via più piccoli.
Ripetendo gli esperimenti su campioni di Hb-ECH si è assi-

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Figura 1. Cromatogramma LC/ESI-MS di un campione di emoglobina normale (pannello a) e di emoglobina alchilata con
epicloridrina (pannello b) digeriti con calpaina in rapporto 200:1 a 26° C per 18 h
stito alla formazione degli stessi peptidi ottenuti con l’Hb, confermando
l’esistenza di una diversa reattività della calpaina nei
confronti dei due substrati. L’arricchimento è stato molto marcato
soprattutto per la catena α, in linea con i dati di letteratura,
che indicano una forte reattività dell’epicloridrina nei confronti
delle istidine della catena α 5 .
Conclusioni
Alla luce dei risultati preliminari, si ritiene che la digestione
selettiva con calpaina consenta un netto arricchimento della frazione
di emoglobina alchilata. L’utilizzazione dei dati finora ottenuti
prevederà:
a) la purificazione del digerito con filtri ad esclusione di massa
con cut-off di 10000 Da, in modo da allontanare l’intera la
frazione digerita;
b) la verifica il comportamento della calpaina rispetto alla catena
β, ripetendo gli esperimenti su campioni di emoglobina alchilati
con un agente reattivo soprattutto verso la catena β, ad
esempio bromuro di metile.
Bibliografia
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and arylating agent. Arch Toxicol 1984; 56: 1-6.
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G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 97
L. Romeo 1 , L. Perbellini 1 , M.E. Fracasso 2 , M. Olivieri 1 , P. Franceschetti 2 , F. Pasini 1 , E. Quintarelli 1 , D. Doria 2 , P. Noris 1
Valutazione dell’esposizione a fumo di tabacco in lavoratori
d’ufficio mediante la determinazione di nicotina e cotinina urinarie
e monossido di carbonio (CO) nell’aria espirata
1 Dipartimento di Medicina e Sanità Pubblica, Medicina del Lavoro, Università degli Studi di Verona
2 Farmacologia Clinica, Università degli Studi di Verona
RIASSUNTO. Il confronto tra soggetti fumatori, non fumatori e
non fumatori esposti a fumo passivo in un gruppo di 101 impiegati d’ufficio
ha messo in evidenza che la nicotina e la cotinina urinarie ed il CO
nell’aria espirata consentono di distinguere i soggetti fumatori dai non
fumatori. I soggetti non fumatori non esposti a fumo passivo ed i soggetti
fumatori sono tra loro distinguibili come gruppi, mediante la determinazione
della cotinina urinaria ed in minore misura della nicotina
urinaria.
Parole chiave: nicotina urinaria, cotinina urinaria, CO nell’aria espirata,
fumo passivo.
ABSTRACT. ASSESSMENT OF ETS EXPOSURE IN OFFICE WORKERS
THROUGH LEVELS OF NICOTINE AND COTONINE IN URINE AND OF CO IN
EXHALED AIR. A group of 101 clerk subjects (smokers, non-smokers and
passive smokers) was evaluated for urinary nicotine, cotinine and CO in
the breath air. All three exposure indicators clearly distinguish between
smokers and non-smokers. Urinary cotinine and, to a lesser extent, urinary
nicotine can identify, in the group of non-smokers, the subjects exposed
to passive smoking, while CO fails to distinguish it.
Key words: nicotine in urine, cotinine in urine, CO in exhaled air,
environmental tobacco smoke.
Introduzione
È dimostrato che il fumo di tabacco può causare la comparsa,
oltre che del tumore polmonare, anche di quello della laringe, e
che è coinvolto nello sviluppo dei tumori della vescica, del rene,
del pancreas, della cervice uterina, dello stomaco, dell’esofago e
della leucemia mieloide cronica (1). Il fumo passivo, negli ultimi
anni, ha assunto un interesse sempre più rilevante. Numerosi studi
hanno dimostrato infatti la sua nocività in seguito all’esposizione
in ambienti confinati. In generale, il rischio di malattie respiratorie
di tipo allergico, infettivo, cronico-degenerativo è maggiore
nei soggetti esposti a fumo passivo rispetto ai non esposti.
Sembra inoltre avere un ruolo importante anche nello sviluppo di
patologie cardiovascolari; infatti il rischio relativo di morte per
malattia cardiovascolare è 1,4 volte più alto per i fumatori passivi
rispetto ai soggetti non esposti al fumo di tabacco (2).
Di recente la IARC (International Agency for Research on
Cancer), a seguito di studi condotti in 12 nazioni, ha inserito il fumo
passivo nel gruppo 1, tra i cancerogeni certi per l’uomo (3).
L’esposizione a fumo passivo ed i rischi che ne derivano per la sa-
lute dei lavoratori esposti costituiscono un
problema sempre più rilevante che deve essere
adeguatamente affrontato dal datore di
lavoro conformemente alle norme di prevenzione.
L’obiettivo del presente studio è quello
di valutare il rischio espositivo di soggetti
fumatori attivi e di soggetti esposti a fumo
passivo (non fumatori ed ex fumatori), mediante
l’utilizzo di un questionario, e la determinazione
di nicotina e cotinina urinarie e
di CO nell’aria espirata, al fine di mettere a
confronto i differenti indicatori utilizzati rispetto
all’abitudine al fumo di tabacco.
Materiali e metodi
Il gruppo di lavoratori esaminato era costituito da 101 soggetti
impiegati d’ufficio. Ciascun soggetto, tra luglio 2002 e gennaio
2003, ha compilato un questionario per valutare l’esposizione
al fumo di tabacco (tipo di abitudine al fumo, marca e numero
di sigarette fumate, durata di esposizione a fumo passivo a casa,
sul lavoro o nei locali pubblici, etc). È stato considerato fumatore
il soggetto che dichiarava di fumare nell’ultimo mese almeno
una sigaretta il giorno o un sigaro o tabacco da pipa almeno
una volta la settimana. In tutti i soggetti esaminati sono state
determinate nelle urine la nicotina e la cotinina, prodotto di biotrasformazione
della nicotina, mediante gascromatografo-spettrometro
di massa (GC-MS) modello Hewelett Packard 5980-
5970. Il limite di rilevabilità del metodo è di 2 µg/L sia per la nicotina
sia per la cotinina urinarie.
Le concentrazioni di nicotina e cotinina ottenute sono state
espresse in µg per grammo di creatinina, in modo da correggere
eventuali diluizioni o concentrazioni urinarie delle due sostanze.
Nell’elaborazione statistica le concentrazioni inferiori ai limiti di
rilevabilità del metodo sono state considerate come metà del limite
stesso. Sono stati definiti fumatori i soggetti con valori di
cotinina urinaria maggiori a 100 µg/gr creatinina e non fumatori
i soggetti con valori inferiori a 50 µg/gr creatinina (4). Per la nicotina
non sono disponibili in letteratura valori di riferimento.
È stata inoltre determinata la concentrazione del monossido
di carbonio nell’aria espirata (espressa in ppm) di 74 soggetti dei
101 esaminati utilizzando Bedfont EC 50 Smokerlyzer.
Risultati
Dei 101 soggetti esaminati 33 erano fumatori e 68 non fumatori;
tra questi ultimi 47 dichiaravano di essere esposti a fumo
passivo e 21 non esposti. I risultati delle determinazioni urinarie
e del CO sono sintetizzati in Tabella I. I fumatori presentavano livelli
di nicotina urinaria compresi tra 7,5 e 5.206 µg/gr creatinina
con una media di 982 µg/gr creatinina. La cotinina urinaria variava
da livelli minimi di 148 a 4449 µg/gr creatinina, con una
media di 1664,8 µg/gr creatinina. Le concentrazioni riscontrate
Tabella I. Concentrazioni urinarie medie di nicotina e cotinina
e concentrazione media del CO nell’aria espirata

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confermano l’effettiva abitudine tabagica dichiarata dai lavoratori
essendo i valori di cotinina urinaria tutti superiori al valore di
riferimento di 100 µg/gr creatinina (valore limite utilizzato per
definire un soggetto sicuramente fumatore). Tra i soggetti non fumatori,
che dichiaravano di non essere abitualmente esposti a fumo
passivo, i risultati ottenuti mostrano concentrazioni comprese
rispettivamente tra 1 e 7 µg/gr creatinina con una media di 1,7
µg/gr creatinina per la nicotina e tra 1 e 21,8 µg/gr creatinina, con
una media di 4,3 µg/gr creatinina per la cotinina; le concentrazioni
di cotinina ottenute sono inferiori al limite di 50 µg/gr creatinina,
limite al di sotto del quale si collocano i soggetti non fumatori.
In 6 soggetti i valori di nicotina e di cotinina non erano
determinabili.
I soggetti non fumatori che dichiaravano di essere quotidianamente
esposti a fumo passivo presentavano livelli di nicotina
tra 1,0 e 36,8 µg/gr creatinina, con una media di 5,0 µg/gr creatinina,
mentre i livelli di cotinina variavano tra 1,0 e 64,5 µg/gr
creatinina, con una media di 11,5 µg/gr creatinina.
È stata determinata la concentrazione di CO in 74 soggetti
dello stesso gruppo esaminato, suddivisi in 22 fumatori, 19 non
fumatori non esposti, 33 non fumatori esposti.
Conclusioni
Grazie all’utilizzo combinato di tre indicatori di esposizione,
la popolazione dei soggetti fumatori può essere identificata e ben
distinguibile da quella dei non fumatori.
Per quanto riguarda i due gruppi dei soggetti non fumatori
(esposti e non esposti a fumo passivo) il monossido di carbonio
non consente una chiara distinzione tra le due popolazioni. La nicotina
e la cotinina urinarie sono invece significativamente differenti
tra i due gruppi.
Bibliografia
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Indicatori di esposizione a idrocarburi aromatici policiclici:
il paradosso pirene-idrossipirene
1 Dipartimento di Medicina del Lavoro, Clinica del Lavoro ‘L. Devoto’, Università degli Studi di Milano, Sezione Ospedale San Paolo, Milano
2 Azienda Ospedaliera ‘Istituti Clinici di Perfezionamento’, Milano
RIASSUNTO. Si dimostra la sussistenza di un’incongruenza quantitativa
tra la dose di pirene inalata da parte di soggetti non fumatori esposti
all’inquinamento aerodisperso urbano e la quantità, di 10-50 volte
maggiore, del metabolita principale 1-idrossipirene escreto nelle urine. Si
ipotizza che la quota di idrossipirene escreto eccedente la dose giornaliera
di pirene inalato possa provenire dal lento rilascio di pirene fortemente
adeso o strutturalmente legato al particolato carbonioso depositato nel
corso della vita del soggetto negli alveoli polmonari.
Parole chiave: pirene aerodisperso, 1-idrossipirene urinario, esposizione
ambientale.
ABSTRACT. Biomonitoring of exposure to pah: the pyrene vs. 1hydroxypyrene
paradox. Comparison between the inhaled dose of pyrene
by non-smoking subjects exposed to urban airborne contamination
and the daily urinary excretion of the main metabolite 1-hydroxypyrene
highlights a quantitative inconsistency, since the amount of the metabolite
is 10-50 times higher than the inhaled dose of the parent compound. It
is suggested that the excessive amount of hydroxypyrene may derive
from the slow release of pyrene strongly absorbed or chemically embedded
in the carbon soot deposited over a lifetime in the lung alveoli of the
subject.
Key words: airborne pyrene, 1-hydroxypyrene in urine, environmental
exposure.
Introduzione
La misura dell’entità della contaminazione da idrocarburi
aromatici policiclici (IPA) associati alla frazione respirabile del
particolato carbonioso aerodisperso e dell’escrezione urinaria dei
rispettivi metaboliti idrossilati rappresenta lo strumento sperimentale
più frequentemente impiegato per effettuare le stime di
esposizione ad IPA, sia in ambito professionale sia nei confronti
della popolazione generale (emissioni da traffico veicolare e abitudine
al fumo di tabacco). In particolare, le misure dell’idrocarburo
non cancerogeno pirene (PIR) e di escrezione del corrispondente
metabolita urinario 1-idrossipirene (1-OHP), quali indicatori
rappresentativi rispettivamente di presenza della contaminazione
ambientale e di entità dell’esposizione, sono largamente
impiegate negli studi di tossicologia industriale (1, 2, 3, 4).
L’escrezione di 1-OHP è un indicatore sensibile a variazioni recenti
nell’introduzione nell’organismo di PIR: le maggiori quantità
introdotte vengono infatti metabolizzate ed escrete come 1-
OHP al più entro la giornata successiva, sommandosi, in un lento
accumulo, all’escrezione basale giornaliera (1). L’entità dell’escrezione
basale di 1-OHP risulta correlata con la pregressa
condizione di fumatore e con il consumo attuale di sigarette (2).
Nell’esposizione ambientale a IPA da traffico veicolare, l’escrezione
di 1-OHP correla con la concentrazione della frazione respirabile
(PM 10 ) e con la quantità totale del materiale particolato
aerodisperso (4). Scopo Del presente studio era quello di confrontare
la concentrazione di IPA aerodispersi con quella urinaria
di 1-OHP in un gruppo di soggetti non fumatori.
Materiali e metodi
Soggetti allo studio. Sono stati esaminati 20 vigili urbani
non-fumatori (età 26-56 anni; media 37 anni; anzianità di servizio
2-36 anni; media 12 anni). Per l’intera mattinata dello studio
(ore 7:30-12:30), i soggetti hanno indossato un campionatore per
la captazione del particolato aerodisperso e degli IPA in fase vapore.
Prima del pranzo i soggetti hanno fornito un campione
estemporaneo di urina per la misura dell’escrezione di 1-OHP.

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
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Misura della concentrazioneaerodispersa
di IPA. I campionatori
ambientali individuali
di IPA, indossati dai
soggetti (filtro in fibra
di vetro seguito da una
fiala adsorbente XAD-
2) sono stati eluiti con
CH 2 Cl 2 e analizzati mediante
HPLC con rivelazione fluorimetrica secondo il metodo ufficiale
NIOSH.
Misura della concentrazione urinaria di 1-OHP. L’1-OHP
nelle urine è stato misurato mediante HPLC con rivelazione fluorimetrica,
dopo idrolisi enzimatica dei coniugati glucuronide e
solfato. Il limite di rivelazione del metodo è di 50 ng/L di 1-OHP
urinario. Le concentrazioni urinarie di 1-OHP sono espresse senza
correzione per l’escrezione urinaria di creatinina.
Risultati
I valori medi di contaminazione aerodispersa espressi come
IPA totali e come PIR sono risultati pari rispettivamente a 6
ng/m 3 (valori compresi tra 3 e 16 ng/m 3 ) e a 1,3 ng/m 3 (valori
compresi tra 0,4 e 3,5 ng/m 3 ), mentre i valori di escrezione di 1-
OHP dei soggetti esaminati sono risultati compresi tra 50 e 429
ng/L, con un valore medio pari a 175 ng/L. Lo scatter-plot tra la
concentrazione aerodispersa totale di IPA cui ciascun soggetto risultava
esposto e quella urinaria di 1-OHP, misurata al termine
del turno di lavoro, ha mostrato l’assenza di una relazione statisticamente
significativa (dati non riportati). L’evidente incongruenza
quantitativa tra la quantità di 1-OHP escreto nelle urine
dai soggetti e la dose di PIR da essi assunta nel periodo immediatamente
precedente il campionamento delle urine emerge dal
calcolo riportato nella Tabella I.
Si nota, infatti, che a livelli di contaminazione aerodispersa di
IPA dell’ordine di 0,4-3,5 ng/m 3 dovrebbero corrispondere valori
di escrezione di OHP 10-100 volte inferiori a quelli misurati
nella popolazione esaminata (50-429 ng/L), che è stata di proposito
selezionata come priva di esposizione significativa a IPA oltre
a quella ambientale (esclusione con questionario dei soggetti
consumatori di alimenti affumicati o cotti in forno a legna).
Discussione e Conclusioni
L’incongruenza di carattere quantitativo tra la dose di PIR inalata
e la quantità di 1-OHP escreta giornalmente nelle urine che
emerge dai risultati esposti e descritti anche da altri autori (1-4) viene
generalmente attribuita alla contestuale presenza di altre sorgenti
di esposizione a IPA, quali l’abitudine al fumo di tabacco o l’ingestione
di cibi affumicati o cotti in forno a legna, contenenti IPA.
Anche ammettendo la sussistenza di tali fattori e la loro influenza
incontrollata sui risultati degli studi, risulta, tuttavia, irrealistico giustificare
solo su tali basi le differenze osservate, perché essi non riescono
a spiegare la differenza tra l’elevata dose escreta, dell’ordine
di 50-500 ng/die, ‘eccedente’ quella attesa di vari ordini di grandezza.
Il complesso delle evidenze disponibili suggerisce piuttosto,
sebbene in via ancora in parte speculativa, che nel particolato aerodisperso
originato dai combustibili fossili sussistano frazioni di IPA
caratterizzate da differente biodisponibilità e velocità di biotrasformazione
ed escrezione col seguente meccanismo:
(a) la quota di IPA adsorbiti sulla superficie del particolato aerodisperso
inalato risulta di biodisponibilità rapida (escrezione
nell’ordine delle ore e proporzionale alla dose recente di particolato
inalato);
(b) la frazione fine del particolato aerodisperso inalato, una volta
depositatasi negli alveoli polmonari, rilascia gli IPA occlusi
nel core dei granuli in un tempo dell’ordine di anni;
(c) processi metabolici ossidativi sono potenzialmente in grado
di degradare progressivamente la matrice grafenica del materiale
particolato, rilasciando strutture di IPA che possono venire
assorbite e successivamente metabolizzate (5).
Bibliografia
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M.L. Scapellato*, A. Trevisan, M. Carrieri, I. Maccà, E. Bonfiglio, G. Gori, S. Serraino, G.B. Bartolucci
Indicatori di dose e di effetto nell’esposizione a sevoflurano
Dipartimento di Medicina Ambientale e Sanità Pubblica, Sezione di Medicina del Lavoro, Università degli Studi di Padova
RIASSUNTO. Scopo del lavoro è stato quello di studiare, in un
gruppo di soggetti professionalmente esposti a sevoflurano, il rapporto
tra indicatori di esposizione e alcuni indicatori di effetto renale ed
epatico. I livelli di esposizione sono risultati contenuti prevalentemente
al di sotto del limite di 2 ppm stabilito dal NIOSH per gli anestetici
alogenati (media: 0,161 ppm; mediana: 0,027 ppm; range: 0.007-2,71
ppm); l’escrezione urinaria a fine turno di sevoflurano appare partico-
Tabella I. Escrezione di 1-OHP attesa sulla base della concentrazione di PIR aerodisperso
misurata e del suo comportamento metabolico standard nell’uomo
larmente influenzata dai picchi espositivi, e quindi per la valutazione
dell’esposizione sembra più affidabile il ricorso al metabolita esafluoroisopropanolo
(HFIP). Sono state trovate correlazioni statisticamente
significative tra HFIP e N-acetil-β-D-glucosaminidasi e glutamina-sintetasi
urinarie; è stato inoltre riscontrato un aumento statisticamente significativo
della concentrazione di acido D-glucarico nelle urine dei
soggetti con esposizioni combinate a N 2 O e sevoflurano rispetto ai

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
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controlli, mentre non vi è alcuna differenza tra controlli ed esposti al
solo sevoflurano.
Parole chiave: esposizione a sevoflurano, monitoraggio biologico,
effetti renali, induzione enzimatica.
ABSTRACT. DOSE AND EFFECT BIOMARKERS IN SEVOFLURANE EX-
POSURE. The aim of this study was to determine the relationship between
exposure biomarkers and renal and liver effect indicators in subjects exposed
to sevoflurane. Many of the subjects show exposure to sevoflurane
below the environmental threshold limit of 2 ppm established by NIO-
SH for halogenate compounds (mean: 0.161 ppm; median: 0.027 ppm;
range: 0.007-2.71 ppm); urinary excretion of sevoflurane appeared to be
influenced by exposure peaks, so that the metabolite hexafluoroisopropanol
(HFIP) seemed to be more reliable as an exposure indicator. Statistically
significant correlations were found between HFIP and renal biomarkers
(N-acetyl-β-D-glucosaminidase and glutamine-synthetase); no
differences between controls and exposed subjects in D-glucaric acid excretion
were found for sevoflurane alone, but there was a significant difference
with respect to the control group in combined exposure to N 2 O
and sevoflurane.
Key words: sevoflurane exposure, biological monitoring, kidney
impairment, enzymatic induction.
Introduzione
Già da alcuni anni il sevoflurano è l’anestetico alogenato di
scelta per l’induzione e il mantenimento dell’anestesia inalatoria
nelle sale operatorie. Il basso coefficiente di solubilità sangue/gas
conferisce infatti una buona precisione nel controllo dell’anestesia,
nonché rapidità di induzione e risveglio. Il suo metabolismo avviene
nel fegato ad opera del citocromo P450 con formazione di ioni
fluoruro ed esafluoroisopropanolo (HFIP). È noto che i fluoruri
possano determinare effetti a carico della funzione renale, tuttavia
a tutt’oggi non ci sono evidenze di nefrotossicità, forse in relazione
all’emivita alquanto rapida di tali composti. Benché per altri
alogenati usati nel passato (alotano) fossero stati dimostrati effetti
sul fegato, per il sevoflurano non vi sono segnalazioni di alterazioni
a carico della funzione epatica. Essendo tuttavia molto limitati
gli studi sull’uomo e soprattutto nei soggetti professionalmente
esposti, abbiamo pianificato uno studio con lo scopo di valutare il
rapporto tra indicatori di esposizione ed alcuni indicatori di effetto
renali ed epatici in soggetti esposti a sevoflurano.
Materiali e metodi
Sono stati esaminati oltre 100 soggetti professionalmente
esposti a sevoflurano nei quali è stata effettuata una valutazione
dell’esposizione individuale utilizzando un campionatore diffusivo
(“Radiello”) posizionato in prossimità delle vie respiratorie.
L’analisi del Radiello è stata eseguita con il metodo dello spazio
di testa in gascromatografia associata a spettrometria di massa.
Al termine della seduta operatoria è stato raccolto per ciascun
soggetto un campione di urina per la determinazione del sevoflurano
e dei suoi metaboliti. L’analisi del sevoflurano urinario è
stata condotta con il metodo dello spazio di testa in gascromatografia
associata a spettrometria di massa, quella dei fluoruri
inorganici con PhMetro B 2500 e sonda specifica e quella dell’HFIP
con la tecnica dello spazio di testa in gascromatografia
con rivelatore FID.
In un gruppo più ristretto di 24 soggetti sono stati anche studiati
i seguenti indicatori di effetto renale: le proteine totali urinarie
(TUP), marcatore generico e aspecifico di coinvolgimento
renale, l’N-acetil-β-D-glucosaminidasi (NAG) usato per rilevare
effetti renali provocati da xenobiotici a livello della pars recta del
tubulo prossimale e la glutamina sintetasi (GS), enzima mitocondriale
utilizzato come indicatore specifico di danno del segmento
S3 . Gli stessi indicatori sono stati determinati anche in un gruppo
di 43 soggetti di controllo impiegati nell’area ospedaliera ma
non esposti a gas anestetici, stratificati per sesso, età ed indice di
massa corporea.
In 66 operatori con esposizioni combinate a N 2 O e sevoflurano
e in 42 operatori esposti esclusivamente a sevoflurano è stata
inoltre valutata l’escrezione urinaria dell’acido D-glucarico
(ADG), indicatore indiretto di induzione enzimatica, effettuando
l’analisi con metodo enzimatico per via spettrofotometrica. È stato
anche esaminato un gruppo di controllo di 33 soggetti, non
esposti a gas anestetici o ad altre sostanze inducenti o epatotossiche.
Tutti i soggetti, esposti e controlli, non presentavano all’anamnesi
una storia di pregresse o attuali malattie epatiche o renali
né un’assunzione regolare di farmaci.
Risultati e Discussione
I livelli di esposizione a sevoflurano sono risultati nella maggior
parte dei soggetti contenuti al di sotto del limite di 2 ppm stabilito
dal NIOSH per gli anestetici alogenati (media: 0,161 ppm;
mediana: 0,027 ppm; range: 0,007-2,710 ppm). La correlazione
tra esposizione individuale a sevoflurano ed escrezione urinaria
dell’anestetico è risultata statisticamente significativa anche se
con una notevole dispersione dei dati (n=103, y=3,491x + 1,111,
r=0,44; p

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
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combinate a N 2 O e isofluorano (4) che suggeriva lo sviluppo di
una induzione enzimatica negli esposti a gas anestetici in cui
sembra determinante il ruolo giocato dal N 2 O. Benché non vi
sia una differenza statisticamente significativa nell’escrezione
di ADG tra controlli ed esposti al solo sevoflurano, si riscontra
tuttavia per questi soggetti una correlazione statisticamente significativa
tra concentrazione urinaria di sevoflurano ed escrezione
di ADG (y=1,397 + 1,902, r=0,54, p

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
102 www.gimle.fsm.it
Discussione
Tabella I. Principali parametri statistici per MTBE urinario, benzene urinario ed esposizione personale
a benzene aerodisperso nelle tre categorie di soggetti indagati
Figura 1. Grafici a scatole per l’MTBE urinario nei soggetti
indagati suddivisi in base all’occupazione lavorativa
I risultati ottenuti per MTBE urinario avvalorano le evidenze
sperimentali a favore dell’utilizzo di questo indicatore per definire
l’esposizione a vapori di benzina (7-9). MTBE urinario non
sembra invece adatto a valutare l’esposizione a traffico autoveicolare.
Questo risultato potrebbe essere attribuito ai bassi livelli
di MTBE presenti nel gas di scarico degli autoveicoli, ma anche
alla scarsa numerosità della casistica indagata. La presenza di
MTBE urinario in tutti i soggetti indica un’esposizione generalizzata
a questa sostanza. Questa esposizione può essere attribuibile,
almeno in parte, all’inquinamento da traffico autoveicolare
(3), ma non si esclude la possibilità che MTBE possa essere ingerito
con la dieta (4).
Ringraziamenti
Lo studio è stato possibile anche grazie al contributo ISPESL
per il progetto “Composti ossigenati di sintesi come nuovi additivi
delle benzine: monitoraggio ambientale e biologico nella popolazione
potenzialmente esposta” (Ricerca n° B65/DML/00).
Bibliografia
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G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 103
E. Scotti 1 , G. De Palma 1,2 , P. Mozzoni 1,2 , S. Carnevali 3 , F. Luppi 3 , A. Caglieri 2 , M.V. Vettori 1,2 , M. Goldoni 1,2 , L. Fabbri 3 , A. Mutti 2
Caratterizzazione in vitro dell’espressione dell’eme ossigenasi 1
in cellule epiteliali polmonari umane esposte a fumo di sigaretta
1 Centro Studi e Ricerche ISPESL, Università degli Studi di Parma
2 Laboratorio di Tossicologia Industriale, Università degli Studi di Parma
3 Clinica di Malattie dell’Apparato Respiratorio, Università di Modena e Reggio Emilia
RIASSUNTO. Viene presentato uno studio in vitro su linee epiteliali
e fibroblastiche polmonari esposte a concentrazioni crescenti (5 e 10%)
di estratto di fumo di sigaretta (EFS) e a N-acetilcisteina (NAC). L’espressione
genica dell’eme ossigenasi 1 (HO-1) era stimolata dall’EFS in
maniera dose-dipendente nelle cellule epiteliali bronchiali immortalizzate
(linea BEAS 2B) e fibroblastiche polmonari fetali (linea HFL1), ma
non nelle epiteliali da adenocarcinoma polmonare (linea A549). L’espressione
di HO-1, regolata in maniera differente nelle tre linee cellulari,
sembra stimolata dallo stress ossidativo indotto da EFS.
Parole chiave: eme ossigenasi 1, espressione genica, estratto di fumo
di sigaretta, modelli in vitro, cellule epiteliali e fibroblastiche polmonari.
ABSTRACT. IN VITRO CHARACTERIZATION OF HEME OXYGENASE 1
IN HUMAN EPITHELIAL LUNG CELLS EXPOSED TO CIGARETTE SMOKE. We
present an in vitro study of lung epithelial and fibroblastic cell lines exposed
to growing concentrations (5%, 10%) of cigarette smoke extract
(CSE), and to N-acetylcysteine. The heme oxygenase 1 (HO-1) gene expression
was stimulated by CSE in a dose-dependent manner in both immortalized
bronchial epithelium (BEAS 2B) and foetal pulmonary fibroblasts
(HFL1), whereas no effect was seen in lung adenocarcinoma cells
(A549). HO-1 gene expression, differently regulated in the three cell lines,
seems to be provoked by CSE induced oxidative stress.
Key words: heme oxygenase 1, gene expression, cigarette smoke extract,
in vitro model, lung epithelial and fibroblastic cells.
Introduzione
L’eme ossigenasi (HO), enzima ubiquitariamente espresso,
catalizza l’ossidazione dell’eme a biliverdina, con rilascio di ferro
(Fe 2+ ) e monossido di carbonio (CO). Sono note tre isoforme,
codificate da geni specifici: HO-1 inducibile, HO-2 costitutiva ed
HO-3 espressa costitutivamente ma a bassa attività metabolica.
L’espressione di HO-1, oltre che dal substrato fisiologico, è indotta
da una varietà di stimoli associati con stress ossidativo e infiammazione.
I prodotti di reazione hanno funzioni antiossidanti
e antinfiammatorie (1). La biliverdina è biotrasformata dalla biliverdina
reduttasi a bilirubina, potente antiossidante endogeno. Il
CO media un effetto miorilassante sulla muscolatura liscia ed effetti
citoprotettivi ed anti-apoptotici. Il fumo di sigaretta è una
miscela complessa in grado di determinare stress ossidativo ed
infiammazione a livello dell’epitelio polmonare. Cellule in coltura
esposte a fumo di sigaretta presentano effetti tipici dello stress
ossidativo, come perossidazione lipidica, rotture a singolo filamento
del DNA e decremento dei livelli intracellulari di glutatione
(2-4).
Materiali e metodi
L’esperimento è stato condotto su linee cellulari umane, derivate
rispettivamente da cellule epiteliali bronchiali immortalizzate
(BEAS 2B), cellule epiteliali alveolari da adenocarcinoma polmonare
(A549) e fibroblasti polmonari fetali (HFL1). Le cellule
sono state esposte a concentrazioni crescenti (5 e 10%) di estratto
di fumo di sigaretta (EFS), ottenuto facendo gorgogliare il fumo
di sigaretta in una beuta contenente 25 ml di terreno di coltura.
Dopo filtrazione e diluizione alla concentrazione desiderata, le
cellule sono state trattate con EFS entro 30 minuti dalla sua preparazione.
È stata prevista anche la co-somministrazione di Nacetilcisteina
(NAC), in associazione ad EFS 10%. L’RNA totale
è stato estratto da circa 5 x 10 6 cellule con metodica Trizol, digerito
con Dnasi I, quantificato con sonda RiboGreen e valutato tramite
elettroforesi su gel d’agarosio 1% in 1X TBE. L’RNA totale
(1 µg) è stato retrotrascritto a cDNA utilizzando Random Decamers
(2.5 µM) e SuperScript II (200 U) RT con protocollo standard,
in 20 µl. Un’aliquota di cDNA è stata diluita 1:8 in H 2 O per
la reazione di PCR quantitativa in tempo reale su iCycler (Bio-
Rad) con chimica SYBR Green I. I primers per il gene HO-1 sono
stati disegnati con software Primer3 su sequenza NM 002133
(GenBank), mentre per l’amplificazione dei geni di controllo β2microglobulina,
succinato de-idrogenasi subunità A ed ipoxantina
fosforibosil-trasferasi 1 sono stati utilizzati primers pubblicati (5).
Le reazioni di PCR (25 µl), contenenti 1 µl di cDNA, 12.5 µl di
2X iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) e 300 nM di ciascun primer,
sono state eseguite in duplicato per ciascun campione secondo
il protocollo: 3’ a 95 °C, seguiti da 40 cicli di 30s a 95 °C, 30s
a 61 °C e 30s a 72 °C, quindi 1’ a 95 °C e denaturazione (melting)
finale, con incremento graduale della temperatura da 50 °C a 94
°C. Il livello di espressione dell’HO-1, mediato su 3 esperimenti
separati, viene ottenuto dopo normalizzazione rispetto all’espressione
dei 3 geni di controllo, tramite algoritmo geNorm (5). L’espressione
genica è stata valutata dopo 24h dallo stimolo per i tre
tipi cellulari e dopo 3h per le sole BEAS 2B.
Risultati
Nelle BEAS 2B l’espressione di HO-1 è aumentata, rispetto al
controllo non trattato, già 3h dopo l’esposizione, con un andamento
dose-dipendente (mediamente di 110,61 vv. per EFS=5%, e
di 277,59 vv. per EFS=10%). Nelle BEAS 2B e HFL1, a 24h dallo
stimolo, i livelli di HO-1 sono aumentati per EFS= 5% (rispettivamente
di 20,88 e 27,5 vv. in BEAS 2B ed HFL1). In entrambi
i casi l’incremento è dose-dipendente e più evidente nelle HFL1
(incremento vs. controllo di 35,9 e 270,65 vv. per EFS=10% in
BEAS 2B e HFL1, rispettivamente). La co-somministrazione di
NAC riduce l’espressione genica in entrambe le linee (riduzione,
rispetto al trattamento con EFS 10%, del 91% e del 96% in BEAS
2B ed HFL1, rispettivamente). Nelle A549 i livelli di espressione
genica osservati a 24h dall’esposizione sono molto modesti (incremento
medio di 1,86 volte rispetto al controllo per il campione
trattato con EFS 10%), e la co-somministrazione di NAC ed EFS
al 10% non modifica significativamente i livelli di espressione.
Discussione
I risultati ottenuti, da considerarsi come preliminari in quanto
gli esperimenti sono in fase di completamento, sembrano promettenti.
Le diverse risposte osservate nelle linee epiteliali
(BEAS 2B ed A549) sembrano correlate al diverso fenotipo cel-

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
104 www.gimle.fsm.it
lulare. La scarsa responsività delle A549 all’EFS, ma anche alla
NAC, sembrerebbero indicare che in queste cellule, tumorali, la
regolazione dell’espressione genica sia compromessa. Nelle
BEAS 2B, che sono cellule immortalizzate, l’EFS stimola in maniera
dose-dipendente l’espressione di HO-1, probabilmente in
conseguenza di stress ossidativo cellulare, come dimostrato dalla
reversione della risposta ad EFS 10% ad opera della NAC, che
agisce aumentando la disponibilità di glutatione. L’espressione di
HO-1 è un evento molto precoce, visibile già a 3h dallo stimolo
(per ora solo in BEAS 2B). L’espressione di HO-1 nelle HFL1,
cellule dal fenotipo normale, segue l’andamento osservato per le
BEAS 2B ed è quantitativamente maggiore.
In conclusione, l’esperimento dimostra che il fumo di sigaretta,
probabilmente inducendo stress ossidativo, stimola l’espressione
di HO-1 in linee cellulari rappresentative dell’organo
bersaglio (polmone). Ciò, in accordo con l’aumentata espressione
di HO-1 osservata nella broncopneumopatia cronica ostruttiva
e nell’asma bronchiale (1, 6, 7), nelle quali il fumo di tabacco
svolge un’importante ruolo eziopatogenetico. Il presente studio,
completato da informazioni relative agli effetti a più basse concentrazioni
di EFS, potrà fornire indicazioni utili per meglio valutare
il rischio derivante dall’esposizione, anche in ambito lavorativo,
a fumo passivo.
G. Spatari 1 , C. Fenga 1 , D. Sapienza 1 , P. Gualniera 2 , A. Asmundo 2
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Analisi dei polimorfismi genetici GSTT1 e GSTM1 in lavoratori di
un deposito costiero di carburante. Messa a punto della metodica
1 Sezione di Medicina del Lavoro, Dipartimento di Medicina Sociale del Territorio, Università degli Studi di Messina
2 Sezione di Medicina Legale, Dipartimento di Medicina Sociale del Territorio, Università degli Studi di Messina
RIASSUNTO. Recentemente, sulla base di differenti tecniche di
biologia molecolare, sono stati condotti studi su polimorfismi genetici
quali “biomarcatori” atti a definire alterazioni o deficit metabolici determinanti
di malattia. È del tutto evidente, quindi, l’esigenza di introdurre
una nuova tecnica d’indagine in tale ambito fondata su criteri di robustezza
(rapporto costo-beneficio), di riproducibilità, di ripetibilità e di
semplicità di esecuzione [Saferstein, New Jersey 1987]. Su tali presupposti
è stata messa a punto una metodica di analisi per i polimorfismi genetici
ai loci GSTT1 e GSTM1 a partire da matrici biologiche (sangue e
saliva) ottenuti da lavoratori di un deposito costiero di carburante del Sud
Italia. I soggetti presi in esame, professionalmente esposti a miscele di
carburanti, costituiscono un campione oggetto di studio del quale vengono
presentati dati preliminari.
Parole chiave: caratterizzazione genotipica, polimorfismi genetici,
Glutatione-S-transferasi T1 (GSTT1) e M1 (GSTM1), biomarcatori, rischio
professionale.
ABSTRACT. ANALYSIS OF GENETIC POLYMORPHISM OF GSTT1 AND
GSTM1 IN PETROL WORKERS: REFINING THE TECHNIQUE. On the basis of
different methods in molecular biology, studies have been recently conducted
on genetic polymorphisms as “biomarkers” of occupational, environmental
or life style related diseases. It is therefore clear that the introduction
of an alternative laboratory method needs to be introduced, based
on classical standards: robustness and simplicity (cost-benefit ratio), reproducibility,
and repeatability [Saferstein, New Jersey 1987]. Starting
from biological samples (blood and saliva) obtained from workers in a
Southern Italian petrochemical depot, the present study describes a simple
method for the analysis of genetic polymorphisms on GSTT1 and
GSTM1 loci. The preliminary data to emerge from this group of workers
- who are occupationally exposed to petroleoum derivatives- are reported.
Key words: DNA genotyping, genetic polymorphism, Glutathione-Stransferase
T1 (GSTT1) and M1 (GSTM1), biomarkers, occupational risk.
Introduzione
Gli studi effettuati sull’esposizione ad idrocarburi policiclici
aromatici (IPA) ed effetti nell’uomo dimostrano una considerevole
variabilità interindividuale a parità di esposizione ambientale
e/o lavorativa. Le basi biologiche di tale variabilità sono, in
parte, da ricercarsi nella differente attività degli enzimi implicati
nella bio-attivazione e nella detossificazione degli IPA (citocromo
P 450, epossido idrolasi, glutatione transferasi) (1). La glutatione
S-transferasi (GST), ad esempio, è una super-famiglia di
enzimi polimorfici che giocano un ruolo importante nella detossificazione
dei tossici endogeni ed esogeni. I polimorfismi genetici
GSTT1 e GSTM1 modulano l’attività di alcune catene enzimatiche
coinvolte nella detossificazione di diversi composti potenzialmente
cancerogeni per l’uomo. Il polimorfismo GSTM1 è
localizzato sul locus cromosomico 1p13.3 ed è coinvolto nell’espressione
fenotipica degli enzimi deputati alla detossificazione
degli idrocarburi aromatici policiclici. Cellule di soggetti omozigoti
per il genotipo null del GSTM1, privi della specifica attività
enzimatica, sono più suscettibili di danno al DNA (Strange-Fryer,
IARC Scientific publications 1999). Il polimorfismo GSTT1 è
localizzato sul cromosoma 22q11.2 e codifica per enzimi anch’essi
implicati nell’attività detossificante.
Il presente lavoro illustra una semplice metodica di estrazione
del DNA da sangue intero e da cellule dell’epitelio buccale
prelevate mediante tampone (“buccal swab”) per la caratterizzazione
dei polimorfismi genetici GSTT1 e GSTM1 in un campione
di lavoratori addetti alle varie fasi del ciclo lavorativo di un
deposito costiero di carburante. Ciò al fine di identificare even-

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 105
tuali genotipi omozigoti defettivi (null), potenzialmente più suscettibili
all’azione degli agenti chimici, attraverso una semplice
metodica, di facile riproducibilità, ripetibilità e di costo assai
contenuto. Il prelievo di cellule dell’epitelio buccale, effettuabile
senza trauma alcuno, contribuisce a rendere ancor più semplice
l’indagine, oltre che ben accetta da parte del lavoratore.
Materiali e metodi
L’estrazione del DNA è stata condotta secondo la metodica
“Chelex®100” (2) a partire da 30 µl di sangue intero e singoli
tamponi buccali appartenenti ad ogni soggetto del gruppo oggetto
di studio; il Chelex è una resina chelante che possiede alta affinità
per gli ioni metalli polivalenti, composta da stirene divinilbenzene
copolimero e ioni aminodiacetati che agiscono come
gruppi chelanti. La presenza di questi gruppi durante il processo
di ebollizione dei campioni previene la degradazione del DNA
dall’azione degli ioni metallici che possono favorire la rottura
della molecola quando viene sottoposta ad alte temperature.
L’amplificazione via polymerase chain reaction (PCR) è stata effettuata
utilizzando quali “primers d’innesco” le sequenze oligonucleotidiche
riportate in letteratura (Pavanello S., Padova 2002).
La reazione di amplificazione, è avvenuta utilizzando un termociclatore
o thermal-cycler (“PCR sprint”, Hybaid) ed allestendo
una “multiplex” per la coamplificazione dei loci GSTT1,
GSTM1 e β-globina (quest’ultimo quale “controllo positivo” della
reazione medesima), in un volume finale di 25 µl: 2.5 µl di
estratto (5-250 ng DNA), 0.5 µM di ciascun primer, 2.5 µl Taq
tampone (10 x PCR Buffer II, Applied Byosystem), 2 µl MgCl 2
25 mM (Applied Byosystem), 0.5 µl dNTPs mix (10 mM PCR
Nucleotide Mix, Promega), 1 U Taq polimerasi polymerase (Dy-
NAzyme II DNA Polymerase, Finnzymes). Sono stati effettuati
un totale di 30 cicli di amplificazione: “denaturazione” a 95° C
per 1 minuto, “annealing” a 60° C per 1 minuto ed “estensione”
a 72° C, sempre per 1 minuto. L’analisi dei prodotti di amplificazione
è stata condotta mediante elettroforesi verticale su gel denaturante
di poliacrilamide al 6% in Urea 7 M ultrasottile (0.4
mm) in TBE buffer 1X con le seguenti condizioni di corsa: 2000
V, max mA, max W, per 150 minuti (3). Le bande di migrazione
relative ai prodotti di amplificazione sono state visualizzate con
la tecnica del “Silver staining”(4) ed identificate in base alla valutazione
del peso molecolare di ciascuna, definito comparativamente
rispetto ai pesi molecolari di specifico marcatore standard
(DNA pGEM® marker, Promega).
Risultati
La tipizzazione elettroforetica dei 24 campioni analizzati (12
tracce ematiche, 12 tamponi buccali) appartenenti a 12 lavoratori
professionalmente esposti ad IPA (ogni soggetto è stato sottoposto
a prelievo di sangue venoso e di cellule dell’epitelio buccale),
ha evidenziato la frequenza del genotipo null per il GSTM1
in cinque soggetti, mentre due soggetti presentavano il genotipo
GSTT1 null (Figura 1). Inoltre dalla lettura dell’elettroferogramma
si evince che la tipizzazione effettuata dai tamponi buccali
(evidenziata con i numeri romani) risulta essere ugualmente interpretabile
e di ottima definizione allelica.
Discussione
La metodica esposta risulta essere una tecnica di facile riproducibilità,
ripetibile e di costo assai contenuto e rappresenta,
quindi, una valida alternativa alle tecniche già in uso nella pratica
dei laboratori di epidemiologia occupazionale. L’uso del
“Chelex®100” per l’estrazione del DNA da cellule dell’epitelio
Figura 1. Elettroferogramma dei genotipi GSTT1 (480 bp) e
GSTM1 (215 bp)
I numeri romani rappresentano la tipizzazione effettuata da
cellule dell’epitelio buccale; i campioni 7 (VII) e 11 (XI) risultano
negativi per il genotipo GSTT1 (GSTT1 null); i campioni
3 (III), 4 (IV), 5 (V) 6 (VI) e 10 (X) risultano negativi per il genotipo
GSTM1 (GSTM1 null)
buccale e/o dai leucociti può essere utilizzato in alternativa ai diffusi
kit commerciali; tale resina è già in uso nella pratica forense
per l’identificazione individuale (ma anche nelle indagini di paternità)
su tracce biologiche anche in presenza di DNA danneggiato
e/o di esigue quantità. Inoltre, la tipizzazione elettroforetica
su gel di poliacrilamide, consente una maggiore distanza allelica
definendo, quindi, in base al peso molecolare del polimorfismo,
una chiara lettura. Si ribadisce come il prelievo di cellule
dell’epitelio buccale attraverso tamponamento sia una tecnica assolutamente
non traumatica per il lavoratore e peraltro ben accettata.
Relativamente al campione esaminato ed ai risultati della
genotipizzazione, l’espressione della frequenza dei genotipi null
per i rispettivi polimorfismi (GSTT1 - GSTM1) non consente, attualmente,
la valutazione dei risultati in quanto sono in corso i
dosaggi relativi agli indicatori di dose interna e di danno genotossico.
Il presente studio prevede l’arruolamento di altri soggetti
da tipizzare, allo scopo di valutare la frequenza dei genotipi
null, per poter correlare una ridotta attività enzimatica GST
(GSTM1 e GSTT1 null) ad una eventuale amplificazione della
via metabolica dell’acido t-t-muconico.
Bibliografia
1) Clonfero E, Ferri GM, Pavanello S. Epidemiologia molecolare in
medicina del lavoro: aspetti metodologici e influenza della suscettibilità
genetica individuale G Ital Med Lav Erg 2003; 25: 3, 279-284.
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extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.
Biotechniques 1991;10(4): 506-13.
3) Robertson JM Evaluation of native and denaturing polyacrylamide
gel electrophoresis for short tandem repeat analysis Adv. Forensic
Haemogenet 1994; 5: 320-322.
4) Budowle B, Chakraborty R, Giusti AM, Eisenberg AJ, Allen RC.
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the polymerase chain reaction followed by high resolution polyacrylamide
gel electrophoresis. Am J Hum Genet 1994; 48: 137-44.

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
106 www.gimle.fsm.it
F. Toffoletto 1 , MR Aiani 2 , A. Baj 1 , P Mascagni 1 , L. Settimi 2
La valutazione del rischio nelle attività non continuative di saldatura:
dubbia utilità del dosaggio del manganese nelle urine
1 Unità Operativa di Medicina del Lavoro, Ospedale di Desio
2 Servizio di Prevenzione e Sicurezza degli Ambienti di Lavoro, Azienda Sanitaria Locale della Provincia di Como
RIASSUNTO. È stato dosato mediante spettrofotometria di assorbimento
atomico con fornetto di grafite il manganese nelle urine (MnU)
raccolte a fine turno di lavoro in 385 soggetti con attività non continuativa
di saldatura. La popolazione esaminata ha presentato livelli di MnU
molto bassi (valore medio = 0,65 µg/l; SD = 0,44; range = 0,50-4,90), vicini
al limite di sensibilità del metodo (0,5 µg/l), e sostanzialmente simili
a quelli riscontrati da altri autori nelle popolazioni non esposte al metallo.
Non sono state evidenziate differenze significative dei livelli di
MnU tra i sottogruppi a diversa esposizione corrente o tra sottogruppi a
diversa anzianità di esposizione. I risultati preliminari del nostro studio
hanno suggerito che a basse esposizioni professionali (saldatura non continuativa
di metalli ferrosi) il MnU non è un indicatore biologico idoneo
per il monitoraggio di singoli soggetti e neppure di gruppi di lavoratori.
Parole chiave: manganese urinario, saldatura, monitoraggio dell’esposizione
professionale.
ABSTRACT. RISK ASSESSMENT IN NON-CONTINUOUS WELDING ACTI-
VITIES: DOUBTFUL UTILITY OF URINARY MANGANESE. End-shift urinary
manganese (MnU) in 385 subjects involved in non-continuous welding activities
was determined by graphite furnace atomic absorption spectrophotometry.
The examined population showed extremely low manganese urinary
levels (mean group urinary value = 0.65 µg/l; SD = 0.44; range =
0.50-4.90), partly coinciding with the limits of sensitivity of the method
(0.5 µg/l), and substantially similar to those found by other authors in nonexposed
populations. Statistically significant differences in MnU levels
were not detected between subgroups with different current exposure or
between subgroups with different previous degrees of exposure. The preliminary
findings of our study suggested that, for low occupational exposures
(non-continuous welding of ferrous metals), MnU is not suitable not
only for individual but also for group biological monitoring.
Key words: urinary manganese, welding, biological monitoring of
occupational exposure.
Introduzione
La gravità degli effetti neurotossici attribuiti al manganese
(1) giustifica la necessità di monitorare attentamente l’esposizione
professionale a tale metallo, anche nelle attività non considerate
particolarmente esponenti, quale l’attività di saldatura di materiali
ferrosi.
È quindi utile verificare quali indicatori biologici siano sufficientemente
sensibili e specifici per il monitoraggio.
Il dosaggio urinario del manganese è stato più volte considerato
un indicatore di applicazione relativamente agevole, ma inadeguato
a valutare l’esposizione del singolo lavoratore, anche se
alcuni autori ne documentano la capacità di valutare le differenze
di esposizione fra gruppi (2, 3).
Materiali e metodi
Nell’ambito di un’indagine di comparto svolta da un Servizio di
Prevenzione e Sicurezza degli Ambienti di Lavoro della Lombardia
sono state raccolte, tramite questionario, informazioni su 93 aziende
di piccola carpenteria metallica, ove lavoravano 410 soggetti con attività
di saldatura (prevalentemente TIG e MIG) non continuativa (di
frequenza e durata molto variabile). In 385 di essi è stato possibile
eseguire il dosaggio del manganese nelle urine raccolte a fine turno
di lavoro. La ricerca del manganese è stata eseguita tramite spettrofotometria
di assorbimento atomico con fornetto di grafite (AAS).
Non disponendo di valutazioni ambientali, la capacità dell’indicatore
di evidenziare eventuali differenze di esposizione recente
è stata valutata suddividendo la popolazione in 3 gruppi, in
base alla durata giornaliera dell’attività di saldatura (fino a 2 ore:
94 sogg.; da 2 a 4 ore: 162 sogg.; oltre 4 ore al giorno: 129 sogg.).
Le eventuali differenze basate sulla esposizione cumulativa sono
state invece studiate suddividendo la popolazione in 3 gruppi in
base all’anzianità complessiva di attività come saldatore (fino a 5
anni: 121 sogg.; da 5 a 10 aa: 74 sogg.; oltre 10 anni: 188 sogg.).
Due soggetti sono stati esclusi dal calcolo in quanto non si disponeva
con precisione della loro anzianità di lavoro.
Risultati
I valori medi di MnU nell’intera popolazione e nei tre gruppi
ad attività di saldatura giornaliera crescente sono riportati nella
Tabella I. I valori medi di MnU riscontrati nei tre gruppi ad anzianità
di saldatura crescente sono riportati nella Tabella II.
Discussione
Nei limiti consentiti da un’elaborazione ancora preliminare è
possibile affermare che lo studio del MnU:
– non evidenzia differenze significative (p = 0.12) fra lavoratori
con attività di saldatura scarsa (meno di 2 ore al dì), rispetto a
lavoratori con attività di saldatura frequente (più di 4 ore al dì);
– non evidenzia differenze significative (p = 0.49) fra soggetti
con modesta anzianità complessiva di saldatura (meno di 5
anni), rispetto a soggetti con anzianità complessiva di saldatura
elevata (oltre 10 anni);
– dimostra che la popolazione esaminata presenta livelli di
MnU molto bassi, prevalentemente (74.3%) coincidenti con
il limite di sensibilità del metodo (0.5 µg/l), valori sostanzialmente
simili a quelli riscontrati da altri autori nelle popolazioni
non esposte al metallo (4, 5).
Tabella I. Valori medi di manganese urinario
nell’intera popolazione e nei tre gruppi ad attività
di saldatura giornaliera crescente
Tabella II. Valori medi di manganese urinario
nei tre gruppi ad anzianità di saldatura crescente

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
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Conclusioni
I risultati preliminari di questo studio indicano che a basse
esposizioni professionali (attività non continuative di saldatura
di metalli ferrosi) il MnU non è un indicatore biologico idoneo
per il monitoraggio di singoli soggetti e neppure di gruppi di lavoratori.
Bibliografia
1) Apostoli P, Lucchini R, Alessio L. Are current biomarkers suitable
P. Tomao, M.C. D’Ovidio, S. Di Renzi, C. Grandi
for the assessment of manganese exposure in individual workers?.
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2) Gobba FM, Galassi C, Minoia C et al. Biological monitoring of occupational
manganese exposure in steel welding operations. Arch Sci
Lav 1988; 4: 91-98.
3) Lucchini R. Apostoli P, Perrone C et al. Long term exposure to “low
level” of manganese oxides and neurofunctional changes in ferroalloy
workers. Neurotoxicology 1999; 20: 287-298.
4) Roels H, Ghyselen P, Buchet JP et al. Assessment of the permissible
exposure level to manganese in workers exposed to manganese
dioxide dust. Br J Ind Med 1992; 49: 25-34.
5) Minoia C, Apostoli P. 1 a lista SIVR dei valori di riferimento definizioni,
criteri metodologici e strategie analitiche. G Ital Med Lav Erg
2003; 25: 1.
Valutazione del danno al DNA in cellule umane dell’epitelio nasale
esposte ad ossido di etilene
ISPESL, Dipartimento di Medicina del Lavoro, Monteporzio Catone (RM)
RIASSUNTO. Nella medicina del lavoro il comet test (CT) ha ricevuto
in questi ultimi anni un’elevata considerazione quale metodica rapida,
semplice e poco costosa per lo studio dell’attività genotossica di sostanze.
L’ossido di etilene, gas infiammabile ed incolore, classificato dalla IARC
nel gruppo 1, può essere assorbito dall’uomo attraverso il tratto respiratorio
e la cute. Scopo del lavoro è valutare la sensibilità del CT nel misurare
il danno al DNA in cellule dell’epitelio nasale (RPMI 2650) esposte in vitro
a diverse concentrazioni di ossido di etilene. Lo studio ha evidenziato
l’appropriatezza della strategia sperimentale utilizzata, fornendo una valutazione
degli effetti dell’ossido di etilene sul DNA del tutto paragonabili a
quelli ottenuti con metodiche convenzionali quali le aberrazioni cromosomiche
e il test del micronucleo. Inoltre le prove condotte hanno mostrato
una maggiore sensibilità del CT, in quanto è stato evidenziato un danno al
DNA anche a dosi di EtO più basse di quelle rilevabili con gli altri test.
Parole chiave: comet test, ossido di etilene, esposizione in vitro.
ABSTRACT. DNA DAMAGE IN HUMAN NOSE EPITHELIAL CELLS EX-
POSED TO ETHYLENE OXIDE. In recent years the comet test has been highly
regarded in occupational medicine as a rapid, simple and inexpensive technique
for detecting substances with genotoxic activity. Ethylene oxide
is a colourless flammable gas, classified in group 1 by IARC, which can
be absorbed through the respiratory tract and the skin. The aim of this
study is to evaluate the capcity of the comet test to measure DNA damage
in epithelial nasal septum cells (RPMI 2650) exposed to ethylene oxide.
The effect of ethylene oxide on DNA can be evaluated by the comet
test, yielding comparable results to those obtained using well-established
techniques such as chromosomal aberration and micronucleus formation
analyses. Moreover, the comet test was more sensitive than the other tests,
showing DNA damage at lower doses than those detectable by chromosomal
aberration and micronucleus formation.
Key words: comet test, ethylene oxide, in vitro exposure.
Introduzione
In medicina del lavoro è fondamentale il monitoraggio dell’esposizione
a sostanze potenzialmente mutagene e/o cancerogene.
Aspetti critici del monitoraggio sono i tempi, le procedure e la
rappresentatività del campionamento, la sensibilità e la specificità
dei metodi analitici, i tempi di esecuzione delle analisi e i costi.
Fondamentale al riguardo è la disponibilità di test di genotossicità
adeguati. Tra le metodiche utilizzate per studiare l’attività genotossica
di sostanze, il Comet Test (CT) ha, in questi ultimi anni, riscontrato
approvazione anche nel campo della medicina del lavoro.
Tale test prevede l’inglobamento in agarosio delle cellule trattate
con la sostanza, la loro lisi e la corsa elettroforetica del lisato
cellulare durante la quale si ha la migrazione del DNA, visualizzata
tramite un colorante fluorescente. Il grado di migrazione del
DNA, in condizioni alcaline, viene ad essere considerato proporzionale
alla frequenza degli eventi di rottura in singole cellule
esposte alle sostanze genotossiche. Il parametro considerato maggiormente
significativo per quanto riguarda la rilevazione delle
rotture del filamento di DNA è il momento di coda (Tail Moment
- TM), definito come il prodotto dell’intensità di fluorescenza relativa
della coda della cometa per la sua lunghezza.
L’ossido di etilene (EtO) è un gas infiammabile e incolore
con un caratteristico odore simile all’etere. In condizioni di pressione
elevata può presentarsi come un liquido volatile. È completamente
miscibile con acqua e molti solventi organici. Si tratta
di una sostanza mutagena e cancerogena (gruppo 1 della classificazione
IARC), che viene assorbita attraverso il tratto respiratorio
e la cute. Il meccanismo d’azione è noto nel dettaglio, con
la formazione di addotti al DNA ben caratterizzati. Viene comunemente
utilizzato come intermedio di sintesi nell’industria chimica
e come agente sterilizzante in ambiente sanitario e nell’industria
alimentare. L’esposizione dei lavoratori a EtO nei diversi
settori di impiego della sostanza varia considerevolmente, fino a
raggiungere in alcune condizioni valori elevati.
Scopo del lavoro è valutare la sensibilità del CT nel misurare
il danno al DNA in cellule dell’epitelio nasale esposte a diverse
concentrazioni di ossido di etilene. I risultati ottenuti con tale
metodica, rapida e poco costosa, possono essere confrontati con
quelli ottenuti da altri autori, con metodiche differenti, soprattutto
in termini di riproducibilità del dato e possibilità di evidenziare
un effetto anche a dosi basse.
Materiali e metodi
È stato analizzato, mediante il CT, l’effetto dell’EtO nella linea
cellulare di epitelio nasale umano RPMI 2650. Le cellule della cavità
nasale sono le prime cellule esposte agli inquinanti e costituiscono
la prima linea di difesa dell’organismo nei confronti di xenobiotici
introdotti per via inalatoria: rappresentano infatti un sito
target ben conosciuto per un ampio range di mutageni e sono quindi
adatte per lo sviluppo di biomarcatori di esposizione/effetto. Le
cellule sono state fatte crescere in monostrato e mantenute in terreno
Minimum Essential Medium (MEM) con sali di Eagle, addi-

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
108 www.gimle.fsm.it
zionato con siero bovino fetale (FCS) al 10%, antibiotici, glutamina
ed amminoacidi non essenziali all’1%. L’EtO disciolto in metanolo
(MEOH 50.000 UG/ML, Supelco) è stato diluito alle concentrazioni
d’uso (0,5-100 mM) in terreno per cellule senza FCS. Le
diluizioni delle sostanze sono state preparate al momento degli
esperimenti, alla temperatura di 0-5°C. Sono stati effettuati esperimenti
preliminari di tossicità per valutare le concentrazioni di sostanza
che non perturbano la sopravvivenza e la crescita cellulare.
Dopo il trattamento con diverse concentrazioni di EtO le cellule
sono state osservate al microscopio per evidenziare eventuali cambiamenti
morfologici e successivamente è stata valutata la citotossicità
mediante l’utilizzo di un colorante vitale (rosso neutro), la
cui incorporazione è stata misurata spettrofotometricamente.
Il CT è stato condotto subito dopo il trattamento delle cellule
con la sostanza (tempo zero), dopo 3 ore e dopo 24 ore, sia per
valutare l’effetto genotossico che per monitorare la cinetica del
riparo. Tutti gli esperimenti sono stati condotti solo quando la vitalità
delle cellule, valutata tramite il test di esclusione del colorante
vitale trypan blu, era > 75%. I risultati sono rappresentativi
della media di tre esperimenti.
Risultati
Il CT, effettuato subito dopo l’esposizione delle cellule RPMI
2650 a EtO nel range di 5,0-50,0 mM e dopo 3 e 24 ore ha mostrato,
in tutte le condizioni sperimentali, un aumento dose-dipendente
nella migrazione del DNA (TM) e una cinetica di riparo che
evidenzia come dopo 24 ore, solo circa il 15% delle rotture viene
riparato. Per quanto riguarda invece il trattamento delle cellule a
concentrazioni più basse (0,5-4,0 mM) sono stati ottenuti risultati
differenti. Il valore del TM varia in modo non significativo, dalle
concentrazioni più basse a quelle più alte, nelle condizioni di esecuzione
del test al tempo zero. Tuttavia, nei campioni sottoposti al
CT dopo 3 ore e 24 ore dal trattamento, è stato riscontrato un aumento
significativo del TM rispetto alle cellule di controllo.
Discussione
Gli effetti genotossici prodotti da sostanze alchilanti il
DNA, come l’ossido di etilene, possono essere studiati attraverso
l’impiego di diverse metodiche. Poiché il danno al DNA indotto
da agenti tossici dipende in molti casi dal tipo di cellula o
di tessuto, il CT, utilizzato nello studio, può rappresentare un
eccellente metodo in grado di rilevare il danno in cellule singole
in diverse condizioni sperimentali. Recentemente questa metodica
è stata ampiamente utilizzata per studiare gli effetti dell’esposizione
a sostanze genotossiche anche nei linfociti di lavoratori
esposti. Lo studio ha evidenziato l’appropriatezza della
strategia sperimentale utilizzata, fornendo una valutazione
degli effetti dell’EtO sul DNA del tutto paragonabili a quelli ottenuti
con metodiche convenzionali quali le aberrazioni cromosomiche
e il test del micronucleo. Inoltre le prove condotte hanno
mostrato una maggiore sensibilità del CT, in quanto è stato
evidenziato un danno al DNA anche a dosi di EtO più basse di
quelle rilevabili con gli altri test. Infine, considerando che nei
campioni analizzati dopo 3 e 24 ore dal trattamento delle cellule
con la sostanza alle concentrazioni più basse si rileva un aumento
del danno e che anche alle concentrazioni più elevate
quest’ultimo è scarsamente riparato, è ipotizzabile che, dopo un
iniziale periodo di latenza, la lesione iniziale (formazione di addotti)
si traduca nell’induzione di rotture a doppio filamento.
Queste ultime, come è noto, presentano una bassa efficienza di
riparo e costituiscono il tipo di lesione più critico ai fini di una
potenziale evoluzione in senso neoplastico.
Bibliografia
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determined with the neutral red cell viability assay. Appl. Environ.
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E. Sabbioni 3 , P. Boscolo 1
Studio in vitro sull’immunotossicità dei metaboliti dell’arsenico
inorganico
1 Sezione di Medicina del Lavoro, Allergologia ed Immunologia Clinica, Dipartimento di Medicina e Scienze dell’Invecchiamento, Università “G.
D’Annunzio”, Chieti
2 Dipartimento di Neuroscienze ed Oncologia, Università “G. D’Annunzio”, Chieti
3 ECVAM, Joint Research Centre, Ispra
RIASSUNTO. Oggetto di questa ricerca erano gli effetti di composti
arsenicali sulla proliferazione di PBMC umane stimolata da PHA e sul
loro rilascio di IFN-γ e TNF-α in presenza di sali arsenicati. Gli effetti
inibitori dei composti 10 -4 e 10 -5 M era nel seguente ordine: acido momometil-arsenioso
(MMAs III ), As(III), As(V), acido dimetil-arsinico
(DMAs V ), acido monometil-arsonico (MMAs V ). Inoltre basse dosi (da
10 -7 a 10 -8 M) di As(III), MMAs III e DMAs V stimolavano la risposta immunitaria.
Questo studio dimostra che l’immunotossicità dell’As inorganico
in parte dipende dalla biosintesi di MMAs III , metabolita successivamente
trasformato in DMAs V .
Parole chiave: arsenico, composti metilati, immunotossicità.
ABSTRACT. IN VITRO STUDY ON THE IMMUNOTOXICITY OF METABO-
LITES OF INORGANIC ARSENIC. The aim of this in study was to evaluate the effects
of As compounds on PHA stimulated PBMC proliferation and IFN-γ
and TNF-α release. The inhibitory effect of 10 -4 and 10 -5 M As compounds
was in the following order: momo-methyl-arsenous acid (MMAs III ) > As(III)
> As(V) > dimethyl arsinic acid (DMAs V ) > monomethyl-arsonic acid
(MMAs V ). Moreover, low doses (from 10 -7 to 10 -8 M) of As(III), MMAs III
and DMAs V stimulated the immune response. This study shows that the immunotoxicity
of inorganic arsenic in part depends on bio-synthesis of MMAs
V into MMAs III , which is subsequently transformed in DMAs V .
Key words: arsenic, methylated compounds, immunotoxicity.

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 109
Introduzione
È noto sia che l’esposizione occupazionale
ed ambientale a composti
arsenicali può arrecare danni
alla salute, sia che gli organismi marini
sono in grado di trasformare
l’As inorganico in composti organici
complessi (come l’arsenobetaina)
privi di significativa tossicità (1).
Da circa 3 decenni è anche noto che
l’As inorganico è trasformato nei
mammiferi in acido monometilarsonico
(MMAs V ) e dimetil-arsinico
(DMAs V ). Recenti studi in vitro
hanno tuttavia dimostrato che durante
la metilazione dell’As inorganico
in epatociti, cheratinociti e cellule
dell’epitelio bronchiale (ma
non in cellule vescicali) umane, si
forma acido monometil-arsenioso
MMAs III , composto citotossico (1).
Scopo di questa ricerca è quello
di studiare in vitro, su sangue umano,
la immunotossicità dei composti
sintetizzati durante la biotrasformazione
dell’As inorganico.
Materiali e metodi
Cellule mononucleate di sangue periferico (PBMC) di nove
donatori sono state utilizzate per determinare la proliferazione
cellulare ed il rilascio di interferone-γ (IFN-γ) e Tumor-Necrosis-
Factor (TNF) α nelle seguenti condizioni:
a) senza sali arsenicali con o senza stimolazione con PHA (10 o
20 µg/ml) (campioni di controllo).
b) in presenza di 10 -4 , 10 -5 , 5 x 10 -5 , 10 -6 , 5 x 10 -6 , 10 -7 , 5 x 10 -7 ,
10 -8 , 5 x 10 -8 e 10 -9 M sodio arsenito(III), sodio arsenato(V),
MMAs V , MMAs III e DMAs V con o senza 20 µg/ml (per determinare
la proliferazione cellulare per 72 ore) o 10 µg/ml di
PHA (per determinare il rilascio di citochine per 32 ore).
I metodi dettagliati per l’incubazione delle PBMC e per determinare
la proliferazione cellulare ed il rilascio di citochine sono
riportate in un lavoro del nostro gruppo (3).
Risultati e Discussione
Il MMAs III a concentrazione 10 -4 M alterava la vitalità delle
PBMC mentre il sodio arsenito(III) ed il sodio arsenato a questa concentrazione
inibivano la proliferazione (Tabella I). La proliferazione
delle PBMC era inibita anche da As(III), As(V) e MMAs III a concentrazioni
10 -5 M e 5 x 10 -5 M. Sia il sodio arsenito che il DMA 10 -
7 e 5 x 10 -7 M avevano un significativo effetto stimolante, mentre il
MMAs III aveva lo stesso effetto a concentrazioni più basse (10 -8 M).
Il rilascio di IFN-γ dalle PBMC era più evidente di quello del
TNF-α. A questo proposito è da segnalare che il DMAs V 10 -4 M
inibiva il rilascio di IFN-γ. Pertanto, gli effetti dei composti arsenicali
sulla inibizione della proliferazione cellulare ed rilascio di
citochine erano nel seguente ordine: MMAs III > As(III )> As(V)
> DMAs V ,> MMAs V .
Tabella I. % di proliferazione delle PBMC stimolate da PHA
in presenza di composti arsenicali
I valori sono espressi come % medi in confronto a culture prive di composti arsenicali (controlli, 100%). Differenza
statisticamente significativa in confronto ai controlli (Mann Whitney U test): * p

COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl
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M. Valentino 1 , V. Rapisarda 2 , G. Solina 1 , C. Fenga 2 , D. Duscio 3
Il benzene ematico quale biomarker di esposizione in lavoratori
di una raffineria
1 Dipartimento di Patologia Molecolare e Terapie Innovative, Clinica di Medicina del Lavoro, Università Politecnica delle Marche
2 Dipartimento di Medicina Sociale del Territorio, Sezione di Medicina del Lavoro, Università degli Studi di Messina
3 Clinica di Medicina del Lavoro, Università degli Studi di Catania
RIASSUNTO. Il benzene è uno dei principali inquinanti degli ambienti
di lavoro. Il D.Lgs. 66/00 ha ridotto il livello di esposizione professionale
a 1 ppm. Si è pertanto aperta la problematica di individuare un
indicatore biologico affidabile per un corretto monitoraggio dei lavoratori
esposti alle attuali basse concentrazioni di benzene. Tra i diversi biomarkers
proposti abbiamo analizzato le concentrazioni di benzene ematico
ad inizio e fine turno di lavoro in un gruppo di 50 lavoratori di una raffineria
di petrolio esposti a concentrazioni inferiori ad 1 ppm. I risultati
incoraggiano l’uso del benzene ematico anche se, per livelli di esposizione
così bassi, il fumo di sigaretta determina l’apporto maggiore di benzene
al sangue.
Parole chiave: benzene ematico, raffineria di petrolio, esposizione
professionale, monitoraggio biologico.
ABSTRACT. Measurement of benzene blood levels as a biomarker
of exposure in oil refinery workers. Benzene is one of the main
polluting substances in the workplace. Following the reduction of occupational
exposure levels to 1 ppm (Legislative Decree 66/00), the need
has arisen to identify a reliable benzene exposure biomarker to monitor
workers exposed to current low benzene concentrations. One option, i.e.
the monitoring of blood levels at the beginning and the end of the work
shift, was investigated in 50 workers of an oil refinery exposed to concentrations
less than 1 ppm. The results show this to be a useful biomarker
even though, at such low levels of exposure, smoking habits contribute
significantly to benzene plasma levels.
Key words: blood benzene, oil refinery, occupational exposure, biological
monitoring.
Introduzione
Il benzene rappresenta uno dei principali inquinanti degli ambienti
di vita e di lavoro (1). L’utilizzo professionale del benzene
è stato regolamentato (D.Lgs. 66/00) in maniera da permettere il
lavoro a livelli di esposizione inferiori a 1 ppm (3,2 mg/m 3 ). Conseguentemente
si è aperta per il medico del lavoro la problematica
di come effettuare un corretto monitoraggio biologico dei lavoratori
esposti alle attuali concentrazioni di benzene. Il dosaggio
dei fenoli nelle urine, parametro comunemente utilizzato negli
ultimi decenni, non costituisce un indice affidabile per monitorare
esposizioni a concentrazioni ambientali inferiori a 5 ppm
(2). Sono perciò stati proposti nuovi biomarkers per valutare l’esposizione
a basse concentrazioni ambientali di benzene (1-3).
Nel presente studio riportiamo i dati preliminari sul monitoraggio
biologico, fenoli urinari e benzene ematico, di 50 lavoratori di
una raffineria di petrolio, considerati professionalmente esposti a
benzene, e di 50 lavoratori impiegati amministrativi presi come
gruppo di controllo.
Materiali e metodi
Cinquanta lavoratori maschi, caucasici, di età media di 45,1
±16,0 anni ed anzianità lavorativa di 15,4 ±3,6 anni sono stati
considerati professionalmente esposti al rischio di esposizione a
benzene per via inalatoria in quanto addetti al laboratorio chimico
(n=14) ed addetti alla movimentazione delle benzine (n=36)
di una raffineria di petrolio. I dati espositivi degli ultimi 5 anni
evidenziano valori inferiori a 1 ppm (valori medi di 0,06 ±0,02
ppm). 50 impiegati amministrativi della stessa raffineria, di sesso
maschile, caucasici, di 47,0 ±13,5 anni e anzianità lavorativa
di 17,0 ±4,1 anni sono stati utilizzati come controlli non esposti.
I prelievi ambientali evidenziavano, per questi lavoratori, valori
medi di 0,02 ±0,01 ppm. Nessuno presentava alterazioni ematochimiche
(emocromo, transaminasi, creatinina, es. delle urine) o
spirometriche. A ciascun soggetto è stato somministrato un questionario
ad inizio e a fine turno di lavoro volto ad indagare il
luogo di residenza, campagna o città, il turno di lavoro svolto,
l’abitudine tabagica, l’assunzione di farmaci, il tragitto percorso
e il mezzo impiegato per recarsi al lavoro. A ciascun lavoratore
è stato effettuato un prelievo ematico di 10 ml di sangue venoso
all’inizio e alla fine di un turno di lavoro di 8 ore l’ultimo giorno
di una settimana lavorativa. I campioni di urine sono stati
raccolti al termine del turno lavorativo nella quantità di 20 ml ed
il dosaggio dei fenoli è stato effettuato con metodo colorimetrico
(4). La determinazione del benzene ematico è stata effettuata
con metodica gas-cromatografica con un rilevatore di massa a
spazio di testa dinamico secondo Brugnone et al. (5). Le concentrazioni
più basse del limite di rilevamento sono state considerate
la metà della soglia minima di rilevazione (6). L’analisi
statistica è stata condotta con il programma SPSS-PC (SPSS,
Italia). I dati sono stati analizzati con test t di Student e correlazione
di Pearson. Il limite di significatività è stato fissato per valori
di p ≤ 0,05.
Risultati
Dai questionari, compilati in modo esaustivo, risulta che
tutti i lavoratori risiedevano in aree della città a non elevata
densità di traffico veicolare, nessuno aveva consumato bevande
alcoliche tali da presumere un’assunzione di alcool maggiore
di 40 g, e tutti avevano svolto il turno di lavoro del mattino
o quello giornaliero con una durata complessiva di almeno
8 ore. Durante il lavoro nessuno aveva dovuto far uso di
maschere con filtro o respiratori per esposizioni accidentali, e
tutti avevano usato regolarmente gli abituali dispositivi di protezione.
Non vi erano differenze per l’abitudine tabagica tra
esposti (40%) e non esposti (42%). Il body mass index medio
era di 25,67 ±3,02 nei soggetti esposti e di 25,91 ±3,60 nei
non esposti.
I risultati dei valori dei fenoli urinari sono sempre stati al di
sotto di 50 mg/g di creatinina, valore adottato dall’ACGIH fino
al 1995 come indicatore biologico. Benché valori maggiori siano
stati riscontrati nei soggetti esposti (32,28 ±14,90 mg/g cr.) rispetto
ai non esposti (23,87 ±55,0 mg/g cr.), la differenza non è
statisticamente significativa.
In 10 esposti ed in 7 non esposti i livelli ematici di benzene
erano inferiori al limite di rivelazione. Le concentrazioni medie
di benzene ematico negli esposti erano significativamente più
elevate a fine turno rispetto ad inizio turno; mentre non si osservano
differenze nel gruppo di controllo (tabella I).

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
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Tabella I. Valori di benzene ematico (ng/L) riscontrati
nei lavoratori esposti e nei non esposti
Analizzando la benzenemia nei fumatori riscontriamo un aumento
a fine turno rispetto ad inizio turno: significativo negli
esposti (84,93 ±22,29 ng/L vs. 59,47 ±17,45 ng/L), non significativo
nei non esposti (29,93 ±52,29 ng/L vs. 24,47 ±17,45 ng/L).
Discussione
Inizio turno Fine turno
Esposti 57,42 ±15,68°* 69,08 ±24,74°^
Non esposti 22,48 ±17,67* 23,02 ±13,36^
°p≤0,05, t di Student per dati appaiati, inizio turno vs fine turno.
* p≤0,05, t di Student per campioni indipendenti, inizio turno esposti vs
inizio turno non esposti.
^ p≤0,05, t di Student per campioni indipendenti, fine turno esposti vs fine
turno non esposti.
Il dosaggio del benzene ematico sembra in grado di distinguere
i lavoratori esposti a basse concentrazioni di benzene dai
non professionalmente esposti. Risultati analoghi erano stati osservati
da Ong et al (3), che hanno rilevato una buona correlazione
(r=0,64) tra la concentrazione di benzene in ambiente e
benzene ematico, e da Brugnone et al. (1, 7), anche se le benzenemie
dei lavoratori delle raffinerie, rilevate da questi ultimi,
sembrano essere più elevate rispetto alle nostre (inizio turno=174
ng/L, fine turno=251 ng/L) (1). Le benzenemie del nostro studio
sono simili a quelle di 75 ng/L rilevate da Brugnone et al. (7) nel-
la popolazione di soggetti non esposti non fumatori. Il fumo determina
un aumento del benzene ematico, anche se non abbiamo
riscontrato una relazione tra benzenemia e numero di sigarette fumate
nelle ultime 2 ore precedenti il prelievo, come invece è stato
rilevato dagli studi di Brugnone et al (5).
Riteniamo dunque che ulteriori studi debbano valutare il benzene
ematico per poterlo considerare come indicatore di esposizione
per le basse concentrazioni di benzene.
Bibliografia
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