Separační metody

pmfhk.cz

Separační metody

Separační metody

používané v proteomice


Proteome = komplexní směsi proteinů

Lidská buňka

• 10,000 typů proteinů

Rozdíl v koncentraci – 10 6 ,plasma10 9

Nutnost separace, frakcionace

• Na úrovni

Proteinů

• Obtížně identifikovatelné, je nutné měřit velké

molekulové hmotnosti, s velkým rozlišením

• lze pomocí FTICR

Peptidů –štěpení


Proteinové štěpení

• Chemické

CNBr

• M

• Enzymatické

Vysoce specifické

• Trypsin –K, R

• AspN - D

• GluC – E

• ArgC – R

• LysC - K

Méně specifické

• Chymotrypsin - aromatické

• Pepsin – F,L,W,Y

Nespecifické

• Proteináza K


Vlastnosti proteinů, peptidů

pI

mw

Hydrofobicita


Alanine

Valine

Aspartic acid


Rozložení aminokyselin v

proteinech podle četnosti


Separační metody



Elektromigrační metody

• SDS PAGE

• 2DE

IEF

SDS PAGE

• Nativní elektroforéza

• Kapilární elektroforéza

• Free flow eletrophoresis

Chromatografické metody

• Jednorozměrná

Na reverzní fázi

Iontově výměnná

Gelová chromatografie

Hydrofilní

Afinitní

• Vícerozměrná

2D – nejčastěji SCX+RP

Chromatofokusace – Beckman-Coulter


Elektromigrační metody

1DE - SDS PAGE

2DE

• IEF

• SDS PAGE

Nativní elektroforéza

Kapilární elektroforéza

Free flow electrophoresis


Elektromigrační metody


SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE)

• Molekulová hmotnost


Elektromigrační metody

isoelektrická fokusace



• Separace proteinů v závislosti na

isoelektrickém bodě

IPG proužky – imobilizovaný pH

gradient

Různý Gradient pH

• 3-10, 4-7, 6-11, 4,5-5,5


Elektromigrační metody

Dvoudimensionální elektroforéza 2-DE

IEF

SDS PAGE

MS analýza

+


Elektromigrační metody

+

Dvoudimensionální elektroforéza 2-DE

První dimense

--

+ +

-

+

-

- - --

-

++ + + +

+

- +

+

++

-- -

+

-

-

-

- -

- -

pI 3 -- - -

-

- +

++

-- -

- -

+

+

+ +

- -- + +

-

+

--

+ ++

pI 10

_

+

-

+ +

--

Druhá dimense

-

-

Polyakrylamid

rylamidový

gel

+

+

++

-

-

+


Elektromigrační metody

2-DE

Vizualizace proteinů:

• Citlivost

• Kompatibilita s

identifikací

• Dynamický rozsah




Stříbření

Modření koloidní coomasie

modří

Fluorescenční barvení

• Sypro Ruby


Elektromigrační metody

2-DE


Elektromigrační metody

DIGE - Differential gel electrophoresis

Modifikace 2DE

• vzorky označené různou flourescenční barvou

CY-2, CY-3, CY-5 – různé maximum excitační energie


Elektromigrační metody

Nativní elektroforéza

Elektroforéza bez denaturačních činidel a

detergentů

• Zachovává aktivní konformaci proteinů

Lze testovat aktivitu

Lze purifikovat velké komplexy

Modrá nativní elektroforéza – BN

• Coomasie modř, udává proteinům negativní

náboj

• V kombinaci s SDS PAGE


2D BN/SDS PAGE


2-D BN/SDS-PAGE membránových proteinových komplexů E. coli

J.-P. Lasserre et al. Electrophoresis 2006, 27, 3306–3321


Elektromigrační metody

Kapilární elektroforéza

• Vysoké rozlišení

• spojení s MALDI

• Nekompatibilní s ESI, příliš solí v pufrech


Elektromigrační metody

Free Flow electrophoresis

Metoda založená na

principu isoelektrické

fokusace v roztoku

• Vysoké rozlišení

• Odpadá problém s

precipitací proteinů v

gelu

Obdobný princip

• ROTOFOR

• ZOOM


Chromatografické metody

• HPLC – vysokotlaká kapalinová chromatografie

Jednorozměrná

• Na reverzní fázi

• Iontově výměnná

• Gelová chromatografie

• Hydrofilní

• Afinitní

Vícerozměrná

• 2D – nejčastěji SCX+RP

• Nízkotlaká chrom. - FPLC

• Extrakce na tuhé fázi - SPE

video


Chromatografické metody

HPLC - Reverzní fáze (RP)

Sorbent - stacionární fáze - je hydorfóbní

náplň

• Uhlovodíkový řetězec navázaný na:



silikagelu

polymeru

Hydrofobicita

Různý počet uhlíků

• C4, C8, C18

• Mobilní fáze

Vodný roztok s přídavkem TFA nebo kys. mravenčí

Gradient tvořený organickým rozpouštědlem

• ACN

Hydrofóbní řetězec

rozměry kolony velikost částic porozita

Příklad označení kolony: C18, 75 um x 15 cm, 3um, 300Å


Chromatografické metody – HPLC -RP

mV

Rozdělení směsi 9-ti peptidů –UV detekce

-8,40

-8,60

-8,80

-9,00

-9,20

-9,40

-9,60 1

-9,80

-10,00

-10,20

mV

-7,00

-7,50

-8,00

-8,50

-9,00

1 - 11,701

7 - 17,039

11 - 18,833

12 - 19,264

2 - 12,370

15 - 21,734

16 - 22,201

17 - 22,639

3 - 13,141

4 - 14,115

6 - 16,757 5 - 16,595

8 - 17,563 9 - 17,684

10 - 18,104

21 - 25,794

23 - 26,726

24 - 27,633

25 - 28,124

26 - 29,106

27 - 29,322

28 - 30,150

29 - 32,998

31 - 34,917

32 - 36,430

18 - 22,895

22 - 26,181

30 - 33,538

13 - 20,557

14 - 21,169

19 - 23,500

20 - 23,677

4 - 19,487

9 - 28,752

1 - 10,974

2 - 12,987

3 - 14,090

5 - 20,907

6 - 22,845

7 - 26,681

8 - 28,053

10 - 29,423

Rozdělení tryptického digestu hemoglobinu – UV detekce

-9,50

2

-10,00

-10,68

0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 37,5 40,0 42,5 45,0 47,5 50,0 52,5 56,0

min


Chromatografické metody

Iontově výměnná chromatografie

• Separace probíhá na základě afinity

nabitých proteinových/peptidových

částic ke stacionární fázi

• Eluce probíhá vyplavením pufru o

větší iontové síle

krokově

gradientově

• Kationtově výměnná

• Aniontově výměnná


Chromatografické metody

Gelová chromatografie (size exclusion chrom.)

• Větší částice se pohybují rychleji než malé,

které jsou brzděny interakcí s póry gelu

Spíše jako hrubá frakcionace


Chromatografické metody

Afinitní chromatografie

• Vazba proteinu přes specifickou

vazebnou schopnost

Substrát

Protilátka

• Využíváno např. pro

odstranění proteinů o veliké koncentraci ze

séra

• Až 20 nejkoncentrovanějších (albumin,

immunoglobuliny)

purifikaci proteinových komplexů


Ukázka specificity separačních technik


Chromatografické metody

Multidimenzionální kapalinová chromatografie

Iontově výměnná + na reverzní fázi

• SCX-RPLC, WAX-RPLC

Gelová permeační + na reverzní fázi

• SEC-RPLC

Afinitní + na reverzní fázi

• AC-RPLC

Na reverzní fázi + kapilární elektroforéza

• RPLC-CE


Chromatografické metody

2D-LC

SCX kolona

1. dimenze

nástřik

trap RP

odpad

pumpa

pumpa

peptidová

směs

RP kolona

2. dimenze

MS

(ESI)

štěpení

proteinová směs

(celý lysát, frakce)


Chromatografické metody

Separace komplexních peptidových směsí

Benefit:

Drawback:

Sensitive

Not Robust

Yates J.R. (1999) Nature Biotechnol. 17, 676-682.

Yates J.R. (2001) Nature Biotechnol. 19, 242-247.


Chromatografické metody

2DLC MS - příklady


SCX-RPLC

• Kvasinky– 1484 proteinů

(Washburn et al, Nat. Biotech, 19, 2001, 242-247)

• Nano 2D-LC

100 fmol BSA

100-300 proteinů E.coli / analýzu (celkem 500)

(Nagele et al, J.Chromatogr. A, 1009, 2003, 197-205)


Chromatografické metody

Analýza HMEC (human mammary epithelial cells)

Lyzát celých buněk

Gelová permeační chromatografie

6 frakcí

Digesce (trypsin)

1574 proteinů

SCX separace

RP separace

114 frakcí

(NET evaluace)

5836 jedinečných peptidů

700000 MSMS spekter

(LCQ Thermo Finnigan)

16836 peptidů

Jacobs et al., J. Proteome Res, 2004, Vol 3, No.1


Separace organel - frakcionace

Analýza subproteomu

• Cytoplasma

• Membrány

G- Bakterie

• Vnější

• Vnitřní

• Mitochondrie, chloroplasty

• Fagozómy, jiné buněčné váčky

• Jádro


Frakcionace

Diferenciální centifugace

• různé sedimentační

schopnosti organel

Zónální centrifugace

• gradient

Sacharóza, ClCs

More magazines by this user
Similar magazines