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BINDAZYME™ Anti-fosfatidilserina umana IgM Kit ... - inova

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BINDAZYME™ Anti-fosfatidilserina umana IgM Kit ... -

BINDAZYME Anti-fosfatidilserina umana IgM Kit Immunoenzimatico Italian Per uso diagnostico in-vitro Codice prodotto : MK052 Prodotto da: The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. www.bindingsite.co.uk Telefono: +44 (0)121 436 1000 Fax: +44 (0)121 436 7061 e-mail: info@bindingsite.co.uk BINDAZYME è un marchio di The Binding Site Ltd., Birmingham, UK. Non lasciare i flaconi dei reattivi stappati; qualsiasi evaporazione o contaminazione che ne risultasse darà luogo a risultati inattendibili. Il substrato TMB deve essere mantenuto al riparo dalla luce e dall’acqua. I sieri con contaminazioni microbiche, emolizzati o lipemici ed i campioni contenenti particelle non devono essere utilizzati. L’accuratezza della diluizione dei campioni non può essere verificata in quanto i controlli sono pronti per l’uso. Si consiglia pertanto l’utilizzo di pipette calibrate e di sieri di controllo interni. Nel caso vengano utilizzati sistemi di dosaggio automatizzati, diluitori di campioni e altre apparecchiature automatizzate, seguire attentamente le istruzioni del fabbricante. Porre particolare attenzione nell’impostazione delle apparecchiature, nell’installazione e nel collegamento alle unità periferiche esterne. Tutte le attività di impostazione del lavatore automatico e del lettore devono essere svolte con cura e le apparecchiature devono essere sottoposte ad interventi di manutenzione ed assistenza secondo le istruzioni del fabbricante 4.3 CONSERVAZIONE E STABILITÀ Il kit deve essere conservato a 2-8°C e non deve essere congelato. Temperature di conservazione inappropriate possono influire sui risultati. Il tampone di lavaggio diluito in un contenitore pulito può essere conservato a temperatura ambiente (20-24°C) per un massimo di 4 settimane. La scadenza del kit è evidenziata sull’etichetta esterna. 5 RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI 1 UTILIZZO Il presente dosaggio permette la determinazione in vitro degli anticorpi IgM antifosfatidilserina in siero umano, come sussidio nella diagnosi della sindrome da anticorpi antifosfolipidi (APS). Vengono forniti materiali sufficienti per il dosaggio di un massimo di 41 campioni in doppio o di 89 campioni in singolo, con una curva di calibrazione, un controllo positivo e uno negativo. 2 DATI CLINICI I pazienti con la sindrome da anticorpi anti-fosfolipidi sviluppano autoanticorpi diretti verso i fosfolipidi anionici e soffrono di trombosi ricorrente, perdita fetale e trombocitopenia 1 . Tali anticorpi sono stati tradizionalmente determinati mediante dosaggi che utilizzano come antigene la cardiolipina associata al cofattore β2-glicoproteina1 2 . Recentemente anche gli anticorpi anti-fosfatidilserina hanno dimostrato una certa rilevanza clinica in queste patologie 3 . Gli anticorpi diretti verso la fosfatidilserina potrebbero rivelarsi un marcatore più efficace per monitorare la sindrome da anticorpi anti-fosfolipidi. Ciò è supportato sia dalla loro presenza nelle membrane cellulari endoteliali e piastriniche 4 che dal fatto che questi anticorpi inducono la sindrome nei topi 5 . 3 PRINCIPIO DEL DOSAGGIO I micropozzetti sono sensibilizzati con fosfatidilserina e cofattore. I calibratori, i controlli e i campioni vengono dispensati nei pozzetti. Gli eventuali autoanticorpi diretti verso la fosfatidilserina si legheranno durante la prima incubazione. Dopo il lavaggio dei pozzetti, per rimuovere il materiale non legato, viene aggiunto il coniugato: anti-IgM umane di coniglio (catena-µ-specifiche) marcate con perossidasi. Il coniugato si legherà agli eventuali anticorpi umani catturati nel pozzetto mentre il coniugato in eccesso viene rimosso mediante ulteriore lavaggio. Il coniugato legato verrà evidenziato mediante aggiunta del substrato TMB (3,3’,5,5’ tetrametilbenzidina). Si ottiene una colorazione blu che virerà al giallo dopo aver aggiunto acido fosforico. L’intensità del colore, proporzionale alla concentrazione di autoanticorpi nel campione, viene letta a 450nm. 4 PRECAUZIONI 4.1 AVVERTENZE Tutti i sieri umani forniti nel kit sono stati sottoposti a screening per donatori, risultando negativi per l’antigene di superficie dell’epatite B e per gli anticorpi verso i virus HIV1, HIV2 e HCV. I suddetti dosaggi tuttavia non garantiscono la totale assenza di agenti infettivi. È opportuno quindi stabilire delle apposite modalità per la manipolazione e lo smaltimento di tali materiali. L’uso del presente kit deve essere consentito solamente a personale qualificato per la gestione di materiali potenzialmente infetti. La sodio azide può reagire con il piombo ed il rame delle tubature, formando azidi di metallo altamente esplosive. Per evitare l’accumulo di tali composti, far scorrere abbondante acqua sui reagenti eliminati. I tamponi ed i sieri forniti nel kit contengono vari inibitori enzimatici qui di seguito elencati. Tali reattivi devono essere manipolati con cautela. INIBITORE CONCENTRAZIONE Kathon 0,02% Sodio Azide 0,099% ProClin 300 0,045% Bromonitrodioxane 0,002% Methylisothiazone 0,002% ProClin è un marchio Rohm & Haas Corp. Philadelphia, PA Il kathon è un agente irritante e può causare sensibilizzazione cutanea. La soluzione bloccante contiene acido fosforico 3M, un agente irritante. Evitare il contatto con la pelle e con gli occhi. Schizzi ed eventuali rovesciamenti di reattivo devono essere ripuliti secondo le opportune modalità stabilite dalle direttive locali sui rifiuti speciali. 4.2 PRECAUZIONI Il presente prodotto deve essere utilizzato da personale specializzato. Si raccomanda di osservare la procedura del test alla lettera. Qualsiasi variazione potrebbe influire sui risultati e la qualità del dosaggio. Non trascurare le eventuali “Note” ed avvertenze contenute nelle istruzioni. I reattivi provenienti da lotti diversi di kit NON sono intercambiabili. Se si effettuano molti dosaggi, occorre avere l’accortezza di controllare che tutti I reattivi provengano dallo STESSO lotto. Tutti gli strip utilizzati devono provenire dalla medesima custodia di alluminio. La sostituzione di qualsiasi componente può portare a risultati errati. Per evitare contaminazioni, utilizzare solamente vetreria/contenitori di plastica nuovi o perfettamente puliti. Mai versare reattivi inutilizzati nuovamente nel flacone di origine. I campioni di sangue devono provenire da prelievi venosi, lasciati coagulare naturalmente, separandone poi il siero. Il siero può essere conservato a 2-8°C per un massimo di 7 giorni prima del dosaggio 6 , oppure per periodi più lunghi, aliquotare e conservare a -20°C o temperature inferiori. Evitare ripetuti congelamenti/scongelamenti dei campioni. I campioni di siero non devono essere inattivati mediante calore, in quanto ciò può dar luogo a risultati falsi positivi. 6 MATERIALI 6.1 MATERIALI FORNITI 6.1.1 Metodica: con tutti i dettagli del dosaggio. 6.1.2 Certificato QC: con i valori attesi del lotto in questione. 6.1.3 Phosphatidylserine Coated Wells (Pozzetti rivestiti con fosfatidilserina): 12 x 8 strip di pozzetti sensibilizzati con l’antigene fosfatidilserina. La piastra è inserita in una custodia di alluminio richiudibile con 2 bustine di agente essiccante. 6.1.4 Type II Sample Diluent (Diluente dei campioni tipo II): 2 flaconi contenenti 50mL di tampone per la diluizione dei campioni. Colorato in giallo, pronto per l’uso. 6.1.5 Type II Wash Buffer (20x Concentrate (Tampone di lavaggio tipo II (concentrato 20x)): 1 flacone contenente 50mL di tampone concentrato 20x per il lavaggio dei pozzetti. 6.1.6 Phosphatidylserine IgM Calibrators (Calibratori fosfatidilserina IgM): 5 flaconcini, ciascuno contenente 1,2mL di siero umano diluito alle seguenti concentrazioni di autoanticorpi anti-fosfatidilserina: 100; 33,3; 11,1; 3,7; 1,23 MPS U/mL. Pronti per l’uso. Il set di standard è calibrato rispetto alla Louisville APL Reference Preparation, come descritto in dettaglio nella sezione 8.6 della presente metodica. 6.1.7 Phosphatidylserine IgM Positive Control (Controllo positivo fosfatidilserina IgM): 1 flaconcino contenente 1,2mL di siero umano diluito. Il valore atteso è riportato sul Certificato QC. Pronto per l’uso. 6.1.8 Phosphatidylserine Negative Control (Controllo negativo fosfatidilserina): 1 flaconcino contenente 1,2mL di siero umano diluito. Il valore atteso è riportato sul Certificato QC. Pronto per l’uso. 6.1.9 Phosphatidylserine IgM Conjugate (Coniugato fosfatidilserina IgM): un flacone contenente 12mL di anticorpi purificati, coniugati con perossidasi. Colorato in azzurro, pronto per l’uso. 6.1.10 TMB Substrate (Substrato TMB): un flacone contenente 14mL di substrato TMB. Pronto per l’uso. 6.1.11 Stop Solution (Soluzione bloccante): un flacone contenente 14mL di acido fosforico 3M. Pronto per l’uso. 6.2 MATERIALI E STRUMENTI AGGIUNTIVI – non forniti 6.2.1 Lavatore automatico per micropiastre: Raccomandato pur essendo possibile il lavaggio manuale delle piastre. 6.2.2 Lettore per micropiastre: In grado di misurare le densità ottiche a 450nm (contro aria). 6.2.3 Acqua distillata o deionizzata: Della migliore qualità disponibile. 6.2.4 Micropipette calibrate: Per dispensare 1000, 100 e 10µL. 6.2.5 Pipetta multicanale: Raccomandata per dispensare i 100µL di coniugato, substrato e soluzione bloccante. 6.2.6 Provette di vetro/plastica: Per la diluizione dei campioni. 7 METODO DI DOSAGGIO 7.1 PREPARAZIONE DEL DOSAGGIO 1. Portare il kit a temperatura ambiente Il kit è stato messo a punto per una procedura a temperatura ambiente (20-24°C). Togliere il kit dal luogo di conservazione e attendere che raggiunga la temperatura ambiente (per circa 60 minuti). I pozzetti non devono essere rimossi dalla custodia di alluminio finché non abbiano raggiunto la temperatura ambiente. Nota: I kit si mantengono a temperatura ambiente per una settimana. 2. Componenti del kit Miscelare delicatamente ciascun componente del kit prima dell’uso. 3. Diluizione del tampone di lavaggio Aggiungere 50mL di tampone di lavaggio concentrato a 950mL di acqua distillata (diluizione 1/20) in un contenitore pulito e miscelare. Si possono frazionare le quantità da diluire se necessario. Nota: Il tampone di lavaggio diluito può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di 4 settimane. Diluirne pertanto solamente le quantità necessarie. 4. Diluizione dei campioni Diluire 10µL di ciascun campione con 1000µL di diluente dei campioni (1:100) e Insert Code: E052.I, Version: 27 th February 2009, Page 1 of 3

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