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BINDAZYME™ Anti-fosfatidilserina umana IgM Kit ... - inova

BINDAZYME™ Anti-fosfatidilserina umana IgM Kit ... - inova

miscelare accuratamente.

miscelare accuratamente. Nota: I campioni diluiti devono essere utilizzati entro 8 ore. 5. Manipolazione degli strip e del supporto Inserire il numero desiderato di pozzetti negli strip, a partire dal pozzetto A1, riempiendo le colonne da sinistra a destra. Durante tale procedura è opportuno premere sui lati più lunghi del supporto, per evitare la fuoriuscita dei pozzetti. Nota: Riporre immediatamente i pozzetti non utilizzati nella custodia di alluminio con le 2 bustine di essiccante, richiudendo saldamente per ridurre al minimo l’esposizione all’umidità. Assicurarsi che non vi siano strappi o forature nella custodia di alluminio: AVVERTENZA: L’esposizione dei pozzetti all’umidità, la contaminazione da polvere o da qualsiasi altro tipo di particelle può dar luogo al deterioramento degli antigeni, con risultati del dosaggio poco attendibili e potenzialmente falsi. 7.2 METODO DEL DOSAGGIO Mantenere lo stesso ordine di dispensazione durante tutta la seduta. 1. Dispensazione dei campioni Dispensare 100µL di ciascun calibratore, controllo e campione prediluito (1:100) nei rispettivi pozzetti, all’interno della piastra. Nota: I campioni devono essere dispensati il più velocemente possibile per ridurre al minimo l’effetto deriva sul dosaggio. Far partire il timer dopo aver dispensato l’ultimo campione. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. 2. Lavaggi La procedura di lavaggio rappresenta un passaggio critico e richiede particolare attenzione. Una piastra non lavata correttamente può dare risultati inaccurati, con scarsa precisione ed elevati rumori di fondo. Terminata l’incubazione, lavare la piastra 3 volte con 250-350µL di tampone di lavaggio per pozzetto. Utilizzare un lavatore automatico oppure procedere manualmente come qui di seguito riportato. Dopo l’ultimo lavaggio automatico, capovolgere la piastra su carta assorbente picchiettando delicatamente. Le piastre possono essere lavate manualmente come segue: a. Rovesciare il contenuto della piastra in uno scarico. b. Capovolgere la piastra su carta assorbente picchiettando delicatamente. c. Con una multicanale, dispensare 250-350µL di tampone di lavaggio. d. Agitare la piastra delicatamente su una superficie piana. e. Ripetere a-d due volte. f. Ripetere a e b. 3. Dispensazione del coniugato Dispensare 100µL di coniugato in tutti i pozzetti. Rimuovere eventuali schizzi sulla superficie dei pozzetti con carta assorbente. Nota: Per evitare contaminazioni, non versare il coniugato in eccesso nuovamente nel flacone d’origine. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. 4. Lavaggio Procedere come al punto 2. 5. Dispensazione del substrato (TMB) Dispensare 100µL di substrato TMB in tutti i pozzetti. Rimuovere eventuali schizzi sulla superficie dei pozzetti con carta assorbente. Nota: Per evitare contaminazioni, non versare il substrato in eccesso nuovamente nel flacone d’origine. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al riparo dalla luce. 6. Dispensazione del bloccante Dispensare 100µL di soluzione bloccante in tutti i pozzetti. Il colore virerà dal blu al giallo. 7. Lettura delle densità ottiche Leggere le densità ottiche (DO) dei pozzetti a 450nm in un lettore per micropiastre, entro 30 minuti dalla dispensazione del bloccante. 8 RISULTATI E CONTROLLO QUALITÀ 1. Controllo qualità Per essere valido il dosaggio deve rispettare i seguenti requisiti: • I calibratori e i controlli negativo e positivo devono essere inclusi in ogni seduta. • I valori ottenuti per ciascun controllo devono rientrare nei range specificati sul Certificato QC. • La forma della curva dovrà essere simile a quella riportata sul Certificato QC. Se non vengono rispettati i suddetti criteri, il dosaggio sarà invalidato e si dovrà ripetere la seduta. 2. Calcolo delle densità ottiche medie (solo per dosaggi in doppio) Calcolare la DO media delle due letture per ciascun calibratore, controllo e campione dispensato in doppio. Il C.V.% di ciascuna DO replicata dovrà essere inferiore al 15%. 3. Tracciare la curva di calibrazione La curva di calibrazione potrà essere tracciata in automazione o manualmente come segue, con la concentrazione degli autoanticorpi anti-fosfatidilserina su scala log, rispetto alle DO su scala lin, per ciascun calibratore: • In automazione – utilizzare un software adeguatamente validato, scegliendo il “fitting” che meglio si adatta ai dati. • Manualmente – utilizzando carta log/lineare (semilogaritmica) tracciare una curva uniforme attraverso i punti (non una retta o una punto-punto). 4. Trattamento dei punti anomali Se uno dei punti fuoriesce dalla curva, questo potrà essere rimosso. Se in seguito a tale rimozione la curva assume una forma diversa rispetto a quella riportata sul Certificato QC o se più punti risultano fuorvianti, il dosaggio dovrà essere ripetuto. 5. Calcolo dei livelli anticorpali nei controlli e nei campioni Leggere i livelli degli autoanticorpi anti-fosfatidilserina nei controlli e nei campioni prediluiti direttamente sulla curva di calibrazione. I valori dei controlli dovrebbero rientrare nei range riportati sul Certificato QC. Nota: I valori dei calibratori sono già corretti considerando un fattore 100 per la prediluizione 1:100 dei campioni. Non sono pertanto necessarie ulteriori correzioni. 6. Calibrazione del dosaggio Il dosaggio è calibrato rispetto allo Standard di Riferimento di Louisville LAPL-GM-200. 7. Limiti del dosaggio • Il presente kit va utilizzato unicamente come sussidio diagnostico. Un risultato positivo è indice di alcune patologie che andranno confermate attraverso i parametri clinici e ulteriori test sierologici. • I risultati ottenuti nel dosaggio non rappresentano una prova diagnostica dell’insorgere o meno di una determinata patologia. FDA (USA) Avvertenze: vedere la pagina iniziale delle instruzioni per l’uso in Inglese. 9 CARATTERISTICHE METODOLOGICHE 9.1 PRECISIONE La precisione intra- ed inter-saggio è stata determinata su 3 campioni che rientravano nei range della curva di calibrazione. Le concentrazioni medie ed i C.V.% di ciascun campione sono qui di seguito riportati: PRECISIONE INTRA-SAGGIO n=16 Concentrazione (MPS U/mL) C.V. % Campione 1 21,6 3,2 Campione 2 54,2 4,8 Campione 3 88,6 5,1 PRECISIONE INTER-SAGGIO n=3 Concentrazione (MPS U/mL) C.V. % Campione 4 17,6 11,5 Campione 5 42,1 7,1 Campione 6 75,4 9,2 9.2 RANGE DI NORMALITÀ Sono stati determinati i livelli degli autoanticorpi anti-fosfatidilserina nei sieri provenienti da 200 donatori sani. I risultati sono illustrati nel seguente grafico. In base a un cut-off negativo di 25 IgM anti-PS MPSU/mL Tale range di normalità costituisce unicamente un parametro guida. Si raccomanda che ciascun laboratorio stabilisca i propri limiti di normalità. 9.3 SPECIFICITÀ, SENSIBILITÀ E CONCORDANZA Sono state determinate specificità, sensibilità e concordanza relative, rispetto a un kit EIA alternativo per anti-fosfatidilserina, utilizzando 63 campioni sia patologici che normali. EIA EIA Alternativo + - BINDAZYME + 25 6 a IgM Anti-fosfatidilserina EIA - 2 b 30 Sensibilità relativa 92,6% Specificità relativa 83,3% Concordanza relativa 87,3% a,b Vi è una correlazione documentata tra la presenza di anticorpi anti-fosfatidilserina e anticorpi anti-cardiolipina nel siero dei pazienti 7 . Gli 8 campioni discrepanti sono stati dosati con un test per anti-cardiolipina IgM; tutti e 8 sono stati confermati positivi. 9.4 SENSIBILITÀ ANALITICA La sensibilità è stata determinata come concentrazione media + 2 DS, su 20 determinazioni del diluente dei campioni, ottenendo un valore di 0,28 MPS U/mL. 9.5 RANGE DI MISURAZIONE Il range di misurazione del dosaggio è tra 1,23 e 100 MPS U/mL. 9.6 SOSTANZE INTERFERENTI Sostanze interferenti varie sono state aggiunte a un campione a titolo elevato di antifosfatidilserina e uno a titolo basso di anti-fosfatidilserina, che sono stati susseguentemente dosati. Il metodo utilizzato per verificare tali sostanze si basa sull’Interference Check A plus - Kokusai Shiyaku, Giappone. Sostanza Concentrazione Bilirubina F (libera) 18,3mg/dL Bilirubina C (coniugata) 19,0mg/dL Emoglobina emolizzata 490mg/dL Chilo 1930 unità Non si sono riscontrate interferenze nei campioni dosati. Insert Code: E052.I, Version: 27 th February 2009, Page 2 of 3

Nota: I campioni di pazienti con mielomi IgM possono dare risultati falsi positivi. È stato documentato 8 tuttavia che alcuni anticorpi associati a mielomi mostrano una specifica attività anti-fosfolipidica. 10 VALORI ATTESI Il range di normalità è stato determinato sul siero di 200 donatori sani adulti. I range rappresentano unicamente un parametro guida. I dosaggi ELISA risultano molto sensibili e in grado rivelare differenze minime nelle popolazioni dei campioni. Si raccomanda pertanto che ciascun laboratorio stabilisca i propri limiti di normalità, in base alla popolazione locale, alla strumentazione e alle tecniche impiegate. IgM anti-fosfatidilserina < 25 MPS U/mL Risultato negativo ≥ 25 MPS U/mL Risultato positivo 11 BIBLIOGRAFIA 1. McNeil HP, Chesterman CN, Krillis SA (1991). Immunology and Clinical Importance of Anti-phospholipid Antibodies. Adv Immunol,49:193-280. 2. Roubey AS (1996). Immunology of the Anti-phospholipid Antibody Syndrome. Arthritis & Rheumatism,39:1444-1454. 3. Barna LK et al. (1994) A study of relationships among anti-phosphatidylserine and anti-cardiolipin antibodies, the lupus anticoagulant and clinical complications. Lupus 3:357. 4. Schick PK, Kurica KB, Chacko GK (1976) Location of phosphatidylethanolamine and phosphatidylserine in the human platelet plasma membrane. J Clin Invest 57:1221-1226. 5. Blank M, Tincani A,, Shoenfeld Y (1994) Induction of experimental antiphospholipid syndrome in naïve mice with purified IgG anti-phosphatidylserine antibodies. J Rheumatol 21:100-104. 6. Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14. 7. Radway-Bright E.L., Ravirajan C.T. and Isenberg D.A. (2000) The prevalence of antibodies to anionic phospholipids in patients with the primary antiphospholipid syndrome and their relatives and spouses. J Rheumatol 21:427-431. 8. MacGregor AJ. et al. (1992). Analysis of antibody reactivity in sera of 42 patients with paraproteinaemia. Autoimmunity; 13: 101-105. Insert Code: E052.I, Version: 27 th February 2009, Page 3 of 3

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