Giugno 2013 - La farmacologia cellulare e molecolare della giunzione

Periodico della Società Italiana di Farmacologia - fondata nel 1939 - ANNO IX n. 34 – Giugno 2013
Riconosciuto con D.M. del MURST del 02/01/1996 - Iscritta Prefettura di Milano n. 467 pag. 722 vol. 2° ISSN 2039-9561
La farmacologia cellulare e
molecolare della giunzione nicotinica:
la mia storia di 40 anni
Francesco Clementi
Professore Emerito, Università degli Studi di Milano
Introduzione
La mia storia scientifica di 40
anni potrebbe essere racchiusa in
2 parole: recettori nicotinici! Mi
sono sempre occupato dei recettori
nicotinici, della loro struttura
e della loro funzione nel regolare
molti fenomeni importanti a
livello del sistema nervoso centrale
e periferico. Questo filone di
ricerca si inserisce in una vecchia
tradizione della farmacologia milanese
che con alti e bassi è sempre
stata presente dai tempi della
registrazione di organi isolati attraverso
i tamburi ricoperti di nerofumo
fino agli studi più recenti
di biologia molecolare e genetica.
L’approccio che io ho seguito, e
che cercherò di illustrare brevemente,
è stato quello della farmacologia
cellulare e molecolare,
sulla cui introduzione il nostro
laboratorio è stato un pioniere.
La farmacologia cellulare è il
luogo di integrazione tra la farmacologia
molecolare e la farmacodinamica.
Della prima mantiene
la precisione e la profondità,
18 - Quaderni della SIF (2013) vol. 34
relativa in particolare ai dettagli
della interazione farmaci-molecole;
della seconda la ricchezza nella
interpretazione di funzioni integrate
e complesse. Ad entrambe
fornisce una “sede”, un “ambiente”,
dove le varie funzioni si svolgono.
Il risultato che ne scaturisce
è una concretezza che il solo
dato biochimico o funzionale non
può dare. È un approccio che ora
sta aprendo vie innovative anche
nella ricerca farmacologica più
applicativa. Quando io ho iniziato
la mia attività di ricercatore questo
non era ancora il caso e la farmacologia
cellulare e molecolare
ancora non esisteva. Mi sembra
quindi utile premettere alla parte
“nicotinica” una breve storia del
nostro laboratorio come l’ho descritta
assieme a Jacopo Meldolesi
alcuni anni fa (Clementi and Meldolesi,
2001).
Il contesto generale
Gli inizi
Si era nel 1956-57 e si cominciavano
a vedere i primi risultati
della microscopia elettronica applicata
alla biologia, soprattutto
per i contributi usciti dalla scuola
di Claude, Porter e Palade alla
Rockefeller University di New
York. Il pregio di quella scuola
era quello di partire dalla fine
descrizione morfologica per cercare,
attraverso correlazioni con
i dati più moderni della biochimica
e della fisiologia, funzioni
e meccanismi degli organuli cellulari
che man mano si venivano
a scoprire. Il Prof. Trabucchi,
che aveva un grande intuito nel
capire le prospettive future della
ricerca, discutendo con i più giovani
ricercatori e con gli studenti
interni, si diceva sicuro che una
analisi accurata, precisa e dinamica
delle strutture subcellulari,
attuata attraverso la microscopia
elettronica associata alle tecniche
biochimiche più moderne, avrebbe
portato a contributi molto importanti
anche nel campo della
Farmacologia, in particolare nella
comprensione del meccanismo
d’azione dei farmaci e dei tossici.
La scelta di allora fu felice e molto

appropriata.
Un’altra scelta, anche questa tipica
di Trabucchi, è stata quella di
affidare il compito di aprire questa
nuova frontiera non a ricercatori
già affermati ma a tre studenti,
diversi per impostazione, formazione
e prospettive di ricerca
future. Questa scelta fu senz’altro
avventata, ma forse solo così si
poteva iniziare una nuova linea di
ricerca che voleva essere di rottura
con una vecchia impostazione
e che necessitava quindi della “incoscienza”
di ricercatori giovani.
I giovani “morfologi” furono inviati
per imparare in alcuni tra i
migliori laboratori europei, a Parigi,
Monaco e Losanna.
Il ricordo più importante di quegli
inizi riguarda non tanto le difficoltà
tecniche ma, soprattutto, il
vuoto culturale che c’era attorno
a questo tipo di ricerca. Vuoto che
abbiamo cercato di colmare man
mano, con pazienza, con molto
lavoro, costanza e coraggio, fino a
portare il nostro laboratorio a dialogare
con i laboratori più importanti
del mondo nel campo della
Biologia e Farmacologia Cellulare.
L’impostazione del laboratorio è
stata fin dall’inizio focalizzata non
sulla tecnologia, ma sui problemi
biologici da risolvere attraverso la
costante integrazione tra le tecniche
più diverse, dalle morfologiche
alle biochimiche, dalle elettrofisiologiche,
alle farmacologiche.
Questa impostazione ci ha permesso
negli anni di non rimanere
sclerotizzati su singole tecniche,
aprendoci sempre al nuovo, senza
paura di affrontare metodologie
ed approcci diversi. Inoltre, questa
apertura di fondo ha portato i
ricercatori ad una libertà di ricerca
e di tematiche che trova il loro
punto di unificazione nella impostazione
critica della ricerca, nella
cultura biologica assieme affinata
e gustata, nella serietà metodologica.
Conseguenza diretta dell’impostazione
“aperta” del laboratorio
è stata la diversificazione delle
linee di ricerca che, pur avendo
un substrato comune, permette a
ciascuno di sviluppare le problematiche
che più gli stanno a cuore
con l’approccio scientifico e culturale
più consono alla sua cultura
ed esperienza. La discussione tra
i ricercatori, lo scambio di esperienze
e di tecnologie, la continua
opera di formazione culturale permette
inoltre a queste diversità di
trasformarsi in arricchimento per
tutti, senza disperdersi in progetti
collaterali, troppo distanti dal comune
sentiero.
Il Laboratorio di
farmacologia cellulare
Il primo nucleo della Farmacologia
Cellulare fu il laboratorio
di microscopia elettronica che si
formò nel 1958, quando Trabucchi
riuscì ad ottenere dal Politecnico
di Milano un microscopio
elettronico di seconda mano, un
Philips EM 100 (che era stato acquisito
con il piano Marshall!).
Questo laboratorio è tuttora presente,
rimodernato nella strumentazione,
e molto attivo sotto
la direzione di Maura Francolini.
Le basi per un laboratorio competitivo
a livello internazionale sono
poi state impostate e sviluppate
dall’incontro con Jacopo Meldolesi
e con Bruno Ceccarelli. Loro
hanno portato visioni diverse nelle
quali gli approcci biochimici
ed elettrofisiologici hanno permesso
di andare più vicino all’integrazione
tra i dati morfologici
e quelli funzionali. L’esperienza
internazionale è stata fondamentale
per farci fare il salto dalla
morfologia alla Biologia Cellulare
e quindi alle aperture di oggi:
io prima con Victor Whittaker a
Cambridge poi con il Prof. George
Palade alla Rockefeller University,
Meldolesi con George Palade,
Ceccarelli con Alex Mauro sempre
alla Rockefeller University. Questi
incontri hanno lasciato in molti
di noi un “imprinting” speciale.
L’influsso di Palade è stato determinante
perché ci ha tratti da un
modo provinciale di concepire
e fare la ricerca; ci ha dato una
impostazione di base che poggia
sull’amore per le cose ben fatte,
per la ricerca che deve dire qualche
cosa di nuovo e di importante.
Una ricerca che non sia fine a
se stessa o finalizzata soltanto al
successo individuale, ma che costituisca
un passo sul lungo cammino
della scoperta della verità.
Gli insegnamenti di Trabucchi
e di Palade, pur diversi tra loro,
erano per molti versi affini e noi
li abbiamo appresi ed integrati
con gioia nel nostro patrimonio
culturale e personale. Nel 1970
avvenne una svolta fondamentale
nel laboratorio, l’istituzione del
Centro del CNR per lo studio delle
Infrastrutture Cellulari – poi Centro
per la Farmacologia Cellulare
e Molecolare, e ora Laboratorio di
Farmacologia Cellulare e Molecolare
dell’Istituto di Neuroscienze
del CNR. La costituzione del Centro
permise al laboratorio di crescere
in autonomia, arricchendosi
di valorosi ricercatori dell’Università
e del CNR.
Gli sviluppi recenti
In quegli anni il gruppo si è
espanso. Jacopo Meldolesi divenne
l’asse portante della ricerca
biomedica del nuovo Dipartimento
Biologico dell’Università Vita-
Salute del S. Raffaele. Bruno Ceccarelli,
prima della sua scomparsa
nel 1988, aveva dato vita, assieme
a Dino Fesce, Flavia Valtorta e Fabio
Grohovaz, al “Centro Universitario
per lo Studio Sperimentale
delle Neuropatie Periferiche e Malattie
Neuromuscolari”, nel quale
la felice combinazione delle tecniche
morfologiche ultrastrutturali
con le tecniche elettrofisiologiche,
permise di dare un decisivo
contributo alle conoscenze sulla
neurobiologia della sinapsi e sulla
plasticità del sistema nervoso periferico.
Purtroppo la sua morte im-
Quaderni della SIF (2013) vol. 34 - 19

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provvisa ha interrotto un cammino
scientifico che si prospettava di
grande innovazione ed interesse.
Il gruppo dei ricercatori che lavorano
in via Vanvitelli è cresciuto
in questi ultimi anni apportando
nuove prospettive di studio.
Basti pensare ai lavori sul traffico
cellulare del gruppo di Nica Borgese,
a quelli sulla sinaptogenesi e
fisiologia della sinapsi del gruppo
di Michela Matteoli e a quelli sulla
plasticità sinaptica di Carlo Sala e
Maria Passafaro, a quelli sui recettori
dei gruppi di Cecilia Gotti
e Bice Chini, a quelli sui meccanismi
di secrezione e di polarità
cellulare di Patrizia Rosa e Grazia
Pietrini, a quelli sulla espressione
genica e sulla epigenetica
del gruppo di Diego Fornasari, a
quelli sulle risposte antivirali del
gruppo di Carlo De Giuli, a quelle
della modellistica matematica
delle immagini di Marco Righi.
Il filo comune di tutte queste ricerche
è l’interesse per gli aspetti
farmacologici. Si aprono così interessanti
prospettive per capire il
meccanismo d’azione dei farmaci,
per sfruttare i farmaci come mezzo
di indagine dei fenomeni biologici
e per trovare bersagli terapeutici
nuovi (notizie più puntuali
sull’attività scientifica del gruppo
sono reperibili in http://www.
in.cnr.it/research.php?c=MI).
Dal nostro laboratorio sono
usciti ricercatori importanti che
hanno diffuso questo approccio
scient ifico in altre strutture: Guido
Fumagalli a Verona, Nica Borgese
all’Università di Catanzaro,
Dino Fesce all’Università dell’Insubria,
Emilio Clementi al Polo
Sacco dell’Università di Milano,
Camillo Peracchia alla Rochester
University, Bianca Conti alla Minnesota
University, Paola Ricciardi
Castagnoli a Singapore, Pietro De
Camilli a Yale, Emanuele Sher alla
Eli Lilly, Michele Solimena a Dresda.
È stato possibile raggiungere
questi risultati anche attraverso
una vivace politica di scambi e
collaborazioni con i più prestigiosi
laboratori europei, americani e
giapponesi.
Attività di formazione
Non posso chiudere questa breve
introduzione generale senza richiamare
il costante e puntiglioso
sforzo che il nostro laboratorio ha
messo nella formazione continua
dei giovani ricercatori, attraverso
i corsi del Dottorato, i seminari,
i journal club, i progress report,
che ha molto contribuito ad elevare
il livello culturale e scientifico
e formare giovani più aperti
alle novità e alla voglia di iniziare
percorsi più propri ed originali.
Il libro di Farmacologia Generale
e Molecolare, edito dalla UTET
da Francesco Clementi e Guido
Fumagalli, che ha raggiunto nelle
quattro edizioni la tiratura di
20.000 copie e vedrà presto una
edizione inglese, ha trasferito con
successo agli studenti ed ai docenti
il nuovo mondo aperto alla
Farmacologia dalle conquiste della
Biologia Molecolare e Cellulare.
Conclusione 1
Questa esperienza di ricerca,
che ormai dura felicemente da
più di quaranta anni, è anche una
bella illustrazione di quanto sia
stato possibile ottenere dalla interazione
positiva tra un vecchio
“Barone”, come il Prof. Trabucchi,
ed un gruppo di giovani ricercatori,
lavoratori, motivati, costanti
e decisi. Il Prof. Trabucchi ci ha
agevolato in ogni modo in questa
avventura con l’impostazione
originale, con il suo interesse costante
e contagioso per il nostro
lavoro, con l’aiuto economico ed
accademico, noi abbiamo contribuito,
non solo con il lavoro e con
l’intelligenza, ma anche, e soprattutto,
con la volontà, a costruire
qualche cosa di nuovo. Qualcosa
che ponesse un segno della nostra
presenza nella comunità scientifica
e che indicasse una via di sviluppo
all’Università, così anchilosata
da rigide impostazioni di
potere e di gerarchia. Siamo così
riusciti a creare, tutti assieme e
con il concorso fattivo di tutti, dal
professore più affermato, al ricercatore,
al tecnico, alla segretaria,
una esperienza umana e di ricerca
che è valsa, e continua a valere, la
pena di vivere.
La mia storia personale
Le mie prime ricerche
di farmacologia cellulare
della sinapsi
In questo contesto generale
sono nate le mie ricerche rivolte
fin dall’inizio alla comprensione
della struttura e funzione delle
terminazioni nervose. Negli anni
sessanta erano in discussione i diversi
pool di catecolamine, la loro
localizzazione nel corpo cellulare
e nelle terminazioni, e i possibili
meccanismi della loro modulazione
da parte dei farmaci psicotropi.
Combinando la microscopia elettronica
con misure delle catecolamine
in vitro ho potuto dimostrare
che questi neurotrasmettitori
erano immagazzinati nei granuli
densi e mostrare i meccanismi
con i quali la reserpina e altri farmaci
psicotropi potevano interferire
con l’immagazzinamento e la
liberazione di neurotrasmettitori
(Clementi, Zocche, 1963; Clementi,
1965). Una delle difficoltà
nella localizzazione quantitativa
dei neurotrasmettitori nelle sinapsi
era la difficoltà di conoscere
il numero di sinapsi presenti nel
sistema nervoso centrale. Nel periodo
di studio a Cambridge, nel
laboratorio del Prof. Whittaker,
abbiamo messo a punto, analizzando
frazioni subcellulari, un
approccio quantitativo per valutare
il numero di sinapsi presenti
nel cervello con il quale, per
la prima volta, abbiamo potuto
affermare che le sinapsi presenti
nella corteccia del sistema nervoso
centrale erano nell’ordine di
3/5 x 10 11 /g di tessuto (Clementi
et al., 1966), numero poi confer-

mato da altri ricercatori con tecniche
morfologiche diverse. Dopo
il periodo molto fruttuoso speso
alla Rockefeller University, dove
con George Palade ho studiato la
permeabilità dei capillari e la sua
modulazione da parte dell’istamina
(Clementi, Palade, 1969a, b),
ho ripreso le ricerche sulle sinapsi
e con Ceccarelli e Mantegazza
mi sono occupato della reinnervazione
autologa ed eterologa dei
gangli simpatici (Ceccarelli et al.,
1971, 1972; Carruba et al., 1974)
e, recentemente con Maura Francolini
(Francolini et al., 2009) e
con il gruppo bresciano coordinato
da Brunelli e Spano, della reinnervazione
eterologa muscolare.
La parte più originale di questi lavori
è stata la dimostrazione che
l’espressione dei recettori sinaptici
è fortemente modulata nel tipo
e nel numero dalla natura della
fibra che reinnerva (per es. se i
neuroni gangliari sono reinnervati
da fibre adrenergiche esprimeranno
anche recettori adrenergici
e se il muscolo striato è reinnervato
da una fibra glutamatergica
esprimerà anche recettori glutamatergici
oltre che nicotinici). È
stato un periodo molto intenso,
innovativo, di forte interdisciplinarietà
- ricerche di microscopia
elettronica, di elettrofisiologia, di
registrazioni in vivo, di farmacologia
classica - ma che non discuto
oggi per non distrarre l’eventuale
lettore dalla sinapsi nicotinica.
I Recettori Colinergici
Nicotinici
Come ha ben introdotto recentemente
Giancarlo Pepeu in questo
giornale (Pepeu, 2013), il sistema
colinergico ha una grandissima
rilevanza nel modulare le risposte
del sistema nervoso centrale e periferico,
attraverso la mediazione
di due sistemi recettoriali: il muscarinico
ed il nicotinico. Egli ha
analizzato, con dettaglio e sintesi
Fig. 1. Struttura e
localizzazione dei recettori
nicotinici neuronali.
La figura riporta in A
la struttura schematica
dei recettori-canale
di tipo niocotinico
e l’arrangiamento
spaziale delle subunità
nei recettori omomerici
ed eteromerici, i siti di
legame per l’acetilcolina
all’interfaccia delle
subunità (pallini scuri) e le
subunità accessorie. In B è
riportata la distribuzione
dei più rilevanti sottotipi
dei recettori nicotinici
nelle aree principali
del cervello di ratto. La
presenza ubiquitaria
dei recettori e la copresenza
di molti sottotipi
recettoriali nelle stesse
aree indica la complessità
del grado di modulazione
dell’attività neuronale
da parte del sistema
colinergico nicotinico
(modificata da Gotti et al.,
2006a).
Quaderni della SIF (2013) vol. 34 - 21

da par suo, le funzioni e la farmacologia
del sistema muscarinico
e il suo coinvolgimento in molte
patologie psichiatriche. Io cercherò
di completare il quadro con
qualche informazione sul sistema
colinergico nicotinico.
I recettori nicotinici (NAChR)
appartengono alla famiglia dei
canali ionici la cui apertura è
controllata e modulata da una
interazione extracellulare con un
ligando. In questo caso il ligando
endogeno è l’acetilcolina; essi
sono chiamati nicotinici in quanto
la nicotina, sostanza presente
nel fumo di foglie di Nicotiana
tabacum, è un ligando abbastanza
selettivo e affine per tutte le
famiglie di recettori nicotinici ed
è stato il primo composto utilizzato
per la loro caratterizzazione
farmacologica. Alla famiglia dei
recettori-canale appartengono
alcuni dei recettori per neurotrasmettitori
classici, oltre alla
acetilcolina, come GABA, glicina,
glutammato, serotonina e ATP.
Sulla base della carica ionica che
passa attraverso il canale aperto
dall’interazione con il ligando, i
recettori-canale possono indurre
depolarizzazione o iperpolarizzazione
e mediare rispettivamente
eventi eccitatori o inibitori (vedi
per maggiori dettagli Gotti et al.,
1997; Gotti, Clementi, 2004; Gotti
et al., 2006b; Gotti et al., 2006a;
Albuquerque et al., 2009; Gotti
et al., 2009). I recettori nicotinici
sono espressi ad alti livelli nella
giunzione neuromuscolare, nei
gangli orto e parasimpatici e in
diverse aree del sistema nervoso
centrale (SNC). A livello neuromuscolare
e gangliare i NAChR
mediano la trasmissione sinaptica
veloce, mentre la maggior parte
dei recettori nicotinici situati nel
SNC presentano una localizzazione
presinaptica o preterminale,
dove partecipano alla modulazione
del rilascio di tutti i tipi di neurotrasmettitori,
e solo in pochissime
aree mediano la trasmissione
postsinaptica veloce e hanno
22 - Quaderni della SIF (2013) vol. 34
una localizzazione postsinaptica
o somatodendritica. Gli NAChR
formano una classe eterogenea di
recettori pentamerici, le cui proprietà
biofisiche, farmacologiche,
funzionali e la loro distribuzione
nell’organismo sono determinate
dalle caratteristiche delle cinque
subunità che si assemblano per
formare il recettore-canale (Gotti
et al., 2006b; Gotti et al., 2006a;
Gotti, Clementi, 2012). Nei vertebrati
sono stati clonati 10 geni che
codificano per subunità α, 4 geni
che codificano per subunità β, 1
gene per la subunità γ, uno per la
subunità δ e uno per la subunità
ε. I recettori nicotinici possono
essere pentameri costituiti da 5
subunità tutte uguali (recettori
omomerici) o da 5 subunità, di
cui fino a quattro possono essere
diverse tra loro (recettori eteromerici).
Nei recettori eteromerici
muscolari e neuronali ci sono due
siti di legame per l’ACh che sono
localizzati in tasche idrofobiche
situate all’interfaccia tra una subunità
α ed una subunità adiacente
(nonα) che contribuiscono
rispettivamente alla componente
primaria e a quella complementare
del sito di legame. Nei recettori
omomerici sono presenti cinque
siti di legame che sono localizzati
all’interfaccia tra una subunità α
e la subunità α adiacente (Fig 1).
La combinazione randomizzata
di queste subunità darebbe origine
ad un numero molto elevato
di sottotipi di recettore, mentre
in realtà i recettori espressi nelle
cellule nervose o muscolari o
di altro tipo sono di numero non
alto, ben definito e con una topografia
precisa. Nel muscolo abbiamo
un recettore composto da α1,
β1, δ, ε o γ durante lo sviluppo;
nel cervello abbiamo due sottotipi
rilevanti gli eteromerici composti
da α4β2 e gli omomerici composti
da α7 o α8 ; nei gangli sono
presenti soprattutto recettori di
tipo α3β4. A queste subunità possono
anche essere associate altre
subunità (per es. α5 e α3) chiamate
accessorie in quanto non
partecipano direttamente alla
formazione del sito di legame ma
regolano la farmacologia, funzione
e localizzazione dei recettori
(Gotti et al., 2007).
I recettori nicotinici muscolari
e la Miastenia Grave
All’inizio della nostra ricerca
sui nicotinici, il primo interesse è
stato per i recettori presenti nella
placca neuromuscolare. Di questa
struttura si conosceva molto
bene la funzione, le proprietà
elettrofisiologiche e una farmacologia
molto ben caratterizzata,
ma gli studi sulla sua struttura,
composizione in recettori e loro
localizzazione erano ancora agli
inizi. Le scoperte di Changeaux
sulla struttura in subunità del
recettore nicotinico muscolare,
il loro clonaggio e la definizione
della teoria allosterica hanno dato
un grande impulso a tutta la storia
nicotinica (Albuquerque et al.,
2009). Il nostro interesse è stato
attirato da una patologia umana,
la Miastenia Grave, che, dagli
studi funzionali e farmacologici,
sembrava avere nei recettori nicotinici
il bersaglio più importante.
Assieme a Bianca Conti, Guido
Fumagalli, Cecilia Gotti ed Emanuele
Sher abbiamo quindi isolato
e purificato i recettori nicotinici
muscolari dall’organo elettrico
della torpedine e iniettandoli nel
coniglio abbiamo provocato una
forma di patologia del tutto simile
alla Miastenia Grave umana, confermando,
quindi, che questa patologia
aveva tutte le caratteristiche
di una malattia auto immune
avente come bersaglio patogenetico
il recettore muscolare (Clementi
et al., 1976; Fumagalli and
Clementi, 1978). Abbiamo ben caratterizzato
il modello animale, la
sua risposta ai farmaci, il tipo di
anticorpi prodotti ed abbiamo definito
il meccanismo patogenetico
di questa malattia consistente

nella degradazione accelerata dei
recettori, prodotta per un aumento
dell’endocitosi dei recettori,
con conseguente diminuzione di
recettori nella placca sinaptica.
Questi dati ci sono serviti per entrare
nella patologia umana dove
abbiamo dimostrato, con un saggio
nostro che determinava la
quantità di anticorpi antirecettore
e la loro capacità funzionale
di aggredire i recettori, la correlazione
tra gravità della malattia
e indice composito anticorpale
(Conti-Tronconi et al., 1979; Morgutti
et al., 1979; Tronconi et al.,
1981) e nella velocità di degradazione
dei recettori il meccanismo
patogenetico degli anticorpi
(Sher and Clementi, 1984). Durante
questi studi abbiamo anche
stabilito, tra i primi, l’importanza
dell’immunità cellulare verso
il recettore come causa rilevante
della malattia e come indice di risposta
ai farmaci e agli interventi
terapeutici (Conti-Tronconi et al.,
1979; Morgutti et al., 1979; Tronconi
et al., 1981).
Tutte le forme di Miastenia
sono a carico dei
recettori nicotinici?
Questi studi sull’autoimmunità
nelle patologie neuromuscolari e
la nostra capacità di isolare anticorpi
specifici ci hanno aperto
un altro capitolo di grande interesse,
quello dalla Sindrome miastenica
di Eaton Lambert. Con
E. Sher abbiamo dimostrato che
la deficienza della funzione neuromuscolare
era dovuta non ad
un difetto nicotinico, ma ad una
diminuzione dei canali per il calcio
voltaggio dipendenti che legano
la ω-Conotossina (Sher et al.,
1989). Anche in questo caso la diminuzione
avveniva per un attacco
auto-immune da parte di anticorpi
specifici anti-canale (Sher
et al., 1991). Di questi ne abbiamo
caratterizzato la funzione ed il
meccanismo d’azione, la correlazione
con la gravità della malattia
e messo a punto un sistema
di dosaggio originale assai utile
in clinica (Sher et al., 1989; Sher,
Clementi, 1991). Questo approccio
ha poi aperto una serie di ricerche
assai stimolanti sui canali
al calcio, sulla loro farmacologia,
sui rapporti tra canali e recettori
nella secrezione di neurotrasmettitori
e nella regolazione della
proliferazione di cellule neuroendocrine
(vedi per es. Sher et al.,
1991). Cito qui questo pezzo del
nostro lavoro solo per indicare
quanto bella e complessa sia la
ricerca e come da un argomento
altri ne sorgano altrettanto complessi
ed interessanti.
I recettori nicotinici neuronali
Il passo dai NAChR di tipo muscolare
a quelli presenti nel sistema
nervoso centrale era da farsi,
ma non era ovvio né semplice. La
farmacologia e la fisiologia avevano
stabilito che NAChR fossero
presenti nei gangli simpatici periferici,
ma i dati sulla loro presenza
nel cervello erano molto
scarsi e la loro funzione considerata
quasi irrilevante. Il campo si
cominciò ad aprire quando si iniziarono
a clonare i primi recettori
nicotinici e ci si accorse che i geni
isolati erano molto più numerosi
di quelli supposti dalle ricerche
sul muscolo (vedi Fig 1) e soprattutto
che essi erano espressi nel
sistema nervoso. I nostri contributi
su questo punto sono stati
rilevanti così da poterci inserire
in questo capitolo sin dall’inizio
con una certa stima da parte dei
nicotinologi.
Ci siamo posti alcune domande
alle quali abbiamo cercato di
dare risposta e che riporto qui per
punti, senza seguire una sequenza
temporale anche se nella realtà
della ricerca spesso gli studi erano
sovrapposti e anzi una risposta
ad un punto sollecitava nuove
prospettive per un altro. Questi
lavori non sarebbero stati possibili
senza la preziosa collaborazione
del gruppo di Zoli di Modena e di
molti altri laboratori nazionali ed
internazionali.
Qual’è la struttura degli
NAChR neuronali?
Era noto dalle ricerche sulla
placca neuromuscolare che i recettori
sono pentameri formati da
diverse subunità, ma quelli neuronali
erano uguali ai muscolari?
Abbiamo iniziato studiando gli
NAChR in cellule di neuroblastoma
e di gangli simpatici (Gotti et
al., 1986; Sher et al., 1988; Gotti
et al., 1995) caratterizzandoli
farmacologicamente e biochimicamente
attraverso il legame
con diverse tossine di serpente ed
abbiamo prefigurato la loro differenziazione
in recettori omomerici,
formati da subunità omologhe,
che legano la α-bungarotossina,
e gli eteromerici formati da
subunità eterologhe, sia di tipo α
che β (Gotti et al., 1985; Gotti et
al., 1991). Il nostro primo importante
contributo è stato quello di
purificare e isolare dal cervello il
recettore che lega la α-bungarotossina
e di ricostituirlo funzionante
in vitro (Gotti et al., 1991),
dimostrando così che la molecola
che legava la tossina era un vero
recettore-canale. Questa ricerca
sui recettori omomerici è poi
proseguita negli anni successivi
soprattutto sul cervello del pollo
dove abbiamo dimostrato che i
recettori per la α-bungarotossina
sono eterogenei strutturalmente
e funzionalmente, costituiti da
cinque subunità α7, o da 5 subunità
α8, o eteropentameri formati
da subunità α7 e α8 (Gotti et al.,
1992; Gotti et al., 1994b; Gotti et
al., 1994a). Gli studi di biologia
molecolare avevano individuato
l’esistenza di mumerose subunità
nicotiniche e attraverso studi di
in situ hybridisation si era visto
che gli mRNA di molte di esse (9α
e 3β) erano presenti nel sistema
nervoso. Purtroppo non si avevano
strumenti per l’identificazione
Quaderni della SIF (2013) vol. 34 - 23

proteica delle subunità in quanto
non erano disponibili ligandi specifici
per i possibili diversi tipi di
recettori se non la α-bungarotossina
per i recettori contenenti le
subunità α7 e α8. Cecilia Gotti,
assieme a Renato Longhi e Milena
Moretti, con molta pazienza e determinazione
è riuscita a produrre
degli anticorpi verso sequenze
aminoacidiche caratteristiche
delle diverse subunità che si sono
dimostrati specifici e selettivi per
le diverse subunità. Si sono così
avuti a disposizione una batteria di
anticorpi che riconoscono tutte le
subunità recettoriali presenti nelle
varie specie compreso l’uomo.
Questo ci ha permesso di isolare
dalle varie aree cerebrali i diversi
sottotipi recettoriali, attraverso
tecniche di immunoprecipitazioe
e colonne di immunocromatografia,
e di costruire una mappa precisa
dei diversi sottotipi nicotinici
presenti nel cervello con la loro
costituzione in subunità, negli
animali (Fig 1) e nell’uomo. Questi
studi indicano che i sottotipi
recettoriali nicotinici sono molti,
anche se in numero molto minore
di quelle teoricamente possibili,
e che solo alcune delle possibili
associazioni tra subunità sono di
fatto espresse, distribuite discretamente
nelle varie aree cerebrali
e nei diversi tipi di neuroni (vedi
per una descrizione accurata Gotti
and Clementi, 2004; Gotti et al.,
2006a; Gotti et al., 2007). Questo
approccio, assieme agli animali
mancanti (KO) delle varie subunità,
si è dimostrato essenziale per
individuare le differenti vie nicotinergiche
neuronali, il ruolo funzionale
e la specificità farmacologica
dei vari sottotipi di recettori.
Perché questa sovrabbondanza
di sottotipi recettoriali?
24 - Quaderni della SIF (2013) vol. 34
Questa domanda è stata ampiamente
studiata da quasi tutti
i laboratori nicotinologici (Vedi
(Gotti and Clementi, 2004). La
varietà della composizione in subunità
si riflette: A) nelle proprietà
biofisiche del canale (per es. i
recettori α7 sono più permeabili
al Ca 2+ che non gli eteromerici
α4β2, i recettori α4β2 desentizzano
meno dei corrispondenti
α4β4; la subunità α5 conferisce
ai recettori α3β4 una maggior
permeabilità al Ca 2+ ); B) in una
farmacologia diversa, per es. il
sito di legame per il neurotrasmettitore
è leggermente diverso
se le interfacce che lo compongono
appartengono a due subunità
differenti (l’esempio più classico
è che la α-bungarotossina si
lega solo alle interfaccie α7-α7,
α8-α8, α7-α8 o a quelle α1-γ e
α1-δ), ma la differenza di specificità
verso i ligandi è forse troppo
piccola tra i vari recettori eteromerici
neuronali per poter esser
sfruttata da un punto di vista farmacologico;
C) la localizzazione
cellulare che sembra essere influenzata
da particolari subunità
accessorie. Noi ci siamo concentrati
in particolare nel capire quali
caratteristiche porti al recettore
la presenza di subunità α6. Prima
di tutto abbiamo dimostrato, per
primi, che questa subunità faceva
parte di un canale nicotinico che
abbiamo anche ricostituito funzionalmente
in membrane lipidiche
in vitro (Vailati et al., 1999).
Abbiamo osservato che recettori
contenenti questa subunità erano
presenti soprattutto nello striato,
nella via dopaminergica connessa
con “il piacere”, sia nel corpo cellulare
dei neuroni dopaminergici
dell’Area Ventrale Tegmentale sia
nelle loro terminazioni nel Nucleo
Accumbens e infine abbiamo
stabilito che i recettori α6 sono
responsabili della liberazione di
dopamina nell’Accumbens e nello
striato (Zoli et al., 2002; Champtiaux
et al., 2003; Gotti et al.,
2010). Tutti questi dati mettono il
sottotipo α6 in posizione strategica
per quanto riguarda il problema
della dipendenza e assuefazione
alla nicotina, e più in generale
da tutte le droghe che agiscono
attraverso una liberazione di dopamina.
È evidente come questa
osservazione contenga un forte
potenziale farmacoterapeutico se
si potessero avere farmaci selettivi
per questo sottotipo di recettori.
Attualmente il gruppo di Cecilia
Gotti sta lavorando intensamente
per stabilire la presenza ed il ruolo
funzionale di altri sottotipi nicotinici
neuronali, meno espressi
da un punto di vista quantitativo,
ma molto importanti in alcune
aree particolari del SNC (Gotti et
al., 2009).
A cosa servono
le subunità accessorie?
Accenno solo brevemente al
ruolo delle così dette subunità
accessorie, quelle cioè che non
sono capaci di contribuire al sito
di legame ma che intervengono
nella formazione del canale, per
il momento sono le subunità β3 e
α5. Abbiamo dimostrato che β3 è
associato prevalentemente con la
subunità α6 e che la presenza di
β3 è importante per la formazione
e localizzazione dei recettori α6
nei diversi domini del neurone;
infatti in topi KO per β3 i nicotinici
α6 sono presenti in numero
molto minore e sono meno trasportati
nei terminali (Gotti et al.,
2005). Per quanto riguarda α5, è
noto che la presenza di questa subunità
cambia le proprietà funzionali
dei nicotinici eteromerici che
la contengono, inoltre studi in
topi KO per questa subunità hanno
dimostrato che i recettori α5
sono responsabili delle proprietà
aversive della nicotina e quindi
responsabili della dipendenza da
fumo di sigaretta (Picciotto and
Kenny, 2013). Inoltre una serie
di studi di linkage genetici hanno
recentemente dimostrato che
una mutazione nella subunità
α5, che determina una ridotta
funzionalità del recettore che la
contiene, correla positivamente
con lo sviluppo della dipendenza
da tabacco e lo sviluppo di tumori

polmonari (Improgo et al., 2010).
Attualmente stiamo studiando il
ruolo di questa subunità mutata
nel determinare il traffico intracellulare
dei recettori e se questo
possa influenzare la proliferazione
cellulare.
Il traffico intracellulare dei
recettori nicotinici, nuovo
bersaglio farmacologico
I recettori nicotinici sono molecole
complesse, localizzati nella
membrana plasmatica. La loro
concentrazione alla superficie
cellulare dipende da un equilibrio
tra quanti recettori vengono
inseriti e quanti ne vengono
rimossi attraverso l’endocitosi. Il
recettore raggiunge la membrana
plasmatica attraverso molte tappe
sequenziali che comprendono la
sintesi a livello dei ribosomi nel
reticolo endoplasmatico, il controllo
di qualità, l’uscita dal reticolo
ed infine il passaggio alla
membrana plasmatica attraverso
il Golgi. Tutte queste tappe sono
o possono essere influenzate da
farmaci (Gaimarri et al., 2007). La
nicotina e molti farmaci nicotinici
aumentano il numero di recettori
alla superficie e si pensa che
questo sia il meccanismo cellulare
responsabile della dipendenza.
Noi abbiamo contribuito a stabilire
che il processo di up-regulation
dipende soprattutto da un aumento
del traffico intracellulare
dei recettori. Abbiamo osservato
che questo effetto è caratteristico
dei farmaci nicotinici che passano
all’interno della cellula, non
dipende da segnali recettoriali di
membrana, ma è prodotto dal legame
sui siti ortosterici dei recettori
che si stanno sintetizzando
nel reticolo (Riganti et al., 2005;
Gaimarri et al., 2007; Mazzo et
al., 2012 ) e abbiamo ipotizzato
che il legame della nicotina produca
una maggior stabilizzazione
dei recettori, una uscita dal reticolo
più efficiente e favorisca una
stechiometria particolare delle
subunità.
Come viene regolata
l’espressione dei recettori?
Le subunità che formano gli NA-
ChR sono espresse in modo specifico
nelle diverse cellule in modo
da poter formare nei momenti
adatti e nei siti opportuni sottotipi
recettoriali cellula-specifici.
Questo aspetto è stato investigato
soprattutto da Diego Fornasari e
Roberta Benfante con Elena Battaglioli,
Francesca Cargnin, Bice
Chini, Simona Di Lascio, Adriano
Flora, N. Hukovich e Paola Tarroni.
Essi, per primi, clonarono le
subunità α3, α7 e α5 umane e ne
hanno descritto la distribuzione
nell’organismo (Fornasari et al.,
1990; Chini et al., 1992; Raimondi
et al., 1992) dove il dato più interessante,
confermato anche da altri
e per il quale non si ha ancora
spiegazione, fu il trovare una distribuzione
di α5 molto ampia nel
cervello ma anche in altri tessuti.
Il passo successivo è stato quello
di studiare i promotori dei geni
nicotinici e i fattori che li regolano.
Essi hanno così identificato
i promotori di α3 (Flora et al.,
2000; Terzano et al., 2000) e di α5
(Flora et al., 2000) identificando
le regioni per il controllo positivo
e negativo dell’espressione e hanno
potuto chiarire i motivi molecolari
per i quali i geni nicotinici
possono essere espressi in modo
differenziato tra le cellule neuronali
e nelle cellule non neuronali,
per es. nelle cellule immuno-competenti
(Battaglioli et al., 1998).
Successivamente essi hanno dimostrato
che il fattore di trascrizione
PHOX2A, fattore dal quale
dipende in gran parte lo sviluppo
del sistema autonomo periferico,
regola anche l’espressione di α3
nei gangli simpatici (Benfante et
al., 2007). Con un ulteriore passo,
analizzando i promotori di questi
fattori di trascrizione, essi hanno
definito che il gene PHOX2A
è regolato da da PHOX2B la cui
regolazione è a sua volta modulata
dalla proteina morfogenetica
dell’osso ma, più importante, anche
dallo stesso PHOX2B. Questi
studi sono alla base per spiegare
la dinamica dell’espressione degli
NAChR nello sviluppo e in modo
differenziato nelle diverse cellule.
Ultimamente il gruppo ha ripreso
gli studi sul controllo dell’immunità
e della infiammazione da parte
degli NAChR identificando nella
forma duplicata di α7 presente
nelle cellule immunocompetenti
una nuova intrigante proteina
coinvolta in questi processi (Benfante
et al., 2011).
Farmaci selettivi per
i recettori nicotinici
Fin’ora sembra che il nostro lavoro
sia stato portato avanti in un
laboratorio di biologia cellulare
con poca sensibilità farmacologica!
In realtà non è mai stato così.
L’attenzione ai farmaci è sempre
stata presente, anzi, in taluni
casi era il movente delle nostre
ricerche per meglio individuare
bersagli innovativi. Il grande
problema farmacoterapeutico in
relazione ai recettori nicotinici
è che non abbiamo farmaci, agonisti
ed antagonisti, specifici per
i diversi sottotipi recettoriali; al
massimo si possono avere farmaci
con prevalente attività in vitro
verso un gruppo di recettori, per
esempio neuronali versus muscolari,
omomerici versus eteromerici,
oppure farmaci più selettivi
ma di difficile uso come le tossine
animali (Gotti et al., 2000; Gotti
et al., 2006b). Per cercare farmaci
sottotipo specifici noi eravamo in
una posizione di forza avendo la
capacità di isolare i diversi sottotipi
recettoriali purificati e quindi
di testare, prima in vitro e poi
in vivo, la selettività, l’efficacia
e gli effetti comportamentali dei
farmaci in esame. Questo gruppo
di ricerche è stato ed è il frutto
di una collaborazione molto positiva
soprattutto con Sparatore
Quaderni della SIF (2013) vol. 34 - 25

di Genova e con i chimici farmaceutici
di Milano, De Amici, Della
Noce, De Micheli, Pallavicini
e Villa, per la parte chimica, con
Fucile di Roma per le analisi in
recettori espressi in sistemi eterologhi
e con Sala di Milano per
l’analisi del comportamento. I
primi farmaci sono stati dei derivati
del 4-ossistilbene, vecchio
farmaco studiato da Mantegazza
negli anni Cinquanta con proprietà
ganglioplegiche, che ci
hanno permesso di ottenere dei
composti selettivi per i recettori
α7 (Gotti et al., 1998; Maggi et
al., 1999; Di Angelantonio et al.,
2000), sono poi seguiti i derivati
della citisina (Carbonnelle et al.,
2003; Tasso et al., 2009; Sala et
al., 2013) che ci hanno dato molte
soddisfazioni sia per lo studio di
correlazione tra attività ed azione,
sia per la possibilità di avere
dei farmaci specifici per il sottotipo
α3β4, i derivati dell’epiboxidina
e i derivati spirociclici della
D2-isoxazoline (Dallanoce et al.,
2009; Dallanoce et al., 2011) che
ci hanno dato dei composti selettivi
per α7 e ancora i derivati delle
2-pyrrolidinylmethoxyimine
che ci hanno dato dei composti
selettivi per α4β2 (Pallavicini et
al., 2004; Pallavicini et al., 2006;
Pallavicini et al., 2009). Infine mi
piace ricordare i lavori fatti assieme
ai gruppi di De Amici e Longhi
sulle tossine polipeptidiche
modificate che ci hanno permesso
di sintetizzare un nuovo peptide
specifico per il sottotipo α6β2
(Pucci et al., 2011).
Conclusione 2
Eccoci arrivati alla fine di questo
lungo elenco di ricerche, alcune
solo abbozzate, altre non inserite
per non appesantire troppo
la lista già lunga. Mi sembra che
possa essere un esempio di una
delle tante vie di approccio alla
scienza, affrontata con metodo e
costanza anche senza disdegnare
di visitare i rami collaterali
26 - Quaderni della SIF (2013) vol. 34
di un unico albero. Riviverle per
scrivere questo lavoro riassuntivo
è stato un momento di gioia,
ma soprattutto di gratitudine per
tutte le emozioni e il godimento
che i miei collaboratori mi hanno
dato ogni volta che parlavamo
di scienza, per il loro esempio di
serietà e correttezza, per l’amore
a fare le cose bene, per un dovere
etico ma anche estetico. Li ho
rivisti uno per uno con i loro caratteri,
le loro intuizioni, anche i
loro difetti. Abbiamo fatto un bel
pezzo di strada assieme che credo
sia stato anche per loro assai positivo
e che spesso li ha lanciati su
percorsi diversi assai stimolanti.
La mia speranza è che non abbiano
dimenticato lo spirito di serietà,
libertà ed entusiasmo che ci
ha mosso nel nostro laboratorio
e che possano trasmetterlo anche
ad altri.
BIBLIOGRAFIA
Riporto in bibliografia non tutte le pubblicazioni
inerenti i punti citati ma
solo quelle più generali che permettono
poi di risalire ai dati specifici.
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28 - Quaderni della SIF (2013) vol. 34