HIV-1 - Regione Campania

HIV: Diagnosi e monitoraggio
dell’infezione
CORSO DI FORMAZIONE AIDS PER DIRIGENTI MEDICI –
X ANNUALITA‘ 2012
Napoli, 21 aprile 2012
G. Portella
A.F. Diagnostica Virologica,
D.AS. Patologia Clinica,
A.O.U. Federico II, Napoli

HIV
Update: Dicembre 2007

Introduzione della terapia antiretrovirale altamente
attiva (HAART) nel 1996
Aumento della sopravvivenza media

HIV
• 1981: primi casi osservati,
• 1982: trasmissione
ematica (CDC)
• 1983: HIV, identificato
• 1984:Test anti-HIV
Il primo strumento per il contrasto della
infezione è stato il test per la ricerca degli
Anticorpi anti HIV
Test imprecisi (falsi positivi e lungo periodo
finestra)

ELISA for HIV antibody
Microplate ELISA for HIV antibody: coloured wells
indicate reactivity

FLOW CHART DIAGNOSI
SIEROLOGICA
I test (ELISA)
NEGATIVO
POSITIVO
INDETERMINATO
II test (ELISA)
NEGATIVO
WESTERN BLOT
POSITIVO/INDETERMINATO

Western blot per HIV ab
• Gli Ab contro le envelope
glicoproteine gp120,
gp160 e gp41 sono i più
importanti per la
conferma della diagnosi
• Anti p24 sono di solito
presenti ma talvolta
possono apparire nelle fasi
più tardive
• Possibili risultati dubbi

Evoluzione della diagnostica sierologica
Prima generazione: individuano le IgG anti anti HIV
Seconda generazione: individuano IgG e IGM anti HIV (riduzione periodo finestra)
Terza generazione: individuano le IgG, le IgM e le IgA anti HIV ( ulteriore
riduzione)

Test sierologici di III generazione
50
Anticipo (giorni)
40
30
20
10
0
20,3 26,4 26,4 31
EIA 3rd gen HIV Ag DNA RNA
Strategie di "screening"
La ricerca di anticorpi e Agp24 consente una forte riduzione del periodo
finestra
Busch et al, Transfusion 1995

Test sierologici IV generazione
HIV RNA
(plasma)
Anti-HIV Ab
NAT
HIV p24 Ag
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
12
>30
22
Day post infection
1 st /2 nd Gen Ab
3 rd Gen Ab
17
4 th Gen Ag/Ab
“L’uso test di screening sierologici di IV generazione
è raccomandato per identificare precocemente l’infezione da HIV.”
Buttò S et al.. (2010), Ann.Ist.Supr Sanità; Buttò S et al.. (2010), Ann.Ist.Supr Sanità

Test IV generazione /Combo
• Periodo finestra ridotto, di poco
superiore ai test molecolari
• Sviluppati su sistemi diagnostici molto
affidabili, altamente automatizzati e
standardizzati
• Chemioluminescenza – no colorimetria
• La diagnosi accurata e precoce
dell’infezione è il requisito
indispensabile per contenere l’epidemia

Sensibilità in sieroconversione:
comparazione tra test HIV Combo
Analisi di 8 pannelli di sieroconversione, corrispondenti a 98 campioni
Tutti i test di IV generazione identificano i campioni positivi entro
20-25 giorni dal contatto,
nessun test mostra delle performance di molto superiori agli altri

Diagnostica Sierologica HIV
La sfida dei cambiamenti
epidemiologici

Trasmissione
Trasmissione sessuale:
OMO
ETERO
Scambio siringe infette (droga)
Trasmissione Verticale
Trasfusioni

Età mediana alla diagnosi di infezione da HIV
40
38
36
34
Età
32
30
28
26
24
22
20
Maschi
Femmine
1985 1987 1989 1991 1993 1995 1997 1999 2001 2003 2005 2007
Anno di diagnosi

Infezione da HIV nella popolazione generale
Casi per 100.000
45,0
40,0
35,0
30,0
25,0
20,0
15,0
10,0
5,0
0,0
COA; Notiziario ISS 2010
1998
1997
1996
1995
1994
1993
1992
1991
1990
1989
1988
1987
1986
1985
Anno di Diagnosi
2008
2007
2006
2005
2004
2003
2002
2001
2000
1999
Italia*, 1985-2008 (*Piemonte, Liguria, Friuli Venezia-Giulia, Veneto,
Lazio, Puglia, Bolzano, Emilia Romagna, Trento, Marche, Valle d’Aosta,
Sassari e Catania)

Nuove diagnosi di infezione da HIV
6,
3
6,5
4,
1
4,
0
6,
3
4,0
8,4
6,7
4,6
3,3
5,5
3,3
Italia, 2010
Incidenza Nazionale:
5,5/100,000 residenti
1,5
8,3
4,0
0,9
2,4
2,4
3,3
3,8
2,4
COA; Notiziario ISS 2010

Numero stimato di soggetti HIV+ viventi
in Italia nel 2007:
~150.000
Quanti sanno di essere HIV+
1/4 dei soggetti HIV+ in Italia
non sa di essere infetto e la
diagnosi è tardiva

Stima della trasmissione sessuale di HIV
da persone consapevoli o meno della loro
sieropositività
Le persone che ricevono una diagnosi di infezione
da HIV sono meno propense a pratiche sessuali a
rischio rispetto alle persone non consapevoli (Marks
G, et al. JAIDS 2005;39:446-53)
Il tasso di trasmissione del virus da persone che
non sanno di essere sieropositive è 3,5 volte
superiore rispetto a quello delle persone
consapevoli (Marks G, et al. AIDS 2006;20:1447-50)

Test HIV–IV Generazione Combo
• L’efficienza di trasmissione è 3.5 volte
maggiore tra i non consapevoli
• La disponibilità dei sistemi di IV
generazione potrebbe consentire un più
largo impiego dei test
• Modalità da individuare
• Non sufficienti per una adeguata
sorveglianza

Sistemi di sorveglianza per HIV/AIDS
Infezione
(sieroconversione)
1° test
anti-HIV+
AIDS
Quanto tempo
Tempo dall’infezione
Sorveglianza HIV
Sorveglianza AIDS

Antibody affinity: the strength of a
single antigen–antibody bond
high-affinity – high
attraction
Good fit
low-affinity – low
attraction
Poor fit
Antibody avidity: the strength with which a multivalent
antibody binds a multivalent antigen

HIV avidity: andamento in 103 soggetti
M. Sweeting et al, Stat Med 2010; 29: 3194-3202

L’indice di avidità anti-HIV
Siero HIV+
Pre-analytic dilution
+ guanidina
(rompe i legami
deboli Ag-Ab)
+ PBS
(nessun effetto
su leg. Ag-Ab)
Il test è automatizzato, semplice, economico e riproducibile
AI basso = infezione
recente (6 mesi)
Suligoi et al., JCM 2002

Applicazione dei test sierologici per l’identificazione
delle infezioni recenti da HIV, Europa
Country
Reference
Serological
assay
No. of HIVpositive
serum
samples tested
Proportion of
recent HIV
infections (%)
Germany
Bätzing-Feigenbaum
2009
BED-CEIA 114 50.9%
Switzerland Daneel 2008 BED-CEIA 532 37.0%
Austria Puchhammer-Stöckl 2005 Avidity Index 205 27.3%
Portugal Cortes Martins 2008 Avidity Index 332 17.8%
Italy
Raimondo 2010;
Regine 2010
Avidity Index 432 26.2%
France Semaille 2008 EIA-RI 10,855 23.1%
UK Fisher 2007 Detuned EIA 715 31.8%
Spain Romero 2009 Detuned EIA 3,444 19.2%

HIV avidity: indicazioni ISS
L. Camoni et al, Not Ist Sup Sanità 2009; 22 (5): 11-15

Diagnostica sierologica:
conclusioni
• Sufficientemente precisa ed affidabile
• Nuove modalità di indagine della
popolazione
• Impatto economico da valutare

Infezione da HIV
La variabilità genetica del
virus ed il suo impatto sulla
diagnostica

HIV 1 & HIV 2
I due virus hanno una omologia di circa il 60% nelle regioni
conservate.

HIV 1 & 2: origine
HIV è entrato nella popolazione
umana dai primati da 30 a 100
anni fa, epoca in cui in regioni
dell’Africa sub-sahariana, si sono
differenziati HIV-1
da
SIV cpz
(scimmia Pan troglodytes troglodytes)
e HIV-2 da SIV sm
(Sooty mangabeys)

HIV 1 & 2: origine

HIV-1: groups and subtypes
I tre gruppi originano probabilmente da tre distinti eventi di passaggio
interspecie dai primati non umani agli umani

Distribuzione globale delle
varianti di HIV-1/M
IAVI Report (2003)

Subtype A
Generation of recombinant forms
Subtype B
Integration Transcription
Recombinant
Translation Assembly

Variabilità genetica HIV
• Patogenicità e progressione della malattia
• Modalità di trasmissione
• Diagnosi e monitoraggio
– Sierologia e test molecolari
• Vaccini
• Trattamento
– drug resistance

Prevalenza delle infezioni HIV-1 non-B
Italia, 1980-2008
2479 pazienti con data di diagnosi nota, 50 centri clinici, 13 regioni italiane
% of subtype B and non-B infections
Total number of HIV-1 diagnoses
• 52% nuove diagnosi
• 2,6% infezioni HIV-1 non-B
• 48% nuove diagnosi
• 18,9% infezioni HIV-1 non-B
Lai A et al; (2010), HIV Medicine
Subtype B
Subtype non-B

Diffusione di sottotipi HIV-1 non-B e CRFs
Italia, 2002-2005
EUROPEI:
40% infezioni non-B
75% è infetto da F1
Infezioni non-B:
51.6%: un sottotipo puro
38.3%: CRF
8.35: URF
AFRICANI:
51.6% infezioni non-B
58% è infetto da CRF02_AG
Riva C. et al. (2010), AIDS Res Hum Retrov

Effetti della diversità virale
•La diversità genetica di HIV ha
un potenziale impatto su:
• Screening del sangue/emoderivati
• Diagnosi sierologica
• Monitoraggio terapeutico
Viral load e genotipizzazione

TTI dovuta a mutazioni virali
multiple
• Paziente sottoposto ad intervento chirurgico (M, 63 anni)
• Diventa HIV+ 10 gg dopo l’intervento
• Indagine sulla donazione fonte di infezione: risulta
ripetutamente NAT negativa in minipool
• La NAT su donazione individuale mostra una VL molto bassa
• 3 mutazioni in regione “target” del test commerciale
“.....Questo caso dimostra che nei paesi a bassa prevalenza di
HIV-1 il rischio di trasmissione causato dalle mutazioni può essere
equivalente al rischio della donazione in fase finestra...”
M. Schmidt et al, (2009), Transfusion

Italia: sieroconversione anti-HIV
• Donatore abituale (M, 46 anni; 39 donazioni)
• NAT negativo, WB positivo
• “Viral load” molto bassa
pos/HIV RNA neg
• 5 mutazione in residui “target” del test commerciale
• Sequenziamento: ricombinante tra CRF12-BF e sottotipo B
• Analisi retrospettiva su pazienti con risultati discordanti: 3,5% di casi con
mutazioni
“...L’insorgenza di varianti virali può impattare, sulla sicurezza del sangue, sulla
corretta diagnosi e cura del paziente...
...Si auspica lo sviluppo ed il mantenimento di programmi di sorveglianza
finalizzati alla rilevazione della varianti di HIV. ”
B. Foglieni et al, (2010), Transfusion

HIV-1 p24 di isolati virali diversi: sensibilità a
confronto
TD Ly et al (2011), ESCV, Madeira

Variabilità genetica
• La variabilità del virus HIV
rappresenta una sfida continua:
•è essenziale la disponibilità di test
diagnostici in grado di identificate
accuratamente tutti i tipi virali

Viral load: marcatore
prognostico
La quantizzazione del numero di copie
virali (carica virale) è indispensabile:
• per la scelta e monitoraggio
terapeutico
• per valutare la progressione della
patologia

Virologic setpoint

Viral load come fattore
prognostico
10 6
10 5
10 4
10 3
62%
49%
26%
8%
AIDS
Stabilizzazione (set point)
3-6 mesi

Replicazione virale e HAART
Persaud D. Journal of Virology 2003 ,77:1659–1665

Metodiche molecolari: PCR

HIV RNA: Real Time PCR
Riproducibilità

Metodiche Real Time: confronto

Correlazione – HIV-1 RNA
7,00
Abbott RealTime (log copie/mL)
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
N= 42
y = 0.9065x + 0.1597
r = 0.9705
0,00
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
Roche CAP/CTM (log copie/mL)

Carica Virale: Blips
• Episodi intermittenti di bassi livelli di carica virale,
identificabili, proceduti e seguiti da livelli non
detectabili senza variazioni della terapia.
Lee et al., 2006

Viral Load Quantification: Causes of
Blips
Blips causes
Artefactual measurements
True viremia due to viral replication
Random
variations around
sensitivity limit
Improper
processing of
specimens by
laboratories
Non-adherence
1 st Towards
development of
resistance
Virus release from latent reservoir

Conclusioni
• L’evoluzione diagnostica consente una
più efficace diagnosi ma i sistemi devono
essere aggiornati per fare fronte alla
variabilità genetica ed alle nuove
esigenze diagnostiche
• Sviluppo di nuove metodiche per la
valutazione della terapia : HIV DNA
quantitativo

GRAZIE PER
L’ATTENZIONE