Fabris Auto-ab anti-cardiolipina e vimentina nella sindrome ... - Simel

Gli anticorpi antifosfolipidi (aPL)
• Gruppo eterogeneo di autoanticorpi specifici per:
– complessi fosfolipide-proteina
– cofattori
– fosfolipidi anionici
• Sono associati alla sindrome da anticorpi aPL (APS):
– trombosi arteriose/venose/microcircolo
– aborti spontanei ricorrenti, perdite fetali
– presenza di anticorpi aPL sierici
• La diagnosi richiede la combinazione di almeno un criterio clinico e un
criterio di laboratorio.
• Pending issues:
– APS sieronegativa
– Nuove specificità e meccanismi Solo meccanismi trombotici e/o ischemici non
riescono a spiegare tutte le manifestazioni (es: neurologiche, complicanze
gravidanza….)

Meccanismo patogenetico I
John G. Hanly CMAJ. 2003 June 24; 168(13): 1675–1682.

Meccanismo patogenetico II
a-β2GPI abs
β2GPI dimers
Endotelial cells
Alard JE et al. J Immunol may 2010

Anticorpi aPL: classificazione
Lupus anticoagulans (LAC)
• Specificità: β2GPI, protrombina,
PL neg, …..
• La loro positività è più specifica
per la sindrome APS agli ACAR.
Anticardiolipina (ACAR)
• Distinti in:
β2GPI-dip legano complessi
PL-β2GPI, sono associati alla
sindrome APS e a neuroLupus.
β2GPI-indip legano solo PL,
privi di significato clinico

Anticorpi aPL: classificazione
Anticorpi anticofattore:
– Predominant target: β2GPI
β2GPI in vitro inibisce l’attivazione della protrombina da parte
dei fattori Xa e Va su una superficie PL e funge da
antiaggregante piastrinico.
– Altri target emergenti:
• protrombina, complessi PT/PS
• annessina V
• proteina C, proteina S
• complessi cardiolipina/vimentina

Background
• Ortona et al. (Blood, oct 2010) hanno analizzato sieri di pazienti con
APS sieronegativa alla ricerca di nuovi autoantigeni (approccio
proteomico utilizzando estratto da membrana citoplasmatica di ECs)
identificando la vimentina (proteina di 57 kDa ubiquitaria presente nei
filamenti intermedi del citoscheletro) come nuovo target di
autoanticorpale nell’APS.
• La vimentina interagisce fortemente con i PL sulla membrana delle
ECs, soprattutto con la CARD.
• L’antigene autoanticorpale specifico di APS è il complesso
VIM/CARD.
• Gli anti-VIM/CARD legando il complesso sulla
superficie delle ECs attivano il pathway IRAK1/NF-kB
innescando una reazione simile agli anticorpi antib2GPI
(via TLR2/TLR4) con probabile up-regolazione
della trascrizione di citochine proinfiammatorie.

Prevalence of antibodies to
vimentin/cardiolipin complex
anti-CARD/VIM IgG
n (%)
IgM
n (%)
SeroNeg-APS 16/29 (55.2) 11/29 (37.9)
APS 37/40 (92.4) 32/40 (80.0)
SLE 13/30 (43.3) 13/30 (43.3)
RA 5/30 (16.6) 5/30 (16.6)
Thrombosis 2/30 (6.6) 0/30 (0)
HBDs 0/32 (0) 0/32 (0)
• Ortona et al. Blood 2010

Scopo del lavoro
• Kit ELISA anti-CARD/VIM IgG/IgM (DiaMetra)
• Analizzare la prevalenza di anti-VIM/CARD nei
pazienti afferenti al nostro laboratorio
– Paz LAC pos con ACAR/aβ2GPI neg con e senza
sindrome APS

Pazienti
• 175 pazienti
– 153F/22M, età 53±15 anni (range 18-88)
I. 89 paz LAC pos/bordeline di cui:
- 19 ACAR/aβ2GPI pos
- 70 ACAR/aβ2GPI neg
II. 68 paz LAC neg e ACAR/aβ2GPI neg
III. 18 paz LAC non valutabile ACAR/aβ2GPI pos/neg

Pazienti
Clinicamente:
– n. 90 LES / UCTD / snd APS (n. 14)
– n. 75 altre connettiviti e vasculiti (AR, SpA, SjS, SSc, MCsn, PMR, etc)
– n. 8 eventi trombotici aterovenosi dndd
– n. 2 riscontro casuale LAC pos
Follow-up
8 pazienti con connettiviti (7 LES, 1 Sjögren’s syndrome): dosaggi ripetuti nel follow-up
73 controlli (donatori)
• 23F/46M, età 37±13 anni (range 18-65)

Materiale e Metodi
• Test ELISA per anti-CARD/VIM IgG (su 175 paz) e IgM (su 129 paz)
“preliminari” sviluppati da DiaMetra
• Substrato: complesso card/vim
• Non avendo una curva di riferimento definitiva abbiamo
considerato i valori di OD
• Specificità e Sensibilità da determinare
• Precisione:
– Inter assay variability 9.6±6.0%
• Statistics
– Mann-Whitney Unpaired U-test

Cut-off sulla popolazione di
• IgG a-CARD/VIM
controllo
– ABS media 0.152±0.109
– 95° perc 0.280
– Pos (abs>0.280) 4/73, 5.5%: specificità 94.5%
• IgM a-CARD/VIM
– ABS media 0.200±0.151
– 95° perc 0.511
– Pos (abs>0.511) 3/73, 4.1%: specificità: 95.9%

I. LAC pos/borderline: Paz vs HBDs
• Anti-CARD/VIM IgG
– Pos TOT 6/89, 6.7% di cui:
• 5/70, 7.1% tra i paz
ACAR/B2GPI neg
• 1/19, 5.3% tra i paz
ACAR/B2GPI pos
• Anti-CARD/VIM IgM
– Pos TOT 14/82, 17.1% di cui:
• 11/64, 17.2% tra i paz
ACAR/B2GPI neg
• 3/18, 16.7% tra i paz
ACAR/B2GPI pos
p= ns **p= 0.0028

I. LAC pos/borderline:
LES/UCTD vs altre patologie
• Anti-CARD/VIM IgG
– LES/UCTD/APS 3/54, 5.6% vs
Altre patologie 3/35, 8.6%
• Anti-CARD/VIM IgM
– LES/UCTD/APS 12/53, 22.6%
– Altre patologie 2/29, 6.9%
p=ns
*p=0.028

Aspecificità anti-CARD/VIM IgG
3 PAZIENTI LAC pos
Casi anti-CARD/VIM pos con altre
patologie
IgG
aCARD/VIM
IgM
aCARD/VIM
1
aPTT allungato con ACAR/B2GPI
elevati, risc. casuale
POS
POS
2
Tumore polmone e TVP, ACAR/B2GPI
neg
POS
NEG
3 Epatocarcinoma, ACAR/B2GPI neg POS NEG
Anti-CARD/VIM IgG legati a eventi tromboembolici in corso di tumore

II. LAC neg / ACAR/β2GPI
neg: paz vs HBDs
• Anti-CARD/VIM IgG
– Pos TOT 2/68, 2.9% di cui:
• 1 paz Sjogren con cryo
ACAR/β2GPI neg
• 1 paz con AR e snd
mielodisplastica politrasfusa
– 30 LES/UCTD/APS nessun pos
• Anti-CARD/VIM IgM
– Pos TOT 5/29, 17.2% di cui:
– 5/25, 20.% tra i paz con LES/UCTD
Paz con APS
sieronegativa
p=ns

III. LAC non valutabile: paz vs HBDs
LAC non valutabile per TAO o non eseguito per fase acuta
12 paz con connettiviti e vasculiti (AR, Sjögren’s snd, Bechêt,
sindrome crioglobulinemica, SpA, PMR, SSc)
6 paz con LES
• Anti-CARD/VIM IgG
– Pos TOT 0/18, 0%
• Anti-CARD/VIM IgM
– Pos TOT 1/18, 5.6%
• 1 paz con scleroLES
ACAR IgM debolmente
pos (16 UI/ml)

Follow-up
• 8 paz (7 LES, 1 SjS)
• Valutazione 6.9±1.5 mesi dopo
PAZ delta time ACAR IgG ACAR IgM B2GPI IgG B2GPI IgM LAC note anti-VIM/CARD IgG anti-Card-Vim IgM
mesi abs pos (>0.280) abs (pos>0.511)
BL67 0 3 1 0 0 NEG Sjs con MCsnd 0,564 0,349
5+ NEG 0,507 0,199
CS82 0 1 1 0 0 borderline LES atrocutaneo 0,133 1,462
6+ 3 1 0 0 POS 0,124 1,55
CS61 0 15 >80 14 100 POS LES ematologico con snd aPL 0,166 0,704
9+ 13 76 11 70 POS 0,27 0,476
FS81 0 1 2 POS LES severo ematologico in RTX 0,324 0,27
7+ 4 1 0 0 POS 0,286 0,149
FA76 0 2 4 0 1 POS UCTD in gravidanza, Cooms diretto pos 0,056 0,17
6+ 2 3 0 1 POS 0,135 0,182
SF77 0 2 1 0 0 POS LES ematologico, snd aPL con ischemie cerebrali 0,032 0,048
6+ 1 1 0 0 ND (TAO) 0,037 nd
SA75 0 16 30 11 26 POS LES artrocutaneo con snd aPL 0,11 0,24
7+ 14 18 5 16 POS 0,071 0,162
VS65 0 12 11 15 7 borderline/NEG LES severo in RTX 0,183 0,801
9+ 18 63 14 65 POS 0,268 0,716

Summary and conclusion
• Dati preliminari
Confronto con Ortona et al. Blood 2010
• Test IgG anti-CARD/VIM
– non significativo, aspecifico
• da ottimizzare o IgG non specifiche
• Sindrome paraneoplastica
• Test IgM anti-CARD/VIM
– specifico
• La % di positività è significativa solo in
LES/UCTD/APS (21% vs 4.4%)
– ma poco sensibile (solo 17.1% di pos
nei LAC pos)
– identifica 22% circa di casi LAC
pos/borberline con ACAR/B2GPI neg
in paz LES/UCTD/APS
– sensibile alla iniziale positivizzazione
LAC
– identifica 20% di LES/UCTD con
presunta APS sieronegativa

Ringraziamenti
• Laboratorio di Immunopatologia
e Allergologia
– Tonutti Elio
– Visentini Daniela
– Molinaro Patrizia
– Blasone Nadia
– Peresan Jessica
• Laboratorio Emostasi
– Giacomello Roberta
– D’Aurizio Federica
• DiaMetra
– Giuliani Ferdinando
– Tarpanelli Tiziano