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Appunti di Principi-BiolMol CTF - Omero

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Polimorfismo: la presenza di due o più forme

alleliche in una specie; ovvero la presenza di alleli che

mostrano variazioni in una data posizione.


• Polimorfismi della lunghezza dei frammenti di

restrizione (RFLP): i primi marcatori genetici

utilizzati.

• Il marcatore genetico

è la lunghezza dei

frammenti di

restrizione che

contengono al loro

interno una particolare

sequenza.


Altri marcatori genetici:

Ripetizioni in tanden in numero variabile (VNTR) o

minisatelliti contengono regioni lunghe 10 ÷ 100 bp,

ripetute in numero variabile di volte: stessa sequenza,

differente numero di ripetizioni. In ogni individuo,

VNTR basate sullo stesso motivo ripetuto possono

comparire soltanto una volta o più volte nel genoma,

con differente lunghezze su differenti cromosomi.

La distribuzione delle lunghezze delle ripetizioni è il

marcatore.

Alec Jeffrey sviluppò il “DNA finger-printing” basato

sui minisatelliti.


DNA finger-printing


Polimorfismi di brevi ripetizioni in tandem (STRP) o

microsatelliti: sono regioni lunghe soltanto 2 ÷ 5 bp, ma

ripetute molte volte, tipicamente 10 ÷ 30 copie consecutive.

Come marcatori, gli STRP hanno sulle VNTR parecchi

vantaggi, uno dei quali è la distribuzione più uniforme nel

genoma umano.

Rilevazione mediante amplificazione con la PCR seguita

dal sequenziamento dell’amplicone.

Il “profiling” del DNA basato sugli STRP ha rimpiazzato il

“DNA finger-printing”.


Questi marcatori genetici non sono comunemente

localizzati entro geni codificanti per proteine, ma ci

sono alcune eccezioni, come le ripetizioni CAG nel

gene per la corea di Huntington ed alcuni altri geni

patologici.

Applicazioni mediche dei marcatori genetici:

a. nella tipizzazione per identificare i donatori

compatibili per trapianti;

b. nell’ identificazione della suscettibilità ad una

malattia;

c. nella previsione della variabilità individuale nella

risposta ai farmaci (farmacogenomica).


Polimorfismo a singolo nucleotide (SNP): un

polimorfismo provocato dal cambiamento di un

singolo nucleotide e responsabile della maggior parte

della variazione genetica tra individui.

Tutte le persone, eccetto i fratelli o le sorelle identici,

hanno sequenze di DNA esclusive. Le differenze

complessive tra le sequenze genomiche di individui

non imparentati corrispondono a circa 0,1%. Molte

delle differenze tra individui hanno la forma di SNP.

Esistono anche molte corte delezioni.


Ciascuno di noi ha un insieme accumulato di SNP che

rispecchia mutazioni avvenute nei nostri progenitori.

Alcuni gruppi di SNP vengono coereditati come

blocchi, mentre altri no. Le mutazioni in differenti

molecole di DNA di cromosomi diploidi si separano

entro una singola generazione, per assortimento. Le

mutazioni sullo stesso cromosoma si separano più

lentamente, per ricombinazione.

Le mutazioni nella stessa molecola di DNA nei

cromosomi diploidi si dissocieranno per effetto di

eventi di ricombinazione che avvengono tra i loro loci.

Maggiore è la distanza tra due siti, maggiore è la

frequenza di ricombinazione.


Gli aplotipi sono combinazioni locali di polimorfismi

genetici che tendono ad essere coereditati.

Combinazioni discrete di SNP nelle regioni povere di

ricombinazione definiscono l’aplotipo o “genotipo

aploide” di un individuo.

Gli aplotipi permettono una caratterizzazione molto

economica di interi genomi. Semplificano la ricerca

dei geni responsabili di malattie o di altre correlazioni

fenotipo-genotipo.


Nel genoma umano, le proteine del MHC, noto nella

specie umana come sistema HLA(Human Leucocyte

Antigen), sono codificate in una regione di 4 Mb sul

cromosoma 6p21.31.

Il sitema è altamente polimorfico con 50 ÷ 150 alleli per

ogni locus.

La serie delle proteine MHC espresse definisce un

aplotipo parziale di un individuo. Rispetto ad altri blocchi

aplotipici, la regione MHC presenta una variabilità

individuale insolitamente ampia.


Le regione MHC contiene oltre 120 geni espressi che

codificano per proteine che:

• forniscono il meccanismo con cui il sistema

immunitario distingue le molecole “self” dalle

molecole “non-self”;

• determinano i profili individuali di competenza per la

resistenza alle malattie;

• sono utili marcatori per la determinazione delle

affinità tra popolazioni umane ed animali e per la

ricostruzione delle migrazioni su grande scala delle

popolazioni e delle interazioni tra queste.


Gli aplotipi MHC controllano la compatibilità

donatore-ricevente nei trapianti;

Gli aplotipi MHC influenzano la suscettibilità allo

sviluppo di patologie autoimmuni;

Gli aplotipi MHC determinano i “pattern” di resistenza

alla malattia;

Gli aplotipi MHC influenzano la scelta del partner

sessuale, attraverso l’associazione tra l’aplotipo MHC e

l’odore corporeo.


Delezioni e duplicazioni di segmenti cromosomici

(CNVs) sono i maggiori responsabili della variazione

tra gli individui e sono un fattore fondamentale

nell’evoluzione umana ed in molte malattie, come le

malattie mentali, i disordini dello sviluppo e le

neoplasie. I CNVs si formano ad una più alta velocità

di altri tipi di mutazioni e ciò avviene con meccanismi

simili sia nei batteri, nei lieviti che negli esseri umani.


Alcuni esempi che mostrano come la variabilità del numero

di copie di geni specifici può offrire un vantaggio selettivo:

• Il gene dell’amilasi salivare, AMY1, mostra variazione del

numero di copie nelle popolazioni umane e la quantità di

amilasi salivare è direttamente proporzionale al numero di

copie del gene AMY1. Il numero medio di copie di AMY1 è

più alto nelle culture che consumano un alto livello di

amido rispetto a quelle che ne consumano poco.

• Esiste una correlazione tra il il numero di copie del gene

della chemochina CCL3La e la suscettibilità all’HIV/AIDS.

• Tuttavia la maggior parte delle CNVs negli esseri umani

sembra essere non adattativo o svataggioso, ed è presente

perché non è stato ancora epurato. Approssimativamente

il 75% del CNV viene ritrovato con una frequenza di meno

del 3% nelle popolazioni umane, suggerendo un origine

stocastica ed una manutenzione della maggior parte di

queste variazioni.


I polimorfismi genetici ci forniscono la possibilità di

predire le differenze tra individui nella suscettibilità

alle malattie.

I “biomarkers” di suscettibilità includono:

polimorfismi nel metabolismo di farmaci/carcinogeni,

nella capacità di riparare il DNA e nei geni che

controllano la crescita cellulare.


I polimorfismi negli enzimi che metabolizzano

farmaci/carcinogeni sono un determinante importante

nella suscettibilità individuale alle neoplasie ed alle

reazioni avverse ai farmaci. Tali polimorfismi possono

essere dovuti a fattori ereditabili e/o fattori ambientali.

Metabolismo dei farmaci: 1) reazioni di ossidazione

mediate dagli enzimi citocromi P450 nel fegato 2)

coniugazioni come glucorinidazione, sulfazione ed

acetilazione.

Uno dei citocromi P450, CYP2D6 è molto importante nel

metabolismo di farmaci usati in clinica con circa il 25-50 %

di questi che vengono metabolizzati da questo enzima.


Il polimorfismo dell’enzima CYP2D6 risulta in

metabolizzatori modesti, intermedi, efficienti ed

ultrarapidi (UM) dei farmaci substrati di questo enzima.

E’ plausibile che il genotipo ultrarapido, dove esiste più di

gene attivo su di un allele, sia il risultato di una selezione

dovuto ad una dieta selettiva in certe popolazioni del nord

est dell’Africa. Il fenotipo UM si ritrova nel 5,5% della

popolazione dell’ovest europeo.

Il polimorfismo di CYP2D6 ha un’influenza significativa

sulla farmacocinetica di circa il 50% dei farmaci in uso

clinico.

Le conseguenze del polimorfismo alle dosi ordinarie dei

farmaci possono essere o reazioni avverse o nessuna

risposta al farmaco.


Polimorfismi nella riparazione del DNA o nel

processamento del DNA danneggiato sono noti da

lungo tempo per quanto riguarda rari disordini

ereditari che coinvolgono difetti della riparazione del

DNA o della stabilità cromosomica.

Circa 130 geni diversi sono coinvolti nella

nell’escissione del DNA o nella riparazione delle basi.

Inoltre, una bassa efficienza nella riparazione del DNA

è stata associata con un’aumentata suscettibilità a

neoplasie della pelle, del cervello, del polmone, dello

stomaco, del seno, della vescica, del collo/testa e del

colon.


Più di 100 geni sono coinvolti come regolatori positivi

(proto-oncogeni) o negativi (geni onco-soppressori)

della crescita cellullare, così come il ciclo cellulare e

l’apoptosi.

Polimorfismi di questi geni che includono p53, p21,

Her/neu, ras, APC, IL-10 e ciclina D1, possono essere

associati allo sviluppo di neoplasie.


Si definisce associazione genetica il caso di due o più

tratti in una popolazione di individui, di cui almeno un

tratto è chiaramente noto essere di origine genetica.

Gli studi di associazione genetica hanno lo scopo di

saggiare se alleli di un singolo locus o frequenze di

genotipi (o più generalmente, frequenze di aplotipi

multilocus) differiscono tra due gruppi di individui

(controlli sani e pazienti).

L’associazione genetica può essere tra fenotipi, tra un

fenotipo ed un polimorfismo genetico, come un SNP, o tra

due polimorfismi genetici. L’associazione tra due

polimorfismi genetici avviene quando non c’è

un’associazione “random” dei loro alleli; ciò risulta dalla

loro prossimità nello stesso cromosoma – linkage

genetico.


Tuttavia il “linkage” può essere incompleto per effetto

del “crossing-over” durante la meiosi. La frequenza del

“crossing-over” non è uguale in tutte le porzioni del

cromosoma (minore in regione pericentromerica). E’

stato stimato che 80% della ricombinazione

genomica avvenga in non più di 25% del genoma

umano.

Quando la distanza tra due loci cromosomici è molto

ridotta, idealmente 0 cM, c’è solo uno stato possibile –

“linkage”- così l’equilibrio è formalmente impossibile.

Perciò, quando il “crossing-over” non avviene mai tra i

loci, sono detti essere nel disequilibrio di “linkage”.


Tipi di approcci per gli studi di associazione:

Studi caso - controllo confronto tra

pazienti e soggetti sani per la frequenza del

genotipo o dell’aplotipo.

Studio di famiglie i genitori dei pazienti

sono usati come controlli.


Malattie causate da una combinazione di multipli

fattori genetici e fattori ambientali.

Numerosi studi di associazione hanno permesso di

identificare i fattori di rischio genetico per alcune

comuni malattie:

• Diabete mellito di tipo I HLA, gene dell’insulina,

gene CTLA4;

• Mallattia di Alzheimer gene dell’APOE;

• Trombosi venosa profonda mutazione del fattore V;

• Morbo di Crohn mutazione di NOD2, variazione

genetica nel cromosoma 5q31.


Nel genoma umano ci sono probabilmente tra 10 ed i

30 milioni di SNPs, circa uno ogni 100 – 300 basi. Di

questi SNP, circa 4 milioni sono SNPs comuni, con

entrambi gli alleli di ogni SNP che ha una frequenza

sopra il 20%.

La presenza di un particolare allele di SNP in un

individuo viene determinata con il saggio

(tipizzazione genetica) di un campione di DNA

genomico.

La coeredidi alleli SNP degli aplotipi produce

associazioni tra tali alleli nella popolazione.


Lo scopo del “Internatinal HapMap Project” è stato quello

di determinare i “patterns” comuni della variazione di

sequenza del DNA nel genoma umano, caratterizzando le

varianti di sequenza, le loro frequenze e le correlazioni tra

esse, in campioni di DNA da popolazioni con antenati da

parti dell’Africa, dell’Asia e dell’Europa.

Lo scopo finale di questo progetto internazionale è quello

di sviluppare uno strumento di ricerca che possa aiutare i

ricercatori a scoprire i fattori genetici che contribuiscono

alla suscettibilità alle malattie, alla protezione contro le

malattie ed alla risposta ai farmaci.


Il “1000 Genomes project”, iniziato nel 2008, è una ricerca

internazionale che ha lo scopo di creare un catalogo molto

dettagliato della variazione genetica umana. Gli scienziati

hanno pianificato di sequenziare i genomi di almeno 1000

partecipanti anonimi di diversi gruppi etnici.

Nel 2010 il progetto ha terminato la fase preliminare,

mentre il sequenziamento di 1092 genomi è stato riportato

in una pubblicazione su Nature dell’ottobre 2012.

Il progetto ha coinvolto numerosi gruppi di ricerca

interdisciplinari in tutto il mondo (Cina, Italia, Giappone,

Kenia, Nigeria, Perù, Gran Bretagna e Stati Uniti).


Cambiamenti nel numero e nell’ordine dei geni crea la diversità genetica

entro le popolazioni e tra le popolazioni.


I genomi di tutti gli individui, eccetto i gemelli monozigoti,

sono unici. Come le impronte digitali , i genomi forniscono

un’identificazione personale unica.

I genomi di ogni persona combina i genomi derivati dai due

genitori. Perciò, i genomi sono anche capaci di indicare le

parentele, in particolare , di identificare la paternità.

Il genoma di ogni persona contiene geni che influenzano,

caratteri riconoscibili, come il colore degli occhi.

A differenza delle impronte digitali i genomi contengono

molte più informazioni su una persona rispetto alla

semplice identificazione. Problemi etici e giuridici.


Le caratteristiche molecolari sono impiegate da 100

anni per identificare le persone e le parentele:

‣ 1) Gruppi sanguigni A, B, AB e O dimostra solo

l’innocenza, non la colpevolezza.

‣ 2)Le sequenze del DNA sono invece in grado di fornire

una prova positiva di colpevolezza o paternità a)

RFLP; b) VNTR (“DNA fingerprinting”, Alec Jeffreys

1984) tuttavia per questa identificazione si

richiedono grandi quantità di DNA non degradato (10

÷ 50 ng di DNA di lunghezza non inferiore a 20000 ÷

25000 bp); c) con lo sviluppo della PCR si sono

amplificate e poi saggiate (sequenziamento del DNA)

corte regioni notoriamente variabili nella popolazione.


L’amplificazione mediante PCR ha portato ad un notevole

miglioramento della sensibilità (basta 1 ng di DNA per

identificare regioni di 100 bp).

‣ Il metodo prevede:

‣ 1) amplificazione mediante PCR di un STR contenente 2

÷ 5 bp, ripetuta tra qualche volta ad una dozzina di volte.

Si producono ampliconi di 200 ÷ 500 bp. I loci usati

comunemente presentano 5 ÷ 20 alleli comuni, e vengono

saggiati 8 ÷ 15 loci.

‣ 2) sequenziamento degli ampliconi.


DNA mitocondriale umano (16569 bp): contiene

una regione ipervariabile di 100 bp, che varia dell’1 ÷

2% tra individui non imparentati (differenze in 8

posizioni). Vantaggi dell’uso del DNA mitocondiale:

molto abbondante e stabile.

Identificazione del genere: identificazione di qualsiasi

sequenza che sia peculiare del cromosoma Y per

dimostrare l’origine maschile. In alternativa, ricerca della

versione corta (cromosoma X; - 6bp) e versione lunga

(cromosoma Y) del gene per l’angiotensina. ♂, due

bande; ♀, una banda.


“Forensic DNA phenotyping” (FDP) è un campo giovane

della genetica forense ed include, nel senso più ampio,

l’estrazione dell’informazione sui fenotipi umani attraverso

l’analisi molecolare di campioni biologici di una scena del

crimine.

Attualmente, FDP coinvolge principalmente la predizione

dal DNA delle caratteristiche esternamente visibili (EVCs)

dell’uomo ed alcune volte la deduzione dal DNA

dell’etnicità degli antenati.

Con il progresso delle conoscenze di genetica umana, si è

cominciato a capire quali geni sono coinvolti nel EVCs

come la pigmentazione della pelle, il tipo dei capelli od il

peso corporeo.


Per quei EVCs, come il colore degli occhi e dei

capelli, un numero ragionevolmente piccolo di

marcatori (varianti del DNA o SNPs) sono stati

identificati, così da permettere una larga

proporzione di variazione delle caratteristiche e

pertanto fornire una forte accuratezza della

predizione.

E’ stato già prodotto un saggio del DNA, validato

per uso forense, che permette di predire il colore

degli occhi del sospettato.

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