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Appunti Princ.Biol.Mol.CTF-capitolo2 - Omero

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Il Clonaggio

del DNA


Clonazione

In Biologia, clonare un organismo significa ottenere da un individuo

una popolazione di organismi geneticamente identici.

Clonaggio

In Biologia Molecolare clonare un tratto di DNA significa ottenere

un insieme di molecole di DNA identiche a quelle di partenza.

Tecnologia del DNA

Ricombinante


TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

Ha reso possibile il CLONAGGIO dei GENI permettendo di

ISOLARE

AMPLIFICARE frammenti di DNA

SEQUENZIARE

Perché manipolare i geni

1) Per facilitare lo studio dell’espressione genica e della regolazione

fisiologica;

2) per identificare il prodotto di un gene e/o per ottenerne la

sovraespressione;

3) per studiare la relazione fra struttura e funzione delle proteine;

4) per identificare componenti cellulari che interagiscono con particolari

sequenze di acidi nucleici o con particolari domini proteici


Applicazioni del Clonaggio del

DNA

Ricerca di base: studio dei maccanismi di replicazione genica e

dell’espressione nei procarioti e negli eucarioti.

Ricerca applicata: per ottenere microrganismi in grado di

produrre composti come l’insulina umana, l’interferone, ormoni

della crescita…

Terapia genica


PROCEDURA di CLONAGGIO

•ISOLAMENTO del gene

•INSERZIONE del gene in un VETTORE PLASMIDICO

•INTRODUZIONE del vettore plasmidico IN CELLULE

VIVENTI per propagarlo.


Cosa serve per un clonaggio

•Gene (DNA di interesse)

•Enzimi di restrizione

•DNA ligasi

•Vettore

•Cellula ospite


DNA Cloning

DNA cloning is a technique for

reproducing DNA fragments. It can be

achieved by two different approaches: (1)

cell based, and (2) using polymerase

chain reaction (PCR). In the cell-based

approach, a vector is required to carry the

DNA fragment of interest into the host

cell. The following figure shows the

typical procedure by using plasmids as

the cloning vector.

The essential steps in DNA cloning using plasmids as

vectors.

(a) DNA recombination. The DNA fragment to be cloned is

inserted into a vector. The recombinant vector must also

contain an antibiotic-resistance gene (not shown).

(b) Transformation. The recombinant DNA enters into the

host cell and proliferates. It is called "transformation"

because the function of the host cell may be altered. Normal

E. coli cells are difficult to take up plasmid DNA from the

medium. If they are treated with CaCl2, the transformation

efficiency can be significantly enhanced. Even so, only one

cell in about 10,000 cells may take up a plasmid DNA

molecule.

(c) Selective amplification. A specific antibiotic is added to

kill E. coli without any protection. The transformed E. coli is

protected by the antibiotic-resistance gene whose product can

inactivate the specific antibiotic. In this figure, the numbers

of vectors in each E. coli cell are not the same, because they

may also reproduce independently.

(d) Isolation of desired DNA clones.


Enzimi di

Restrizione

Sono endonucleasi di tipo II (classe delle idrolasi) in grado di tagliare

i legami fosfodiesterei del DNA per dare frammenti specifici.

L’attività endonucleasica e la funzione di metilazione del DNA sono

separate. Non hanno bisogno di ATP.

Tipo I: taglio casuale

Endonucleasi di tipo I e III: sono

enzimi bifunzionali e necessitano di

ATP come coenzima.

Tipo III: taglio in siti

specifici (24-26 coppie

di basi a valle del sito di

riconoscimento).


Sono enzimi di origine batterica necessari per degradare il DNA

virale dei batteriofagi

Riconoscono sequenze di 4,6, o 8 coppie nucleotidiche


Commonly used restriction enzymes.

Note: The "Recognition site" of a restriction enzyme is also called the restriction site. In this

column, the first line is from 5' to 3' and the second line is from 3' to 5'. The arrow indicates the

cleavage site. If the cleavage site is not at the center, the restriction enzyme will generate sticky ends

which can base-pair with other DNA fragments cleaved by the same restriction enzyme. If the

cleavage site is at the center, the restriction enzyme will generate blunt ends.


Gli enzimi di restrizione possono

generare estremità piatte (blunt

ends) oppure estremità coesive

(sticky ends).

Isoschizomeri: enzimi di

restrizione che riconoscono

la stessa sequenza.

Isocaudameri: riconoscono

siti diversi, ma lasciano

estremità compatibili (es.

BamHI e Sau3A).

5’-GGATCC-3’

3’-CCTAGG-5’

5’-GATC-3’

3’-CTAG-5’


Analisi del DNA tagliato dagli enzimi di restrizione:

Elettroforesi su gel di agarosio

Separa le molecole di DNA in base alla

lunghezza facendole migrare in un campo

elettrico.

Per visualizzare il DNA si usa Etidio Bromuro,

una molecola fluorescente alla luce

ultravioletta.


L’agarosio è un polisaccaride purificato dall’agar-agar, una

sostanza gelatinosa isolata dalle alghe. È un polimero lineare e

neutro formato da unità di D-galattosio e di 3,6-anidro-Lgalattosio

legate alternativamente con legami glicosidici.

L’agarosio è un polisaccaride solubile in acqua alla temperatura

di ebollizione, mentre diventa solido man mano che si raffredda

formando un gel grazie alla formazione di una matrice

tridimensionale costituitasi attraverso dei legami ad idrogeno tra

le catene lineari.


Bromuro di Etidio


Le Mappe di Restrizione

E’ una rappresentazione grafica

delle localizzazioni dei siti di

restrizione all’interno di una

sequenza di DNA.


• Plasmidi

• Fagi

• Cosmidi

• YAC (Yeast Artificial Chromosome)

• BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

• MAC (Mammalian Artificial Chromosome)

• HAC (Human Artificial Chromosome)


Cloning Vectors

Vector" is an agent that can carry a DNA fragment into a host cell. If it is used for

reproducing the DNA fragment, it is called a "cloning vector". If it is used for expressing

certain gene in the DNA fragment, it is called an "expression vector".

Commonly used vectors include plasmid, Lambda phage, cosmid and yeast artificial

chromosome (YAC).

Plasmid

Plasmids are circular,

double-stranded DNA

molecules that exist in

bacteria and in the nuclei of

some eukaryotic

cells. They can replicate

independently of the host

cell. The size of plasmids

ranges from a few kb to

near 100 kb

A typical plasmid vector. It contains a polylinker which can recognize several different restriction

enzymes, an ampicillin-resistance gene (ampr) for selective amplification, and a replication origin

(ORI) for proliferation in the host cell.


Vettori

plasmidici

Molecola circolare di

DNA a doppio

filamento,

normalmente

presente nella cellula

batterica, in grado di

replicarsi

autonomamente

dal cromosoma.


PLASMIDI

• Piccole molecole di DNA batterico extracromosomico,

circolare.

• In natura conferiscono vantaggi selettivi ai ceppi che li

contengono.

• Ingegnerizzati per l’uso di laboratorio.

Per essere un buon vettore di clonaggio, un plasmide deve

avere:

l) Dimensioni contenute; 2) un sito di origine della replicazione;

3) un gene per la resistenza ad un antibiotico; 4) siti unici di

restrizione (polilinker)


DNA LIGASI

Forma legami covalenti fra il gruppo fosfato 5’ di una estremità

ed il gruppo ossidrilico 3’ della catena adiacente.

L’enzima comunemente utilizzato è la T4 DNA Ligasi, perché

stabile e poco costosa.

CARATTERISTICHE DELLA REAZIONE:

‣ Presenza di ATP;

‣Temperatura di 10°C o temperatura ambiente, per poche ore.

La bassa temperatura è consigliata in quanto, diminuendo l’energia cinetica

delle molecole, riduce la possibilità che le estremità appaiate si separino prima di

venir stabilizzate dalla ligazione.


Reazione

ligasica di

frammenti di

restrizione


Replicazione di un

plasmide


INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO

IN UN VETTORE DI CLONAGGIO


Clonaggio in un

vettore

plasmidico

e trasformazione


I Plasmidi si dividono in:

• Plasmidi ad elevato numero di copie, la cui replicazione avviene più

frequentemente rispetto a quella del DNA cromosomico (alta resa);

• Plasmidi a basso numero di copie, la cui replicazione avviene con la

stessa frequenza del DNA cromosomico.

Possono essere classificati anche in base alla Specificità d’ospite:

Alcuni plasmidi sono in grado di replicare in un numero limitato di specie

batteriche e si dicono a specificità d’ospite limitata.

(per es. PBR322 e PUC18 si replicano solo in E.Coli)

Altri plasmidi sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie

batteriche e si dicono a largo spettro d’ospite.

(possiedono geni per il riconoscimento dell’origine di replicazione e

dipendono meno dall’apparato replicativo dell’ospite batterico).


Requisiti dei Plasmidi per il Clonaggio

1) Piccole dimensioni per aumentare l’efficienza della trasformazione;

2) Devono avere un origine della replicazione (ORI);

3) Devono avere un buon numero di siti di restrizione unici (polylinker);

4) Devono avere dei marcatori

genetici specifici che consentano

la selezione delle cellule batteriche

In cui la trasformazione sia avvenuta

correttamente


Selezione per inattivazione

inserzionale

Bam HI

Il gene che conferisce resistenza

all’ampicillina codifica per l’enzima

β-lattamasi.

Il gene che conferisce resistenza

alla tetraciclina codifica per un

trasportatore di membrana che

espelle l’antibiotico dalla cellula.


Selezione per inattivazione

inserzionale

Il gene LacZ codifica per

l’enzima β-Galattosidasi, il

quale è in grado di demolire

il substrato cromogeno X-Gal

con la produzione di una

colorazione blu


Esempio di selezione bianco-blu

in pUC


Come evitare che il plasmide si richiuda su se

stesso

1) Digerire il frammento ed il plasmide con due enzimi diversi, in modo che le

estremità 5’ e 3’ del vettore non siano compatibili;

2) Alternativamente si può trattare il plasmide, prima della ligazione, con

fosfatasi alcalina che rimuove i gruppi fosfato al 5’


• I batteri in grado di assumere DNA dall’ambiente

vengono definiti competenti.

Competenza naturale

Trattamento con

soluzioni fredde di

ioni bivalenti

(Ca 2+ ).

Competenza artificiale


• TRASFORMAZIONE delle CELLULE

BATTTERICHE:

• Inserimento del plasmide nella cellula ospite

• Cellule competenti

• Solo le cellule che hanno incorporato il plasmide

formeranno delle colonie.


Densità cellulare (OD 600 )

INTERVALLO (Lag

phase)

I batteri vengono diluiti nella coltura

iniziale; la divisione procede lentamente

in quanto le cellule si stanno adattando

al terreno fresco.

4 - 5 ore

FASE LOGARITMICA

I batteri crescono esponenzialmente.

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0

10 - 11 ore

0 5 10 15 20

Tempo (h)

FASE STAZIONARIA

La densità cellulare rimane costante. La coltura può anche entrare in una

fase di declino in cui le cellule si lisano ed il DNA si degrada parzialmente.


METODI FISICI

• Shock termico

•Elettroporazione

•Microiniezione

METODI CHIMICI

•Trasformazione con Cloruro

di Calcio

•Metodo di Hanahan

METODI BIOLOGICI

•Lipofezione


• Le cellule batteriche si

raccolgono quando sono ancora

in fase di crescita logaritmica;

• Si centrifuga la coltura

batterica e si risospende in una

soluzione di CaCl 2; le cellule

vanno tenute in ghiaccio per

almeno un’ora;

• Alle cellule competenti si

aggiunge il DNA della miscela di

ligazione e si lasciano le cellule

in ghiaccio (il DNA entra).


• Heat shock (1 min a 42°C): favorisce

l’ingresso del plasmide;

• Si lasciano le cellule a 37°C il tempo

necessario a far esprimere il gene

per la resistenza all’antibiotico;

• Si dispensano aliquote di cellule su

piastre di terreno LB solido

contenenti l’antibiotico appropriato;

• Dopo una notte in incubazione a

37°C si ottengono colonie da

vagliare per la presenza di DNA

ricombinante.


Elettroporazione:

Elettroporatore

ECM 830


1. Le cellule batteriche vengono mescolate

con il DNA ricombinante plasmidico;

2. Il mix ottenuto viene posto in cuvette

munite di elettrodi connessi ad un

alimentatore;

3. Si induce un breve impulso elettrico che

apre transitoriamente dei pori nella

membrana cellulare attraverso i quali

entra il plasmide.


Lipofezione:

Il DNA può essere

incorporato entro

vescicole lipidiche

artificiali dette liposomi.


Sono stati sviluppati un certo numero di metodi allo scopo di

incapsulare il DNA in doppi strati lipidici sintetici che

assomigliano a membrane cellulari.

Questi liposomi sono essenzialmente delle sferette di membrane

sintetiche riempite di DNA, le quali si fondono spontaneamente

con le membrane cellulari, scaricando il loro contenuto nel

citoplasma.

Produrre dei liposomi ex novo è complicato, ma sono disponibili

in commercio dei reagenti che semplificano notevolmente la

procedura.


PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO

1. RISOSPENSIONE

3. NEUTRALIZZAZIONE

E. coli

KAc

2. LISI

NaOH / SDS

RNasi

Centrifugazione

Supernatante

contenente il

DNA plasmidico

Precipitato

contenente DNA

genomico, proteine,

detriti cellulari

DNA cromosomico

DNA plasmidico


Vettori di Clonaggio: i FAGI

• I batteriofagi sono virus in grado di infettare I batteri

• Si utilizzano quando il frammento di DNA da clonare è troppo

grande per utilizzre vettori plasmidici (librerie di DNA).

Plasmidi fino a 10-15 Kb Fagi fino a 20 -22 Kb


ASSORBIMENTO

PARETE BATTERICA

CICLO LITICO

A

R

CICLO

LISOGENICO

A

REPLICAZIONE

TARDIVA

(modello circolare)

REPLICAZIONE

PRECOCE

(bidirezionale)

DNA

E. coli

RICOMBINAZ.

GAL

R

COS

bio

TAGLI AD OPERA

PROTEINA A

CON CATAMERO

INCAPSIDAZIONE

PARTICELLA

FAGICA

MATURA

CROMOSOMA

E. coli

GAL

ATT

ATT

R COS A J

RICOMBINAZ.

ATT

REPLICAZIONE CON

DNA CROMOSOMICO

bio

LISI DELLA

PARETE BATTERICA


CII = attivatore trascrizionale; CI = inibitore trascrizionale; CIII = proteina di legame,

protegge = inibitore trascrizionale.


CICLO LISOGENICO

Ad alto stato di infezione la cellula contiene alte concentrazioni di cIII:

Hfl è inibita

cII stimola la trascrizione di cI e della proteina Integrasi

cI è un repressore dei geni del ciclo litico e blocca la

sintesi di N, O, P e Q legandosi agli operatori O L e O R ,

bloccando il ciclo litico

CICLO LITICO

A basse concentrazioni di cIII:

Hfl non inibita

riduce l’attività o la quantità di cII

blocco della sintesi di cI

la sintesi di N, O, P, Q non è più bloccata


Lambda phage

l phages are viruses that can infect

bacteria. The major advantage of the

phage vector is its high transformation

efficiency, about 1000 times more

efficient than the plasmid vector.

Schematic drawing of the DNA

cloning using phages as

vectors. The DNA to be cloned is first

inserted into the DNA, replacing a

nonessential region. Then, by an in

vitro assembly system the virion

carrying the recombinant DNA can be

formed. The genome is 49 kb in

length which can carry up to 25 kb

foreign DNA.


Il DNA isolato dalle particelle virali è a doppio filamento con

due estremità a singolo filamento di 12 nucleotidi complementari

fra loro, chiamati siti cos. Questi siti permettono al DNA di

ciclizzare dopo l’infezione della cellula ospite.

5’ GGGCGGCGACCTCGC-----------------ACG 3’

GCG-----------------TCGCCCGCCGCTGG

La mappa genetica del fago comprende circa 40 geni che

possono essere suddivisi in tre gruppi funzionali:

‣ la parte sinistra, comprendente i geni da A a J, codifica per

proteine strutturali della testa e della coda.

‣ la parte centrale, contiene geni responsabili per la lisogenia, cioé

il processo che porta all'integrazione del DNA virale ed altri

processi ricombinativi. Gran parte di questa regione non é

essenziale per la crescita litica e può essere eliminata per la

costruzione di vettori.

‣ la parte destra contiene geni coinvolti nella replicazione del

DNA e nel ciclo litico (S, R), geni regolatori (cI, cII, cIII, cro, N,

Q).


Il fago Lambda λ

Inserimento

DNA

Cohesive ends

Proteine strutturali

della testa e della coda

Geni per la lisogenia

4.85 Kb

Ciclo litico e

replicazione DNA

Limite massimo per l’impaccamento: 51 Kb

Limite minimo per fagi vitali: 37 Kb


• Per l’assemblaggio

delle particelle fagiche

ricombinanti, il

packaging si fa in vitro.


The extreme ends of the λ DNA are known as COS

sites, each is single stranded, 12 nucleotides

long. Because their sequences are complementary

to each other, one end of λ DNA may base-pair

with the other end of a different λ DNA, forming

concatemers. The two ends of a λ DNA may also

bind together, forming a circular DNA. In the host

cell, the λ DNA circularizes because ligase may

seal the join of the COS sites.

In the assembly process of λ virions, two proteins

Nu1 and A can recognize the COS site, directing

the insertion of the λ DNA between them into an

empty head. The filled head is then attached to the

tail, forming a complete λ virion. The whole

process normally takes place in the host

cell. However, to prepare the λ virion carrying

recombinant λ DNA, the following in vitro

assembly system is commonly used.

Proteins Nu1 and A are encoded by the genes in the

λ genome. If the two genes are mutated, λ DNA

cannot be packaged into the pre-assembled

head. Because tails attach only to filled heads, the

cell will accumulate separate empty heads and tails,

which can then be extracted. When the extract is

mixed with recombinant λ DNA and proteins Nu1

and A, the complete λ virion carrying recombinant

λ DNA will be assembled.

The assembly process of the virion.


0 10 20 30 40 50 Kb

braccio sinistro 32,7 Kb

lacZ

braccio sinistro 19.9 Kb

EcoRI

cI

EcoRI

braccio destro 21,9 Kb

braccio destro 10,6 Kb

gt10

Charon16A

braccio sinistro 19.9 Kb

SalI, BamHI, EcoRI

braccio sinistro 19.2Kb

polilinker

Stuffer

SalI

Stuffer

braccio destro 8,8 Kb

SalI, BamHI, EcoRI

polilinker

EMBL4

Charon40

braccio destro 9,6Kb


COSMIDI

Sono PLASMIDI,

ma contengono, oltre alle

caratteristiche essenziali di un

plasmide, anche un

SITO COS

La presenza di questo elemento è determinante per consentire

l’inserimento della molecola di DNA ricombinante nella testa del virus

che, a sua volta, la inietta in una cellula batterica per infezione.


Cosmidi

• Un Cosmide è un plasmide di

circa 5 Kb contenente un sito cos;

• Permettono di inserire DNA fino a

45 Kb;

• Posseggono un origine di

replicazione e un gene per la

farmacoresistenza.


Cosmid

The cosmid vector is a

combination of the

plasmid vector and the

COS site which allows the

target DNA to be inserted

into the head. It has the

following advantages:

High transformation

efficiency.

The cosmid vector can

carry up to 45 kb whereas

plasmid and phage

vectors are limited to 25

kb.

Cloning by using cosmid vectors. (a) In addition to ampr, ORI, and polylinker as in the

plasmid vector, the cosmid vector also contains a COS site. (b) After cosmid vectors are

cleaved with restriction enzyme, they are ligated with DNA fragments. The subsequent

assembly and transformation steps are the same as cloning with phages.


Bacterial Artificial Chromosome - BAC

Plasmidi di dimensioni enormi (derivati dal plasmide F

di E. Coli), consentono l’inserimento di frammenti di

DNA umano fino a 300 Kb.

Il DNA viene inserito nei batteri mediante processo di

elettroporazione: uno shock elettrico provoca la

formazione transitoria di pori sulla membrana

batterica attraverso i quali passa il DNA.


Vettori di lievito: YAC Yeast Artificial Chromosome

Possono accettare inserti grandi fino a 2Mb!

I componenti essenziali di un vettore YAC sono:

• un centromero di lievito (CEN);

• una sequenza di replicazione autonoma (ARS);

• due set di sequenze telomeriche di lievito (TEL);

• marcatori di resistenza per stabilire una selezione positiva in E.Coli;

• un sito ORI;

• siti di restrizione unici;

• marcatori di selezione auxotrofica (ura3, trp1, leu2, his3).

Una delle principali differenze tra i vettori plasmidici e quelli di lievito risiede nei

marcatori di selezione. A differenza dei batteri, infatti, i lieviti sono molto meno resistenti

agli antibiotici e la selezione viene di solito effettuata sfruttando la complementazione di

mutazioni auxotrofiche nel ceppo di lievito ospite


YAC

The yeast artificial chromosome (YAC)

vector is capable of carrying a large

DNA fragment (up to 2 Mb), but its

transformation efficiency is very low.

Essential components of YAC vectors

Centromers (CEN), telomeres (TEL) and

autonomous replicating sequence (ARS) for

proliferation in the host cell.

ampr for selective amplification and markers

such as TRP1 and URA3 for identifying cells

containing the YAC vector.

Recognition sites of restriction enzymes

(e.g., EcoRI and BamHI)

Procedure

The target DNA is partially digested by

EcoRI and the YAC vector is cleaved by

EcoRI and BamHI.

Ligate the cleaved vector segments with a

digested DNA fragment to form an artificial

chromosome.

Transform yeast cells to make a large number

of copies.

Cloning by the yeast

artificial chromosome

(YAC) vector.


MAC (mammalian artificial chromosome)


MAC


Caratteristiche ed applicazioni dei diversi

vettori di clonaggio

Vettore Base Dimensione

limite

dell’inserto

Applicazioni principali

Plasmide Plasmidi multicopia naturali < 10 kb Subclonaggio, clonaggio di

cDNA e saggi di espressione

Fago Batteriofago 5 – 20 kb Clonaggio di DNA genomico

e di cDNA, librerie di

espressione

Cosmide

Plasmide contenete un sito cos del

batteriofago

35 – 45 kb Costruzione di librerie

genomiche

BAC Plasmide del fattore F di E. coli 75 – 300 kb Analisi di grandi genomi

YAC

MAC

Centromero, telomeri e sequenza

che si replica autonomamente di S.

cervisiae

Centromero, telomeri ed origine di

replicazione di mammiferi

100 – 1000

kb

Da 100 a > 1

Mb

Analisi di grandi genomi, topi

transgenici YAC

Biotecnologie animali e

terapia genica umana


Le strategie di base per il clonaggio

consistono in tre tappe:

1) Scelta della fonte di DNA da usarsi per il

clonaggio

DNA

cromosomico

cDNA

2) Frammentazione del DNA con enzimi di

restrizione

Libreria Genica o Genoteca

Genomica

a cDNA


Quando si clona l’intero genoma di un organismo si dice che si

costruisce una libreria (library) genomica


Produzione di frammenti di restrizione

sovrapponibili attraverso digestione parziale

con SauIII


Costruzione di una

libreria genomica

attraverso l’uso di

vettori fagici


Costruzione di una

libreria di cDNA:

1)Estrazione RNA totale;

2)Isolamento mRNA.


Costruzione di una libreria di cDNA

Sintesi del cDNA (metodo 1)


Preparazione di una

libreria di cDNA

utilizzando il

batteriofago λ


DNA

(gene)

Promotor

Exon 1 Exon 2

...

Exon n

hn-mRNA

mRNA

AAAAAAAAA

protein coding region

poly A tail

nucleus

cytoplasm

protein

AAAAAAAAA

translation


3) Screening della libreria:

• uso di sonde oligonucleotidiche;

• uso di anticorpi specifici;

• saggi di funzionalità della proteina stessa.


• Oligonucleotide: ogni molecola formata da un piccolo

numero di nucleotidi legati tra loro da legami fosfodiestere

5’-3’.

• Il numero di nucleotidi in questi piccoli acidi nucleici a

singolo filamento è variabile, ma spesso nell’ambito da 6 a

24 nucleotidi (da esamero a 24mer).

• Sonde oligonucleotidiche: oligonucleotidi sintetici o

naturali usati negli studi di ibridizzazione per identificare e

studiare specifici frammenti di acidi nucleici.

• Questo frammento di DNA od RNA è di solito marcato con

un tracciante (di solito radioattivo), così da permettere al

biologo molecolare di seguire l’ibridizzazione della sonda

con un DNA od un RNA sconosciuto.


Tre tipi principali di sonde:

1) Sonde oligonucleotidiche, che sono sintetizzate

chimicamente e marcate ad un’estremità.

2) Sonde di DNA, che sono DNA clonati e possono

essere marcarte ad un’estremità o marcate

internamente durante la replicazione in vitro.

3) Sonde di RNA (ribosonde), che sono marcate

internamente durante la trascrizione in vitro da

stampi di DNA clonato.


• Sonde omologhe: è esattamente complementare alla

sequenza dell’acido nucleico che interessa

identificare.

• Sonde eterologhe: è simile, ma non esattamente

uguale al filamento complementare della sequenza

dell’acido nucleico che interessa studiare.


Radioisotopo Simbolo Molecola

marcata

Trizio 3

H Basi azotate,

nucleotidi

Emivita

Applicazione

12,28 anni Marcatura di RNA

e DNA in vivo.

Sonde per

ibridizzazione in

situ.

Carbonio 14

14

C cloramfenicolo 5730 anni Saggio CAT.

Fosforo 32

32

P Nucleotidi

trifosfato

14,29 giorni Sonde di

ibridizzazione.

Zolfo 35

35

S Amminoacidi 87,4 giorni Marcatura delle

proteine (in vivo

ed in vitro).

Iodio 125

125

I Proteine 60,14 giorni Marcatura di

anticorpi.


Metodo di

marcatura

Tipo di marcatura Enzima Esempio di

applicazione

Primer casuali Uniforme DNA polimersi di

Klenow

Trascrizione in vitro Uniforme

Riempimento di

Klenow

Oligonucleotidi

Marcatura

all’estremità 3’

Marcatura

dell’estremità 5’ o

dell’estremità 3’

RNA polimerasi del

fago SP6, T7 o T3

DNA polimerasi di

Klenow

Polinucleotide

chinasi T4

Trasferasi terminale

Sonde di

ibridazione

Sonde di

ibridazione,

tracciamento della

localizzazione

dell’RNA

Footprinting con

DNAasi

Sonde di

ibridizzazione,

EMSA*

*Saggio di spostamento della mobilità elettroforetica


Screening di una

libreria:

uso di sonde

oligonucleotidiche

Una sonda oligonucleotidica deve

essere lunga abbastanza così che la sua

sequenza complementare si ritrova solo nel

clone d’interesse e non in altri cloni.

Questa condizione è soddisfatta da

sonde contenenti circa 20 nucleotidi.

Questo perché una sequenza specifica di

20 nucleotidi si ritrova una volta ogni 4 20

( 10 12 ) nucleotidi. Poiché tutti i genomi

sono molto più piccoli ( 3 x 10 nucleotidi

per l’uomo) una sequenza specifica di 20

nucleotidi in un genoma si ritrova una

sola volta.


• Per prepare una sonda specifica si può utilizzare il metodo seguente:

1. Purificazione della proteina d’interesse e determinazione della sequenza

amminoacidica mediante degradazione di Edman o spettrometria di

massa.

2. Sulla basa del codice genetico, si può predire la sequenza

oligonucleotidiche che codifica una determinata sequenza peptidica.

Tuttavia, dobbiamo ricordarci che il codice genetico è degenerato, cioè

molti amminoacidi sono codificati da più di un codone.

3. Poichè non si conoscono i codoni specifici usati per codificare la nostra

proteina, si devono sintetizzare oligonucleotidi che contengono tutte le

possibili combinazioni di codoni, in modo da assicurarci che almeno una

di esse si appai al gene in maniera perfetta.

4. Si determina la sequenza di un frammento peptico di 6 -7 amminoacidi

che può essere codificato dal più piccolo numero di possibili sequenze di

DNA.


Quindi: una sonda degenerata 20-mer è costituita da

una mistura di tutti gli oligonucleotidi 20-mer possibili,

che possono codificare una porzione selezionata di una

sequenza peptidica.


Sintesi di sonde

oligonucleotidiche

basata sulla sequenza

aminoacidica e

marcatura con fosforo

radioattivo – Sonde

Degenerate


• Le EST sono sequenze parziali di cDNA lunghe circa 200 -400 bp

(anche dette etichette “tags”, perchè rappresentano soltanto una breve

porzione del DNA genomico).

• Questo metodo usa i dati delle sequenze parziali di cDNA conservati

in banche dati e resi disponibili alla comunità scientifica mediante

internet.

• Il metodo permette di identificare un singolo oligonucleotide e non

una miscela degenerata.

• Un programma informatico usa il codice genetico per tradurre un EST

in una sequenza parziale di amminoacidi. Se si trova una

corrispondenza con la proteina in esame , l’EST fornisce la sequenza

del DNA di quella porzione del cDNA.

• Si può così sintetizzare una sonda ed usarla per identificare in una

libreria l’intero clone di cDNA o di DNA genomico.


• Può quindi essere sintetizzata chimicamente e radiomarcata una

singola sonda specifica lunga fino a 100 basi che è

perfettamente complementare ad una porzione del EST.

• Alternativamente si può utilizzare la PCR per sintetizzare una

sonda complementare all’intera lunghezza del EST.

• Attualmente, il “database” delle EST umane è così grande che

possono essere identificati EST che codificano sequenze

parziali di amminocidi della maggior parte delle proteine

umane isolate.


Production of Recombinant Proteins

Many proteins which

may be used for medical

treatment or for research

are normally expressed

at very low

concentrations. Through

recombinant DNA

technology, a large

quantity of proteins can

be produced. This

involves the cloning of

the gene encoding the

desired protein into an

"expression vector"

which must contain a

promoter so that the

protein can be expressed.

Production of recombinant proteins. (a) The expression vector

contains the lac promoter and its neighboring lacZ gene

encoding b-galactosidase. Lactose or its analog IPTG will

stimulate the expression of b-galactosidase. (b) If lacZ is

replaced by the gene encoding the protein of interest, lactose

or IPTG will stimulate the expression of desired proteins.


Affinchè la proteina venga espressa è necessario

rispettare alcuni requisiti:

1) Il gene di interesse viene clonato a valle di un promotore;

2) Il frammento di DNA deve essere in frame;

3) E’ necessario un sito di legame al ribosoma a monte del codone di

inizio del gene.

I fattori che influenzano il livello di espressione di un

gene clonato sono:

1) Numero di copie del plasmide la sovra-espressione può avere

effetti tossici;

2) Solubilizzazione delle proteine espresse;

Limitazioni per gli eucarioti:

1) I batteri non sono in grado di rimuovere gli introni;

2) Se la proteina funzionale è glicosilata la cellula ospite deve essere

una cellula eucariotica.


Librerie di espressione:

ricerca della proteina di

interesse attraverso anticorpi

specifici.

Plasmidi e fagi si utilizzano

come vettori di espressione.

Si possono anche costruire

proteine di fusione.


Etichette di

purificazione e

rivelazione


Gel Electrophoresis

Gel electrophoresis is a

technique for separating

charged molecules with

different sizes. Two kinds of

gels are commonly used:

agarose and polyacrylamide.

Agarose gels can be applied to a

wider range of sizes than

polyacrylamide gels. By using

standard agarose

electrophoresis, nuclei acids up

to 50 kb (100 to 50,000 bp) can

be separated. If Pulsed Field

Gel Electrophoresis is used, the

upper limit can be extended to

10 Mb. Polyacrylamide gels

may separate nucleic acids that

differ in length by only 1

nucleotide if their length is less

than 500 bp.

In a gel (either agarose or polyacrylamide), the negatively charged DNA fragments move toward the positive electrode

at a rate inversely proportional to their length. After the electric field is applied for a certain period, DNA fragments with

different lengths will be separated, which can be visualized by autoradiography or by treatment with a fluorescent dye

(e.g., ethidium bromide). The relationship between the size of a DNA fragment and the distance it migrates in the gel is

logarithmic. Therefore, from the band positions, the lengths of DNA fragments can be determined.


Separation of DNA fragments of different lengths by gel

electrophoresis. A gel is prepared by pouring a liquid containing

either melted agarose or unpolymerized acrylamide between two

glass plates a few millimeters apart. As the agarose solidifies or

the acrylamide polymerizes into polyacrylamide, a gel matrix

(orange ovals) forms consisting of long, tangled chains of

polymers. The dimensions of the interconnecting channels, or

pores, depend on the concentration of the agarose or acrylamide

used to form the gel. Because the pores are larger in agarose gels

than in polyacrylamide gels, the former are used to separate large

DNA fragments (≈500 bp to ≈20 kb) and the latter to separate

small DNA fragments (1 nucleotide to ≈2 kb). The mixture of

DNA fragments to be separated is layered in a well at the top of

the gel and an electric current is passed through the gel. DNA

fragments move toward the positive pole at a rate inversely

proportional to the log of their length, forming bands that can be

visualized by autoradiography (if the fragments are radiolabeled)

or by addition of a fluorescent dye such as ethidium. Agarose

gels can be run in a horizontal orientation; in this case, the melted

agarose is allowed to harden on a single horizontal glass or

plastic plate. This is not easily done with polyacrylamide gels

because oxygen in the atmosphere inhibits polymerization of

acrylamide. Gels are generally depicted with the origin at the top

and migration downward.


• Elettroforesi su gel di agarosio: i gels di agarosio hanno un ambito di

separazione molto ampio, ma un potere di risoluzione piuttosto basso.

• Elettroforesi su gel in campo pulsante (PFGE): per frazionare grandi

molecole di DDNA come per es. Il vettore YAC, l’elettroforesi su gel di

agarosio è eseguita con un campo elettrico pulsante. Il campo elettrico

periodico provoca il riorientamento delle molecole di DNA. Applicando

questo metodo si possono separare molecole di DNA fino a 200 – 400 Mb.

• Elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE): i gels di poliacrilammide

hanno un ambito di separazione piuttosto piccolo, ma un potere di

risoluzione piuttosto alto. La poliacrillamide si usa per separare frammenti

più corti di 500 bp, ma in appropriate condizioni, si risolvono facilmente

frammenti di DNA che differiscono in lunghezza di un solo nucleotide.

Questa alta risoluzione è necessaria per alcune applicazioni, come il

sequenziamento del DNA, il footprinting con DNAasiI, ed i saggi di

spostamento della mobilità elettroforetica.


Membrane-hybridization

assay for detecting nucleic

acids. This assay can be used

to detect both DNA and RNA,

and the radiolabeled

complementary probe can be

either DNA or RNA.


Following gel electrophoresis, probes are often used to detect

specific molecules from the mixture. However, probes cannot be

applied directly to the gel. The problem can be solved by three types

of blotting methods: Southern blotting, Northern blotting and

Western blotting.

Southern blotting

Southern blotting is a technique for detecting specific DNA

fragments in a complex mixture. The technique was invented in

mid-1970s by Edward Southern. It has been applied to detect

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) and Variable

Number of Tandem Repeat Polymorphism (VNTR). The latter is

the basis of DNA fingerprinting.


Southern blotting. (a) The DNA to be analyzed is

digested with restriction enzymes and then

separated by agarose gel electrophoresis. (b) The

DNA fragments in the gel are denatured with

alkaline solution and transferred onto a

nitrocellulose filter or nylon membrane by blotting,

preserving the distribution of the DNA fragments

in the gel. (c) The nitrocellulose filter is incubated

with a specific probe. The location of the DNA

fragment that hybridizes with the probe can be

displayed by autoradiography.


The Southern blot technique for detecting the presence of

specific DNA sequences following gel electrophoresis of a

complex mixture of restriction fragments. The diagram depicts

three restriction fragments in the gel, but the procedure can be

applied to a mixture of millions of DNA fragments. A similar

procedure, called Northern blotting, is used to detect specific

RNA sequences. [See E. M. Southern, 1975, J. Mol. Biol.

98:508.]


Southern Blot


Fluorescence in situ hybridization (FISH), the assay of choice

for localization of specific nucleic acids sequences in native

context, is a 20-year-old technology that has developed

continuously. Over its maturation, various methodologies and

modifications have been introduced to optimize the detection of

DNA and RNA. The pervasiveness of this technique is largely

because of its wide variety of applications and the relative ease

of implementation and performance of in situ studies. Although

the basic principles of FISH have remained unchanged, high

sensitivity detection, simultaneous assay of multiple species,

and automated data collection and analysis have advanced the

field significantly.


State of the art in FISH. (A) Many transcription sites (10) detected using barcoded probes can

determine the gene expression pattern of each cell (Levsky et al., 2002) (B-D).

Levsky J M , Singer R H J Cell Sci 2003;116:2833-2838

©2003 by The Company of Biologists Ltd

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