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Appunti Princ. Biol.Mol.CTF -capitolo 1 - Omero

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Principi di Biologia Molecolare

Corso di Laurea Magistrale in C.T.F.

Anno Accademico 2012/2013

Docente:

Prof.ssa Maria R. Mazzoni


Testi consigliati

• Fondamenti di Biologia Molecolare. L.A. Allison, Zanichelli.

Biologia Molecolare. B. Amaldi et al., Editrice Ambrosiana.

• Il Gene X. B. Lewin et al., Zanichelli.

• Introduzione alla Genomica. A. M. Lesk, Zanichelli.

• L’essenziale di Biologia Molecolare della Cellula. B. Alberts

et al., Zanichelli.


• La biologia molecolare è una scienza di base nata

dalla convergenza di biologia, chimica e fisica, che

possiede intensa consapevolezza pratica e

commerciale.

• La biologia molecolare è lo studio di come il DNA,

l’RNA e le proteine sono intercorrelate (D.

Baltimore, Nobel Lectures in Molecular Biology).


Cronistoria della genetica e della biologia molecolare


Un gene codifica un RNA che può codificare una

proteina


Tre linee di ricerca hanno

portato alla scoperta che il

DNA è il materiale ereditario


Legge della combinazione di caratteri diversi

(Mendel, 1866)


Il principio trasformante (Griffith, 1928)


Il DNA è il materiale genetico dei batteri e dei virus


L’ipotesi un gene-un enzima (Beadle e Tantum, 1941)


Il DNA è il materiale genetico dei batteri e dei virus

La trasformazione batterica ha fornito

la prima evidenza del fatto che il

DNA è il materiale genetico dei

batteri.

Le proprietà genetiche possono essere

trasferite da un ceppo batterico ad un

altro estraendo il DNA dal primo

ceppo e somministrandolo al secondo

(Avery, MacLeod, e McCarty –

1944).


Il DNA è il materiale genetico del batteriofago T2


Il DNA è il materiale genetico dei batteri e dei virus

L’infezione fagica (fago T2) ha dimostrato

che il DNA è il materiale genetico dei virus.

Se il DNA e le proteine del batteriofago

sono marcati con isotopi radioattivi diversi,

solamente il DNA è trasmesso alla progenie

fagica prodotta infettando i batteri (Hershey,

e Chase – 1952).


Il DNA è il materiale genetico della cellula eucariotica

Le cellule eucariotiche possono

acquisire un nuovo fenotipo in seguito

alla trasfezione con DNA..

Il DNA costituisce il materiale

genetico di tutte le cellule e di

molti virus. Fanno eccezione

alcuni virus che usano come

materiale genetico l’RNA.


Fotografia di diffrazione ai raggi X del DNA (Wilkins e Franklin,

1952-53)


Modello della struttura del DNA (Watson e Crick, 1953)


Le catene polinucleotidiche hanno basi azotate unite ad

uno scheletro di zuccheri e fosfati


Struttura chimica dello zucchero -

pentoso

Struttura generale dei nucleotidi


Struttura chimica

delle basi azotate


Formazione delle catene degli acidi nucleici


Struttura secondaria del DNA - fra le basi si formano legami a

idrogeno


Il DNA è una doppia elica

Modello della doppia

elica del DNA (Watson

e Crick, 1953).


Impilamento delle basi – stabilità chimica della doppia elica


Il DNA è una doppia elica


Il DNA è una doppia elica

• Il DNA nella conformazione B è una doppia elica formata da

due catene polinucleotidiche che corrono antiparallele.

• Le basi azotate di ciascuna catena sono anelli piatti purinici o

pirimidinici rivolti verso l’interno ed appaiati tra di loro per

mezzo di legami idrogeno che portano solamente alla

formazione delle coppie A-T o G-C.

• La doppia elica ha un diametro di ~ 20 Å (2 nm) e forma un

giro completo ogni 34 Å (3,4 nm), con dieci coppe di basi per

giro d’elica.

• La doppia elica ha un solco maggiore (22 Å di diametro) ed

uno minore (12 Å di diametro).


Il DNA è una doppia elica

DNA a doppia elica:

• forma B (idratata) > elica destrorsa;

• forma A (disidratata) > elica destrorsa,

ma più corta e spessa della forma B;

• forma Z > elica sinistrorsa e più lunga e

stretta della forma B.


Strutture alternative a doppia elica del DNA


Denaturazione, rinaturazione ed ibridizzazione del DNA a doppio

filamento


Curva di denaturazione del DNA


Dependenza della denaturazione del DNA dal contenuto di G-C e

dalla concentrazione salina


Strutture secondarie insolite del DNA


Struttura terziaria del DNA - superavvolgimento del DNA


Il DNA è superavvolto


Il DNA è superavvolto

• Il superavvolgimento si forma solo in molecole di DNA

“chiuse” senza estremità libere.

• Il DNA chiuso è dato da molecole circolari (cellule

procariotiche) o da molecole lineari (cellule eucariotiche) in

cui le estremità sono bloccate per interazioni con proteine così

da non poter ruotare liberamente.

• Una molecola di DNA chiusa ha proprio numero di legame

(L), che è dato dalla somma del numero di giri completi o twist

(T) e di superavvolgimento writhe (W).

• Si può cambiare il numero di legame solamente rompendo e

riformando dei legami nell’ossatura del DNA.


L’appaiamento delle basi fornisce

il meccanismo per la replicazione

del DNA

Replicazione del DNA


La replicazione del DNA è semiconservativa (Meselson e Stahl,

1958


Replicazione del DNA


Replicazione del DNA batterico


La forcella di replicazione


La sintesi di DNA

avviene da 5’ a 3’


• La replicazione del DNA è eseguita da un complesso di enzimi

e proteine che separano i filamenti parentali e sintetizzano i

filamenti figli.

• La forcella di replicazione è il punto in cui i filamenti parentali

vengono separati.

• Gli enzimi che sintetizzano il DNA si chiamano DNA

polimerasi; catalizzano la sintesi del nuovo filamento solo in

direzione 5’ 3’ e necessitano di un innesco di RNA (20

nucleotidi) (“primer”) per poter iniziare la sintesi.

• Le nucleasi sono enzimi che degradano gli acidi nucleici,

comprendono le DNasi e le RNasi e possono essere suddivise

in endonucleasi ed esonucleasi. Le prime tagliano i legami

fosfodiestere all’interno della catena nucleotidica, mentre le

seconde rimuovono un nucleotide alla volta a partire

dall’estremità, tagliando il legame fosfodiestere.


La replicazione del DNA è semidiscontinua


Endonucleasi ed esonucleasi


Dogma centrale della biologia molecolare


L’informazione genetica può essere contenuta nel DNA o

nell’RNA

• I geni cellulari sono costituiti da DNA, ma i genomi virali

possono essere costituiti da RNA.

• Il DNA è convertito in RNA dalla trascrizione mentre la

trascrizione inversa può convertire l’RNA in DNA.

• La traduzione dell’RNA in proteine è unidirezionale.


Replicazione degli Ac. Nucleici a doppio e singolo filamento


Confronto fra vari genomi


Appaiamento delle basi nel DNA a doppio filamento e nell’RNA


Landmarks in molecular biology and biotechnology

•1869- Friedrich Miescher discovered DNA.

1941- Beadle and Tatum demonstrated that a gene codes for a single

protein and one gene one protein theory was put forward.

•1944- Avery, McLeod ana McCarty showed that DNA is the genetic

material.

•1951- The helical conformation of a chain of aminoacids was proposed

and the α-helix and β-sheet structures in proteins were deciphered.

•1952- Hershey and Chase proved that DNA is the carrier of genetic

information.

•1953- Watson and Crick gave the double helical structure of DNA.

•1955- Method for determination of amino acid sequence of a protein

was developed by Frederick Sanger and the sequence of insulin was

determined.


Landmarks in molecular biology and biotechnology

•1957- Arthur Kornburg discovered the DNA polymerase I.

•1958- Meselson and Stahl showed that DNA replicates in a semiconservative

manner.

•1960- The detailed 3-D structure of proteins was described to very high

resolution.

•1960- Polycistronic genes in bacteria were discovered. The one gene one

protein theory became obsolete.

•1961- The triplet nature of codons was discovered and the genetic code was

deciphered by Marshal Nirenberg and H.G. Khurana.

•1961- Messenger RNA was discovered.

•1961- Jacob and Monad proposed the `operon model’ for regulation of gene

expression.

•1963- The circular nature of bacterial DNA was discovered by John Cairns.

•1967- Enzyme DNA ligase was discovered by Gilbert.


Landmarks in molecular biology and biotechnology

•1970- Temin and Baltimore reported the discovery of reverse

transcriptase in retrovirus.

•1973- Type II restriction endonucleases were discovered.

•1974- Eukaryotic genes were cloned in bacterial plasmids.

•1975- The signal hypothesis was proposed by Gunter Blobel.

•1976- Retroviral oncogenes were identified as the causative agents for

cellular transformation by JM Bishop and HE Varmus.

•1976- DNA sequencing protocols were developed (chemical method by

Maxam & Gilbert and enzymatic method by Sanger) and it became

possible to find out the nucleotide sequence of gene.

1977- It was shown that the eukaryotic genes are interrupted. The introns

were discovered and the splicing mechanism for the removal of introns from

primary transcripts was deciphered.

1978- The NIH guidelines for r-DNA technology were formulated.


Landmarks in molecular biology and biotechnology

•1979- Cellular oncogenes were discovered.

•1981- The catalytic activity of RNA was discovered and the concept

of ribozyme was accepted.

•1981- Transgenic mice and flies were created by introducing

novel genes in the germ lines.

•1984- Polymerase chain reaction (PCR) was discovered by Kary

Muller.

•1997- Dolly, the sheep was cloned from the somatic cell genome.

The first animal cloning experiment established the totipotency in

animal cells.

•1998- RNAi was discovered.

•2000- The human genome project was completed. The first draft

of the sequence of human genome was published. Functional

genomics and proteomics became the new fields.


Il genoma

• Quanti geni contiene un genoma

• Un gene può essere definito come un’unità di trascrizione.

• Il genoma è la serie completa di geni di un organismo. Può

essere definito come la sequenza completa di DNA, anche se

può non essere possibile identificare ogni gene

inequivocabilmente solo in base alla sequenza.

• Il trascriptoma è la serie completa di geni espressi in certe

condizioni specifiche. Viene definito in funzione dell’insieme

di molecole di RNA presenti in un dato momento in qualunque

tipo di cellula, in un insieme di cellule (tessuto) od in un

organimso. Il trascriptoma può essere più grande del numero

di geni definiti nel genoma e comprende: mRNA, tRNA,

rRNA, miRNA ed una serie di altri RNA dalle funzioni ancora

ignote.


• Il proteoma è la serie completa di proteine codificata da un

intero genoma o prodotta da una particolare cellula o tessuto.

Dovrebbe corrispondere all’mRNA del trascriptoma, anche se

vi possono essere alcuni dettagli differenti, dati per esempio da

cambiamenti nell’abbondanza relativa o nella stabilità degli

mRNA e delle proteine. Ci possono anche essere delle

modificazioni post-traduzionali per cui più di una proteine può

essere prodotta da un singolo trascritto di mRNA.

• Le proteine possono funzionare in modo indipendente o come

parte di complessi multiproteici o multimolecolari, come gli

oloenzimi o le vie metaboliche in cui gli enzimi sono

raggruppati. Come esempi possiamo citare l’oloenzima della

RNA polimerasi ed il complesso formato da piccoli RNA

nucleare e proteine detto splicesoma.


Il contenuto di DNA di varie specie

Organismo

Numero di

coppie di

basi

Lunghezza del

DNA (mm)

Dimesioni

dello spazio

cellulare (mm)

Numero di

cromosomi

Batteriofago 4.85 x 10 4 0,017 < 0,0001 1

Batterio

(Escherichia coli)

Lievito

(Saccharomyces

cervisiae)

Moscerino della

frutta (Drosophila

melanogaster)

Esseri umani

(Homo sapiens)

4,7 x 10 6 1,4 0,001 1

1,25 x 10 7 4,6 0,005 16 (x 1 o 2)

1,65 x 10 8 56,0 0,010 4 (x 2)

3 x 10 9 999,0 0,010 23 (x 2)


Organizzazione dei genomi a DNA

Genoma Forma Dimensioni (kb)

Eucarioti ds lineare da 10 4 a 10 6

Batteri ds circolare 10 3

Plasmidi ds circolare (alcuni ds lineari) 2-15

Virus a DNA dei

mammiferi

ss lineare, ds lineare, ds

circolare

3-280

Batteriofagi ss circolare, ds lineare 50

DNA dei cloroplasti ds circolare 120-160

DNA mitocondriale ds circolare (alcuni ds lineari) Animali: 16,5

Piante: 100-2500


Il genoma eucariotico


Genoma batterico


Rappresentazione di un batterio contenente DNA plasmidico


Genoma del virus SV40


Il DNA degli organelli


Eredità materna del genoma mitocondriale negli animali


I genomi mitocondriali


DNA mitocondriale umano

22 geni per tRNA,

2 geni per rRNA,

13 geni codificanti proteine.


Origine dei mitocondri


Tipi principali di virus ad RNA

Tipo di virus Genoma Modo di

replicazione

Famiglia di

virus

Alcuni membri

patogeni

Virus ad RNA RNA RNA RNA Togavirus

Coronavirus

Rabdovirus

Paramixovirus

Filovirus

Reoviru

Ortomixovirus

Rosolia, Rinovirus,

Poliomelite.

Raffreddore comune,

SARS.

Rabbia.

Morbillo, parotite.

Ebola

Rotavirus

Influenza

Retrovirus RNA RNADNA

RNA

Lentivirus

HIV-1


Virus eucariotici ad RNA


Caratteristiche delle sequenze genomiche degli eucarioti

• E’ possibile distinguere la frequenza di ripetizione di sequenze

genomiche dalle cinetiche di riassociazione del DNA di un

genoma denaturato.

• Dalle cinetiche di riassociazione si individuano due tipi di

sequenze genomiche:

Il DNA non ripetitivo consiste di sequenze uniche di cui ce

ne è una sola copia per genoma aploide.

Il DNA ripetitivo consiste di sequenze presenti in più di una

copia per genoma.

• Le proteine sono in genere codificate da sequenze di DNA

non ripetute.


• Il DNA ripetitivo può essere suddiviso in due categorie

generali:

DNA moderatamente ripetitivo, costituito da sequenze

relativamente corte ripetute nel genoma in genere da 10 a 1000

volte. Sono sequenze disperse nel genoma.

DNA altamente ripetitivo, consiste di sequenze molto corte

(in genere meno di 100 bp) ripetute molte migliaia di volte nel

genoma e spesso organizzate come lunghe ripetizioni in

tandem.

• Nessuna delle due classi si trova nelle regioni codificanti.

• Nello stesso gruppo tassonomico i genomi più grandi non

contengono più geni, ma solo una maggiore quantità di DNA

ripetitivo.


Le proporzioni delle

diverse componenti

di sequenza variano

nei genomi

eucariotici


Organizzazione del genoma umano


• Soltanto lo 0,1% del genoma umano differisce da una persona

all’altra. Ad eccezione della regione codificante gli antigeni

leucocitari umani (HLA) la variazione genetica è modesta nel

DNA codificante.

• Meno del 40% del genoma umano è costituito da geni e da

sequenze correlate a geni.

• Il DNA intergenico consiste di: 1) sequenze uniche od in basso

numero di copie; 2) sequenze moderatamente od altamente

ripetitive.

• Le sequenze moderatamente od altamente ripetitive si possono

suddividere in due classi principali: (1) elementi sparsi; (2)

sequenze ripetute in tandem.


Elementi dispersi nel genoma

• Sono ripetizioni presenti in tutto il genoma che sono

trasposoni (elementi instabili del DNA che si possono spostare

in parti diverse del genoma) o meglio copie degenerate di

trasposoni.

• Le ripetizioni non sono raggruppate, ma sono sparse in

numerose posizioni all’interno del genoma. Possono essere

suddivisi in due categorie in base alla loro lunghezza:

Sequenze più corte di 500 bp - SINE (short interspersed

nuclear elements); elementi Alu (SINE attivi nell’uomo).

Sequenze più lunghe di 500 bp – LINE (long interspersed

nuclear elements); elementi L1 (LINE attivi nell’uomo).


Classi di elementi trasponibili

Classe Intermedio di trasposizione Esempi

Classe I

Retrotrasposoni LTR RNA Lievito: elementi Ty;

Esseri umani: Retrovirus endogeni

umani (HERV);

Topo: particella A intracisternali

(AP).

Retrotrasposoni non LTR

LINE (autonomi)

SINE (non autonomi)

Classe II

RNA

Esseri umani:

Elementi L1

Elementi Alu

Trasposoni di DNA DNA Batteri:

Sequenze di inserzione

Batteriofago Mu

Trasposoni (batterifago Tn7).

Drosophila:

Elementi P.

Mais:

Elementi Ac e Ds.

Invertebrati e vertebrati:

Superfamiglia Tc1/mariner


ITR: ripetizioni terminali invertite; DR: brevi ripetizioni dirette; ORF: modulo di lettura

aperto; LTR, lunghe ripetizioni terminali; HERV, retrovirus endogeni umani; gag,

antigene gruppo specifico; prt, proteasi; Pol, polimerasi; env, involucro; RT, trascriptasi

inversa; EN, endonucleasi; TSD, duplicazioni del sito di bersaglio; UTR, regione

terminale non trascritta.


Sequenze ripetute in tandem

• Le ripetizioni in tandem costituiscono approssimativamente il 10% del

genoma e si dividono in tre classi in base alla lunghezza:

Satelliti: sono costituiti da DNA altamente ripetitivo con una lunghezza

di ripetizione che va da una a parecchie migliaia di coppie di basi.

Queste sequenze sono organizzate in grandi gruppi nelle regioni di

eterocromatina dei cromosomi, vicino ai centromeri ed ai telomeri, e

sono abbondanti anche nel cromosoma Y.

Minisatelliti: loci di ripetizioni in tandem a numero variabile (VNTR),

sono composti da motivi di sequenza che vanno da circa 15 a 50 bp. La

lunghezza totale delle ripetizioni in tandem va da 500 bp a 20 kb.

Microsatelliti o brevi ripetizioni in tandem (STR): l’unità ripetuta va da

2 a 6 bp per una lunghezza totale che varia fra 50 e 500 bp. Le

sequenze STR più comuni sono ripetizioni dinucleotidiche.


La ripetizione in

tandem di corte

sequenze ha

spesso proprietà

fisiche distinte

che possono

essere usate per

il suo isolamento

(centrifugazione

in gradiente di

densità di ClCs).


• La variazione genetica da individuo ad individuo nei

minisatelliti e STR (polimorfismi) è dovuta soprattutto al

numero di elementi ripetitivi disposti in tandem, ma ci possono

essere piccole differenze anche nella sequenza.

• Queste regioni variabili sono particolarmente utili per la

genetica legale perché si possono usare per generare un profilo

del DNA di un individuo, pur non dando alcuna informazione

sui tratti fenotipici dello stesso.


Benefits of molecular biology products in medicine

Medicine utilizes molecular biology products and

techniques in analysis of disease, disease genes and

gene function.

Early stage diagnostics, new disease biomarkers.

New vaccines and medicines.

Gene therapy.

Personalized medicine.


Le basi cromosomiche delle malattie umane

Sviluppo di nuovi metodi citologici all’inizio degli anni 1950.

1956: Tjio e Leven (NIH) mostrarono in maniera conclusiva che l’uomo ha

un corredo cromosomico costituito da 46 cromosomi.

Entro pochi anni da tale dimostrazione, fu stabilita una relazione diretta tra

i disordini genetici umani ed il numero anormale di cromosomi o

anauplodia. Così, la trisomia fu trovata nella sindrome di Down (cr. 21),

nella sindrome di Patau (cr. 13) e nella sindrome di Edward (cr. 18).

Furono anche descritte anormalità nel numero dei cromosomi sessuali

come nella sindrome di Turner (X) e nella sindrome di Klinefelter (XXY).

Nei primi anni 1960, furono identificate traslocazioni cromosomiche in

alcuni casi di sindrome di Down.

Negli anni 1970, diversi studi dimostrarono che la leucemia mieloide

cronica, il linfoma di Burkitt e diverse altre neoplasie del sangue, sono

caratterizzate da specifiche traslocazioni cromosomiche.


Le basi genetiche delle malattie umane

1) Malattie genetiche “semplici” , malattie geneticamente

omogenee, (anemia a cellule falciformi, fibrosi cistica), per le

quali gli individui malati condividono mutazioni geniche

comuni e sintomi altamente simili.

2) Malattie genetiche “più complesse o meno semplici”

come la b-talassemia e la neurofibromatosi 1, nelle quali una

varietà di tipi di mutazioni in un singolo gene producono

sintomi variabili.

3) Malattie genetiche “complesse”, malattie geneticamente

eterogenee, come l’asma ed il disordine bipolare, nelle quali le

mutazioni in un numero di geni, in combinazione con fattori

ambientali, verosimilmente sono responsabili per sintomi

estremamente variabili.


La genetica umana nell’era molecolare

1910: il medico J. Herrick di Chicago descrive l’anemia a cellule

falciformi.

Nella metà degli anni 1940, I. Sherman trova che il sangue di pazienti

affetti da anemia a cellule falciformi trasmette la luce in maniera diversa

rispetto al sangue normale, suggerendo differenze strutturali nella molecola

dell’emoglobina.

L. Pouling and H. Itano, isolarono l’emoglobina, la separarono mediante

elettroforesi e trovarono che l’emoglobina dei pazienti con anemia

falciforme (Hb S ) migra più lentamente, dimostrando che possiede una

minore carica negativa rispetto all’emoglobina normale (Hb A ) .

1956: V. Ingram e J. Hunt sequenziarono Hb A e Hb S , trovando che un

acido glutammico in posizione 6 nella catena b dell’Hb A è sostituito con

una valina nella stessa catena polipeptidica nell’Hb S .


La genetica umana nell’era molecolare

Primi anni 1980: la disponibilità della sequenza della proteina e della

sequenza predetta del DNA facilitò il clonaggio dei geni della a- e b-

globina da una libreria genomica umana.

Nel costruire le prime mappe di restrizione del DNA umano clonato, fu

subito ovvio che una mutazione puntiforme può cambiare il sito di

riconoscimento per una endonucleasi di restrizione, producendo frammenti

di diversa dimensione, chiamati polimorfismo di lunghezza dei frammenti

di restrizione (RFLP).

1978: Y.W. Kan e A.M. Dozy rivelarono, mediante analisi RFLP, la

mutazione responsabile dell’anemia falciforme.


Diagnosi RFLP di anemia a cellule falciformi

Chang J.C,. and Kan Y.W. 1982. A sensitive new prenatal test for sickle-cell anemia. N.

Engl. J. Med. 307: 30-32.


Produzione di molecole terapeutiche da geni clonati

Alcune patologie umane sono dovute ad un difetto assoluto o relativo nella

produzione di un specifica proteina – diabete mellito, emofilia e nanismo

ipofisario – e possono essere curate fornendo al paziente la proteina che

non viene prodotta o la cui produzione è ridotta, come: l’insulina per il

diabete mellito, i fattori di coagulazione VIII e IX per l’emofilia, l’ormone

della crescita umano (HGH) per il nanismo ipofisario.

Tuttavia, era molto difficoltoso ottenere quantità adeguate e prive di agenti

patogeni di queste proteine terapeutiche.

Lo sviluppo delle nuove tecniche di biologia molecolare ha reso possibile il

clonaggio di diversi geni inclusi quelli che producono proteine importanti

da punto di vista medico, come : insulina, fattori della coagulazione,

HGH, l’attivatore del plasminogeno tissutale (t-PA), l’interleuchina,

l’interferone ed i fattori che stimolano le colonie.

1979: Eli Lilly Co. produce l’insulina ricombinante umana

inducendone l’espressione in Escherichia Coli.


Biosynthesis of Insulin: -

Insulin is synthesized in significant

quantities only in beta cells in the pancreas.

The insulin mRNA is translated as a single

chain precursor called preproinsulin, and

removal of its signal peptide during insertion

into the endoplasmic reticulum generates

proinsulin. Proinsulin consists of three

domains: an amino-terminal A chain, a

carboxy-terminal B chain and a connecting

peptide in the middle known as the C

peptide. Within the endoplasmic reticulum,

proinsulin is exposed to several specific

endopeptidases which excise the C peptide,

thereby generating the mature form of

insulin. Insulin and free C peptide are

packaged in the Golgi into secretory granules

which accumulate in the cytoplasm. When

the b cell is appropriately stimulated, insulin

is secreted from the cell by exocytosis and

diffuses into islet capillary blood. C peptide

is also secreted into blood, but has no known

biological activity


The first step was to chemically synthesize the DNA chains that carry the

specific nucleotide sequences of the A and B polypeptide chains of insulin.


Product Generic name/Company Year of first U.S.

Approval

Rec. human insulin

Rec. HGH

Humulin/Eli Lilly & Co.

Protropin/Genentech Inc.

1982

1985

Approved for

Diabetes mellitus

hormone deficiency in children

Rec. interferon-α

Rec. hepatitis B

vaccine

Rec. Erythropoietin

Rec. interferon-γ

Colony-stimulating

factor (CSF)

Rec. anti-hemophiliac

Rec. DNase I

Rec. coagulation factor

IX

Intron A/Scherin-Plough

Recombivax HB/Merck & Co.

EPOGEN/Amgen Ltd.

Acctimune/Genentech Inc.

Leukine/Immunex Corp.

Recombinater AHF/

Baxter Healthcare

Pulmozyme/Genentech, Inc.

AlphaNine SD/Alpha

Therapeutic Corp.

1986

1988

1988

1991

1992

1986

1989

1990

1991

1992

1993

1996

Hairy cell leukemia

Genital warts

Kaposi’s sarcoma

Hepatitis C

Hepatitis B

Hepatitis B prevention

Anemia of chronic

renal failure

Chronic granulomatous

disease

Bone marrow transplantation

Hemophilia A

Cystic fibrosis

Christmas Disease

Hemophilia B


DNA polimorfismo ed identità

1980 -1990: l’analisi molecolare acquisì nuove potenzialità quando l’analisi

dei polimorfismi di RFLP fu soppiantata dall’analisi dei polimorfismi di

VNTR e di STR.

1984: Alec Jeffreys scoprì il così detto “Jeffreys’ probe” studiando la

frazione dei minisatelliti del DNA altamente ripetitivo nel genoma umano.

Identificò due sequenze “core” comuni ad una serie di VNTR associati al

locus genico della mioglobina. Saggiandoli mediante “Southern blotting”,

si produceva un “DNA fingerprint” che era una composizione di VNTR a

loci multipli – “multilocus probes”.

1987: Y. Nakamura, R. White et al., ricercando VNTR di “single locus”

identificarono più di 100 loci polimorfici distribuiti nel genoma. Ogni

“probe” ibridizza ad un’unica regione ipervariabile del genoma e genera

un “pattern” che consiste di una o due bande dal DNA di un individuo, a

seconda che sia omozigote od eterozigote a quel locus .

“Cocktails” di “probes” diversi diretti verso loci diversi sono utilizzati per

scopi di medicina legale.


DNA polimorfismo ed identità

1992: Thomas Caskey propose l’uso dei polimorfismi degli STR in

medicina legale. La corta unità ripetitiva degli STR crea alleli più piccoli,

creando le condizioni per recuperare un polimorfismo del STR anche da

campioni di DNA degradato.

L’analisi degli STR è stata sviluppata utilizzando la PCR ed il

sequenziamento automatizzato del DNA.

Nel 1997, FBI raccomandava che un pannello di 13 marker di STR, più un

marker XY, divenisse la procedura standard utilizzata nelle indagini

criminali. I moderni test del DNA hanno la capacità di identificare in

maniera inequivocabile ogni persona vivente oggi.

Nel Giugno 2002, “FBI’s Combined DNA Index System (CODIS)

conteneva 1.013.746 profili di DNA, compresi 997.895 profili di criminali

giudicati.


Clonaggio genico: dal legame alla diagnosi del DNA

La diagnosi del DNA è basata sul collegamento di un allele

di un marcatore polimorfico all’eredità di un fenotipo di

malattia. Più il marcatore è vicino al locus genico della

malattia, più la diagnosi sarà accurata.

L’analisi di “linkage” ha permesso di individuare i geni

responsabili di alcune patologie genetiche monogeniche,

come la malattia di Huntington (HD), la distrofia muscolare

di Duchenne, la fibrosi cistica, ecc.

www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22266 /#A273


La HD è un disordine neurodegenerativo che porta invariabilmente a

perdita della funzione motoria, compromissione delle capacità mentali e

morte precoce. E’ un raro esempio di patologia letale a trasmissione

autosomica dominante.

1983: HD è stato il primo locus genico di malattia mappato mediante

analisi del “RFLP/linkage” – mappato all’estremità telomerica del braccio

corto del cromosoma 4.

1993: “Huntington’s Disease Collaborative Research Group” riuscì a

clonare il gene HD. I pazienti di 75 famiglie con HD mostravano un

polimorfismo di lunghezza nella regione codificante del gene

dell’huntingtin causato da una ripetizione della tripletta CAG (Glu).

Il gene normale dell’huntingtin presenta 6-35 ripetizioni CAG; la versione

mutata nei pazienti HD ha 36-180 ripetizioni. Il numero di ripetizione è

correlato con l’età di insorgenza dei sintomi; così individui con 36-41

ripetizioni possono anche non sviluppare sintomi di malattia, mentre quelli

con più di 50 ripetizioni sviluppano i sintomi prima dei 20 anni.


Disease Protein Number of triplet

repeats (normal/disease)

Huntington’s disease

Fragile X mental retardation

Spinocerebellar ataxia

SCA1

SCA2

SCA3

SCA6

SCA7

SCA12

Spinobulbar muscular atrophy

(SBMA)

Dentatorubral and pallidolyusian

atrophy (DRPLA)

Ataxia with intellectual

deterioration

Schizophrenia

Male infertility

Huntingtin

FMR1

Ataxin-1

Ataxin-2

Ataxin-3

Ataxin-P/Q Ca 2+ channel

Ataxin-7

PPP2R2B

Androgen receptor

Atrophin-1

TATA-binding protein

KCNN3

POLG1

6–35/36–180

30/60–200

6–39/40–88

14–32/33–77

12–40/55–86

4–18/21–31

7–17/34–200

7–32/55–93

9–36/38–65

3-36/49-88

25–42/45–63

12–28/Long alleles overrepresented

10/0


La malattia legata al cromosoma X, distrofia muscolare di

Duchenne, è stato uno dei primi loci di malattia che è stato

clonato prima di conoscere il suo prodotto proteico. Il gene

distrofina (Xp21) è uno dei geni più grandi e complessi che si

conosca che codifica per una proteina di 4000 aa. Questo gene

appare essere predisposto a danno, spesso costituito da delezioni

di esoni.

1989: isolamento ed analisi del gene che causa la fibrosi cistica

(CF) sul cromosoma 7. Il gene della fibrosi cistica è un

regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR)

(250.000 nucleotidi). Gli esoni del gene CFTR producono una

proteina di 1480 aa. La lesione genetica primaria della CF è una

specifica mutazione che interessa un singolo aa. Circa il 70%

dei pazienti con CF mostrano una delezione di 3 bp DF508, che

risulta nella perdita di un singolo residuo aa, Phe 508 .


Farmacogenomica

L’uso della sequenza del genoma umano per fornire

l’informazione per la scoperta dei farmaci è chiamata

farmacogenomica. Ogni gene che è stato in maniera

definitiva correlato ad una malattia diviene un bersaglio

confermato per la scoperta di farmaci. La conoscenza delle

mutazioni in quel determinato gene e quindi dei corrispondenti

cambiamenti nelle strutture tridimensionali della proteina

codificata, permette di sviluppare strategie per lo screening di

librerie di composti.


Identificazione dei geni coinvolti in patologie

complesse

L’asma, la schizofrenia ed il disordine bipolare sono esempi di patologie

complesse od eterogenee. Ognuna di queste patologie coinvolge geni

multipli la cui espressione è ulteriormente modificata da fattori ambientali

come per esempio, la qualità dell’aria nell’asma, la dieta nel diabete mellito

di tipo II, l’abuso di alcol o farmaci nella schizofrenia e nel disordine

bipolare. Inoltre, a rendere le cose più complesse, ognuna di queste

patologie ha un “range” di severità e di espressione.

Lo scopo dello studio di popolazioni, come lo studio di famiglie, è quello di

correlare polimorfismi del DNA particolari con un fenotipo di malattia.

Nonostante ci siano numerosi problemi in questi studi e nelle metodologie

utilizzate, negli ultimi 10 anni sono state evidenziate correlazioni per la

schizofrenia con loci sui cromosomi 1, 6, 8, 10, 13, 15 e 22. Similmente

per il disordine bipolare sono state evidenziate correlazioni con loci sui

cromosomi 4, 12,13, 18, 21 e 22.


Polimorfismi a singolo nucleotide

1990: i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) non sono

altro che mutazioni puntiformi. Vari geni possono essere

associati con differenti “markers” in diversi gruppi di

popolazione. Per essere utile nella scansione dei geni, un SNP

deve avere una frequenza nella popolazione di almeno l’1%.

Una volta che la mappa del genoma umano sarà altamente

popolato con SNP, i geni correlati a malattie potranno essere

identificati in popolazioni eterogenee di individui non

correlati.


Farmacogenetica

• Gli SNP offrono la potenzialità di poter predire la risposta negativa ad un

farmaco.

• La risposta ai farmaci è largamente mediata dagli enzimi metabolici nel

fegato – citocromo P450 monossidasi (CPY450s) – che detossificano

composti e metabolizzano molti farmaci nelle loro forme bioattive . Così

si possono distinguere tre gruppi di persone: 1) persone che sono

“metabolizzatori attivi” che efficientemente convertono un determinato

farmaco nella sua forma attiva e/o lo metabolizzano ad una velocità che

produce l’effetto terapeutico desiderato; 2) persone che sono

“metabolizzatori deboli” che non convertono quantità sufficienti del

farmaco nella sua forma attiva o lo metabolizzano ad una velocità che non

permette di produrre un effetto terapeutico; 3) persone che sono

“metabolizzatori tossici” che convertono il farmaco in un prodotto tossico

o lo metabolizzano così lentamente che si accumula producendo livelli

tossici.


Farmacogenetica

L’enzima CPY2D6 è coinvolto nel metabolismo di almento

40 farmaci ed i soggetti “metabolizzatori modesti” dei farmaci

ereditano un enzima CPY2D6 difettoso.

1988: il clonaggio e sequenziamento del gene CPY2D6 ha

rivelato che i “metabolizzatori modesti” hanno polimorfismi di

questo gene che producono errori dello “splicing” o

sostituzioni di aa.

Infine, diversi appaiamenti di aplotipi di SNP nel gene

CPY2D6 predicono la risposta al farmaco anti-asma

albuterolo.

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