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15 lezione - Omero

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Il Sistema

Immunitario


Patogeno è qualsiasi organismo dotato del potenziale di provocare una malattia.

Divisi in 4 categorie:

batteri, funghi, virus, parassiti

Patogeno opportunista: colonizza l’organismo senza provocare una malattia.

Può divenire patogeno se le difese sono indebolite.

Batteri

Parassiti nei globuli rossi

SARS virus

Fungi


L’organismo reagisce all’invasione di un patogeno con due

tipi di risposta:

-Risposta immunitaria innata

-Risposta immunitaria acquisita

>umorale (cellule B , anticorpi)

>cellulo-mediata (cellule Tc e Th)

Il Sistema immunitario deve essere in grado di

disitinguere il self dal non-self (tolleranza verso il self)


IMMUNITA’

innata

acquisita

• aspecifica

• riconosce strutture

comuni

• sempre operativa

• sempre uguale

• previene l’infezione

• specifica

• riconosce strutture

specifiche

• consegue al contatto

• potenziata da contatti

ripetuti

• richiede l’infezione


IMMUNITA’ INNATA

• Comprende 4 tipi di barriere:

– Anatomica

• Cute

• Superficie delle mucose

– Fisiologica

• Temperatura

• pH

• Fattori solubili

– Endocitica/fagocitica

• fagocitosi

– Infiammatoria

• Complesso Risposta infiammatoria


Cute: -barriera meccanica ritarda l’ingresso dei microbi

- l’ambiente acido(pH 3-5) ne ritarda la crescita

Mucose: - la flora normale compete con i microbi per i siti di

attacco e i nutrienti

-il muco intrappola i microrganismi interi

- Le ciglia spingono i microrgansimi fuori dal corpo

Temperatura: -la normale t inibisce la crescita di alcuni patogeni

-la febbre inibisce la crescita di alcuni patogeni

pH:

- l’acidità gastrica uccide la maggior parte dei patogeni

ingeriti

Mediatori chimici: -lisozima scinde la parete batterica

-interferone induce uno stato antivirale nelle

cellule infettate

- Il sistema del complemento lisa i mocrorganismi e

facilita la fagocitosi


• 1-2 adesione del batterio a lunghe evaginazioni della membrana

(pseudopodi)

• 3- ingestione del batterio con formazione del fagosoma che si muove

verso il lisosoma

• 4- fusione del fagosoma e lisosoma con rilascio di enzimi lisosomiali nel

fagosoma

• 5- digestione del materila ingerito

• 6- rilascio di prodotti di digestione della cellula

Fagocitosi


INFIAMMAZIONE

Il danno tissutale provoca il rilascio di vari fattori vasoattivi e chemiotattici.

Questi fattori inducono aumento del flusso sanguigno nell’area, aumento della permeabilità capillare

e afflusso dei globuli bianchi, tra cui fagociti e linfociti.

Le proteine seriche contenute nell’essudato hanno proprietà antibatteriche e i fagociti incominciano

a fagocitare i batteri

Tra i principali mediatori chimici ci sono: proteine della fase acuta

istamina

chinine


Il Sistema immunitario:

meccanismi di base

Componenti del sistema immunitario: organi linfatici e leucociti.

Organi linfatici: i leucociti si sviluppano fino alla maturità negli organi linfatici PRIMARI (il

midollo osseo e nel caso dei linfociti T, il timo). Gli organi linfatici periferici mostrano

un’architettura reticolare che intrappola materiale estraneo presente nel sangue (milza), nella

linfa (linfonodi), nell’aria (tonsille e adenoidi) e in cibo e acqua (appendice vermiforme e

placche di Peyer nell’intestino).

Leucociti: si dividono in neutrofili, monociti e macrofagi (dai monociti), cellule fagocitarie

che “inglobano e distruggono” agenti estranei e detriti; gli eosinofili ed i basofili proteggono

invece dai grandi parassiti e sono coinvolti nelle reazioni allergiche.

Linfociti: si dividono in B (cellule B) e T (cellule T), specifici rispetto agli agenti esterni. I

linfociti non B e non T sono “natural killer (NK)” antivirali.


Organi del Sistema immunitario

Tonsille e adenoidi

Linfonodi

Vasi linfatici

Timo

Linfonodi

Milza

Appendicite

Midollo osseo

Placche di Peyer

Linfo nodi

Vasi linfatici


CELLULE


Cellule della linea linfatica

• Linfociti sono il 20-40% dei globuli bianchi e

99% delle cellule presenti nella linfa

• Nel corpo umano ci sono circa 10 11 linfociti

• Circolano nel sangue e nella linfa e possono

migrare nei diversi tessuti e organI linfatici

• Si dividono in

– Linfociti B

– Linfociti T

– Linfociti null (cellule natural Killer)


Linfociti B

• Maturano nel midollo osseo

• Esprimono sulla superficie un recettore (Ab) specifico per un

antigene (Ab=antibody anticorpo)

• Dopo l’incontro con l’Ag maturano e si differenziano in Linfociti B

della memoria e linfociti effettori (plasmacellule)

• Linfociti B della memoria esprimono lo stesso Ab delle cellule

progenitrici

• Una plasmacellula sercerne più di 2.000 Ab al secondo

• Le plasmacellule muoiono in 1-2 settimane


Cellule T

• Nascono nel midollo osseo e maturano nel timo

• Durante la maturazione esprimono sulla membrana uno

specifico recettore per l’Ag: recettore del linfocita T

(T cell receptor TCR)

• TCR riconosce Ag solo se è legato a proteine MHC,

glicoproteine polimorfiche, presentate da altre cellule

• Ci sono 2 sottopopolazioni di linfociti T:

– T helper (T H )

– Th1 e Th2

– T citotossiche (T c ) o killer




V H V H

ε δ

V L

C L

C H1

C H1

C L

V L

ζ

ζ

γ



ε

C H2

C H2

Igα/Ιgβ

C H3

C H3

Igα/Ιgβ

fyn

lck

Blk, Fyn or Lyn

Zap 70

RECETTORE CELLULE B

RECETTORE CELLULE T


• Antigeni sono sostanze in grado di indurre una risposta immunitaria

• Ci sono differenze fondamentali nel modo in cui i linfociti B e T

riconoscno l’Ag

• Immunogenicità e antigenicità sono due propietà

immunologiche correlate, ma distinte

• Un antigene è un immunogeno e l’antigenicità è la sua capacità di

reagire in maniera specifica con i prodotti finali delle risposte

immuni

• "TUTTI GLI IMMUNOGENI SONO

ANTIGENI, MA NON TUTTI GLI

ANTIGENI SONO IMMUNOGENI".


APTENE: molecola solitamente di piccole

dimensioni che hanno la proprietà di essere

antigeniche, ma che di per sé non è in grado

di evocare una risposta immunitaria (sono

prive di immunogenicità).

Può diventare anche immunogenica se si

lega a una molecola carrier.Può reagire con i

prodotti di una risposta immune specifica.


EPITOPO O DETERMINANTE ANTIGENICO:

PARTE DI UN ANTIGENE CHE ENTRA IN CONTATTO

CON IL SITO DI LEGAME DI UN ANTICORPO O COL

RECETTORE PER L’Ag DELLE CELLULE T o B. (GLI

EPITOPI SONO PRATICAMENTE LE PORZIONI PIÙ

IMPORTANTI DELL’ANTIGENE, CAPACI DI EVOCARE

LA RISPOSTA IMMUNITARIA).


Quando i farmaci diventano immunogeni

• I farmaci sono piccole molecole incapaci di scatenare la risposta

immunitaria se non sono associate a una molecola più grande

• La penicillina in alcuni individui può reagire con alcune proteine

dell’organismo per formare un derivato penicilloil-proteina (aptene-vettore),

in cui il derivato penicillinico, il gruppo penicilloil, ha la funzione di epitopo

aptenico

• Questo epitopo è riconosciuto dal sistema immunitario che produce Ab

(IgE) contro di esso. Le IgE vengono trasportate in tutto l’organismo dove

vengono riconosciute dai recettori per le IgE posti sui basofili (mast-cellule)

e rimanere per molto tempo. Se a una persona che ha anticorpi IgE contro

la penicillina viene somministrata penicillina, andrà incotro a reazione

allergica

• 1-5% della popolazione ha questo problema


SISTEMA

IMMUNITARIO

ACQUISITO


Sistema immunitario specifico

Origine

Linfociti:

1.Linfociti

T

2.Linfociti

B


• La selezione clonale dei linfociti B e linfociti T è alla base della risposta innata

• Sia i linfociti B che T esprimono recettori dotati di una singola specificità

– Linfociti B esprimono immunogobuline (Anticorpi, Ab)

– Linfociti T esprimono recettori

V L

V H V H Vβ Vα

C H1 C H1 V L

γ ε ε δ

ζ ζ Cβ C

C L

C L

α

C H2

C H2

Igα/Ιgβ

C H3

C H3

Blk, Fyn or Lyn

Igα/Ιgβ

fyn

Zap 70

lck

• Ciascun linfocita da origine a un unico tipo di molecola

• Ciascun linfocita, stimolato dal patogeno da origine a una popolazione di cellule che

esprimono tutte immunoglobuline o recettori delle cellule T identici (SELEZIONE

CLONALE)


Esempio: SELEZIONE CLONALE nei linfociti B

Ogni linfocita B esprime

sulla membrana 150.000

Anticorpi (recettori) identici per lo

stesso Ag


Antibody Molecule Structure

Ag binding

region

N terminal

end

Light Chain

disulfide

bonds

Heavy Chain

CHO

h

CH2

CH3

C terminal

end

CH1

CL

VH

VL

globular

domains

Ag

= Y


• 2 catene leggere identiche (L, light, 220 aminoacidi)

• 2 catene pesanti identiche (H, heavy, 440 aminoacidi)

• A forma di Y rovesciata

• Ponti S-S fra le catene

• 2 siti di legame per Ag (bivalenti)

• Zona di riconoscimento per Ag o Fab (Fragment Antigen

Binding) con sequenza di aminoacidi relativamente variabile

• Zona costante o Fc (Fragment cristallizzabile) con sequenza

di aminoacidi relativamente costante

• REGIONI IPER VARIABILI

• La variabilità della sequenza di aminoacidi è confinata in 3

regioni ipervariabili (5-7 aminoacidi per L, 6-17 aminoacidi

per H)

• Il sito antigenico è composto dalle regioni ipervariabili della

catena L e dalle regione ipervariabili della catena H

• Alta costante di affinità Ig-Ag (10 4 -10 11 l/mole)


Papain Cleavage


Papain Cleavage

2 Fab

Fc


Pepsin Cleavage


Pepsin Cleavage

F(ab’)2

Enzymatic degradation

of Fc fragment.


Funzione effettrice

Legame a C4b

C fissazione

(legame a C1q )

Si lega a FcR

(Mac, Mono)

Si lega a FcR

(neutrofili; NK cells)


Classi di anticorpi

Esistono 2 tipi di catene leggere

– K (uomo 60%)

− λ (uomo 40%)

Esistono 5 classi di catene pesanti:

µ, γ, α, δ, ε

Ognuna di queste diverse catene pesanti è chiamata

ISOTIPO

Ogni Ab è formato da 2 catene pesanti e 2 catene leggere

identiche H2L2, oppure è un multimero di questa struttura

base a 4 catene (H2L2)n


5 Classi di anticorpi nell’uomo

• Classe catena sottoclassi catena formula

pesante leggera molecolare

ΙgG γ γ1γ2γ3γ4 Κ, λ γ2Κ2, γ2 λ2

IgM µ nessuna Κ, λ (µ2Κ2)n

(µ2λ2)n n=1 o 5

IgA α α1, α2 Κ, λ (α2Κ2)n

(α2λ2)n n=1,2,3,4

IgE ε nessuna Κ, λ (ε2Κ2) (ε2λ2)

IgD δ nessuna Κ, λ (δ2Κ2) (δ2λ2)


Immunoglobuline: struttura

IgG, IgD, IgE, and IgA

IgA

IgM


Funzione degli anticorpi

• IgG:

• Coinvolte nella risposta umorale

• 70% delle Ig sieriche

• Azioni:

– Opsonizzazione

– Neutralizzazione di microbi e tossine

– Attivazione del complemento per via classica

– Attraversare la placenta

• IgM:

• Primi a comparire nel sangue in risposta ad antigeni

• Potere agglutinante a causa dei molteplici siti disponibili

• Attivatori del Complemento

• Non attraversano la placenta


• IgA:

• Ig dimeriche

• Sintetizzate da linfociti B dei tessuti linfoidi associati alle mucose

• Presenti nelle secrezioni, latte, saliva, lacrime, etc.

– Impediscono l’aderenza di microrganismi.

– Scarsa attività opsonizzante

– Attivazione del complemento per via alternativa

• IgE:

• Reazioni di ipersensibilità di Tipo I (asma, febbre da fieno)

provocando il rilascio di citochine e mediatori infiammatori.

• Attivi nelle infezioni da parassiti favorendo l’attività citotossica degli

eosinofili.

• IgD:

• Ig di membrana espresse sulla superficie dei linfociti.

• Ruolo non chiarito, ma sono importanti drante la differenziazione dei

linfociti B.


Ruolo delle IgE nella secrezione di istamina

Recettore Fc

per IgE

IgE

Ag

mastocita

Vescicole di

istamina

Istamina

Vasodilatazione, reazioni

allergiche

Rilascio di

istamina


Caratteristiche delle risposte immunitarie

• Versatilità: numero di potenziali

Ag>10 8 :

Molecole fisiologiche

Virus

Cellule

Molecole non fisiologiche (intolleranze

a materiali sintetici)

• Memoria: La prima esposizione a Ag

provoca la produzione di Ab che

rendono la seconda esposizione a Ag

meno dannosa della prima

• Umorali: Produzione di Ab solubili

che circolano nel sangue

Formazione del complesso Ab-Ag

Precipita con la sostanza estranea

(complemento) o marcatura per la

distruzione (macrofagi)

• Cellulari: Produzione di cellule

(linfociti T) dagli organi linfoidi

10 12 linfociti nell’organismo


Teoria della selezione clonale

• Il sistema immunitario è composto da milioni di cloni provenienti da un

progenitore comune

• Ogni linfocita:

E’ destinato a reagire con un Ag specifico prima dell’esposizione a Ag

> “Pronto per l’uso”, e non “fatto su misura”

Possiede recettori (Ig) sulla superficie che riconoscono un solo Ag

Prolifera e matura solo dopo il riconoscimento

• 3 stadi di sviluppo delle cellule:

Cellule vergini (o naïve)

Cellule memoria che vivono a lungo (mesi/anni)

Cellule attivate che producono Ab e vivono pochi giorni


Come distinguere il self dal non-self

• L’organismo eredita tutti i geni dei recettori non-self, ma non i geni dei

recettori del self: NO!

• Il sistema immunitario risponde alla presenza dei vari Ag, imparando a non

rispondere al self: NO!

• La tolleranza verso il self non è congenita ma acquisita durante la vita

fetale

Clonal deletion: eliminazione dei linfociti diretti contro il self

Clonal anergy: i linfociti diretti contro il self sono inattivati ma vivi (la

riattivazione conduce alle malattie autoimmuni, ad es lupus eritematoso)


• 4 catene polipeptidiche

2 catene leggere identiche (L, light, 220

aa)

2 catene pesanti identiche (H, heavy,

440 aa)

A forma di Y

Ponti S-S fra le catene

• 2 siti di legame per Ag

• 3 zone:

Zona cerniera (hinge region)

Zona costante o Fc (Fragment

Cristallizzabile) con sequenza di

aminoacidi relativamente costante

Zona di riconoscimento per Ag o Fab

(Fragment Antigen Binding) con

sequenza di aminoacidi relativamente

variabile

Immunoglobuline


Struttura primaria

• Catene H e L: segmenti ripetuti di 110

aminoacidi con notevole analogia

• Dominii variabili (V) e costanti (C)

• Catena L=VL + CL

• Catena H=VH + CH1 + CH2 + CH3

Catena pesante H

-S-S-

-S-S-

C H 3

C H 2

Parte costante

Catena leggera L

-S-S-

-S-S-

Sito di legame con Ag

C H 1

V H

C L

V L

Parte variabile

Gerald M. Edelman

Rockefeller University

New York, NY, USA

Rodney R. Porter

University of Oxford

Oxford, United Kingdom

Premio Nobel 1972


Isoforme della parte costante di Ig

• 5 isoforme H, determinano la classe

IgM, isoforma µ

IgG, isoforma γ

IgA, isoforma α

IgD, isoforma δ

IgE, isoforma ε

• 2 isoforme L, presenti in tutte le classi di Ig

κ e λ


Paradosso

• Esistono 10 8 Ab differenti (un Ab per ogni Ag), ma il genoma

umano contiene 20 000 geni al massimo:

Come produrre più Ab di quanti sono i geni nel genoma

• Ipotesi degli anni ‘70 (non si conoscevano i domini delle proteine):

Un sito antigenico è determinato da 1 catena H e 1 catena L

Se ci fossero 1000 geni per L e 1000 geni per H, ci potrebbero

essere 1000x1000=10 6 differenti siti antigenici

Problema: Il meccanismo dovrebbe essere così sofisticato che

una parte dei geni che codificano le catene L e H (sempre

quella!) rimane sempre costante, mentre il resto può mutare

selvaggiamente: Bello ma FANTASCIENTIFICO !!!

• Oggi: Ricombinazione degli esoni

Generazione di una grande variabilità di proteine differenti

congiungendo segmenti separati di geni prima della

trascrizione a RNA

Avviene nelle cellule B prima dell’esposizione a qualunque Ag


Codificazione di κ L

• 1 sequenza leader (1 copia per gene) → 20 aa per trasportare Ig fuori dalla

cellula (non mostrata)

• 1 segmento V (150 copie) → 95 aa (regione variabile)

• 1 segmento J (5 copie) → 13 aa (regione variabile)

• 1 segmento C (1 copia) → 110 aa (regione costante)

• Calcolo combinatoriale:

150 V x 5 J = 750 diverse catene κ L

Giunzione V-J non ben definita, n. possibilità x 10

Totale: 7500 combinazioni diverse per le catene κ L


• Segmenti V: 80 copie

• Segmenti D: 50 copie

• Segmenti J: 6 copie

• Segmento C: 1 copia

• Calcolo combinatoriale:

Codificazione delle catene H

80 V x 50 D x 6 J = 24 000 diverse catene H

Giunzione V-J non ben definita, inserzioni random nelle giunzioni V/D e

D/J

Totale: 2.4 milioni di combinazioni


Calcolo combinatoriale per l’intero sito antigenico (catena L +

catena H)

• Il sito antigenico è composto da 1 catena H e 1 L

• Totale delle combinazioni possibili per il sito:

• 7500 x 2.4 milioni = 18x10 9

Questa enorme variabilità è generata da non più di 300

segmenti di DNA differenti

Susumu Tonegawa, Japan

Massachusetts Institute of Technology (MIT)

Cambridge, MA, USA

Premio Nobel 1987


Fusione di cellule somatiche e

produzione di anticorpi monoclonali

di topo


Cellule eucariote possono sopravvivere al trattamento con aminopterina (inibitore

della DHFR) utilizzando la via di salvataggio per la sintesi del DNA, purché non siano

mutate nei geni che codificano gli enzimi Tk (Timidino-chinasi) o HGPRT

(Ipoxantina-Guanina Fosforibosil-Trasferasi)

amminoacidi + zuccheri

via classica

DHFR dihydrofolate reductase

aminopterina

nucleotidi

DNA

Tk Timidino-chinasi

basi azotate

HGPRT Ipoxantina-Guanina Fosforibosil-Trasferasi

via di salvataggio


G. Kohler e C. Milstein:

Continuous cultures of fused cells secreting antibodies of predefined specificity

Nature 256: 495-497 (1975)

Partner della fusione:

• Cellule di mieloma di topo HGPRT - che proliferano ma non producono anticorpi

• Splenociti di topo iperimmune nei confronti di eritrociti di pecora.

Gli splenociti sono HGPRT + e possono produrre anticorpi

ma non proliferano.

Fotografia originale

dei primi ibridomi


1

4

1

coltura di cellule

di mieloma HGPRT -

sospensione di splenociti

(10 8 cellule) in terreno

senza siero

centrifugazione

Immunizzazione

2

splenectomia

3

2

verifica della risposta

immunitaria specifica

3

unione delle

due sospensioni

di cellule

4

risospensione

in terreno

senza siero

(2 x 10 7 cellule)


centrifugazione

risospensione

in terreno

HAT

sospensione

mielomasplenociti

centrifugazione

trattamento

con PEG del

pellet per

indurre la

fusione

diluizione graduale

del PEG in terreno

senza siero

PIASTRAMENTO


La selezione viene effettuata in terreni di coltura selettivi

contenenti ipoxantina, aminopterina e timidina (HAT).

L’aminopterina è un analogo dell’acido folico, che blocca la sintesi

delle purine e pirimidine endogene; quindi le cellule per

mltiplicarsi devono servirsi della via alternativa di biosintesi fornita

dall’enzima HGPRT, che permette di utilizzare l’ipoxantina e la

timidina esogene presenti nel terreno HAT. Lecellule prive di

questo enzima muoiono in terreno HAT. I linfociti B e gli

ibridomi cellula B-cellula B, possiedono l’enzima HPRT e

sarebbero quindi capaci di moltiplicarsi in terreno HAT, ma non

essendo immortali non sono capaci di sopravvivere a lungo in

coltura e muoiono dopo poco tempo. Gli ibridomi mielomamieloma

mancano dell’enzima HPRT e di conseguenza

non riescono a sopravvivere. Solo l’ibridoma cellula B-cellula

mielomatosa, che ha l’enzima HPRT fornitogli dalle cellule

spleniche, può utilizzare l’ipoxantina e timidina esogene e quindi

sopravvivere emoltiplicarsi nel terreno di selezione.


Selezione di ibridi somatici. Cellule Tk - e cellule HGPRT - non possono crescere in un

terreno nel quale sia presente l’Aminopterina: la via classica è bloccata dalla

Aminopterina, la via di salvataggio è inattiva se manca anche solo uno dei due enzimi.

amminoacidi + zuccheri

via classica

DHFR

aminopterina

nucleotidi

DNA

Tk - HGPRT -

basi azotate

via di salvataggio


Piastramento delle cellule in diluizione limite (almeno 1000

subcolture) in piastre “Microtiter” in terreno selettivo HAT

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Trasferimento di un’aliquota

di surnatante da ciascuna subcoltura

nella piastra-saggio,

rispettando le posizioni

B

C

D

E

F

G

H


Dosaggio immuno-enzimatico

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

surnatante dalle

subcolture

Pozzetto rivestito

con l’antigene

B

C

D

E

F

G

H

L’anticorpo che non

riconosce l’antigene

non si lega

OPD

+

H 2 O 2

(incolore)

Reazione

positiva

(colore)

L’anticorpo specifico

per l’antigene si lega

HRP HRP

Reazione

negativa

Aggiunta di un anticorpo anti-Ig di topo

coniugato con l’enzima perossidasi (HRP)

pozzetto con

anticorpo specifico

pozzetto senza

anticorpo specifico


A

B

C

D

E

F

G

H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Nella piastra-saggio, alcuni pozzetti

danno reazione positiva nei confronti

dell’antigene. Le relative subcolture

vengono recuperate dalla piastra madre,

riclonate, ricontrollate e coltivate in

fermentatori.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

D

E

F

G

H

A

B

C

D

E

F

G

H

A

B

C

D

E

F

G

H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


Applicazioni degli anticorpi monoclonali

• Dosaggi immunologici per uso diagnostico e di ricerca

• Purificazione di antigeni mediante immunoaffinità

• Analisi e purificazione di sottopopolazioni cellulari

• Identificazione di antigeni differenziativi

• Anticorpi neutralizzanti infezioni virali e indagini

sulla struttura/funzione di proteine

• Analisi del proteoma


VANTAGGI E LIMITI DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI MURINI

• Gli anticorpi sono specifici per un epitopo della molecola riconosciuta.

• Possibilità di produrre anticorpi nei confronti di antigeni ancora ignoti

o di miscele di antigeni.

• Possibilità di mantenere i cloni congelati per lunghi periodi di tempo.

• Possibilità di effettuare studi sugli mRNA dei singoli cloni e clonare le

sequenze che determinano la specificità in sistemi procariotici

o eucariotici.

• Limitate applicazioni in immunoterapia: risposte immunitarie contro

le Ig di topo da parte dei pazienti.


Solo in tempi relativamente recenti (Karpas, P.N.A.S. 2001) è stata

isolata una linea di mieloma umano capace di fondersi con buona

efficienza con linfociti B umani, generando anticorpi monoclonali umani

mieloma umano

HGPRT -

linfociti B umani

HGPRT + S

Fusione e selezione in HAT

per favorire solo la crescita degli ibridi

e la produzione di anticorpi umani


Tecniche immunoenzimatiche

La specificità delle reazioni antigene-anticorpo e la sensibilità di

“marcatori” (isotopi, sostanze fluorescenti, radicali liberi, enzimi)

possono essere combinate insieme per compiere un “dosaggio

immunologico”, ossia quantificare con precisione una sostanza

antigenica.

La tecnica più usata è il dosaggio radioimmunologico (RIA), in cui il

tracciante è costituito da un isotopo.

Vantaggi:

- elevata sensibilità, della facilità con cui si ottengono le marcature

isotopiche

- invariabilità delle cinetiche di reazione a seguito della marcatura

stessa.

Svantaggi:

- alti costi dei reattivi e delle apparecchiature,

- deperibilità, pericolosità e difficoltà di smaltimento dei composti

radioattivi,


Quando il tracciante è costituito da un enzima, si parla di

dosaggi immunoenzimatici (EIA).

In questo caso non viene misurato direttamente il marcatore,

ma la sua attività nei confronti di un suo substrato specifico

(ovvero la quantità di prodotto formato).

È da tener presente che l’attività enzimatica, come pure

l’affinità fra Ab e Ag, può variare a seguito della

coniugazione fra enzima e anticorpo (o antigene).

Vantaggi:

- minor costo,

- assenza di rischi derivati dall’esposizione a radiazioni,

- maggior praticità e versatilità.


Saggio competitivo diretto

uso del coniugato Antigene-Enzima

Una quantità fissa di antigene marcato e diluizioni decrescenti di

antigene libero (come standard o nel campione) vengono messe a reagire

insieme nei confronti di un anticorpo in difetto. In questo modo,

l’antigene marcato e libero si troveranno a competere per un numero

limitato di siti anticorpali. Dopo aver lavato il complesso, si aggiunge il

substrato per l’enzima e si misura l’attività enzimatica

spettrofotometricamente, fluorimetricamente o mediante

chemioluminescenza. La concentrazione del prodotto enzimatico

misurata risulterà inversamente proporzionale alla concentrazione

dell’analita.


Saggio competitivo diretto

uso del coniugato Anticorpo-Enzima

Questo tipo di saggio competitivo coinvolge l’uso del coniugato

anticorpo-enzima, con l’antigene immobilizzato sulla fase solida. La

reazione di competizione avviene fra l’antigene immobilizzato e quello

libero in soluzione come standard o proveniente dal campione, nei

confronti dell’anticorpo marcato presente in concentrazione fissa e in

difetto. La misura del prodotto della reazione enzimatica sarà

indirettamente proporzionale alla concentrazione di antigene presente

nel campione.


Saggio competitivo indiretto

uso di un anticorpo secondario

La procedura implica l’uso di un anticorpo secondario marcato, in grado di

riconoscere la regione costante dell’anticorpo primario, precedentemente

incubato su fase solida.

La reazione di competizione avviene fra l’antigene immobilizzato e quello

libero in soluzione come standard o proveniente dal campione, nei confronti

dell’anticorpo presente in concentrazione fissa.

La misura del prodotto enzimatico sarà direttamente proporzionale nel caso

della misura del titolo dell’anticorpo da determinare, mentre inversamente

proporzionale per l’analita.


Saggio non competitivo

Saggio ELISA a sandwich

Questa metodica può essere utilizzata esclusivamente quando l’analita

possiede almeno due determinanti antigenici.

Un eccesso di anticorpo verso il primo sito antigenico viene

immobilizzato sulla fase solida e incubato con diluizioni successive di

antigene presente nel campione o in soluzioni standard. Dopo il

lavaggio, il complesso Ag-Ab immobilizzato viene incubato con una

concentrazione fissa di anticorpo marcato che andrà a legarsi al

secondo sito antigenico dell’immunocomplesso. La misura del

prodotto della reazione enzimatica risulterà direttamente proporzionale

alla concentrazione dell’antigene da stimare.


Fattori che influenzano la scelta del metodo

•Le tecniche ELISA non competitive offrono una maggiore

sensibilità rispetto alle competitive.

•La rilevabilità finale di un’analisi competitiva è limitata dalla

costante di affinità dell’anticorpo usato.

•La sensibilità finale dei saggi non competitivi è determinata dal

binding non specifico degli immunoreagenti marcati.

•Nei saggi competitivi diretti, dipende dal grado di purezza e dalla

stabilità degli immunoreagenti, Ag o Ab, marcati con l’enzima.

•Quando di lavora con campioni reali (sieri, urine, tessuti, ecc),

possono essere presenti proteine in grado di modificare i traccianti

enzimatici (proteasi), oppure di inibirne l’attività.

•L’uso dell’anticorpo secondario consente un’amplificazione della

risposta del saggio, poiché quando si lavora con il solo anticorpo

primario la sensibilità dell’analisi è fortemente influenzata

dall’affinità del sistema Ag-Ab-E.


Sensibilità

•concentrazione dell’analita,

•sensibilità del sistema di rivelazione,

•affinità dell’anticorpo da usare,

•tempo di incubazione

•tempo di sviluppo del prodotto enzimatico,

•precisione del saggio

• volumi impiegati.

Sensibilità (analitica) : capacità di un metodo di distinguere piccole

variazioni di concentrazione di analita. Nella terminologia abituale

immunochimica: capacità di un metodo di distinguere da zero piccole

concentrazioni di analista, inversamente correlata al limite di rivelazione

o di misura, o alla minima concentrazione misurabile (rivelabilità).

Specificità (analitica) : capacità di un metodo di determinare


Scelta dell’enzima

L’enzima da utilizzare in un saggio ELISA deve possedere i seguenti

requisiti:

1 - deve essere stabile in un intervallo di temperatura compreso fra 25 e

37° C, con un tempo di vita di almeno sei mesi a 4° C

2 - deve essere disponibile commercialmente e ad un prezzo

ragionevole

3 - la sua attività deve essere facilmente misurata con opportuni tests

(colorimetrici, fluorimetrici, ecc.)

4 - deve essere facilmente dosabile e possedere un alto numero di turnover

e inoltre il suo prodotto di reazione deve avere un alto

coefficiente di estinzione molare

5 - non deve risentire degli effetti negativi della matrice in cui

eventualmente è svolto il saggio

Gli enzimi normalmente più usati sono la perossidasi da rafano, la


ANALISI DEI DATI

1 0 0

8 0

% A/A

0

6 0

4 0

2 0

0

1 0 - 4 1 0 - 3 1 0 - 2 1 0 - 1 1 0 0 1 0 1

[ a n a l i t a ]

Curva di concentrazione/risposta (curva standard, di calibrazione, di taratura) :

espressione grafica dell’andamento della risposta del saggio al variare della

concentrazione dell’analita (standard) utilizzata come scala di calibrazione per

interpolare le risposte relative ai campioni incogniti.

Modello logit-it logistico a “4

parametri”

Y = (a - d)/[1 + (x/c) b ] + d

a = valore asintotico del massimo (dose massima)

b = pendenza del tratto rettilineo della sigmoide

c = IC 50

, ovvero concentrazione dell’analita

nel campione in grado di legare il 50% dell’anticorpo

d = valore asintotico del minimo (dose 0)


Visualizzazione delle proteine nel gel

I due metodi piu’ usati sono:

Colorazione con il Coomassie Brilliant

Colorazione con l’argento “Silver staining” (puo’ essere

visualizzato ~1ng di proteina per banda)

Coomassie staining

Silver staining


Western Blotting


Southern Blot: Per l’analisi del DNA.

(sonda = DNA o RNA).

Northern Blot: Per l’analisi dell’ RNA.

(sonda = DNA o RNA).

Western Blot: Per l’analisi delle proteine.

(sonda = anticorpo).


Cosa e’ un Western Blot

Una tecnica in cui le proteine sono separate

mediante elettroforesi su gel e

successivamente trasferite su un supporto

(membrana o filtro). Successivamente una

specifica proteina viene identificata mediante

la sua reazione specifica con un anticorpo.


A cosa serve il Western Blot

Qual e’ la proteina che mi interessa

SDS-PAGE (non certo)

Si basa sul confronto di peso molecolare

Western blot (certo)

Si basa su una reazione specifica antigene-anticorpo



+


A cosa serve il Western Blot

Quanta proteina di interesse c’e’

Proteina

di interesse

Bande non

specifiche

Densita' media

(intensita')

100

80

60

40

20

0

1 100 10000

[Proteina], pg

Pg di Proteina


Fasi di un Western Blot

Prima fase: elettroforesi su gel.

(Le proteine del campione vengono separate su un

gel in base alle loro dimensioni)

Seconda fase: trasferimento su membrana.

(Le proteine nel gel sono poi trasferite su una

membrana di nitrocellulosa mediante un campo

elettrico)

Terza fase: saturazione o “blocking”.

(La saturazione e’ usata per prevenire le interazioni

non specifiche tra l’anticorpo e la membrana)


Fasi di un Western Blot

Quarta fase: legame dell’anticorpo primario.

(L’anticorpo riconosce la proteina specifica immobilizzata

sulla membrana)

Quinta fase: legame dell’anticorpo secondario.

(L’anticorpo secondario, coniugato a un enzima (AP o

HRP), riconosce specificamente l’anticorpo primario, gia’

legato alla proteina sulla membrana)

Sesta fase: rivelazione o “detection”.

(L’enzima coniugato all’anticorpo secondario scinde un

substrato che, in corrispondenza della proteina specifica,

sviluppa precipitato colorato o chemioluminescenza)


Western blot: seconda fase

Immobilizzazione e trasferimento

Le proteine nel gel sono ancora in soluzione


Le bande diffondono e si confondono col tempo

E’ necessaria l’immobilizzazione per:



Preservare in maniera permanente l’esperimento di

elettroforesi

Permettere il riconoscimento di proteine specifiche

La strategia piu’ comune e’ il trasferimento su

membrana



Fatta di Nitrocellulosa, PVDF (Polivinilidene fluoride) o nylon

Si usa l’elettroforesi, in un processo detto ‘blotting’


Western blot: seconda fase

Immobilizzazione e trasferimento

membrana


Western blot: seconda fase

Immobilizzazione e

trasferimento

Elettroblotting

Apparato di trasferimento

Il gel e’ messo tra strati di carta da filtro con la

membrana a diretto contatto col gel sul lato verso

l’elettrodo positivo

Viene applicato un campo elettrico e le proteine

migrano fuori dal gel verso l’elettrodo positivo e si

legano alla membrana

Fatto a 4°C per evitare surriscaldamento,

decomposizione del tampone e degradazione

delle proteine


Western blot: seconda fase

Immobilizzazione e trasferimento

Trasferimento dal catodo

(-) all’ anodo (+)

1) Spugnette

2) 3 fogli di carta da filtro

imbevuti di tampone di

trasferimento

3) Gel

4) Membrana

5) 3 fogli di carta da filtro

imbevuti di tampone di

trasferimento

6) Spugnette


Apparato per il trasferimento “Semi-dry”


Buffer-soaked

filter papers

Western Blotting

Nitrocellulose

membrane

-

+

Gel

Buffer

Electrode

SDS-PAGE

Direction of

transfer

Assemble ‘sandwich’

Wet blotting

Graphite Electrode Plates

-

+

Semi-dry blotting

Nitrocellulose with bound proteins

Stained

(Red

Ponceau)


Western blot: seconda fase

Immobilizzazione e

trasferimento

Componenti del tampone di

trasferimento:

25mM Tris

190mM glicina

20% metanolo


Western blot: terza fase

saturazione o “blocking”

Per saturare i siti idrofobici

liberi sulla membrana

Per prevenire il legame

dell’anticorpo primario alla

membrana stessa

Latte scremato o Albumina

di Siero Bovino (BSA)


Western blot: quarta fase

incubazione con anticorpo

primario

L’anticorpo primario riconosce la proteina di

interesse e non lega le altre proteine

immobilizzate sulla membrana

Anticorpi come sonde:

Molto sensibili

Possono essere “prodotti”

Immunizzando una specie diversa (anticorpi policlonali)

Generando anticorpi monoclonali (mAb)

Economici


Anticorpi

Ab + Ag AbAg

Kd

Kd = = 10 -9 M

[Ab]

[AbAg]


Anticorpi (immunoglobuline, Ig)

Una proteina a forma di

Y secreta nel sangue in

risposta ad uno

specifico antigene,

come un batterio o un

virus, che neutralizza

l’antigene legandosi

specificamente ed esso

e producendo una

risposta immunitaria.

Anticorpi


Anticorpi policlonali

Produzione

Immunizzazione ripetuta dell’animale con

l’antigene (peptide, proteina purificata o

ricombinante)

Il sangue e’ prelevato nel momento di picco di

produzione dell’anticorpo ed e’ purificato il

siero

Il “pool” degli anticorpi riconosce molti epitopi

dell’antigene usato per l’immunizzazione


Anticorpi monoclonali

Riconoscono solo

un epitopo


Western blot: quarta fase

incubazione con anticorpo primario


Western blot: quinta fase

Incubazione con anticorpo secondario


Anticorpi

Anticorpo primario

Riconosce la

proteina

Anticorpo secondario






Lega l’anticorpo primario

Generalmente prodotto in

una specie diversa

Coniugato con un enzima

Il substrato dell’enzima

sara’ convertito in un

prodotto colorato

Puo’ anche essere

radioattivo o fluorescente


Western blot: quinta fase

Incubazione con anticorpo secondario


Western blot: sesta fase

rivelazione o “detection”

Fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi del

rafano (HRP: horseradish peroxidase)

Conversione di un substrato colorimetrico in un

precipitato colorato

Substrati Chemioluminescenti

Emettono luce se convertiti dall’enzima

Possono essere visualizzati su lastre radiografiche

Marcatura radioattiva

Anticorpi secondarii biotinilati


Western blot

substrato

HRP

HRP

luce

Anticorpo primario Anticorpo secondario Rivelazione

Il substrato metabolizzato dalla perossidasi (HRP) emette luce

pg proteina

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