genome

Bioinformatica
• Prof. Raffaele Calogero
raffaele.calogero@unito.it
Tel. 011 6705417
Cell. 333 3827080
Orari di ricevimento:
– in qualunque momento
• Testo:
– Introduzione alla Genomica, Gibson & Muse (Zanichelli)
• Capitoli trattati durante le lezioni.

Whole Genome Shotgun Assembly
Two strategies t for sequencing:
clone-by-clone approach
whole-genome shotgun approach
(Celera, Gene Myers).
Shotgun sequencing was
introduced by F. Sanger et al.
(1977) and has remained the
mainstay of genome sequence
assembly for nearly 25 years now.
ED Green, Nat Rev Genet 2, 573 (2001)

Il sequenziamento gerarchico
del genoma umano

• Passaggi principali del sequenziamento
gerarchico

Mappa fisica
• Un punto importante preliminare al sequenziamento del genoma
umano è stata la costruzione di una mappa fisica ad alta risoluzione
di ognuno dei cromosomi umani.
• Per completare una mappa fisica di 3 x 10 9 basi è necessario
disporre di libraries genomiche comprensive di tutto il genoma
suddiviso i in frammenti sovrapposti eclonati in appositi vettori.
• Una delle caratteristiche di queste libraries genomiche è che devono
essere costituite da grossi frammenti di DNA nell’ordine di 100-300
Kb in modo che con 2-5 x 10 5 cloni indipendenti è possibile avere la
completa rappresentazione del genoma.
∼300 kb
Eterocromatina
costitutiva
gaps

BAC: Bacterial artificial chroosome
• Nel 1992 è stato sviluppato un
vettore di clonaggio basato sul
fattore episomale F di
Escherichia coli.
• IlfattoreFdiE.colièunDNA
extracromosomale circolare che
contiene sul suo DNA alcuni
geni regolativi:
• oriS e repE
• parA e parB
• I vettori BAC sono caratterizzati
ti
da:
• un marcatore fenotipico
• siti cosN del batteriofago
lambda e loxP del batteriofago
P1
• una serie di siti di restrizione
rari.

• Costruzione di librerie di cloni contenenti 50-
200Kb

Sequenziamento gerarchico
• Filtrazione: i rimozione i dalle librerie i di
genomiche di materiale spurio (frammenti
di genoma batterico)
• Assemblaggio: ordinamento delle contig di
ciascun BAC/PAC e successivo
allineamento e delle e contig tg sui cromosomi
oso
via STS
• Merging: assemblaggio dei vari contig
negli “scaffolds” cromosomici

Ordinamento dei cloni BAC

BAC
Fingerprint:

• Il chromosome walking
permette di costruire delle
contig in modo sequenziale.
• Usando la sequenza terminale
di un primo clone si
identificano altri che la
condividono.
• Usando l’analisi dei profili di
restrizione è possibile
ricostruire consequenzialità dei
vari cloni.
• Si isola una nuova sequenza
terminale e si ripete la
procedura.

• Dal punto di vista storico il metodo principale per allineare le
mappe fisiche con le genetiche è l’uso delle mappe
citologiche.
i • Le mappe citologiche sono profili di bandeggio cromosomico
osservabili al microscopio i ottico su piastre metafasiche
colorate.
• L’ibridazione in situ di frammenti di DNA (STS, sequence
tagged site) permette l’allineamento con la mappa fisica.

Ricombinazione
genomica
• La ricombinazione tende ad
essere soppressa vicino al
centromero ed incrementare
notevolmente nelle parti distali
del cromosoma con particolare
riguardo per le ultime 20-35 Mb.
• La ricombinazione è più alta in
cromosomi corti per permettere
almeno un crossing-over over per
braccio, anche perche’ i
crossing-over sembrano essere
necessari per la corretta
disgiunzione meiotica delle
coppie di cromosomi omologhi.

Ricombinazione
genomica
• La ricombinazione
media per cromosoma
aumenta in funzione
della riduzione della
lunghezza del braccio
del cromosoma.
• Lunghe braccia
cromosomiche hanno
una media di
ricombinazione di un cM
per Mb mentre braccia
corte possono arrivare a
2 cM per Mb.

Mappatura citogenetica
Bandeggiamento:
• C-banding
• N-banding
• D-banding • T-banding
• G-banding

Integrazione tra citogenetica e sequenze
genomiche
• Il collegamento tra mappa citogenetica e sequenza nucleotidica è
stato realizzato attraverso l’uso delle STS (sequenze tagged site)
che sono delle sequenze uniche del genoma.
• La definizione di una mappa fisica genomica di STS è stato uno dei passi
preliminari al sequenziamento del genoma umano.
• Utilizzando una tecnica nota come FISH è stato possibile mappare
la posizione di lunghi frammenti genomici (100-200 kb), contenenti
una o piu’ STS, sul cromosoma metafasico e di conseguenza
associare la posizione delle STS all’interno delle bande citogenetiche

FISH: Trisomia del 21
FISH

Integrazione tra citogenetica e sequenze
genomiche

Integrazione tra citogenetica e sequenze
genomiche

• Una fase
importantissima nel
sequenziamento del
genoma umano è
stato lo sviluppo di
nuove tecnologie di
sequenziamento
automatico:
– Incremento della
lunghezza dei
frammenti sequenziati
– Maggiore high-
throughput

Automated Sequencing
nearly all automatic ti sequencing is done using the enzymatic dideoxy chaintermination
method of Sanger (1977).
Separation of fragments by gel electrophoresis.
Readout of fragments labeled with fluorescent dyes.
Computer analysis of gel images:
- lane tracking – identify gel boundaries
- lane profiling – sum each of 4 signals across lane width to create a profile
- trace processing – deconvolute and smooth signal estimates + reduce noise
- base-calling in which the processed trace is translated into a sequence of bases.
Program Phred is quasi-standard for last step (base calling).

Base Calling - Phred
B. Ewing, L. Hillier, M.C. Wendl, P. Green Base-calling of automated sequencer traces using Phred.
I. Accuracy assessment. Genome Res 8, 175-185 (1998).
B. Ewing, P. Green. Base-calling of automated sequencer traces using Phred. II. Errror probabilities.
Genome Res 8, 186-194 (1998).
The processed traces are displayed as chromatograms of 4 curves of
different color, each curve representing the signal of 1 of the 4 bases.

Base Calling - Phred
Idealized traces would
consist of evenly spaced,
nonoverlapping peaks.
Quality:
high – no
Real traces deviate from ambiguities
this ideal due to imperfections
of the sequencing
reactions, of gel electro-
phoresis, and of trace medium – some
processing.
ambiguities
The first 50 or so peaks
and peaks over 500 or so
are particularly noisy.
Poor – low
confidence

Phred
• La probabilità di errore di lettura di una base
generata da Phred è data da:
– La variazione di distanza del picco in un intervallo di
sette picchi, con al centro la base in corso di
identificazione.
i
– Il rapporto tra il più alto ed il più basso picco non
identificato nello stesso intervallo.
– Lo stesso rapporto in un intervallo costituito da tre
picchi.
– Il numero di basi tra quelle in esame e quella vicina
non identificata.

Phred
• La probabilità di errore (P) è trasformata in un
punteggio che corrisponde a 10 volte il logaritmo
negativo di P.
• Un punteggio di phred inferiore a 13 indica che
c’è una probabilità di errore >0.05.
• Un punteggio di phred maggiore a 30 indica che
c’è una probabilità di errore

• Ciascun tracciato è
accompagnato da due
righe (automatica e
manuale).
– A) Notevole rumore di
fondo dato dalla lettura
delle prime basi
– B) Presenza di tratti
polimorfici in due
sequenze
– C) Dopo 800 basi si
osserva in genere una
degradazione della
qualità della sequenza
• Distribuzione dei punteggi
phred su 26000 letture di
sequenza. Gli istogrammi
i
più scuri rappresentano la
qualità di lettura per basi
comprese tra 100 e 400.
• Gli istogrammi più chiari
rappresentano i punteggi
assegati a tutta la
sequenza leggibile

Phrap & Consed
• Phrap:
– Programma che permette l’assemblaggio delle sequenze
derivate dallo stesso clone in una contig
• Consed:
– Programma grafico per la valutazione e manipolazione dei
og a a g a co pe a a uta o e e a po a o e de
risultati dell’assemblaggio phrap

Quanti frammenti devo sequenziare
• Considerando N frammenti di lunghezza h
distribuiti su un genoma di lunghezza G, il
grado di copertura è dato da:
Shotgun sequencing
• Se N è grande e h è piccolo la
distribuzione ib i dei frammenti puo’ essere
approssimata ad una distribuzione di
Poisson con media pari al grado di
copertura a.
• Data la distribuzione di Poisson la
probabilità che l’estremo lestremo sinistro di un
frammento sia presente in un punto
scelto casualmente è pari a:
a =
Nh
G
p
=1− e
−a

Quanti frammenti devo sequenziare
p =1−1
e
−a
• Per avere una probabilità bl del 0.99 a=4.6.
• Per avere una probabilità del 0.999 a=6.9
• Essendo il genoma umano 3 x 10 9 basi anche con
un copertura di 6.9 rimangono 3 x 10 6 basi non
sequenziate.

Sequenziamento shotgun

Passaggi del sequenziamento
shotgun
• Screener: mascherare le sequenze
ripetute.
• Overlapper: assemblare tra loro i
frammenti
– Le sovrapposizioni specifiche hanno una
17
probabilità di apparire una volta ogni 10 17
comparazioni quindi è poco probabile che
compaiano 2 volte nello stesso genoma se
non ci sono state duplicazioni recenti.

Passaggi del sequenziamento
shotgun
• Unitigger: ragguppamento delle contig
basate su sequenze non ripetute e ripetute
in unitig, che sono una serie di sequenze
uniche che non si sovrappongono in modo
ambiguo.
• Scaffolder: assemblaggio delle unitig in
scaffolds.

• Assemblaggio nel sequenziamento shotgun:
– A: asseblaggio per sequenze singole (sinistra) e sequenze ripetute (destra)
– B: Overlapper allinea le Unicontig (U-unitig sequenze non ripetute, Unitig
supercollassate sequenze ripetute)
– Orientamento delle U-unitig sulla base delle sequenze terminali di cloni da 10-50 Kb

Rifiniture del sequenziamento
shotgun
• Le lacune restanti vengono risolte in più
passaggi successivi:
– Inserzione delle unitig precedentemente scartate ma
confermate da più di due o tre coppie appaiate
– Inserizione delle sequenze la cui posizione è
confermata da una sola lettura
– BAC walking per completare le lacune rimanenti
– Associazione degli scaffolds alla struttura genomica
via STS

• Rifiniture di assemblaggio shotgun

Verifica delle sequenze
• La valutazione della veridicità ità di un
sequenziamento genomico viene fatta a tre
livelli:
– Completezza: limitata dalla possibilità di clonare e
sequenziare regioni ad altissima ripetitività
(eterocromatina costitutiva)
– Accuratezza: L’accuratezza di sequenza puo’ essere
aumentata semplicemente aumentando la ridondanza
di sequenziamento
– Validità degli allineamenti: E’ determinabile
integrando dati preesistenti quali mappe fisiche o
genetiche con i dati di sequenziamento.

• Valori stimanti di identificazione corretta dei tratti
riuniti di un genoma
• Per il progetto genoma umano l’94% è inserito in
contig di almeno 100Kb

• Discrepanze tra i progetti di sequenziamento alla stesura preliminare della
sequenza.
– Il cromosoma 22 considerato “finito” aveva molte meno discrepanze del 5 ancora in
fase “draft”
– Verde allineamenti appaiati, arancione zone >50kb non ordinate, azzurro regioni
orientate in modo opposto. Trattini neri: interruzioni, trattini blu N di 10 kb

Annotazione dei geni
su sequenze genomiche

Structure and transcription of a Eukaryotic gene

What is gene prediction
Detecting meaningful signals in uncharacterised DNA sequences.
Knowledge of the interesting information in DNA.
Sorting the ‘chaff from the wheat’
GATCGGTCGAGCGTAAGCTAGCTAG
ATCGATGATCGATCGGCCATATATC
ACTAGAGCTAGAATCGATAATCGAT
CGATATAGCTATAGCTATAGCCTAT
Gene prediction is ‘recognising proteincoding
regions in genomic sequence’

Knowing what to look for
What is a gene
Not a full transcript with control regions
The coding sequence (ATG -> STOP)
N
Start Middle End

Annotation of eukaryotic genomes
Genomic DNA
Unprocessed RNA
transcription
RNA processing
ab initio gene
prediction
Mature mRNA
Nascent
polypeptide
Gm 3
translation
folding
AAAAAAA
Comparative gene
prediction
Active enzyme
Functional
identification
Function
Reactant A
Product B

Gene finding: Issues
Issues regarding gene finding in general
Genome size
Genome composition
Genome complexity
cis-splicing
trans-splicing
i
alternate splicing

Gene finding: genome
Genome composition
Long ORFs tend to be coding
Presence of more putative ORFs in GC rich
genomes (Stop codons = UAA, UAG & UGA)
Genome complexity
Simple repetitive sequences and dispersed repeats
tend to be anti-coding
May need to mask sequence prior to gene
May need to mask sequence prior to gene
prediction

Gene finding: coding density
As the coding/non-coding length ratio decreases, exon
prediction becomes more complex
Human
Fugu
worm
E.coli
In procarioti e eucarioti inferiori l’identificazione di geni è relativamente facile.
I metodi ab-initio identificano in modo preciso fino al 90% dei geni.

cis-splicing of genes
Gene finding: splicing
Finding multiple (short) exons is harder than
finding a single (long) exon.
In uomo la dimensione media di un esone è 50 basi
trans-splicing of genes
A trans-splice acceptor is no different to a
normal splice acceptor
worm
E.coli

Gene finding: alternate splicing
Alternate splicing (isoforms) are very
difficult to predict.
Human A
Human B
Human C

ab initio prediction
What is ab initio gene prediction
Prediction from first principles using the raw DNA
sequence only.
GATCGGTCGAGCGTAAGCTAGCTAG
ATCGATGATCGATCGGCCATATATC
ACTAGAGCTAGAATCGATAATCGAT
CGATATAGCTATAGCTATAGCCTAT
Requires ‘training sets’ of known gene
structures to generate statistical tests for the
likelihood (probability) of a prediction being
real.

Gene finding: ab initio
What features of a ORF can we use
Size - large open reading frames
DNA composition - codon usage / 3rd position codon bias
Kozak sequence CCGCCAUGG
Ribosome binding sites
Termination signal (stops)
Splice junction boundaries (acceptor/donor)

Gene finding: features
Think of a CDS gene prediction as a linear series
of sequence features:
Initiation codon
Coding sequence (exon)
Splice donor (5’)
Non-coding sequence (intron)
N times
Splice acceptor (3’)
Coding sequence (exon)
Termination codon

Splicing Signals
Exons are interspersed with introns and
typically flanked by GT and AG

Consensus splice sites
Donor: 7.9 bits
Acceptor: 9.4 bits
(Stephens & Schneider, 1996)
(http://www-lmmb.ncifcrf.gov/~toms/sequencelogo.html)

Splice site detection
Donor site
5’ 3’
Position
% -8 … -2 -1 0 1 2 … 17
A 26 … 60 9 0 1 54 … 21
C 26 … 15 5 0 1 2 … 27
G 25 … 12 78 99 0 41 … 27
T 23 … 13 8 1 98 3 … 25
From lectures by Serafim Batzoglou (Stanford)

An end to ab initio prediction
ab binitio ii gene prediction i is inaccurate
High false positive rates for most predictors
Exon prediction sensitivity can be good
Rarely used as a final product
Human annotation runs multiple algorithms and scores
exon predicted by multiple predictors.
Used as a starting point for refinement/verification
Prediction need correction and validation
Why not just build gene models by comparative means

Annotation of eukaryotic genomes
Genomic DNA
Unprocessed RNA
transcription
RNA processing
ab initio gene
prediction
Mature mRNA
Nascent
polypeptide
Gm 3
translation
folding
AAAAAAA
Comparative gene
prediction
Active enzyme
Functional
identification
Function
Reactant A
Product B

comparative gene prediction
Use knowledge of known coding sequences to
identify region of genomic DNA by similarity
transcriptome - transcribed DNA sequence
proteome - peptide sequence
genome - related genomic sequence

Transcript-based prediction: datasets
Generation of large numbers of Expressed Sequence Tags (ESTs)
Quick, cheap but random
Subtractive hybridisation to find rare transcripts
Use multiple libraries for different life-stages/conditions
Single-pass sequence prone to errors
Generation of small number of full length cDNA sequences
Slow and laborious but focused
Large-scale sequencing of (presumed) full length cDNAs
Systematic, multiplexed l cloning/sequencing i of CDS
Expensive and only viable if part of bigger project

Transcript-based prediction: How it works
Align transcript data to genomic sequence using a pair-wise
sequence comparison
EST
(Expression sequence tag)
cDNA
OST
(ORF sequence tag)

Summary
Genes are complex structure which are difficult to predict with
the required level of accuracy/confidence
We can predict stops better than starts
t
We can only give gross confidence levels to predictions (i.e.
confirmed, partially confirmed or predicted)
Gene prediction is only part of the annotation procedure
Movement from ab initio to comparative methodology as
sequence data becomes available/affordable
Curation of gene models is an active process – the set of gene
models for a genome is fluid and WILL change over time.