Controllodellosviluppomicrobicoecolturebatteriche - Dipartimento di ...

Esami in laboratorioColorazionedi GramEsamicolturaliBiologiamolecolare(?)

Colorazione di GramFasi della colorazioneStruttura della pareteGram-positiviGram-negativi

Esame colturale per batteriGram-negativi• agar McConkey (Enterobatteri)• agar sangue (G. vaginalis)• agar cioccolato (Gonococco)Gram-positivi• agar sale mannite (Stafilococchi)• agar sangue (Streptococchi )

Identificazione microbicaBatteri Gram-negativiProve biochimiche:TSI agarIndolo e/oMobilità inSIM agarGallerie API 20 EGallerie API 20 NEGallerie API NH

Colorazione di Gram1884 Hans Christian Gram-Tecnica basata sulle proprietà fisichedella pareta cellulare

Identificazione microbicaStaphylococcus aureusMannite+ e Coagulasi+Test coagulasiGallerie API Staph (bioMérieux)Test catalasi

Lieviti: esame colturaleSabouraud dextrosio agar(Incubazione a 37° per 2-5 gg)

Diversità morfologica dei microrganismiDIVERSITà MORFOLOGICA DELLE COLONIEIMPORTANZA DEI PIGMENTIE DEI MARGINI DELLE COLONIE

PANORAMA SULLA DIVERSITA MORFOLOGICA: LE COLONIE

DALLACOLONIADIVERSITà METABOLICATest biochimiciidentificativi

DIVERSITà METABOLICA

Controllo dello sviluppomicrobico• Per controllo dello sviluppo microbicosi possono intendere diverse cose: sipuò volere inibire e non uccidere imicrorganismi, oppure si vuoleeliminare totalmente la popolazionemicrobica su soggetti inanimati o susuperfici viventi.• Si usano diversi metodi e diverseterminologie ne indicano le finalità.

Controllo dello sviluppomicrobico• Sterilizzazione: è il processo in cuivengono distrutte o rimosse tutte lecellule viventi (includendo le spore, i viruse i viroidi) da un determinato habitat oda oggetti inanimati;• Disinfezione: uccisione o inibizione di solimicrorganismi patogeni e disinfettantisono gli agenti chimici che vengonousati nei processi di disinfezione;• Sanificazione: la carica microbica vieneridotta entro limiti considerati sicuri per glistandard di sanità pubblica;

Controllo dello sviluppomicrobico• Antisepsi: è la pratica in grado diprevenire una infezione e si diconoantisettici i composti chimici utilizzati;• Antibiotici e chemioterapici: rientranonelle categorie dei composti in gradodi controllare lo sviluppo microbico.

Il modello di mortemicrobica• La distruzione di una popolazionemicrobica non avviene istantaneamentecon l’esposizione ad un agente letale.• Dopo che la popolazione ha subito unamarcata riduzione, il tasso di mortalitàrallenta e ciò consente la sopravvivenzadi ceppi microbici più resistenti.• E’ molto difficile stabilire il punto di mortedei microrganismi: quando avviene?Generalmente quando una cellula,inoculata in brodo fresco, non dà piùorigine ad una progenie.

• COLTURE DI MICRORGANISMILa coltivazione dei batteri in laboratorio richiedel'impiego dei cosiddetti "terreni" o "mezzi di coltura", con iquali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente ingrado di soddisfare le esigenze metaboliche del microrganismoche si desidera coltivare. Il terreno, prima della semina, deveessere sterile e contenuto in recipienti sterili dotati di unsistema di chiusura che garantisca la sterilità del contenuto.Tutte le operazioni relative alla semina devono essere condotteosservando precauzioni necessarie a evitare la contaminazionedel terreno ad opera dei batteri presenti nell'ambiente.

Colture di microrganismiRIPRODUCENDO LE CARATTERISTICHEDELL’AMBIENTE DI ORIGINE è POSSIBILE OTTENEREDELLE COLTURE E MANTENERE I MICROOGANISMI INLABORATORIO PER STUDIARNE LE CARATTERISTICHEFISIOLOGICHE, L’ATTIVITà ANCHE AL FINE PERAPPLICAZIONI BIOTECNOLOGICHE.

Microbiologia : analisi delle acque- Solo implicazioni di tipo sanitario, ricerca di germi indicatori diinquinamento

MEZZI (TERRENI) DI COLTURAsolidoliquido

I terreni di coltura• Per coltivare i batteri dobbiamo ricrearel’ambiente adeguato alla crescita e lamistura adatta a questo è chiamataterreno di coltura.• Il terreno provvede i nutrienti più adattiper quella specie, nonché un ambientecontrollato dal punto di vista del pH

I terreni di coltura• Liquidi – vengono chiamati brodi• Solidi – vengono solidificatimediante l’aggiunta di unpolisaccaride colloidale derivatodalle alghe rosse e chiamato agar• L’agar non è idrolizzabile dai batteri

I terreni di coltura• Terreni complessi• Terreni chimicamente definiti• Terreni di isolamento• Terreni di arricchimento• Terreni di identificazione edifferenziali

Brodo nutritivoCostituentiPeptoneQuantità g/L5Estratto di carne3

Agar MacConkeyCostituentiIdrolizzati pancreaticidi gelatinaQuantità g/L17,0Idrolizzati pancreaticidi caseinaIdrolizzati peptici ditessuto animaleLattosioSali biliariCloruro di sodioRosso neutro1,51,510,01,55,00,03Cristal violettoAgar0,00113,5

The Staphylococcus aureus fermentsmannitol and turns the medium yellow.The Serratia marcescens does not growbecause of the high salt content.Esempio di Terreno selettivo:MANNITOL SALT AGARMEZZI (TERRENI) d DI COLTURAiumyellow.Selettivo per Staphylococcus spp. e Micrococcaceae;TheSerratiStreptococcus agalactiae does not grow onMSA because of the high salt content.Staphylococcus epidermidis grows butdoes not ferment mannitol.

TERRENO DI COLTURA: differenzialeSodium ChlorideSodium AcetateMonoammoniumPhosphateDipotassiumPhosphateMagnesium SulfateBromothymol BlueAgar5.0gm2.0gm1.0gm1.0gm0.1gm0.08gm20.0gmFinal pH 6.7 +/- 0.2 at 25 °C.Escherichia coliFormazione di colonie suAcetate Differential Slant.Incubazione in aerobiosi.24 h at 35°CShigella flexneriInibito dall’ acetato.Assenza di crescita AcetateDifferential Slant.Incubazione in aerobiosi .24h a 35 °C

Terreni sintetici e chimicamente definitiEsempio terreno sintetico per E.coliGlucosio1,0 g/L16,4Na 2HPO 4KH 2PO 41,5(NH 4) 2SO 42,0MgSO 4200 mgCaCl 210 mgFeSO 40,5 mgpH finale 6.8-7.0

Microscopia ottica ed elettronicaConcetti chiave1. Ingrandimento2. Potere risolutivo: capacità di mostrare due punti adiacenti come distinti.- occhio umano 75-100 µm- microscopio ottico: 0.2 µm (200 nm)- microscopio elettronico: 0.2-2 nmIl potere risolutivo dipende dalla caratteristiche fisiche del mezzo (lucefasciodi elettroni)

Schema: microscopio compostoOCULARE-Tubo metallicoGENERALMENTEBINOCULARE !!Ruota obiettiviOBIETTIVO 10XOBIETTIVO 40XOBIETTIVO 100XGanciCondensatoreDiaframmaSorgente di luceBraccioTavolinoPorta campioneVite macrometricaVite micrometricaMESSA AFUOCOBase microscopio

Principi di base: microscopio compostoSistema di lenti convergenti:1. Oculare ed 2. Obiettivo all’estremità di un tubo metallico (160 mm)- Campione (oggetto) davanti l’ obiettivo → immagine reale-capovolta edingrandita- Immagine reale, capovolta ed ingrandita davanti all’oculare →immagine virtuale,capovolta ed ingrandita

INGRANDIMENTOFISSOPrincipi di base: microscopio composto10X oculare10X, 40X,100XobiettiviIngrandimentototale=Ingr. oculare XIngr. obiettivoOBIETTIVO ED OCULARELAVORANO INSIEMEPER RISOLVERE L’IMMAGINEL’oculare “risolve” l’immagine “reale”risolta dall’obbiettivo

Microscopio composto: obiettivo 100X ad immersione- L’obiettivo 100X è sempre adimmersione- L’obiettivo 100X è retrattatile- L’olio ha lo stesso indice di rifrazionedel vetro dell’obiettivo

Osservazione in vivo e le colorazioni1. Osservazione in vivo:- vetrino + goccia campione+ coprioggetto- vetrino + goccia campione + inchiostro di china+ coprioggetto- vetrino + goccia campione+ coprioggetto2. Le colorazioni. I coloranti sono composti organici con differenti affinitàper specifiche componenti cellulari.Distinguiamo :A: Coloranti cationici (basici) [ strutture cellulari cariche negativamente, acidi nucleici epolisaccaridi acidi, COO - ] : blu di metilene, safranina e cristal violettoB. Coloranti anionici: (acidi )[ strutturecellulari citoplasmatiche].Eosina, Rosso congo, Fucsina acida.

La colorazione di Gram1. Aggiunta del cristal violetto 2. lavaggio

La colorazione di Gram3. Aggiunta della soluzione diiodio (Lugol)4. lavaggio

La colorazione di Gram5. Dopo la decolorazione conalcool-acetone il passaggiofinale è la colorazione dicontrasto con safranina

La colorazione di GramUn Gram positivo Un Gram negativo Un Gram positivo

Diversità morfologica dei microrganismiNumero edisposizione deiflagelli in rapportoalla cellulaMonotricoAnfitrico Flagello/i nonvisibile almicroscopio!!!LofotricoMORFOLOGIA CELLULAREPeritrico